TY  - THES
A1  - Kleffel, Sonja Beate
T1  - The role of cancer cell-expressed PD-1 in tumorigenesis and tumor immune evasion
T1  - Funktionelle Charakterisierung von Tumorzell-exprimiertem PD-1 in der Karzinogenese und antitumoralen Immunabwehr
N2  - Melanoma and Merkel cell carcinoma (MCC) are highly aggressive cancers of the skin that frequently escape immune recognition and acquire resistance to chemotherapeutic agents, which poses a major obstacle to successful cancer treatment. Recently, a new class of therapeutics targeting the programmed cell death-1 (PD-1) immune checkpoint receptor has shown remarkable efficacy in the treatment of both cancers. Blockade of PD-1 on T cells activates cancer-specific immune responses that can mediate tumor regression. The data presented in this Ph.D. thesis demonstrates that PD-1 is also expressed by subsets of cancer cells in melanoma and MCC. Moreover, this work identifies PD-1 as a novel tumor cell-intrinsic growth receptor, even in the absence of T cell immunity. PD-1 is expressed by tumorigenic cell subsets in melanoma patient samples and established human and murine cell lines that also co-express ABCB5, a marker of immunoregulatory tumor- initiating cells in melanoma. Consistently, melanoma-expressed PD-1 downmodulates T effector cell functions and increases the intratumoral frequency of tolerogenic myeloid- derived suppressor cells. PD-1 inhibition on melanoma cells by RNA interference, blocking antibodies, or mutagenesis of melanoma-PD-1 signaling motifs suppresses tumor growth in immunocompetent, immunocompromised, and PD-1-deficient tumor graft recipient mice. Conversely, melanoma-specific PD-1 overexpression enhances tumorigenicity, including in mice lacking adaptive immunity. Engagement of melanoma- PD-1 by its ligand PD-L1 promotes tumor growth, whereas melanoma-PD-L1 inhibition or knockout of host-PD-L1 attenuates growth of PD-1-positive melanomas. Mechanistically, the melanoma-PD-1 receptor activates mTOR signaling mediators, including ribosomal protein S6. In a proof-of-concept study, tumoral expression of phospho-S6 in pretreatment tumor biopsies correlated with clinical responses to anti-PD-1 therapy in melanoma patients. In MCC, PD-1 is similarly co-expressed by ABCB5+ cancer cell subsets in clinical tumor specimens and established human cell lines. ABCB5 renders MCC cells resistant to the standard-of-care chemotherapeutic agents, carboplatin and etoposide. Antibody-mediated ABCB5 blockade reverses chemotherapy resistance and inhibits tumor xenograft growth by enhancing chemotherapy-induced tumor cell killing. Furthermore, engagement of MCC-expressed PD-1 by its ligands, PD-L1 and PD-L2, promotes proliferation and activates MCC-intrinsic mTOR signaling. Consistently, antibody- mediated PD-1 blockade inhibits MCC tumor xenograft growth and phosphorylation of mTOR effectors in immunocompromised mice. In summary, these findings identify cancer cell-intrinsic functions of the PD-1 pathway in tumorigenesis and suggest that blocking melanoma- and MCC-expressed PD-1 might contribute to the striking clinical efficacy of anti-PD-1 therapy. Additionally, these results establish ABCB5 as a previously unrecognized chemoresistance mechanism in MCC.
