TY - THES A1 - Surrey, Verena T1 - Identification of affected cellular targets, mechanisms and signaling pathways in a mouse model for spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) T1 - Identifizierung betroffener zellulärer Zielmoleküle, Mechanismen und Signalwege in einem Maus-Modell für spinale Muskelatrophie mit Ateminsuffizienz Typ 1 (SMARD1) N2 - Spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) is a fatal monogenic motoneuron disease in children with unknown etiology caused by mutations in the immunoglobulin μ-binding protein 2 (IGHMBP2) gene coding for DNA/RNA ATPase/helicase. Despite detailed knowledge of the underlying genetic changes, the cellular mechanisms leading to this disease are not well understood. In the Nmd2J ("neuromuscular disorder") mouse, the mouse model for the juvenile form of SMARD1 patients, in which similar pathological features as diaphragmatic paralysis and skeletal muscle atrophy are observed. Ex vivo studies in Nmd2J mice showed that loss of the motor axon precedes atrophy of the gastrocnemius muscle and does not correlate with neurotransmission defects in the motor endplate. The already described independent myogenic anomalies in the diaphragm and heart of the Nmd2J mouse raised the question whether spinal motoneuron degeneration develops cell autonomously. Ighmbp2 is predominantly localized in the cytoplasm and seems to bind to ribosomes and polysomes, suggesting a role in mRNA metabolism. In this Ph.D. thesis, morphological and functional analyses of isolated Ighmbp2-deficient (Ighmbp2-def.) motoneurons were performed to answer the question whether the SMARD1 phenotype results from dysregulation of protein biosynthesis. Ighmbp2-deficient motoneurons show only negligible morphological alterations with respect to a slight increase in axonal branches. This observation is consistent with only minor changes of transcriptome based on RNA sequencing data from Ighmbp2-deficient motoneurons. Only the mRNA of fibroblast growth factor receptor 1 (Fgfr1) showed significant up-regulation in Ighmbp2-deficient motoneurons. Furthermore, no global aberrations at the translational level could be detected using pulsed SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell culture), AHA (L-azidohomoalanine) labeling and SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) methods. However, a reduced β-actin protein level was observed at the growth cones of Ighmbp2-deficient motoneurons, which was accompanied with a reduced level of Imp1 protein, a known β-actin mRNA interactor. Live-cell imaging studies using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) showed translational down-regulation of eGFPmyr-β-actin 3'UTR mRNA in the growth cones and the cell bodies, although the amount of β-actin mRNA and the total protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons showed no aberrations. This compartment-specific reduction of β-actin protein occurred independently of a non-existent direct IGHMBPF2 binding to β-actin mRNA. Fgfr1, which was upregulated on the RNA level, did not show an increased protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons, whereas a reduced amount could be detected. Interestingly, a correlation could be found between the reduced amount of the Imp1 protein and the increased Fgfr1 mRNA, since the IMP1 protein binds the FGFR1 mRNA and thus could influence the transport and translation of FGFR1 mRNA. In summary, all data suggest that Ighmbp2 deficiency leads to a local but modest disturbance of protein biosynthesis, which might contribute to the motoneuron defects of SMARD1. N2 - Die spinale Muskelatrophie mit Atemnot Typ 1 (SMARD1) ist eine tödliche, monogene Motoneuron-Erkrankung bei Kindern mit unbekannter Ätiologie. SMARD1 wird durch Mutationen im Immunoglobulin µ-bindenden Protein 2 (IGHMBP2)-Gen verursacht, welches für eine DNA/RNA ATPase/Helikase kodiert. Trotz detaillierter Kenntnisse über die zugrunde liegenden genetischen Veränderungen sind die zellulären Mechanismen, die zu dieser Krankheit führen, nicht