TY - THES A1 - Aufmkolk, Sarah T1 - Super-Resolution Microscopy of Synaptic Proteins T1 - Hochauflösende Mikroskopie von Synaptischen Proteinen N2 - The interaction of synaptic proteins orchestrate the function of one of the most complex organs, the brain. The multitude of molecular elements influencing neurological correlations makes imaging processes complicated since conventional fluorescence microscopy methods are unable to resolve structures beyond the diffraction-limit. The implementation of super-resolution fluorescence microscopy into the field of neuroscience allows the visualisation of the fine details of neural connectivity. The key element of my thesis is the super-resolution technique dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) and its optimisation as a multi-colour approach. Capturing more than one target, I aim to unravel the distribution of synaptic proteins with nanometer precision and set them into a structural and quantitative context with one another. Therefore dSTORM specific protocols are optimized to serve the peculiarities of particular neural samples. In one project the brain derived neurotrophic factor (BDNF) is investigated in primary, hippocampal neurons. With a precision beyond 15 nm, preand post-synaptic sites can be identified by staining the active zone proteins bassoon and homer. As a result, hallmarks of mature synapses can be exhibited. The single molecule sensitivity of dSTORM enables the measurement of endogenous BDNF and locates BDNF granules aligned with glutamatergic pre-synapses. This data proofs that hippocampal neurons are capable of enriching BDNF within the mature glutamatergic pre-synapse, possibly influencing synaptic plasticity. The distribution of the metabotropic glutamate receptor mGlu4 is investigated in physiological brain slices enabling the analysis of the receptor in its natural environment. With dual-colour dSTORM, the spatial arrangement of the mGlu4 receptor in the pre-synaptic sites of parallel fibres in the molecular layer of the mouse cerebellum is visualized, as well as a four to six-fold increase in the density of the receptor in the active zone compared to the nearby environment. Prior functional measurements show that metabotropic glutamate receptors influence voltage-gated calcium channels and proteins that are involved in synaptic vesicle priming. Corresponding dSTORM data indeed suggests that a subset of the mGlu4 receptor is correlated with the voltage-gated calcium channel Cav2.1 on distances around 60 nm. These results are based on the improvement of the direct analysis of localisation data. Tools like coordinated based correlation analysis and nearest neighbour analysis of clusters centroids are used complementary to map protein connections of the synapse. Limits and possible improvements of these tools are discussed to foster the quantitative analysis of single molecule localisation microscopy data. Performing super-resolution microscopy on complex samples like brain slices benefits from a maximised field of view in combination with the visualisation of more than two targets to set the protein of interest in a cellular context. This challenge served as a motivation to establish a workflow for correlated structured illumination microscopy (SIM) and dSTORM. The development of the visualisation software coSIdSTORM promotes the combination of these powerful super-resolution techniques even on separated setups. As an example, synapses in the cerebellum that are affiliated to the parallel fibres and the dendrites of the Purkinje cells are identified by SIM and the protein bassoon of those pre-synapses is visualised threedimensionally with nanoscopic precision by dSTORM. In this work I placed emphasis on the improvement of multi-colour super-resolution imaging and its analysing tools to enable the investigation of synaptic proteins. The unravelling of the structural arrangement of investigated proteins supports the building of a synapse model and therefore helps to understand the relation between structure and function in neural transmission processes. N2 - Das Zusammenspiel von synaptischen Proteinen organisiert präzise die Funktion eines der komplexesten Organe, dem Gehirn. Die Vielfalt der molekularen Bestandteile, die diese neurologischen Beziehungen beeinflussen, verkomplizieren den Bildgebungsprozess, da die konventionellen Fluoreszenzmikroskopiemethoden Strukturen, die kleiner sind als das Beugungslimit, nicht auflösen können. Die Implementierung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in das Gebiet der Neurowissenschaften ermöglicht die Visualisierung feiner Details neurologischer Verbindungen. Die hochauflösende Mikroskopietechnik dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) und dessen Optimierung als Mehrfarbenanwendung sind Schlüsselelemente meiner Doktorarbeit. Mit der Möglichkeit mehr als ein Protein zu messen, ist es mein Ziel die Verteilung