N2  - Das Melanom und das Merkelzellkarzinom (MZK) sind auttumoren neuroendokrinen Ursprungs, die sich durch ein besonders aggressives Wachstum auszeichnen. Melanome und MZK entgehen häufig der antitumoralen Immunabwehr und erwerben Resistenzen gegen Chemotherapeutika, was eine erfolgreiche Behandlung der betroffenen Patienten erschwert. In klinischen Studien hat eine neue Klasse von therapeutischen Antikörpern, die den Immun-Checkpoint Rezeptor PD-1 (Programmed Cell Death-1) inhibieren, hohe Ansprechraten und dauerhafte Remissionen bei Melanom- und MZK-Patienten erzielt. Die Blockade des PD-1 Rezeptors auf T-Zellen reaktiviert autologe Immunreaktionen gegen Tumorzellen, die zur Reduktion des Tumors führen können. Die vorgelegte Dissertation zeigt, dass Subpopulationen von Melanom- und MZK-Zellen PD-1 exprimieren, und dass die Aktivierung von Tumorzell-intrinsischem PD-1 einen pro-tumorigenen Mechanismus darstellt, einschliesslich in T-Zell-defizienten Mäusen. In Biopsien von Melanom-Patienten, sowie in humanen und murinen Melanom-Zelllinien wird PD-1 präferentiell von
tumorigenen, immunregulatorischen, ABCB5+ Melanom-Stammzellen exprimiert. PD-1+ Melanomzellen hemmen die Aktivität von Effektor-T-Zellen und erhöhen die Anzahl der
tolerogenen myeloiden Suppressorzellen im Tumor. Die Inhibierung des PD-1 Rezeptors auf Melanomzellen durch RNA-Interferenz, blockierende Antikörper oder Mutagenese der
intrazellulären Signalmotive des PD-1 Proteins unterdrückt das Melanom-Wachstum in immunkompetenten, immunsupprimierten und PD-1-defizienten Mäusen. Umgekehrt führt die Melanom-spezifische Überexpression von PD-1 zu einem signifikant erhöhtem Tumorwachstum, sogar in immunsupprimierten Mäusen. Die Aktivierung des PD-1 Rezeptors auf Melanomzellen durch die Bindung seines Liganden, PD-L1, fördert das Tumorwachstum, während das protumorigene Potential von PD-1-positiven Melanomzellen durch die Inhibierung von PD-L1 auf Melanomzellen, sowie in PD-L1-defizienten Mäusen, gehemmt wird. In Melanomzellen aktiviert der PD-1 Rezeptor den mTOR Signaltransduktionsweg, einschließlich des Effektormoleküls ribosomales Protein S6. In einer Teststudie korrelierte die Expression des Phospho-S6 Proteins in Melanomzellen aus Biopsien, die vor Gabe der Immuntherapie entnommen wurden, mit den Ansprechraten der Melanom Patienten auf die Behandlung mit PD-1-Antikörpern. Auch in Biopsien von MZK-Patienten und in etablierten humanen MZK-Zelllinien wird
PD-1 präferentiell von ABCB5+ Subpopulationen exprimiert. Im MZK vermittelt der ABCB5-Membrantransporter Resistenzen gegenüber den Zytostatika Carboplatin und Etoposid. Die Antikörper-vermittelte Blockade des ABCB5-Transporters sensibilisiert MZK-Zellen für die Carboplatin- und Etoposid-vermittelte Apoptose, was zu einer signifikanten Reduktion des experimentellen Tumorwachstums führt. Ähnlich wie im
Melanom fördert die Bindung des PD-1 Rezeptors auf MZK Zellen durch seine Liganden, PD-L1 und PD-L2, deren Proliferation und die intrazelluläre Aktivierung der mTORSignalkaskade. Entsprechend führt die antikörper-vermittelte Blockade von PD-1 zur Inhibierung des MZK-Tumorwachstums in immunsupprimierten Mäusen und zu einer reduzierten Phosphorylierung von mTOR Effektormolekülen. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass Subpopulationen von Melanom- und MZK-Zellen PD-1 exprimieren, und dass Tumorzell-intrinsische PD-1-Funktionen das Krebswachstum fördern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockade des PD-1-Rezeptors auf Tumorzellen zu der klinischen Wirksamkeit der anti-PD-1 Therapie beitragen könnte. Darüber hinaus konnte ABCB5 als neuer Chemoresistenz-Mechanismus in MZK identifiziert werden.
KW  - Melanom
KW  - Merkelzellkarzinom
KW  - Cancer
KW  - Melanoma
KW  - Merkel cell carcinoma
KW  - Cancer immunotherapy
KW  - Chemotherapeutic resistance
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151205
ER  - 
TY  - THES
A1  - Adhikari, Bikash
T1  - Targeted degradation of Myc-interacting oncoproteins
T1  - Gezielte Degradation von mit Myc interagierenden Onkoproteinen
N2  - The hallmark oncoprotein Myc is a major driver of tumorigenesis in various human cancer entities. However, Myc’s structural features make it challenging to develop small molecules against it. A promising strategy to indirectly inhibit the function of Myc is by targeting its interactors. Many Myc-interacting proteins have reported scaffolding functions which are difficult to target using conventional occupancy- driven inhibitors. Thus, in this thesis, the proteolysis targeting chimera (PROTAC) approach was used to target two oncoproteins interacting with Myc which promote the oncogenicity of Myc, Aurora-A and WDR5. PROTACs are bifunctional small molecules that bind to the target protein with one ligand and recruit a cellular E3- ligase with the other ligand to induce target degradation via the ubiquitin- proteasome system. So far, the most widely used E3-ligases for PROTAC development are Cereblon (CRBN) and von Hippel–Lindau tumor suppressor (VHL). Furthermore, there are cases of incompatibility between some E3-ligases and proteins to bring about degradation. Hence there is a need to explore new E3- ligases and a demand for a tool to predict degradative E3-ligases for the target protein in the PROTAC field.

