TY  - THES
A1  - Waltenberger, Constanze Ricarda Maria
T1  - Virtuelles Screening nach einer neuen Inhibitorklasse der Enoyl-ACP-Reduktase InhA aus Mycobacterium tuberculosis
T1  - Virtual screening for a new inhibitor class of the enoyl-ACP-reductase InhA of Mycobacterium tuberculosis
N2  - Die Zahl der Tuberkuloseerkrankungen ist in den letzten Jahrzehnten weltweit gestiegen. Da es an innovativen Antituberkulotika mangelt, werden nach wie vor Medikamente der ersten Generation eingesetzt. Das wachsende Problem sind multi-resistente und extrem-resistente Bakterienstämme, die kaum oder gar nicht auf die medikamentöse Therapie ansprechen. Charakteristisch für M. tuberculosis ist eine dicke Zellwand. Der Aufbau der Zellwand ermöglicht es dem Bakterium in den Makrophagen zu persistieren und sich dort zu vermehren. Die Zellwand ist reich an Mykolsäuren und so wenig durchlässig für Fremdstoffe. Das mykobakterielle Zellwandskelett kann man in zwei Teile unterteilen, den Zellwandkern und die äußere Lipidhülle. Die freien Lipide der äußeren Lipidhülle dienen als Signalmoleküle im Krankheitsverlauf und interkalieren mit den Mykolsäuren des Zellwandkerns. M. tuberculosis besitzt für die Fettsäurebiosynthese zwei Enzymkomplexe: Die Typ-I-Fettsäuresynthase, die auch in Säugetieren zu finden ist, produziert Fettsäuren von C16- bis C26-Kettenlänge, die dann in der Typ-II-Fettsäuresynthase (FAS-II) zu Meromykolsäuren verlängert werden. Im Synthesezyklus des FAS-II sind mehrere monofunktionale Enzyme hintereinander geschaltet. Wird eines dieser Enzyme in seiner Funktion gestört, kumulieren Zwischenprodukte und benötigte Zellwandlipide können nicht synthetisiert werden. In der Folge wird die Zellwand instabil und das Bakterium stirbt. Die mykobakterielle Lipidbiosynthese ist somit ein ideales Target für die Entwicklung neuer Antituberkulotika. Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Inhibitorklasse des FAS-II Enzyms InhA des M. tuberculosis mittels virtuellem Screening zu finden. Für das virtuelle Screening wurden drei aufeinander aufbauende Pharmakophorhypothesen entwickelt und mit diesen zwei unabhängige Datenbanken durchsucht. Als Grundlage für die Berechnungen des virtuellen Screenings diente die PDB Röntgenkristallstruktur 2h7m mit dem Liganden 1-Cyclohexyl-N-(3,5-dichlorophenyl)-5-oxopyrrolidin-3-carboxamid. Für die Erstellung der Pharmakophorhypothesen wurden zuerst die Strukturen des Enzyms mit und ohne Ligand bezüglich ihrer Konformationsunterschiede vor allem im Bereich der Bindetasche analysiert. Als nächstes wurden die Wechselwirkungen des Liganden mit den Aminosäuren der Bindetasche und dem Cofaktor näher analysiert und die verschiedenen Wechselwirkungsarten hinsichtlich ihrer Relevanz für eine inhibitorische Aktivität beurteilt. Schließlich wurde eine Bindetaschenanalyse durchgeführt und Hotspots für unterschiedliche chemische Funktionalitäten berechnet. Für das Datenbankenscreening wurden das ZINC 'drug-like' Subset (2005) und CCGs MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection verwendet, beides Datenbanken exklusiv kommerziell erhältlicher Verbindungen. Das ZINC 'drug-like' Subset wurde über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert. Von den verbleibenden Verbindungen wurde eine Konformerendatenbank berechnet. Die MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection lag bereits als Konformerendatenbank vor und wurde für das Screening 'as-is' verwendet. Mit den Pharmakophorhypothesen I und II wurde das reduzierte ZINC 'drug-like' Subset gescreent. Für die Treffer wurden Fingerprints berechnet, sie danach mithilfe des Tanimotokoeffizienten nach ihrer Ähnlichkeit in Cluster eingeteilt und visuell analysiert; 149 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die MOE Konformerendatenbank wurde ebenso über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert und mit der Pharmakophorhypothese III gescreent, 28 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die Dockingsimulationen wurden mit den Programmen MOE Dock und Autodock durchgeführt. Die Ergebnisse wurden numerisch ausgewertet und innerhalb der Bindetasche relativ zur jeweiligen zugrunde liegenden Pharmakophorhypothese visuell analysiert; 27 Substanzen wurden schließlich für die Testungen ausgewählt. Die Testungen erfolgten mit einem enzymatischen Assay und einem Assay an attenuierten M. tuberculosis Für die Etablierung des enzymatischen Assays wurde das Enzym InhA mittels Vektortransformation in E. coli überexprimiert und säulenchromatographisch aufgereinigt. Das Substrat 2-trans-Octenoyl-Coenzym A wurde synthetisiert. Von den 27 ausgewählten Substanzen waren 9 im Handel erhältlich und wurden schließlich auf ihre inhibitorische Aktivität getestet. Es wurden ein Thiazolidin-2,4-dion, ein 2-Thioxoimidazolidin-4-on und ein Sulfonamid als aktive Substanzen gefunden.