synaptischer Proteine mit nanometer Genauigkeit zu entschlüsseln und diese in ein strukturelles und quantitativ Verhältnis zueinander zu setzen. Aus diesem Grund wurden dSTORM spezifische Protokolle den Besonderheiten der jeweiligen neuronalen Proben angepasst und optimiert. In einem Projekt wird der neurotrophe Faktor BDNF (brain derived neurotrophic factor) in primären hippocampalen Neuronen untersucht. Mit einer Auflösungspräzision von unter 15 nm kann durch eine Färbung der Proteine Bassoon und Homer in der aktiven Zone die prä- und postsynaptische Seite identifiziert werden. Daraus resultierend können Kennzeichen für vollentwickelte Synapsen erfasst werden. Die Einzelmolekülsensitivität von dSTORM ermöglicht erstmalig die Messung von endogenem BDNF und zeigt, dass die BDNF Gruppierungen entlang von glutamatergen Präsynapsen verteilt sind. Diese Daten beweisen, dass hippocampale Neuronen die Möglichkeit haben, BDNF in der vollausgebildeten glutamatergen Präsynapse anzureichern und somit möglicherweise synaptische Plastizität beeinflussen. Die Verteilung des metabotropen Glutamatrezeptors mGlu4 wird in physiologischen Gehirnschnitten untersucht. Das ermöglicht den Rezeptor in seiner natürlichen Umgebung zu analysieren. Mit Zweifarben-dSTORM Messungen wird das räumliche Arrangement der mGlu4 Rezeptoren in der Präsynapse der parallelen Fasern der molekularen Schicht des Mauskleinhirns visualisiert und eine vier- bis sechsfache erhöhte Dichte des Rezeptors in der aktiven Zone, verglichen mit dem näheren Umfeld, aufgezeigt. Vorausgegangende funktionale Messungen zeigen, dass metabotrope Glutamatrezeptoren spannungsgesteuerte Calciumkanäle und Proteine, die in synaptische Vesikelgrundierung involviert sind, beeinflussen. Entsprechende dSTORM Daten deuten darauf hin, dass ein Teil der mGlu4 Rezeptoren mit dem spannungsgesteuerten Calciumkanal Cav2.1 auf einer Distanz von circa 60 nm korreliert ist. Diese Ergebnisse basieren auf der Verbesserung der direkten Analyse der Lokalisationsdatensätze. Werkzeuge, wie die Koordinaten basierte Korrelationsanalyse und die Nächste Nachbaranalyse von Clusterschwerpunkten werden sich ergänzend benutzt, um ein umfassendes Bild von Proteinverbindungen in der Synapse zu erzeugen. Die Grenzen und die Verbesserungsmöglichkeiten dieser Werkzeuge werden diskutiert, um die quantitative Analyse von Einzelmoleküldatensätzen voranzubringen. Die Durchführung von hochauflösender Mikroskopie an komplexen Proben, wie Gehirnschnitten, wird begünstigt durch die Maximierung der Aufnahmefläche in Kombination mit der Möglichkeit mehr als zwei Zielstrukturen zu visualisieren, um somit das Protein von primären Interesse in einen zellulären Zusammenhang zu setzen. Diese Herausforderung hat als Motivation gedient, ein Messprotokoll für korrelierte Strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) und dSTORM zu etablieren. Die Entwicklung der Visualisierungssoftware coSIdSTORM erleichtert die Kombination dieser beiden leistungsstarken, hochauflösenden Techniken, sogar wenn diese auf getrennten Mikroskopieaufbauten umgesetzt werden. Als ein Beispiel werden Synapsen, die zwischen den parallelen Fasern in der molekularen Schicht des Cerebellums und den Purkinje-Zellen ausgebildet werden, mit SIM identifiziert und das Protein Bassoon in diesen Präsynapsen wird mit einer nanometergenauen Präzision drei-dimensional mit dSTORM Messungen visualisiert. In meiner Arbeit habe ich den Fokus auf die Weiterentwickelung von hochauflösender Mehrfarbenmikroskopie und die damit verbundenen analytischen Werkzeuge gelegt, sodass die Untersuchung von synaptischen Proteinen ermöglicht wird. Die Herausarbeitung des strukturellen Arrangements der untersuchten synaptischen Proteine unterstützt den Aufbau eines Models der Synapse und erweitert somit das Verständnis des Zusammenhangs von Struktur und Funktion in neuronalen Übertragungsvorgängen. KW - Hochauflösende Mikroskopie KW - correlative methods KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Synaptische Proteine KW - Korrelative Mikroskopie KW - dSTORM KW - SIM KW - fluorescence KW - super-resolution microscopy KW - localization microscopy KW - two-color microscopy KW - synapse KW - synaptic proteins Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151976 ER - TY - JOUR A1 - Dietz, Mariana S. A1 - Hasse, Daniel A1 - Ferraris, Davide M. A1 - Göhler, Antonia A1 - Niemann, Hartmut H. A1 - Heilemann, Mike T1 - Single-molecule photobleaching reveals increased MET receptor dimerization upon ligand binding in intact cells JF - BMC Biophysics N2 - Background: The human receptor tyrosine kinase MET and its ligand hepatocyte growth factor/scatter factor are essential during embryonic development and play an important role during cancer metastasis and tissue regeneration. In addition, it was found that MET is also relevant for infectious diseases and is the target of different bacteria, amongst them Listeria