In the first part, a highly specific mitotic kinase Aurora-A degrader, JB170, was developed. This compound utilized Aurora-A inhibitor alisertib as the target ligand and thalidomide as the E3-ligase CRBN harness. The specificity of JB170 and the ternary complex formation was supported by the interactions between Aurora-A and CRBN. The PROTAC-mediated degradation of Aurora-A induced a distinct S- phase defect rather than mitotic arrest, shown by its catalytic inhibition. The finding demonstrates that Aurora-A has a non-catalytic role in the S-phase. Furthermore, the degradation of Aurora-A led to apoptosis in various cancer cell lines.

In the second part, two different series of WDR5 PROTACs based on two protein- protein inhibitors of WDR5 were evaluated. The most efficient degraders from both series recruited VHL as a E3-ligase and showed partial degradation of WDR5. In addition, the degradation efficiency of the PROTACs was significantly affected by the linker nature and length, highlighting the importance of linker length and composition in PROTAC design. The degraders showed modest proliferation defects at best in cancer cell lines. However, overexpression of VHL increased the degradation efficiency and the antiproliferative effect of the PROTACs.

In the last part, a rapamycin-based assay was developed to predict the degradative E3-ligase for a target. The assay was validated using the WDR5/VHL and Aurora- A/CRBN pairs. The result that WDR5 is degraded by VHL but not CRBN and Aurora-A is degraded by CRBN, matches observations made with PROTACs. This technique will be used in the future to find effective tissue-specific and essential E3-ligases for targeted degradation of oncoproteins using PROTACs.
Collectively, the work presented here provides a strategy to improve PROTAC development and a starting point for developing Aurora-A and WDR5 PROTACs for cancer therapy.
N2  - Das Onkoprotein Myc ist ein wichtiger Faktor bei der Tumorentstehung in verschiedenen menschlichen Krebsarten. Die strukturellen Merkmale von Myc machen es jedoch schwierig, kleine Moleküle gegen dieses Protein zu entwickeln. Eine vielversprechende Strategie zur indirekten Hemmung der Funktion von Myc besteht darin, auf seine Interaktoren abzuzielen. Viele Proteine, die mit Myc interagieren, haben Gerüstfunktionen, die mit herkömmlichen Inhibitoren nur schwer zu hemmen sind. Daher wurde in dieser Arbeit der PROTAC-Ansatz (Proteolysis Targeting Chimera) verwendet, um zwei Onkoproteine, die mit Myc interagieren und die Onkogenität von Myc fördern, ins Visier zu nehmen: Aurora-A und WDR5. PROTACs sind bifunktionale kleine Moleküle, die mit einem Liganden an das Zielprotein binden und mit dem anderen Liganden eine zelluläre E3-Ligase rekrutieren, um den Abbau des Zielproteins über das Ubiquitin-Proteasom-System einzuleiten. Die bisher am häufigsten verwendeten E3-Ligasen für die Entwicklung von PROTACs sind Cereblon (CRBN) und der von Hippel-Lindau-Tumorsuppressor (VHL). Außerdem gibt es Fälle von Inkompatibilität zwischen einigen E3-Ligasen und Proteinen, die abgebaut werden sollen. Daher besteht die Notwendigkeit, neue E3-Ligasen zu erforschen und Werkzeuge zur Vorhersage abbauender E3-Ligasen für das Zielprotein zu entwickeln.
Im ersten Teil wurde ein hochspezifischer Degrader der mitotischen Kinase Aurora-A, JB170, entwickelt. Bei dieser Verbindung wurde der Aurora-A-Inhibitor Alisertib als Zielligand und Thalidomid als Binder für die E3-Ligase CRBN verwendet. Die Spezifität von JB170 und die ternäre Komplexbildung wurden durch die Wechselwirkungen zwischen Aurora-A und CRBN unterstützt. Der durch PROTAC vermittelte Abbau von Aurora-A führte zu einem deutlichen Defekt in der S-Phase und nicht zu einem mitotischen Stillstand, wie es für dessen katalytische Hemmung beobachtet wurde. Dies zeigt, dass Aurora-A eine nicht-katalytische Funktion in der S-Phase hat. Außerdem führte der Abbau von Aurora-A in verschiedenen Krebszelllinien zur Apoptose.