N2  - Worldwide the number of tuberculosis cases has increased in the decades. Since there is a lack of innovative anti-tuberculosis drugs, the first-generation drugs are still used as gold standard. Therefore, strains of mycobacteria, that respond only little or not at all to drug therapy, picture a growing problem. Characteristic of M. tuberculosis is its thick cell wall. The structure of the cell wall allows the bacterium to persist in the macrophages and to multiply there. The cell wall is rich in mycolic acids and, in this, little permeable to xenobiotics. The mycobacterial cell wall skeleton can be divided into two parts, the cell wall core and the outer lipid envelope. The free lipids of the outer lipid envelope serve as signalling molecules in course of the disease, and intercalate with the mycolic acids of the cell wall core. For fatty acid biosynthesis M. tuberculosis has two enzyme complexes: the type I fatty acid synthase, which is also found in mammals, produces fatty acids of C16 to C26 chain length; subsequently, these are extended to meromycolic acids in the type II fatty acid synthase (FAS II). The synthesis cycle of FAS-II consists of mono-functional enzymes that build up on each other. If one of these enzymes is disturbed in its functionality, intermediates accumulate and required cell wall lipids can not be synthesized. As a result, the cell wall turns unstable and the bacterium dies. Therefore, the mycobacterial lipid biosynthesis is an ideal target for developing new antituberculous drugs. The aim of this study was to develop a new inhibitor class of the mycobacterial FAS-II enzyme InhA by means of virtual screening. For the virtual screening three consecutive pharmacophore hypotheses were developed, and with these two independent databases were screened. As a basis for the calculations of the virtual screening the PDB X-ray crystal structure 2h7m with the ligand 1-cyclohexyl-N-(3,5-dichlorophenyl)-5-oxopyrrolidine-3-carboxamide was used. In order to construct the pharmacophore hypotheses, first, the structures of the enzyme with and without a ligand were analyzed for their conformational differences, in particular with respect to the geometry of the binding pocket. Next, the interactions of the ligand with the amino acids of the binding pocket and with the cofactor were analyzed in detail; thereby, the different types of interactions were assessed in terms of their relevance for the inhibitory activity. Finally, a hot spot analysis of the active site was carried out for different chemical functionalities. The ZINC 'drug-like' subset (2005) and CCG's 2006 Vendor MOE 3D compound collection were used for the database screening, both being databases of commercially available compounds. The ZINC 'drug-like' subset was numerically reduced by a hierarchical filter customized for InhA; of the remaining compounds a database of conformers was calculated. The MOE 2006 Vendor 3D Compound Collection was already available as a conformer database. The reduced ZINC 'drug-like' subset was screened with the pharmacophore hypotheses I and II. After calculating fingerprints the hits were clustered according to their similarity using the Tanimoto coefficient and visually analyzed; 149 compunds were selected for the docking simulations. The MOE conformers database also was numerically reduced by a hierarchical filter customized for InhA, and then screened with the pharmacophore hypothesis III, 28 compounds were chosen for the docking simulations. The docking simulations were performed with the programs MOE Dock and Autodock. The results were evaluated numerically, and analyzed visually within the binding pocket relative to the respective underlying pharmacophore hypothesis. Finally, 27 substances were selected for testing. The tests were carried out using an enzymatic assay and an assay on attenuated M. tuberculosis. For establishing the enzymatic assay, the enzyme InhA was overexpressed using vector transformation into E. coli and purified by column chromatography. The substrate 2-trans-octenoyl-coenzyme A was synthesized. Of the 27 selected compounds 9 substances were commercially available and were tested for their inhibitory activity. A thiazolidine-2,4-dione, a 2-thioxoimidazolidine-4-one and a sulfonamide were found to be active.
KW  - Screening
KW  - Tuberkelbakterium
KW  - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase
KW  - Inhibitor
KW  - Virtuelles Screening
KW  - Enoyl-ACP-Reduktase
KW  - InhA
KW  - neue Inhibitorklasse
KW  - Tuberkulose
KW  - Virtual Screening
KW  - enoyl-ACP-reductase
KW  - InhA
KW  - new inhibitor class
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73736
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kesetovic, Diana
T1  - Synthesis and biological testing of potential anti-tuberculosis drugs targeting the β-ketoacyl ACP synthase
T1  - Synthese und biologische Untersuchung von β-ketoacyl-ACP-Synthase-Inhibitoren als potentielle Antituberkulotika
N2  - With 9.6 million new cases and 1.5 million deaths in 2014, tuberculosis (TB) is alongside with AIDS the most deadly infection.‎ Foremost, the increased prevalence of resistant strains of M. tuberculosis among the TB-infected population represents a serious thread. Hence, in the last decades, novel drug targets have been investigated worldwide. So far a relatively unexplored target is the cell wall enzyme β-ketoacyl-ACP-synthase “KasA”, which plays a crucial role in maintaining the membrane impermeability and hence the cell ability to resist to the immune response and drug therapy. KasA is a key enzyme in the fatty acid synthase “FAS-II” elongation cycle, responsible for the extension of the growing acyl chain within the biosynthesis of precursors for the most hydrophobic constituents of the cell wall – mycolic acids. Design of the novel KasA inhibitors, performed in the research group of Prof. Sotriffer by C. Topf and B. Schaefer, was based on the recently published crystal structure of KasA‎ in complex with its known inhibitor thiolactomycin (TLM). Considering the essential ligand-enzyme interactions, a pharmacophore model was built and applied in the virtual screening of a modified ZINC database. Selected hits with the best in silico affinity data have been reported by Topf‎ and Schaefer‎.

In this work, two of the obtained hits were synthesized and their structure was systematically varied. First, a virtual screening hit, chromone-2-carboxamide derivative GS-71, was modified in the amide part. Since the most of the products possessed a very low solubility in the aqueous buffer medium used in biological assays, polar groups (nitro, succinamidyl and trimethyl-amino substituent in position 6 of the chromone ring or hydroxyl group on the benzene ring in the amide part have been inserted to the molecule. Further variations yielded diaryl ketones, diaryl ketone bearing a succinamidyl substituent, carboxamide bearing a methylpiperazinyl-4-oxobutanamido group and methyl-malonyl ester amides. Basically, the essential structural features necessary for the ligand-enzyme interactions have been maintained. The latter virtual screening hit, a pyrimidinone derivative VS-8‎ was synthesized and the structure was modified by substitution in positions 2, 4, 5 and 6 of the pyrimidine ring. Due to autofluorescence, detected in most of the products, this model structure was not further varied. 

Simultaneously, experiments on solubilization of the first chromone-2-carboxamides with cyclodextrins, cyclic oligosacharides known to form water-soluble inclusion complexes, were performed. Although the assessed solubility of the chromone 3b/DIMEB (1:3) mixture exceeded 14-fold the intrinsic one, the achieved 100 µM solubility was still not sufficient to be used as a stock solution in the binding assay. The experiments with cyclodextrin in combination with DMSO were ineffective. Owing to high material costs necessary for the appropriate cyclodextrin amounts, the aim focused on structural modification of the hydrophobic products.