monocytogenes that induces bacterial uptake through the surface protein internalin B. Binding of ligand to the MET receptor is proposed to lead to receptor dimerization. However, it is also discussed whether preformed MET dimers exist on the cell membrane. Results: To address these issues we used single-molecule fluorescence microscopy techniques. Our photobleaching experiments show that MET exists in dimers on the membrane of cells in the absence of ligand and that the proportion of MET dimers increases significantly upon ligand binding. Conclusions: Our results indicate that partially preformed MET dimers may play a role in ligand binding or MET signaling. The addition of the bacterial ligand internalin B leads to an increase of MET dimers which is in agreement with the model of ligand-induced dimerization of receptor tyrosine kinases. KW - single-molecule photobleaching KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - fluorescence KW - EGF receptor KW - rat hepatocytes KW - structural insights KW - Scatter factor KW - SEMA domain KW - hepatocyte-growth-factor KW - invasion protein-INLB KW - listeria-monocytogenes KW - tyrosine kinase KW - living cells KW - dimerization KW - MET receptor KW - Signal transduction Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121835 SN - 2046-1682 VL - 6 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Wolter, Steve T1 - Single-molecule localization algorithms in super-resolution microscopy T1 - Einzelmoleküllokalisierungsalgorithmen in der superauflösenden Mikroskopie N2 - Lokalisationsmikroskopie ist eine Methodenklasse der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, deren Methoden sich durch stochastische zeitliche Isolation der Fluoreszenzemission auszeichnen. Das Blinkverhalten von Fluorophoren wird so verändert, dass gleichzeitige Aktivierung von einander nahen Fluorophoren unwahrscheinlich ist. Bekannte okalisationsmikroskopische Methoden umfassen dSTORM, STORM, PALM, FPALM, oder GSDIM. Lokalisationsmikroskopie ist von hohem biologischem Interesse, weil sie die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops bei minimalem technischem Aufwand um eine Größenordnung verbessert. Der verbundene Rechenaufwand ist allerdings erheblich, da Millionen von Fluoreszenzemissionen einzeln mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden müssen. Der Rechen- und Implementationsaufwand dieser Auswertung hat die Verbreitung der superauflösenden Mikroskopie lange verzögert. Diese Arbeit beschreibt meine algorithmische Grundstruktur für die Auswertung lokalisationsmikroskopischer Daten. Die Echtzeitfähigkeit, d.h. eine Auswertegeschwindigkeit oberhalb der Datenaufnahmegeschwindigkeit an normalen Messaufbauten, meines neuartigen und quelloffenen Programms wird demonstriert. Die Geschwindigkeit wird auf verbrauchermarktgängigen Prozessoren erreicht und dadurch spezialisierte Rechenzentren oder der Einsatz von Grafikkarten vermieden. Die Berechnung wird mit dem allgemein anerkannten Gaussschen Punktantwortmodell und einem Rauschmodell auf Basis der größten Poissonschen Wahrscheinlichkeit durchgeführt. Die algorithmische Grundstruktur wird erweitert, um robuste und optimale Zweifarbenauswertung zu realisieren und damit korrelative Mikroskopie zwischen verschiedenen Proteinen und Strukturen zu ermöglichen. Durch den Einsatz von kubischen Basissplines wird die Auswertung von dreidimensionalen Proben vereinfacht und stabilisiert, um präzisem Abbilden von mikrometerdicken Proben näher zu kommen. Das Grenzverhalten von Lokalisationsalgorithmen bei hohen Emissionsdichten wird untersucht. Abschließend werden Algorithmen für die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf verbreitete Probleme der Biologie aufgezeigt. Zelluläre Bewegung und Motilität werden anhand der in vitro Bewegung von Myosin-Aktin-Filamenten studiert. Lebendzellbildgebung mit hellen und stabilen organischen Fluorophoren wird mittels SNAP-tag-Fusionsproteinen realisiert. Die Analyse des Aufbaus von Proteinklumpen zeigt, wie Lokalisationsmikroskopie neue quantitative Ansätze jenseits reiner Bildgebung bietet. N2 - Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost. However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time. In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data. I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them. I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units. The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model. I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples. I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities. Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems. I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging. KW - super-resolution microscopy KW - fluorescence KW - scientific computing KW - dSTORM KW - localization microscopy KW - PALM KW - 3D microscopy KW - two-color microscopy KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Bildauflösung KW - Bioinformatik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109370 ER - TY - THES A1 - Kusnezow, Wlad T1 - Entwicklung von Antikörper-Mikroarray : von Biophysik der Mikrospot-Reaktion bis zur Hochdurchsatzanalyse der Proteine T1 - Development of antibody microarray: from biophysics of microspot reaction to high throughput analysis of proteins N2 - Obwohl Protein-Mikroarrays ursprünglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repräsentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilität der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilität und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antikörper–Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen Lösungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begründete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antikörper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie für deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antikörpern für verschiedene Oberflächen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antikörper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberflächen am besten geeignet sind. Diese Oberfläche ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde für alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der nötigen Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und für den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM ermöglicht auf eine phänomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensität oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein müssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Berücksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die phänomenologischen TCM-Werte interpretieren zu können und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, für die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl für konventionelle als auch für Mikrospot-Immunoassays ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für einen typischen Standard-Antikörper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabhängige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegenübersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen fürs Design und die zukünftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antikörper-Mikroarray ein kritischer Punkt für die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Größe eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosität des Inkubationspuffers und Mischintensität die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Größenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gewährleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinität, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter berücksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivität von Antikörper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der etablierten Antikörper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen für die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet für eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivitäten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antikörper-Mikroarrays sowohl für eine markierte Antigenmischung als auch für komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren öffnet zusätzliche Möglichkeiten für schnelle, kostengünstige und unbeschränkt erweiterungsfähige Mikrospot-Immunoassays. N2 - Although protein microarrays are superficially similar to DNA microarrays, the conversion of microarray technology to the protein world still represents a big technological challenge because of the enormous physicochemical variability and relatively low stability of proteins as well as complex microspot kinetics. Therefore, the intention of developing the concept of antibody microarray into a really functioning tool requires a multiplicity of technological solutions as well as a systematic and physically justified approach in this technological development. These were essentially the two most important goals while developing antibody microarrays. Aiming to establish antibody microarrays in principle und to find optimal antibody immobilization chemistry, several chemical coatings of glass slides, antibody spotting conditions for different surfaces, different blocking procedures and strategies for slides storage were analysed and optimised in the first part of this dissertation. Subsequently, a set of commercial and home-made chemically coated slides was compared under these optimized conditions. As a main result, manufacturing of antibody microarrays was established. Among other things, the epoxysilan surface was found to be best suitable for fabrication of antibody microarrays in course of this systematic analysis. This kind of chemical coating is nowadays one of the most popular in the protein microarray field and it was also used in all other studies presented here. The development of antibody microarray technology in the