Im zweiten Teil wurden zwei verschiedene Serien von WDR5 PROTACs auf der Grundlage von zwei Protein-Protein-Inhibitoren von WDR5 untersucht. Die effizientesten Degrader aus beiden Serien rekrutierten VHL als E3-Ligase und zeigten einen teilweisen Abbau von WDR5. Darüber hinaus wurde die Abbaueffizienz der PROTACs erheblich von der Art und Länge des Linkers beeinflusst, was die Bedeutung der Linkerlänge und -zusammensetzung bei der Entwicklung von PROTACs unterstreicht. Die Abbauprodukte zeigten bestenfalls bescheidene Proliferationsdefekte in Krebszelllinien. Eine Überexpression von VHL erhöhte jedoch die Abbaueffizienz und den antiproliferativen Effekt der PROTACs.
Im letzten Teil wurde ein auf Rapamycin basierender Assay entwickelt, um die abbauende E3-Ligase für ein Target vorherzusagen. Der Assay wurde anhand der Paare WDR5/VHL und Aurora-A/CRBN validiert. Das Ergebnis, dass WDR5 von VHL, aber nicht von CRBN abgebaut wird und Aurora-A von CRBN abgebaut wird, stimmt mit den Beobachtungen überein, die mit PROTACs gemacht wurden. Diese Technik wird in Zukunft eingesetzt werden, um wirksame gewebespezifische und essentielle E3-Ligasen für den gezielten Abbau von Onkoproteinen mit Hilfe von PROTACs zu finden.
Insgesamt bieten die hier vorgestellten Arbeiten eine Strategie zur Verbesserung der PROTAC-Entwicklung und einen Ausgangspunkt für die Entwicklung von Aurora-A- und WDR5-PROTACs für die Krebstherapie.
KW  - Degradation
KW  - PROTACs
KW  - Oncoprotein
KW  - Cancer
KW  - Onkoprotein
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317326
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hofstetter, Julia Eva Ines
T1  - MYC shapes the composition of RNA polymerase II through direct recruitment of transcription elongation factors
T1  - MYC beeinflusst die Zusammensetzung der RNA-Polymerase II durch die direkte Rekrutierung von Transkriptions-Elongationsfaktoren
N2  - The transcription factor MYC is a onco-protein, found to be deregulated in many human cancers. High MYC levels correlate with an aggressive tumor outcome and poor survival rates. Despite MYC being discovered as an oncogene already in the 1970s, how MYC regulates transcription of its target genes, which are involved in cellular growth and proliferation, is not fully understood yet.

In this study, the question how MYC influences factors interacting with the RNA polymerase II ensuring productive transcription of its target genes was addressed using quantitative mass spectrometry. By comparing the interactome of RNA polymerase II under varying MYC levels, several potential factors involved in transcriptional elongation were identified. Furthermore, the question which of those factors interact with MYC was answered by employing quantitative mass spectrometry of MYC itself. Thereby, the direct interaction of MYC with the transcription elongation factor SPT5, a subunit of the DRB-sensitivity inducing factor, was discovered and analyzed in greater detail. SPT5 was shown to be recruited to chromatin by MYC. In addition, the interaction site of MYC on SPT5 was narrowed down to its evolutionary conserved NGN-domain, which is the known binding site for SPT4, the earlier characterized second subunit of the DRB-sensitivity inducing factor. This finding suggests a model in which MYC and SPT4 compete for binding the NGN-domain of SPT5.
Investigations of the SPT5-interacting region on MYC showed binding of SPT5 to MYC’s N-terminus including MYC-boxes 0, I and II.
In order to analyze proteins interacting specifically with the N-terminal region of MYC, a truncated MYC-mutant was used for quantitative mass spectrometric analysis uncovering reduced binding for several proteins including the well-known interactor TRRAP and TRRAP-associated complexes.
Summarized, ...
N2  - Bei dem Transkriptionsfaktor MYC handelt es sich um ein Onkoprotein, welches in einer Vielzahl der menschlichen Krebserkrankungen in erhöhter Konzentration vorliegt, was wiederum mit einem schweren Krankheitsverlauf einhergeht. Bereits in den 1970iger Jahren wurde das Protein MYC als ein Onkoprotein identifiziert, aber wie es die Transkription seiner großen Bandbreite an Zielgenen, welche für Zellwachstum und -proliferation verantwortlich sind, reguliert, ist bisher noch nicht eindeutig geklärt.