Precise structural data have been obtained from the solved crystal structures of three chromone derivatives: the screening hit GS-71 (3b), its trimethylammonium salt (18) and 6-nitro-substituted N-benzyl-N-methyl-chromone-2-carboxamide (9i). The first two compounds are nearly planar with an anti-/trans-rotamer configuration. In the latter structure, the carboxamide bridge is bent out of the chromone plane, showing an anti-rotamer, too. Considering the relatively low partition coefficient of compound 3b (cLogP = 2.32), the compound planarity and correlating tight molecular packing might be the factors significantly affecting its poor solubility. 
Regarding the biological results of the chromone-based compounds, similar structure-activity correlations could be drawn from the binding assay and the whole cell activity testing on M. tuberculosis. In both cases, the introduction of a nitro group to position 6 of the chromone ring and the presence of a flexible substituent in the amide part showed a positive effect. In the binding study, the nitro group at position 4 on the N-benzyl residue was of advantage, too. The highest enzyme affinity was observed for N-(4-nitrobenzyl)-chromone-2-carboxamide 4c (KD = 34 µM), 6-nitro substituted N-benzyl-chromone-2-carboxamide 9g (KD = 40 µM) and 6‑nitro-substituted N-(4-nitrobenzyl)-chromone-2-carboxamide 9j (KD = 31 µM), which could not be attributed to the fluorescence quenching potential of the nitro group. The assay interference potential of chromones, due to a covalent binding on the enzyme sulfhydryl groups, was found to be negligible at the assay conditions. Moderate in vivo activity was detected for 6‑nitro-substituted N-benzyl-chromone-2-carboxamide 9g and its N-benzyl-N-methyl-, N‑furylmethyl-, N-cyclohexyl- and N-cyclohexylmethyl derivatives 9i, 9d, 9e, 9f, for which MIC values 20 – 40 µM were assessed. Cytotoxicity was increased in the N‑cyclohexylmethyl derivative only. None of the pyrimidine-based compounds showed activity in vivo. The affinity of the model structure, VS-8, surpassed with KD = 97 µM the assessed affinity of TLM (KD = 142 µM). 

Since for the model chromone compound GS-71 no reliable KasA binding data could be obtained, a newly synthesized chromone derivative 9i was docked into the KasA binding site, in order to derive correlation between the in silico and in vitro assessed affinity. For the 6‑nitro-derivative 9i a moderate in vivo activity on M. tuberculosis was obtained. The in silico predicted pKi values for TLM and 9i were higher than the corresponding in vitro results, maintaining though a similar tendency, i.e., the both affinity values for compound 9i (pKi predicted = 6.64, pKD experimental = 4.02) surpassed those obtained for TLM (pKi predicted = 5.27, pKD experimental = 3.84). Nevertheless, the experimental pKD values are considered preliminary results. 

The binding assay method has been improved in order to acquire more accurate data. Owing to the method development, limited enzyme batches and solubility issues, only selected compounds could be evaluated. The best hits, together with the compounds active on the whole cells of M. tuberculosis, will be submitted to the kinetic enzyme assay, in order to confirm the TLM-like binding mechanism. Regarding the in vivo testing results, no correlations could be drawn between the predicted membrane permeability values and the experimental data, as for the most active compounds 9e  and 9f, a very low permeability was anticipated (0.4 and 0.7 %, respectively). Further biological tests would be required to investigate the action- or transport mode.
N2  - Mit 9.6 Millionen Neuerkrankungen und 1.5 Millionen Todesfällen im Jahr 2014 ist Tuberkulose (TB) neben AIDS die häufigste Todesursache unter Infektionskrankheiten.‎ Insbesondere die zunehmende Verbreitung resistenter Stämme von M. tuberculosis stellt eine ernste Gefahr dar. In den letzten Jahrzehnten wurde daher weltweit nach neuen möglichen Wirkstoff-Zielen gesucht. Bisher noch relativ unerforschtes Ziel ist das Zellwand-Enzym β Ketoacyl-ACP-Synthase "KasA", das eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Membran-Dichtigkeit spielt, und somit den Zellen ermöglicht, gegen den Immunabwehr und Arzneimitteltherapie Resistenz zu zeigen. KasA ist ein Schlüsselenzym in der Fettsäure-Synthase-(FAS-II)-Elongationsrunde, die für die Erweiterung der wachsenden Acylkette während der Biosynthese der Vorstufen der hydrophobesten Zellwand-Bestandteilen – der Mykolsäuren, verantwortlich ist. Das Design der neuen KasA-Hemmer, das im Arbeitskreis von Prof. Sotriffer von C. Topf und B. Schäfer durchgeführt wurde, basiert auf der kürzlich veröffentlichten Kristallstruktur von KasA im Komplex mit seinem bekannten Inhibitor Thiolactomycin (TLM)‎. In Anbetracht der essentiellen Ligand-Enzym-Wechselwirkungen wurde ein Pharmakophor-Modell erstellt und im virtuellen Screening einer modifizierten ZINC-Datenbank angewendet. Die ausgewählten “Hits“ mit den besten In-silico-Affinitätsdaten wurden in den Doktorarbeiten von Topf‎ und Schaefer‎ veröffentlicht.

In Rahmen dieser Arbeit wurden zwei der erhaltenen “Hits“ synthetisiert und ihre Struktur systematisch variiert. Erste Modellstruktur, das Chromon-2-Carboxamid-Derivat GS-71‎. wurde zunächst in dem Amid-Rest modifiziert. Da die meisten Produkte (3a-p, 4a-k) eine sehr geringe Löslichkeit im wässrigen Puffermedium aufwiesen, wurden polare Gruppen in das Molekül eingefügt (Nitro, Succinamidyl- und Trimethyl-Amino-Substituenten in der 6 Stellung des Chromon-Rings, oder eine Hydroxyl-Gruppe am Benzolring im Amid-Teil. Weitere Variationen ergaben Diarylketone, ein Diarylketon mit der Succinamidyl Kette, ein Carboxamid mit dem Methylpiperazinyl-4-oxobutanamido-Substituenten und Methyl-Malonyl-Ester-Amide. Grundsätzlich wurden alle Strukturmerkmale notwendig für die Ligand-Enzym-Wechselwirkungen beibehalten. Die letztere Modellstruktur aus dem virtuellen Screening, das Pyrimidinon Derivat VS-8‎ wurde synthetisiert, und die Struktur wurde durch Substitution in den Positionen 2, 4, 5 und 6 des Pyrimidin-Rings modifiziert. Wegen Eigenfluoreszenz, detektiert in den meisten Produkten, wurde diese Modellstruktur nicht weiter variiert. 