last years demonstrated substantial difficulties trying to achieve the required sensitivity and reproducibility. In order to get the bottom of this issue and to be able to examine microspot kinetics experimentally, the so-called two-compartment model (TCM) was modified and adapted for the case of microrrays in this work. TCM enables a quantitative experimental analysis of microspot kinetics with regard to effects of mass transport. It is a phenomenological model, so that one does not need to know density of binding sites or any parameters of mass transport such as diffusion coefficient or mixing intensity. To be able to interpret the phenomenological reaction descriptors of TCM and to investigate reaction mechanism, some relevant theoretical models were also adapted for the case of microspot reaction as well as were mathematically joined with the modified TCM. Our theory is the first mathematical tool of this sort in the microarray technology and it has therefore a lot of potential to be applied also in the other related techniques such as DNA or peptide microarrays. Additionally, another uniform theoretical model was developed in this work. It enables a kinetic simulation of different reaction regimes for the case of conventional as well as microspot immunoassays. Long-lasting and strongly mass transport dependent microspot kinetics was described in this work, both theoretically and experimentally. The attainment of the thermodynamic equilibrium in microarrays may require many hours, days or even weeks due to a relatively slow ligand transport to spots. A new physical concept, which represents the opposite view to the today’s most widespread concept, so called ambient analyte theory, could be formulated in consequence of this investigation. Also, we could draw many consequences for design and future development of this relatively new techique. As a logical consequence of the mass transport limited reactions, proper assay design is cruicial for performance of antibody microarrays. In the course of our experimental and/or theoretical considerations, it was shown that a number of general parameters such as size of a spot, spotting pattern, incubation geometry, volume and concentration of a sample, viscosity of incubation buffer and mixing intensity could altogether affect signal velocity by many orders of magnitude. If the maximum rate of mass transport in a microarray procedure is ensured, then also the maximum binding capacity of spots could be achieved by adjusting such parameters as density of binding sites, binding affinity, incubation time etc. The same factors should be also considered for washing and detection steps in a kinetically relevant design of microarray procedure. Optimizing these parameters, the performance of antibody microarrays as applied for protein profiling of clinical specimens could be strongly improved. A significant improvement of the antibody microarray performance as applied for protein profiling of clinical blood samples could be also achieved in a further study aiming to analyze different detection approaches. A number of labeling substances containing either NHS (N-hydroxysuccinimide) or ULS (universal linkage system) reactive groups was examined within three general detection procedures: 1) direct sample labeling with fluorescence dyes, 2) sample labelling with biotin- containing substances with subsequent detection using fluorescently labeled extravidin and 3) sample labelling with fluorescein-substances with detzection by anti-fluorescein. Based on the experience of the previous kinetic investigations, kinetic behavior of the applied test system was first analyzed in this study to find optimal incubation conditions. Also, optimal blood plasma labelling concentration for every analyzed substance was determined in this study. The indirect detection approaches (biotin/extravidin and fluorescein/anti-fluorescein) resulted in substantially better signal-to-noise ratios as compared to direct fluorescent labeling. Some substances such as biotin-ULS or fluorescein-NHS were found to be best suitable for microarray-based protein profiling of blood plasma. Using the established antibody microarrays, sensitivities in the fM range could be attained in this dissertation both for a labeled mix of antigens as well as for complex clinical samples. Many low abundant proteins as for example cytokines, which are normally present in a pM-fM concentration in the blood, was detected in this work with very high signal-to-noise ratios. The approach described here opens additional possibilities for fast, economical and unrestricted multiplexing microspot immunoassays. KW - Microarray KW - Antikörper KW - Antikörper-Mikroarray KW - Oberflächenchemie KW - Kinetik KW - Fluoreszenz KW - Blutserum KW - antibody microarray KW - surface chemistry KW - kinetics KW - fluorescence KW - serum Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22534 ER -