In dieser Arbeit wurde die zentrale Frage untersucht, wie MYC die Proteine beeinflusst, die mit der RNA-Polymerase II interagieren, um dadurch eine schnelle und produktive Transkription seiner Zielgene zu ermöglichen. Hierfür wurden mittels der Durchführung massenspektrometrischer Untersuchungen Proteine, die in der An- und Abwesenheit von MYC mit der RNA-Polymerase II interagieren, identifiziert, was eine MYC-bedingte Änderung einiger Elongationsfaktoren im Interaktom der RNA-Polymerase II aufzeigte. Des Weiteren wurden ebenfalls unter Zuhilfenahme massenspektrometrischer Analysen Proteine bestimmt, die mit MYC selbst interagieren. Hierdurch konnte die bisher unbeschriebene, direkte Interaktion zwischen MYC und SPT5, der großen Untereinheit des DRB-sensitivity inducing factors, aufgedeckt und näher analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass MYC SPT5 zum Chromatin rekrutiert. Weiter konnte nachgewiesen werden, dass MYC mit der evolutionär konservierten NGN-Domäne von SPT5 interagiert, an welche auch SPT4, die zweite Untereinheit des DRB-sensitivity inducing factors, bindet. Dies resultiert in dem Modell, dass MYC mit SPT4 um die Bindestelle auf SPT5 konkurriert und durch dieses ersetzt werden kann.
Die Nähere Untersuchung der Bindestelle von SPT5 auf MYC zeigte eine Binderegion im N-terminalen Bereich von MYC auf, der die MYC-Boxen 0, I und II miteinschließt.
Um Proteine zu identifiziert, die selektiv mit dem N-terminalen Bereich von MYC interagieren, ...
KW  - Transkription <Genetik>
KW  - Myc
KW  - MYC
KW  - DSIF
KW  - Transcription
KW  - Cancer
KW  - RNA polymerase II
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240358
ER  - 
TY  - THES
A1  - Alrefai, Hani Gouda Alsaid
T1  - Molecular Characterization of NFAT Transcription Factors in Experimental Mouse Models
T1  - Molekulare Charakterisierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren in experimentellen Mausmodellen
N2  - In this work we wanted to investigate the role of NFATc1 in lymphocyte physiology and in pathological conditions (eg. psoriasis). NFATc1 is part of the signal transduction
pathways that regulates B cells activation and function. NFATc1 has different isoforms that are due to different promoters (P1 and P2), polyadenylation and alternative splicing. Moreover, we tried to elucidate the points of interactions between the NFAT and the NF-κB pathways in
activated B-cell fate. NFAT and NF-κB factors share several properties, such as a similar mode of induction and architecture in their DNA binding domain. We used mice which over-express a constitutive active version of NFATc1/α in their B cells with -or without- an ablated IRF4. IRF4 inhibits cell cycle progression of germinal center B cell-derived Burkitt’s lymphoma cells and
induces terminal differentiation toward plasma cells. Our experiments showed that a ‘double hit’ in factors affecting B cell activation (NFATc1 in this case) and late B cell Differentiation (IRF4 in this case) alter the development of the B cells, lead to increase in their numbers and increase in stimulation induced proliferation. Therefore, the overall picture indicates a link between these 2 genes and probable carcinogenic alterations that may occur in B cells.

We also show that in splenic B cells, c-Rel (of the NF-κB canonical pathway) Support the induction of NFATc1/αA through BCR signals. We also found evidence that the lack of NFATc1 affects the expression of Rel-B (of the NF-κB non-canonical pathway). These data suggest a tight interplay between NFATc1 and NF-κB in B cells, influencing the competence of B cells and their functions in peripheral tissues.

We also used IMQ-induced psoriasis-like inflammation on mice which either lack NFATc1 from B cell. Psoriasis is a systemic chronic immunological disease characterized
primarily by abnormal accelerated proliferation of the skin keratinocytes. In psoriasis, the precipitating event leads to immune cell activation. Our experiments showed that NFATc1 is needed for the development of psoriasis. It also showed that IL-10 is the link that enables NFAT
from altering the B cell compartment (eg Bregs) in order to affect inflammation. The important role of B cell in psoriasis is supported by the flared up psoriasis-like inflammation in mice that lack B cells. Bregs is a special type of B cells that regulate other B cells and T cells; tuning the immunological response through immunomodulatory cytokines.