Gleichzeitig wurden Experimente zur Solubilisierung der ersten Chromon-2-Carbonsäureamide mit Cyclodextrinen, cyclischen Oligosacchariden, die bekanntlich wasserlösliche Einschlusskomplexe bilden, durchgeführt. Obwohl die gemessene Löslichkeit des 3b/DIMEB (1:3)-Gemisches die intrinsische Löslichkeit um das 14-fache überschritt, war die erzielte Löslichkeit von 100 µM noch nicht ausreichend, um diese Lösung als Stammlösung im Assay zu verwenden. Die Experimente mit Cyclodextrin in Kombination mit DMSO waren unproduktiv. Aufgrund der hohen Materialkosten für die benötigten Cyclodextrinmengen wurden die Löslichkeit-Tests an dieser Stelle abgebrochen und eine strukturelle Modifizierung der hydrophoben Produkte stand in Vordergrund des Interesses.

Genaue Strukturdaten wurden aus den aufgeklärten Kristallstrukturen von drei Chromon-Derivaten, der Modellstruktur GS-71 (3b), seiner Trimethylammoniumsalz (18) und dem 6‑Nitro-substituierten N-Benzyl-N-methyl-Chromon-2-Carboxamid (9i), erhalten. Die ersten beiden Verbindungen sind mit einer anti-/trans-Rotamer Konfiguration fast planar. Die Carbonsäureamid-Brücke der letzteren Struktur, die ebenso ein anti-Rotamer darstellt, wird aus der Chromon Ebene gebogen. Angesichts des relativ geringen Verteilungskoeffizientes der Verbindung 3b (clogP = 2.32), die Ebenheit des Moleküls und das damit verbundene enge Molekülpackung könnten die wesentlich schlechtere Löslichkeit begründen. 
In Bezug auf die biologischen Ergebnisse der Chromon-basierten Verbindungen, ähnliche Struktur-Aktivitäts-Beziehungen können aus dem Bindungs-Assay, sowie aus dem Ganzzellaktivitätstests auf M. tuberculosis gezogen werden. In beiden Fällen zeigte die Einführung einer Nitrogruppe in die Position 6 des Chromon-Rings und das Vorhandensein eines flexiblen Substituents im Amidrest einen positiven Effekt. In dem Bindungs-Assay war die Nitrogruppe in Position 4 des N-Benzyl-Rests ebenso vorteilhaft. Die höchste Enzymaffinität wurde im Falle des N-(4-Nitrobenzyl)-Chromon-2-Carboxamid 4c (KD = 34 µM), des substituierten 6-nitro-N-Benzyl-Chromon-2-Carboxamid 9g (KD = 40 µM) und des 6-Nitro-substituierten N-(4-Nitrobenzyl)-Chromon-2-Carboxamid 9j (KD = 31 µM), beobachtet, allerdings konnte sie nicht dem Fluoreszenzlöschungspotenzial der Nitrogruppe zugeschrieben werden. Das Assay-Störpotential der Chromonverbindungen aufgrund einer kovalenten Bindung an die Sulfhydryl-Gruppen des Enzyms zeigte sich in den Assay-Bedingungen als vernachlässigbar. Moderate in vivo-Aktivitäten wurden für den 6-nitro substituierten N‑Benzyl-Chromon-2-Carboxamid 9g und dessen N-Benzyl-N-Methyl- (9i), N‑Furfurylmethyl-(9d), N-Cyclohexyl- (9e) und N-Cyclohexylmethyl- (9f) Derivate, für denen die MIC-Werte zwischen 20 und 40 µM erhalten wurden (siehe Tab. 17). Die Zytotoxizität wurde erhöht nur im Falle des N-Cyclohexylmethyl Derivates. Keine der Pyrimidin-basierten Verbindungen wies eine Aktivität in vivo auf. Die KasA-Affinität der Modellstruktur VS-8 übertraf mit KD = 97 µM die gemessene Affinität von TLM (KD = 142 µM).

Da für die Modell Chromon-Verbindung GS-71 keine zuverlässigen KasA Bindungsdaten erhalten werden konnten, ein neu-synthetisierte Chromon-Derivat 9i wurde in die KasA Bindungsstelle gedockt, um die Korrelation zwischen den In-silico- und In-vitro-Affinitätswerten abzuleiten. Für den 6-Nitroderivat 9i wurde eine mäßige Aktivität in vivo auf M. tuberculosis bestimmt. Die in silico-vorhergesagten pKi-Werte für TLM und 9i waren allgemein höher als die entsprechenden experimentellen Ergebnisse. Sie bewiesen allerdings eine ähnliche Tendenz, d.h. die beiden Affinitätswerte für die Verbindung 9i (pKi vorhergesagt = 6.64, pKD experimentell = 4.02) übertrafen die Werte von TLM (pKi vorhergesagt = 5.27, pKD experimentell = 3.84). Dennoch sind die experimentellen Affinitätsdaten nur als vorläufige Resultate zu betrachten, solange die Bindungsweise mittels des kinetischen Enzymassays verifiziert wird.