gut verstanden. In der Nmd2J („neuromuscular disorder“) Maus, dem Mausmodell für die juvenile Form von SMARD1-Patienten, werden ähnliche pathologische Merkmale wie Diaphragma-Lähmung und Skelettmuskelatrophie beobachtet. Ex vivo-Studien an Nmd2J-Mäusen zeigten, dass der Verlust des motorischen Axons einer Atrophie des Gastrocnemius-Muskels vorausgeht und nicht mit Neurotransmissionsfehlern an der motorischen Endplatte korreliert. Die bereits beschriebenen, unabhängig auftretenden myogenen Anomalien in Zwerchfell und Herz der Nmd2J-Maus führten zu der Frage, ob sich die spinale Motoneuron-Degeneration zellautonom entwickelt. Ighmbp2 ist prädominant im Zytoplasma lokalisiert und scheint an Ribosomen und Polysomen zu binden, was auf eine Rolle im mRNA-Stoffwechsel hindeutet. In dieser Doktorarbeit wurden morphologische und funktionelle Analysen von isolierten Ighmbp2-defizienten (Ighmbp2-def.) Motoneuronen durchgeführt, um die Frage zu beantworten, ob der SMARD1-Phänotyp aus der Deregulierung der Proteinbiosynthese resultiert. Ighmbp2-defiziente Motoneuronen weisen nur geringfügige morphologische Unterschiede hinsichtlich einer leichten Zunahme der axonalen Verzweigungen auf. Diese Beobachtung steht im Einklang mit nur geringen Veränderungen im Transkriptom basierend auf den RNA-Sequenzierungs-Daten in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Ausschließlich die mRNA des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (Fgfr1) zeigte eine signifikante Hoch-Regulation in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Des Weiteren konnten keine globalen Aberrationen auf der translationalen Ebene mit Hilfe der gepulsten SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in der Zellkultur), AHA (L-Azidohomoalanin)-Markierung und der SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) Methoden ermittelt werden. Jedoch konnte eine verringerte β-actin Proteinmenge an den Wachstumskegeln von Ighmbp2-defizienten Motoneuronen beobachtet werden, die von einer Reduktion an Imp1 Protein, einem bekannten β-actin mRNA Interaktor, begleitet wurde. Lebendzell-Bildgebungsstudien mittels Fluoreszenz-Recovery after Photobleaching (FRAP) Untersuchung zeigten eine translatorische Herunter-Regulation der eGFPmyr-β-actin 3‘UTR mRNA in Wachstumskegeln und Zellkörpern, obwohl die Menge an β-actin mRNA und die Gesamt-Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen im Vergleich zu wildtypischen Motoneuronen unverändert war. Diese Kompartiment-spezifische Reduktion von β-actin Protein trat unabhängig von einer nicht vorhandenen direkten IGHMBP2-Bindung an die β-actin mRNA auf. Der auf RNA Ebene hochregulierte Fgfr1 zeigte hingegen keine erhöhte, aber eine verringerte Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Interessanterweise konnte ein Zusammenhang zwischen der reduzierten Menge des Imp1 Proteins und der erhöhten FGFR1 mRNA gezogen werden. Da das IMP1 Protein neben der β-actin mRNA ebenfalls die FGFR1 mRNA bindet, könnte es so den Transport und die Translation beeinflussen. Alle Daten deuten zusammenfassend daraufhin, dass Ighmbp2-Mangel zu einer lokalen und geringen Störung der Proteinbiosynthese führt, die aber durchaus zu den beobachteten Motoneuron-Defekten in SMARD1 beitragen könnte. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Ighmbp2 KW - Maus KW - RNA helicase KW - IMP1/ZBP1 KW - SMARD1 KW - motoneuron KW - translation KW - Signalkette KW - Molekularbiologie KW - Atmungsinsuffizienz Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176386 ER - TY - THES A1 - Handoko, Lusy Lusiana T1 - Functional Characterization of IGHMBP2, the Disease Gene Product of Spinal Muscular Atrophy with Respiratory Distress Type 1 (SMARD1) T1 - Funktionelle Charakterisierung vom IGHMBP2, des Krankheitgenproduktes der Spinalen Muskelatrophie mit Atemnot Typ 1 N2 - Spinale Muskelatrophie mit Atemnot Type 1 (SMARD1) ist eine autosomal rezessive, neurodegenerative Erkrankung, die sich häufig schon im Säuglings- und Kleinkindalter manifestiert. Pathologisches Merkmal von SMARD1 ist eine