N2  - Diese Arbeit befasst sich mit der Regulation und der Funktion des Transkriptionsfaktors NFATc1 (“nuclear factor of activated T-cells c1) in B-Lymphozyten. Hierzu wurde zum einen die transkriptionelle Kontrolle des Nfatc1-Gens in aktivierten B-Lymphozyten und zum anderen die Bedeutung dieses Faktors für die Wachstumskontrolle und Autoimmunität anhand verschiedener Modellsysteme analysiert.
Sechs verschiedene NFATc1-Isoformen können in B-Lymphozyten durch die Nutzung zweier verschiedener Promotoren, zweier Polyadenylierungsstellen und eines alternativen Splicings generiert werden. Wir zeigen hier, dass insbesondere die NF-kB Faktoren c-Rel und p50 eine essentielle Bedeutung für die starke Induktion des Promoters P1 und damit der Expression der kurzen Isoform NFATc1A in B-Zell-Rezeptor-stimulierten B-Zellen spielen. Interessanterweise zeigen NFATc1-defiziente B-Lymphozyten eine geschwächte Aktivierung der NF-kB-Faktoren, was auf eine enge Verknüpfung dieser zwei Signalwege hindeutet.
NFATc1-defiziente B-Lymphozyten weisen eine Aktivierungs- und Wachstumsschwäche auf (Bhattacharyya S., et.al.). Hier zeigen wir, dass die Überexpression von konstitutiv aktivem NFATc1A in B-Lymphozyten, insbesondere wenn dies im Kontext einer IRF4-Defizienz geschieht, zu einer verstärkten Expansion der B-Zellpopulation, insbesondere nach deren Aktivierung, führt. Dies belegt die kritische Bedeutung, die der wohldosierten Expressions- und Aktivierungskontrolle der NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten zukommt. 
Dies zeigt sich auch in einem Imiquimod-induziertem Psoriasis Mausmodell. Hier wird durch Applikation von Imiquimod auf die Haut eine der Schuppenflechte ähnelnde entzündliche Reaktion ausgelöst, die insbesondere durch eine stark verstärkte Proliferation der Keratinozyten gekennzeichnet ist.  Wir können zeigen, dass die NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten kritisch an dieser Reaktion beteiligt sind. Fehlt den B-Lymphozyten das NFATc1-Gen, so produziert eine Subpopulation, die sogenannten regulatorischen B-Zellen, verstärkt das immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch die entzündliche Reaktion fast komplett unterdrückt wird. Dies ähnelt vorhergehenden Beobachtungen, in denen wir zeigen konnten, dass auch in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose (EAE) die Immunreaktion durch den Verlust von NFATc1 in B-Zellen erheblich gelindert werden kann (Bhattacharyya S., et.al.).
KW  - Schuppenflechte
KW  - Maus
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - B-Lymphozyt
KW  - NFAT
KW  - NF-kB
KW  - Transgenic mice
KW  - Psoriasis
KW  - Cancer
KW  - B cells
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97905
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TY  - THES
A1  - Hein, Melanie
T1  - Functional analysis of angiogenic factors in tumor cells and endothelia
T1  - Funktionelle Analyse angiogener Faktoren in Tumorzellen und Endothelien
N2  - Tumor angiogenesis is essential for the growth of solid tumors as their proliferation and survival is dependent on consistent oxygen and nutrient supply. Anti-angiogenic treatments represent a therapeutic strategy to inhibit tumor growth by preventing the formation of new blood vessels leading to starvation of the tumor. One of the best characterized anti angiogenic therapeutics is the monoclonal antibody bevacizumab (Avastin), which targets and neutralizes VEGF leading to disruption of the VEGF signaling pathway. Until today, bevacizumab has found its way into clinical practice and has gained approval for treatment of different types of cancer including colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer and renal cell carcinoma. Signaling of VEGF is mediated through VEGF receptors, mainly VEGFR2, which are primarily located on the cell surface of endothelial cells. However, there has been evidence that expression of VEGF receptors can also be found on tumor cells themselves raising the possibility of autocrine and/or paracrine signaling loops. Thus, tumor cells could also benefit from VEGF signaling, which would promote tumor growth. The aim of this study was to investigate if bevacizumab has a direct effect on tumor cells in vitro. To this end, tumor cell lines from the NCI-60 panel derived from four different tumor types were treated with bevacizumab and angiogenic gene and protein expression as well as biological outputs including proliferation, migration and apoptosis were investigated. Most of the experiments were performed under hypoxia to mimic the in vivo state of tumors. Overall, there was a limited measurable effect of bevacizumab on treated tumor cell lines according to gene and protein expression changes as well as biological functions when compared to endothelial controls. Minor changes in terms of proliferation or gene regulation were evident in a single tumor cell line after VEGF-A blockade by bevacizumab, which partially demonstrated a direct effect on tumor cells. However, the overall analysis revealed that tumor cell lines are not intrinsically affected in an adverse manner by bevacizumab treatment. 