Die Assay-Methode wurde verbessert, um zuverlässigere Daten zu erhalten. Aufgrund der Verfahrensentwicklung, den limitierten Enzymchargen und Löslichkeitsprobleme konnten nur ausgewählte Verbindungen bewertet werden. Die besten “Hits“, zusammen mit den Verbindungen, die auf den ganzen Zellen von M. tuberculosis aktiv waren, werden dem kinetischen Enzymtest vorgelegt. In Bezug auf die In-vivo-Testergebnisse, es konnten keine Korrelationen zwischen den vorhergesagten Membranpermeabilität-Werten und den experimentellen Daten gezogen werden, da bei den wirksamsten Verbindungen 9e und 9f nur eine sehr geringe Permeabilität erwartet wurde (zu 0.4 und 0.7 %). Weitere biologische Tests wären erforderlich, um das Wirkungsmechanismus oder die Transportweise zu untersuchen.
KW  - Tuberkelbakterium
KW  - Inhibitor
KW  - Ketoacyl-ACP-Synthase <beta->
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Tuberculosis
KW  - Enzyme inhibitor
KW  - Synthesis
KW  - Ketoacyl-ACP-synthase
KW  - Chromone
KW  - Pyrimidinone
KW  - Tuberkulose
KW  - Synthese
KW  - Zellwand
KW  - Enzym
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131301
ER  - 
TY  - THES
A1  - Loeff, Rebekka Magdalena
T1  - Screening auf multiresistente Erreger, Erhebung von Tuberkulose- und Impfstatus sowie sonstiger meldepflichtiger Infektionskrankheiten bei Geflüchteten am Universitätsklinikum Würzburg im Zeitraum vom 1.11.2015 bis 30.04.2016
T1  - Screening for Multidrug-Resistant Organisms, status of tuberculosis, vaccination and other infectious diseases in refugees at the University Hospital Würzburg from November 1, 2015 to April 30, 2016
N2  - Hintergrund: Geflüchtete haben ein hohes Risiko, Multiresistente Erreger (MRE) zu tragen. Infektionen mit MRE (Multiresistente Gram-negative Bakterien [MRGN] und Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus [MRSA]) sind mit einer erhöhten Mortalität, Krankenhausaufenthaltsdauer und Krankenhauskosten assoziiert. Der Einfluss von prädisponierenden Faktoren für eine Besiedlung mit MRE ist für Geflüchtete noch unzureichend erforscht. Kenntnisse über prädisponierende Faktoren können helfen, Infektionsschutzmaßnahmen für Geflüchtete in Krankenhäusern anzupassen.
Methodik: Von November 2015 bis April 2016 wurden 134 Geflüchtete am Universitätsklinikum Würzburg auf MRE im Nasen-/Rachen- (MRSA), Rektal- (MDRGN-Enterobacteriaceae, MDRGN-Pseudomonas aeruginosa) und Haut-/Rachenabstrich (MDRGN-Acinetobacter baumannii) gescreent.
Ergebnisse: 62,7% von 134 gescreenten Flüchtlingen waren männlichen Geschlechts und das Durchschnittsalter lag bei 19 Jahren [IQR: 7–31]. 23,9% (n=32) zeigten einen positiven MRE-Befund (MRSA: 3,4 % von 118, 2MDRGN-Neopäd: 19,3 % von 57, 3MDRGN: 13,6 % von 125, 4MDRGN: 0 % von 125). Es wurden 25 Escherichia coli (98,3%), 3 Klebsiella pneumoniae (10,7%) und keine positiven Befunde auf Pseudomonas aeruginosa oder Acinetobacter baumannii gefunden. 3 Geflüchtete (9,6%) zeigten eine Mehrfachbesiedlung und 2 Geflüchtete (6,2%) wiesen eine durch MRE bedingte Infektionserkrankung auf (submandibulärer Abszess, Pyelonephritis). Bei 94 Geflüchteten mit vollständigem Screening waren Geflüchtete mit positivem MRE-Befund im Vergleich zu Geflüchteten mit negativem MRE-Befund jüngeren Alters (Medianalter: 8 Jahre [IQR: 3–36] vs. 24 Jahre [IQR: 14–33]) und vermehrt weiblichen Geschlechts (61,1%). Geflüchtete mit positivem MRE-Befund wiesen zudem im Vergleich vermehrt prädisponierende Faktoren auf, bspw. einen vorherigen Krankenhausaufenthalt (61,1 % vs. 35,5%), chronische Pflegebedürftigkeit (16,7 % vs. 1,3 %) oder eine Fluchtanamnese ≤ 3 Monate (80,0 % vs. 29,4 %).
Schlussfolgerung: Prädisponierende Faktoren spielen eine große Rolle für eine Besiedlung mit MRE. Prospektive Studien sollten folgen, um prädisponierende Faktoren für eine Besiedlung mit MRE bei Geflüchteten besser charakterisieren zu können.
N2  - Background: Refugees are at high risk to carry multidrug-resistant organisms (MDRO). Infections with MDRO (multidrug-resistant gram-negative organisms [MDRGN] and methicillin-resistant Staphylococcus aureus [MRSA]) are associated with increased mortality, duration of hospital stay and hospital costs. The influence of risk factors for MDRO is still insufficient for refugees. Knowledge about risk factors of refugees can help to adapt infection control measures for refugees at hospitals.
Methods From November 2015 to April 2016, 134 refugees were screened at the University Hospital of Würzburg for MDRO with naso/pharyngeal (MRSA), rectal swab (MDRGN-Enterobacteriaceae, MDRGN-Pseudomonas aeruginosa) and skin/pharyngeal swab (MDRGN-Acinetobacter baumannii).
Results 62.7% of 134 screened refugees were masculine and the median age was 19 years [IQR: 7-31]. 23.9% (n=32) were positive for at least one MDRO (MRSA: 3.4% of 118, 2MDRGN-Neopäd: 19.3% of 57, 3MDRGN: 13.6% of 125, 4MDRGN: 0% of 125). 25 Escherichia coli (98.3%), 3 Klebsiella pneumoniae (10.7%) and neither Pseudomonas aeruginosa nor Acinetobacter baumannii were found. We detected co-colonization with 2 pathogens in 3 refugees (9.6%) and an infection of MRDO (submandibular abscess, pyelonephritis) in 2 refugees (6.2%). In a subsample of 94 refugees screened simultaneously with all swabs abovementioned, refugees with MDRO were younger (median age: 8 years [IQR: 3-36] vs. 24 years [IQR: 14-33]) and more feminine (61.1%) in comparison to MDRO-negative refugees. Refugees screened positive for MDRO had more risk factors than refuges screened negative, e.g. previous hospital stay (61.1% vs. 35.5%), presence of care level (16.7% vs. 1.3%) or duration of stay in Germany ≤3 months (80.0% vs. 29.4%). 