frühe und akut einsetzende Atemnot und eine progrediente, zunächst distal betonte Muskelschwäche, die durch eine Lähmung des Zwerchfells und der Skelettmuskulatur aufgrund des Absterbens der motorischen Vordernhornzellen des Rückenmarks eintritt. SMARD1 ist eine monogene Krankheit, die durch Mutationen im Gen für das Immunoglobulin µ-bindende Protein 2“ (IGHMBP2) hervorgerufen wird. Obwohl Mutationen in IGHMBP2 ausschließlich die Degeneration von Motoneuronen auslösen, ist das Gen bei Menschen und Mäusen ubiquitär exprimiert. Deshalb scheint SMARD1 durch den Defekt eines „Haushaltsproteins“ statt eines Neuron-spezifischen Faktors verursacht zu werden. IGHMBP2 verfügt über eine N-terminale DEXDc-Helicase/ATPase-Domäne und gehört zur Superfamily 1 Helicase. Bislang war lediglich bekannt, dass das Protein in verschiedenen zellulären Aktivitäten wie DNA Replikation, Transkription und prä-mRNA Splicing zugewiesen wurde. Die präzise Funktion von IGHMBP2 in den obengenannten Prozessen, und damit auch die molekulare Ursache von SMARD1 sind jedoch noch völlig unklar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das IGHMBP2 Protein sowohl enzymatisch zu charakterisieren als auch den Prozess zu identifizieren, in dem dieses Protein in vivo agiert. Mit diesem Wissen sollten dann pathogene Mutanten von IGHMBP2 auf Defekte hin untersucht werden. Ein Schlüssel für diese Arbeit war die Gewinnung von rekombinantem, biologisch aktivem IGHMBP2 durch eine zweistufige Aufreinigungsstrategie. Dieses hochreine Enzym zeigte eine ATP-abhängige Helikaseaktivität, die sowohl doppelsträngige DNA als auch RNA mit einer 5’→3’ Direktionalität entwindet. Interessanterweise zeigte sich, dass dieses Enzym -im Gegensatz zu früheren Befunden- nahezu ausschließlich im Zytoplasma von Zellen lokalisiert ist. Darüber hinaus wiesen die Affinitätsaufreinigungsexperimente und Grossenfraktionierungsuntersuchungen daraufhin, dass IGHMBP2 ein Bestandteil des RNase-empfindlichen Komplexes ist, der als Ribosomen identifiziert wurde. IGHMBP2 interagiert primär mit 80S Monosomen, wobei das Protein mit beiden Untereinheiten in Kontakt steht. Hingegen ist IGHMBP2 an Polysomen nur in geringen Mengen zu finden. Diese Befunde deuten stark auf eine Rolle von IGHMBP2 bei der mRNA Verarbeitung am Ribosom hin, wobei noch unklar ist, ob es sich um translationsrelevante Prozesse handelt oder die mRNA-Stabilität beeinflusst. Die biochemische und enzymatische Charakterisierung von IGHMBP2 erlaubte erstmals Einblicke in den Pathomechanismus von SMARD1. In den folgenden Untersuchungen wurden die enzymatischen Aktivitäten der SMARD1-erregenden Ighmbp2 Mutante und ihre Assoziation mit ribosomalen Untereinheiten nachgeforscht. Interessanterweise konnten pathogene Missense-Mutanten von IGHMBP2 noch genauso gut wie das Wildtyp-Protein mit ribosomalen Untereinheiten wechselwirken. Jedoch inhibierten alle bisher getesteten Mutanten die RNA Helikaseaktivität, allerdings über unterschiedliche Mechanismen. Diese Daten weisen darauf hin, dass ein Defekt in den enzymatischen Aktivitäten des IGHMBP2 direkt mit der Pathogenese der SMARD1 korreliert. Des Weiteren lassen die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse vermuten, dass SMARD1 durch Defekte in der zellularen Translationsmaschinerie entsteht. N2 - Spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) is an autosomal recessive neuronal disorder in infants. The disease is marked by early onset of respiratory distress and predominantly distal muscle weakness, as consequences of diaphragmatic paralysis and progressive degeneration of  motor neurons in the spinal cord, respectively. Genetically, SMARD1 is caused by mutations in the single gene encoding Immunoglobulin µ-Binding Protein 2 (IGHMBP2). Despite the tissue specific degeneration observed in SMARD1 patients, the disease gene product IGHMBP2 is ubiquitously expressed in human and mouse tissues. Therefore, SMARD1 appears to be a motor neuron disease caused by the malfunction of a “housekeeping” protein, rather than a neuron specific