Besides the functional analysis of tumor cells, embryonic stem cell derived endothelial cells were characterized to delineate vascular Hey gene functions. Hey and Hes proteins are the best characterized downstream effectors of the evolutionary conserved Notch signaling pathway, which mainly act as transcriptional repressors regulating downstream target genes. Hey proteins play a crucial role in embryonic development as loss of Hey1 and Hey2 in mice in vivo leads to a severe vascular phenotype resulting in early embryonic lethality. The major aim of this part of the thesis was to identify vascular Hey target genes using embryonic stem cell derived endothelial cells utilizing a directed endothelial differentiation approach, as ES cells and their differentiation ability provide a powerful in vitro system to study developmental processes. To this end, Hey deficient and Hey wildtype embryonic stem cells were stably transfected with an antibiotic selection marker driven by an endothelial specific promoter, which allows selection for endothelial cells. ESC-derived endothelial cells exhibited typical endothelial characteristics as shown by marker gene expression, immunofluorescent staining and tube formation ability. In a second step, Hey deficient ES cells were stably transfected with doxycycline inducible Flag-tagged Hey1 and Hey2 transgenes to re-express Hey proteins in the respective cell line. RNA-Sequencing of Hey deficient and Hey overexpressing ES cells as well as ESC-derived endothelial cells revealed many Hey downstream target genes in ES cells and fewer target genes in endothelial cells. Hey1 and Hey2 more or less redundantly regulate target genes in ES cells, but some genes were regulated by Hey2 alone. According to Gene Ontology term analysis, Hey target genes are mainly involved in embryonic development and transcriptional regulation. However, the response of ESC-derived endothelial cells in regulating Hey downstream target genes was rather limited when compared to ES cells, which could be due to lower transgene expression in endothelial cells. The limited response also raises the possibility that target gene regulation in endothelial cells is not only dependent on Hey gene functions alone and thus loss or overexpression of Hey genes in this in vitro setting does not influence target gene regulation.
N2  - Tumorangiogenese ist essential für das Wachstum von Tumoren, da ihr Überleben und ihre Proliferation von einer dauerhaften Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen abhängig sind. Anti-angiogene Therapeutika inhibieren das Wachstum von Tumoren, indem sie die Bildung von neuen Blutgefäßen unterbinden, was zu einem „Verhungern“ des Tumors führt. Zu den am besten untersuchten anti-angiogenen Therapeutika gehört der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin), welcher den Wachstumsfaktor VEGF bindet und neutralisiert, was schließlich zu einer Unterbrechung des VEGF-Signalweges führt. Bevacizumab wird aktuell zur Behandlung verschiedener Tumortypen, unter anderem Colonkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Brustkrebs und Nierenzellkarzinom in der Praxis angewandt. VEGF bindet an VEGFR2 und andere VEGF-Rezeptoren, welche primär an der Oberfläche von Endothelzellen lokalisiert sind. Dennoch gibt es Hinweise, dass die Expression von VEGF-Rezeptoren nicht ausschließlich auf Endothelzellen begrenzt ist, sondern auch auf Tumorzellen nachgewiesen werden konnte. Die tumorale Expression von VEGF-Rezeptoren ermöglicht eine direkte autokrine und/oder parakrine Stimulation von Tumorzellen. Tumorzellen könnten dadurch selbst vom VEGF-Signalweg profitieren, was das Tumorwachstum fördern würde. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob Bevacizumab in vitro einen direkten Einfluss auf Tumorzellen ausübt. Dazu wurden verschiedene Tumorzelllinien von vier unterschiedlichen Tumortypen aus der NCI-60 Sammlung mit Bevacizumab behandelt und anschließend die Gen- und Proteinexpression von angiogenen Markern sowie biologische Funktionen wie Proliferation, Migration und Apoptose untersucht. Die Experimente wurden hauptsächlich unter Hypoxie durchgeführt, um den in vivo Status von Tumoren nachzuahmen. Insgesamt war ein direkter Effekt von Bevacizumab auf Tumorzellen im Vergleich zu Endothelzellen nicht nachweisbar. Gen- und Proteinexpression sowie biologische Funktionen waren in Tumorzellen nach Bevacizumab Behandlung bis auf wenige Ausnahmen unverändert. Geringe Veränderungen in der Proliferationsrate sowie in der Genregulation nach Inhibition von VEGF durch Bevacizumab konnten jeweils in einer einzelnen Zelllinie nachgewiesen werden, wodurch zumindest teilweise eine direkte Wirkung von Bevacizumab auf Tumorzellen gezeigt werden konnte. Dennoch zeigt die umfassende Analyse der verschiedenen Tumorzellen, dass die Bevacizumab-Behandlung sich insgesamt nicht negativ auf Tumorzellen auswirkt und diese nicht intrinsisch beeinflusst werden. 