Conclusion Risk factors are associated with higher prevalence of MDRO. Prospective studies need to follow to better understand the risk factors in refugees.
KW  - Geflüchtete
KW  - Multiresistente Erreger
KW  - Screening
KW  - Tuberkulose
KW  - Impfungen
KW  - refugee
KW  - multidrug-resistant organisms
KW  - screening
KW  - tuberculosis
KW  - vaccination
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239424
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hansen, Niels
A1  - Seiler, Carola
A1  - Rumpf, Julian
A1  - Kraft, Peter
A1  - Dlaske, Henry
A1  - Abele-Horn, Marianne
A1  - Muellges, Wolfgang
T1  - Human Tuberculous Meningitis Caused by \(Mycobacterium\) \(caprae\)
JF  - Case Reports in Neurology
N2  - INTRODUCTION: Tuberculous meningitis (TM) causes substantial morbidity and mortality in humans. Human TM has been known to be induced by bacteria from the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), such as M. tuberculosis and M. bovis.
CASE PRESENTATION: We describe a case of meningitis treated with fosfomycin, which showed partial effectiveness in an 80-year-old patient. After a lethal myocardial infarction, M. caprae (MC) was identified in cerebrospinal fluid culture. This isolated acid-fast organism was first identified as MTBC by MTBC-specific PCR (16S rDNA-PCR). Furthermore, species-specific identification of the isolate was done by gyrB PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of a part of gyrB DNA. Colony morphology of the isolated MC strain showed dysgonic growth on Lowenstein-Jensen medium. The strain was susceptible to pyrazinamide (PZA).
CONCLUSION: This isolated strain was convincingly identified as MC according to the phenotypic and genotypic characteristics and PZA sensitivity. This is the first report of MC causing TM.
KW  - Mycobacterium caprae
KW  - Mycobacterium caprae
KW  - fosfomycin
KW  - Tuberkulose
KW  - Mycobacterium tuberculosis complex
KW  - tuberculous meningitis
KW  - cerebrospinal fluid culture
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123425
VL  - 4
IS  - 1
ER  - 
TY  - THES
A1  - Möllering, Nele
T1  - Drug Monitoring von Efavirenz im Rahmen der antiretroviralen Kombinationstherapie mit tuberkulostatischer Begleittherapie in Südafrika
T1  - Drug monitoring of Efavirenz in patients receiving a high active antiretroviral therapy and tuberculostatic treatment in South Africa
N2  - In Südafrika ist die Tuberkulose die häufigste opportunistische Infektion bei HIV-Patienten. Eine gleichzeitige Therapie mit Rifampicin führt zur Induktion von CYP-Enzymen und folglich zu kritischen Medikamenteninteraktionen mit einem relevanten Risiko für Veränderungen der Medikamentenkonzentration z.B. von EFV. Da Drugmonitoring in Südafrika nicht routinemäßig durchgeführt wird, liegen keine hinreichenden Daten über EFV-Serumkonzentrationen in dieser Population vor. In der vorliegenden Untersuchung wurden daher klinische und pharmakokinetische Daten südafrikanischer HIV-Patienten unter Therapie mit EFV und Rifampicin erhoben und unterschiedliche Einflussfaktoren auf die EFV-Serumkonzentrationen untersucht.
Insgesamt wurden bei 93 erwachsenen HIV-Patienten der HIV-Tageskliniken „Delft Community Health Clinic“ und „Tygerberg hospitals“ die EFV-Serumkonzentrationen während einer Routineuntersuchung, zu einem zufälligen, dem Patienten vorher unbekannten Zeitpunkt bestimmt. Letztlich konnten 80 HIV-Patienten unter antiretroviraler Therapie mit EFV und tuberkulostatischer Therapie mit Rifampicin in die vorliegende Untersuchung einbezogen werden.
Die gemessenen EFV-Serumkonzentrationen lagen zwischen 422 ng/ml und 33.023 ng/ml und ergaben einen Mittelwert von 3.437 ± 4.806 ng/ml. Davon lagen die Serumkonzentrationen bei 68 % (n = 54) der Patienten im angestrebten therapeutischen Bereich; 20 % (n = 16) lagen darüber und 10 % (n = 16) darunter. In der untersuchten Risikopopulation lagen also 32% der EFV-Serumkonzentrationen außerhalb des therapeutischen Bereichs, deutlich mehr Serumkonzentrationen als bei einer Vergleichspopulation in Deutschland (16%). Bei 88% der Patienten lagen jedoch mindestens ausreichende EFV-Serumkonzentrationen vor, obwohl durch die Enzyminduktion durch Rifampicin niedrigere EFV-Serumkonzentrationen zu erwarten gewesen wären.
Es konnte ein signifikanter Unterschied in der Therapiedauer mit Rifampicin im Vergleich der Patientengruppen mit EFV-Serumkonzentrationen innerhalb und oberhalb des angestrebten therapeutischen Bereichs festgestellt werden (p = 0,033). Die Patienten in der Gruppe mit EFV-Serumkonzentrationen innerhalb des therapeutischen Bereichs nahmen Rifampicin im Durchschnitt seit 121 Tagen und somit 35 Tage länger als die Patienten in der Vergleichsgruppe ein. Eine mögliche Ursache könnte die intensivere Enzyminduktion durch konstantere bzw. höhere Serumkonzentrationen von Rifampicin sein. Der Einfluss der Therapiedauer mit Rifampicin auf die Höhe der EFV-Serumkonzentrationen konnte in anderen Studien allerdings nicht gezeigt werden. 
EFV-Serumkonzentrationen innerhalb des Therapeutischen Bereichs waren außerdem mit einer signifikant längeren Therapiedauer mit EFV assoziiert (p = 0,044). Dies könnte an einer mit der Therapiedauer zunehmenden Therapieadhärenz liegen, die in mehreren Studien beschrieben wurde. Eine gute Therapieadhärenz ist eine wichtige Voraussetzung für konstante EFV-Serumkonzentrationen. Bezogen auf das gesamte Patientenkollektiv konnte in der vorliegenden Untersuchung jedoch kein signifikanter Zusammenhang zwischen einer guten bzw. einer schlechten Therapieadhärenz und der Höhe der EFV-Serumkonzentrationen gezeigt werden. 