factor. IGHMBP2 harbors an N-terminal DEXDc-type helicase/ATPase domain and has been classified as a member of the Superfamily 1 (SF1) of helicases. This protein has been assigned to various cellular activities such as DNA replication, pre-mRNA splicing and transcription. However its precise function in either process has remained elusive. The study presented here aimed at the enzymatic characterization of IGHMBP2, the identification of a specific cellular process to which IGHMBP2 is connected and the role of this factor in the pathophysiology of SMARD1. As a first step toward this end, a two-step purification strategy was established, which enabled the large-scale purification of properly folded and enzymatically active IGHMBP2. In vitro enzymatic studies using this recombinant protein defined IGHMBP2 as an ATP-dependent helicase that catalyzes unwinding of duplices composed of either DNA or RNA in a 5’→3’ direction. In contrast to previous reports, indirect immunofluorescence studies revealed a predominantly cytoplasmic localization of IGHMBP2. Size-fractionation studies and affinity-purification experiments further showed that IGHMBP2 is part of an RNase-sensitive macromolecular complex, which was identified as the ribosome. Interestingly, IGHMBP2 was abundantly detected in both subunits as well as to 80S ribosomes but only in small amounts in actively translating polysomes. These data strongly point to a role of IGHMBP2 in ribosomes-associated gene regulation control, such as in mRNA stabilization or mRNA translation. However, its precise function in those pathways remains to be identified. The biochemical and enzymatic characterization of IGHMBP2 allowed for the first time insights into the pathomechanism of SMARD1. SMARD1-causing pathogenic IGHMBP2 variants were investigated for their enzymatic activities and interaction with ribosomal subunits. Interestingly, among all missense mutations that have been tested thus far, none obstructs association with ribosomal subunits. However, these mutants exhibit specific defects in either the ATPase or RNA helicase activity or both. The data suggest that defects in the enzymatic activity of IGHMBP2 directly correlate with the pathogenesis of SMARD1. Furthermore, these data also raise the possibility that the disease SMARD1 is caused by alterations in the cellular translation machinery. KW - IGHMBP2 KW - SMARD1 KW - DSMA1 KW - Translation KW - RNA Helikase KW - IGHMBP2 KW - SMARD1 KW - DSMA1 KW - Translation KW - RNA Helicase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24984 ER - TY - JOUR A1 - Krieger, Frank A1 - Metzger, Friedrich A1 - Jablonka, Sibylle T1 - Differentiation defects in primary motoneurons from a SMARD1 mouse model that are insensitive to treatment with low dose PEGylated IGF1 JF - Rare Diseases N2 - Muscle atrophy and diaphragmatic palsy are the clinical characteristics of spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1), and are well represented in the neuromuscular degeneration \((Nmd^{2J})\) mouse, modeling the juvenile form of SMARD1. Both in humans and mice mutations in the IGHMBP2 gene lead to motoneuron degeneration. We could previously demonstrate that treatment with a polyethylene glycol-coupled variant of IGF1 (PEG-IGF1) improves motor functions accompanied by reduced fiber degeneration in the gastrocnemius muscle and the diaphragm, but has no beneficial effect on motoneuron survival. These data raised the question which cell autonomous disease mechanisms contribute to dysfunction and loss of Ighmbp2-deficient motoneurons. An analysis of primary Ighmbp2-deficient motoneurons exhibited differentiation deficits such as reduced spontaneous \(Ca^{2+}\) transients and altered axon elongation, which was not compensated by PEG-IGF1. This points to an IGF1 independent mechanism of motoneuron degeneration that deserves treatment approaches in addition to IGF1. KW - SMARD1 KW - motoneurons KW - Ighmbp2 KW - IGF1 KW - Cav2.2 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120610 SN - 2167-5511 VL - 2 IS - e29415 ER -