Neben der funktionellen Analyse von Tumorzellen wurden Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen gewonnen wurden, charakterisiert, um anhand derer die Rolle der Hey Gene in der vaskulären Entwicklung näher zu bestimmen. Hey und Hes Proteine sind die am besten charakterisierten nachgeschalteten Effektoren des evolutionär konservierten Notch-Signalweges. Als Transkriptionsfaktoren sind Hey Proteine an der Regulation von Zielgenen beteiligt, wobei sie meist als transkriptionelle Repressoren fungieren. Hey Proteine spielen eine sehr wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, da der gemeinsame Verlust von Hey1 und Hey2 in Mäusen in vivo einen vaskulären Phenotyp hervorruft, der in sehr früher embryonaler Letalität endet. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, vaskuläre Hey Zielgene mit Hilfe von Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen differenziert wurden, zu identifizieren. Die Fähigkeit embryonaler Stammzellen verschiedene Zelltypen zu bilden, liefert dabei ein wertvolles in vitro System, um entwicklungsbiologische Prozesse zu analysieren. Dazu wurden Hey-defiziente und Hey-Wildtyp embryonale Stammzellen mit einem antibiotischen Selektionsmarker versehen, dessen Expression von einem Endothel spezifischen Promoter kontrolliert wird und daher die Selektion von Endothelzellen erlaubt. Die differenzierten Endothelzellen wiesen typische endotheliale Charakteristika auf, was durch Markergen-Expression, Immunfluoreszenzfärbungen und der Bildung netzwerkähnlicher Strukturen gezeigt werden konnte. In einem zweiten Schritt wurden Doxyzyklin-induzierbare Flag-markierte Hey1 bzw. Hey2 Konstrukte stabil in Hey-defiziente Zellen integriert, um Hey1 bzw. Hey2 kontrollierbar zu re-exprimieren. Die Zielgensuche mittels RNA-Seq Analyse lieferte viele Hey Zielgene in embryonalen Stammzellen, jedoch weitaus weniger Zielgene in ausdifferenzierten Endothelzellen. Zusammengefasst zeigten Hey1 und Hey2 eine redundante Regulation von Zielgenen in embryonalen Stammzellen, wobei einige wenige Gene alleine durch Hey2 reguliert wurden. Die Gen-Ontologie Analyse zeigte, dass diese Zielgene hauptsächlich an der embryonalen Entwicklung und der transkriptionellen Regulation von anderen Genen beteiligt sind. Dennoch war die Anzahl der Hey regulierten Gene in Endothelzellen weitaus geringer als in embryonalen Stammzellen. Das könnte auf eine geringere Transgen-Expression in Endothelzellen im Vergleich zu embryonalen Stammzellen zurückzuführen sein. Die weitaus geringere Anzahl an Hey Zielgenen in Endothelzellen lässt außerdem vermuten, dass die Regulation von Zielgenen in Endothelzellen nicht ausschließlich von der Funktion der Hey Gene abhängig ist. Die Regulation von Hey Zielgenen in Endothelien wurde durch den Verlust bzw. die Überexpression von Hey1 und Hey2 in dem angewandten in vitro System nur geringfügig beeinflusst.
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Angiogenese
KW  - Cancer
KW  - Angiogenesis
KW  - Bevacizumab
KW  - Monoklonaler Antikörper
KW  - Antiangiogenese
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93863
ER  -