EFV-Serumkonzentrationen oberhalb des Therapeutischen Bereichs waren mit signifikant höheren ALT-Werten assoziiert. Unter einer Therapie mit EFV können hepatotoxische Nebenwirkungen auftreten, es scheint jedoch kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Höhe der EFV-Serumkonzentrationen und der Höhe der Transaminasen zu bestehen. Im Einzelfall könnte bei einem HIV-Patienten mit unerklärbarem Transaminasenanstieg eine Bestimmung der EFV-Serumkonzentration sinnvoll sein, um Anhaltspunkte für eine Hepatotoxizität von EFV im Zusammenhang mit EFV-Serumkonzentrationen zu finden.
Zwischen den Patientengruppen mit EFV-Serumkonzentrationen innerhalb und oberhalb des therapeutischen Bereichs zeigte sich außerdem ein signifikanter Unterschied in der ethnischen Zugehörigkeit (p = 0,046). Der Anteil der schwarzen Patienten in der Gruppe mit erhöhten Serumkonzentrationen war mit 75 % (n = 12) signifikant höher als in der Gruppe mit Serumkonzentrationen innerhalb des angestrebten Bereichs (44 %, n = 24).
Der Einfluss der ethnischen Zugehörigkeit auf die EFV-Serumkonzentrationen könnte an dem in der schwarzen Bevölkerung überdurchschnittlich häufig vorkommenden Polymorphismus CYP2B6 516 TT liegen. Dieser Polymorphismus ist mit deutlich höheren EFV-Serumkonzentrationen assoziiert. In einigen Studien fanden sich insbesondere höhere EFV-Serumkonzentrationen bei schwarzen, weiblichen Patientinnen im Vergleich zu weißen, männlichen Patienten. Dieser Einfluss des Geschlechts auf die Höhe der EFV-Serumkonzentrationen konnte in der vorliegenden Untersuchung nicht gezeigt werden.
Weitere Begleitmedikamente scheinen die EFV-Serumkonzentrationen zusätzlich zu beeinflussen. Bei Patienten, die zusätzlich Vitamin C einnahmen (n = 9), konnten signifikant höhere EFV-Serumkonzentrationen im Vergleich zu der Patientengruppe, die kein Vitamin C einnahmen, gemessen werden. Eine mögliche Erklärung ist die durch die Anwendung der Komplementärmedizin geförderte Stärkung des Eigenverantwortungsgefühls des Patienten und der Akzeptanz gegenüber der Schulmedizin und einer damit einhergehenden Verbesserung der Therapieadhärenz.
Es konnte kein Zusammenhang zwischen dem Alter der Patienten, dem WHO-Stadium der Erkrankung, der Höhe der CD4-Zellzahl bzw. der Viruslast oder dem EFV- Dosierungsintervall und der Höhe der EFV-Serumkonzentrationen gezeigt werden.
Zusammenfassend konnten bei HIV-Patienten mit nachgewiesenermaßen enzyminduzierender Begleitmedikation mit Rifampicin weitere Einflussfaktoren auf die EFV-Serumkonzentrationen bestimmt werden. Faktoren wie ethnische Herkunft, weitere Begleitmedikamente und die Therapiedauer scheinen die EFV-Serumkonzentrationen zusätzlich zu beeinflussen. Im untersuchten Patientenkollektiv lagen allerdings bei 88% der Patienten mindestens ausreichende EFV-Serumkonzentrationen vor, sodass die Therapie als ausreichend sicher angesehen werden kann. Die Messung der EFV-Serumkonzentrationen könnte genutzt werden, um den Therapieerfolg bei HIV-Patienten unter einer antiretroviralen Therapie und einer tuberkulostatischen Begleittherapie mit Rifampicin weiter zu verbessern.
N2  - Tuberculosis is the most common opportunistic infection in HIV patients in South Africa.
Tuberculostatic treatment with Rifampicin can lead to differences in plasma efavirenz concentrations due to CYP-induction.

Drug monitoring of efavirenz can help to increase the safety oft the antiretroviral therapy in this risk population.
KW  - Arzneimittelüberwachung
KW  - Antiretrovirale Substanz
KW  - HIV-Infektion
KW  - Antituberkulotikum
KW  - Tuberkulose
KW  - Antiretrovirale Substanz
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162100
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schäfer, Christin Marliese
T1  - Approaching antimicrobial resistance –  Structural and functional characterization of the fungal transcription factor Mrr1 from Candida albicans and the bacterial   ß-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from Mycobacterium tuberculosis
T1  - Auf den Spuren der antimikrobiellen Resistenz – Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Mrr1 aus Candida albicans und der bakteriellen β-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 aus  Mykobakterium tuberculosis
N2  - The number of fungal infections is rising in Germany and worldwide. These infections are mainly caused by the opportunistic fungal pathogen C. albicans, which especially harms immunocompromised people. With increasing numbers of fungal infections, more frequent and longer lasting treatments are necessary and lead to an increase of drug resistances, for example against the clinically applied therapeutic fluconazole. Drug resistance in C. albicans can be mediated by the Multidrug resistance pump 1 (Mdr1), a membrane transporter belonging to the major facilitator family. However, Mdr1-mediated fluconazole drug resistance is caused by the pump’s regulator, the transcription factor Mrr1 (Multidrug resistance regulator 1). It was shown that Mrr1 is hyperactive without stimulation or further activation in resistant strains which is due to so called gain of function mutations in the MRR1 gene. 
To understand the mechanism that lays behind this constitutive activity of Mrr1, the transcription factor should be structurally and functionally (in vitro) characterized which could provide a basis for successful drug development to target Mdr1-mediated drug resistance caused by Mrr1. Therefore, the entire 1108 amino acid protein was successfully expressed in Escherichia coli. However, further purification was compromised as the protein tended to form aggregates, unsuitable for crystallization trials or further characterization experiments. Expression trials in the eukaryote Pichia pastoris neither yielded full length nor truncated Mrr1 protein. In order to overcome the aggregation problem, a shortened variant, missing the N-terminal 249 amino acids named Mrr1 ‘250’, was successfully expressed in E. coli and could be purified without aggregation. Similar to the wild type Mrr1 ‘250’, selected gain of function variants were successfully cloned, expressed and purified with varying yields and with varying purity. The Mrr1 `250’ construct contains most of the described regulatory domains of Mrr1. It was used for crystallization and an initial comparative analysis between the wild type protein and the variants. The proposed dimeric form of the transcription factor, necessary for DNA binding, could be verified for both, the wild type and the mutant proteins. Secondary structure analysis by circular dichroism measurements revealed no significant differences in the overall fold of the wild type and variant proteins. In vitro, the gain of function variants seem to be less stable compared to the wild type protein, as they were more prone to degradation. Whether this observation holds true for the full length protein’s stability in vitro and in vivo remains to be determined. The crystallization experiments, performed with the Mrr1 ‘250’ constructs, led to few small needle shaped or cubic crystals, which did not diffract very well and were hardly reproducible. Therefore no structural information of the transcription factor could be gained so far. 
Infections with M. tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, are the leading cause of mortality among bacterial diseases. Especially long treatment times, an increasing number of resistant strains and the prevalence of for decades persisting bacteria create the necessity for new drugs against this disease.  The cholesterol import and metabolism pathways were discovered as promising new targets and interestingly they seem to play an important role for the chronic stage of the tuberculosis infection and for persisting bacteria.
In this thesis, the 3-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from M. tuberculosis was characterized and the potential for specifically targeting this enzyme was investigated. FadA5 catalyzes the last step of the β-oxidation reaction in the side-chain degradation pathway of cholesterol. We solved the three dimensional structure of this enzyme by X-ray crystallography and obtained two different apo structures and three structures in complex with acetyl-CoA, CoA and a hydrolyzed steroid-CoA, which is the natural product of FadA5. Analysis of the FadA5 apo structures revealed a typical thiolase fold as it is common for biosynthetic and degradative enzymes of this class for one of the structures. The second apo structure showed deviations from the typical thiolase fold. All obtained structures show the enzyme as a dimer, which is consistent with the observed dimer formation in solution. Thus the dimer is likely to be the catalytically active form of the enzyme. Besides the characteristic structural fold, the catalytic triad, comprising two cysteines and one histidine, as well as the typical coenzyme A binding site of enzymes belonging to the thiolase class could be identified. The two obtained apo structures differed significantly from each other. One apo structure is in agreement with the characteristic thiolase fold and the well-known dimer interface could be identified in our structure. The same characteristics were observed in all complex structures. In contrast, the second apo structure followed the thiolase fold only partially. One subdomain, spanning 30 amino acids, was in a different orientation. This reorientation was caused by the formation of two disulfide bonds, including the active site cysteines, which rendered the enzyme inactive. The disulfide bonds together with the resulting domain swap still permitted dimer formation, yet with a significantly shifted dimer interface. The comparison of the apo structures together with the preliminary activity analysis performed by our collaborator suggest, that FadA5 can be inactivated by oxidation and reactivated by reduction. If this redox switch is of biological importance requires further evaluation, however, this would be the first reported example of a bacterial thiolase employing redox regulation. 
Our obtained complex structures represent different stages of the thiolase reaction cycle. In some complex structures, FadA5 was found to be acetylated at the catalytic cysteine and it was in complex with acetyl-CoA or CoA. These structures, together with the FadA5 structure in complex with a hydrolyzed steroid-CoA, revealed important insights into enzyme dynamics upon ligand binding and release. The steroid-bound structure is as yet a unique example of a thiolase enzyme interacting with a complex ligand. The characterized enzyme was used as platform for modeling studies and for comparison with human thiolases. These studies permitted initial conclusions regarding the specific targetability of FadA5 as a drug target against M. tuberculosis infection, taking the closely related human enzymes into account. Additional analyses led to the proposal of a specific lead compound based on the steroid and ligand interactions within the active site of FadA5.
N2  - Die Zahl der Pilzinfektionen, welche hauptsächlich durch den opportunistisch-pathogenen Pilz C. albicans verursacht werden, ist nicht nur in Deutschland, sondern weltweit steigend. Die auftretenden Infektionen betreffen vor allem immunsupprimierte Personen. Dieser Anstieg an Pilzinfektionen verursacht häufigere und immer länger andauernde Behandlungen und resultiert auch im vermehrten Auftreten von Resistenzen gegen Antimykotika, unter anderem gegen das klinisch eingesetzte Fluconazol. Eine Möglichkeit der Resistenzbildung in C. albicans ist die Expression der ‚Multidrug resistance pump 1‘ (Mdr1), einer Membranpumpe, die zur Major-Facilitator-Superfamilie zählt. Diese durch Mdr1-vermittelte Fluconazolresistenz wird durch den Mdr1 regulierenden Transkriptionsfaktor Mrr1 (‚Multidrug resistance regulator 1‘) gesteuert. In resistenten C. albicans Stämmen befindet sich Mrr1 ohne weitere Stimulation oder externe Aktivierung bereits in einem hyperaktiven Zustand, der durch Mutationen mit Funktionsgewinn im MRR1 Gen verursacht wird.    
Um die Mechanismen, die sich hinter der konstitutiven Aktivität von Mrr1 verbergen, zu entschlüsseln, sollte dieser Transkriptionsfaktor in vitro strukturell und funktionell charakterisiert werden. Diese Charakterisierung könnte im Anschluss genutzt werden, um Wirkstoffe gegen die von Mrr1 gesteuerte und von Mdr1-vermittelte Resistenz zu entwickeln. Zu diesem Zweck, wurde das gesamte, 1108 Aminosäuren umfassende, Protein in Escherichia coli exprimiert. Die anschließende Proteinreinigung war allerdings durch Aggregatbildung beeinträchtigt, welche Kristallisationsansätze oder eine weitere Charakterisierung dieses Proteinkonstruktes verhinderten. Im Eukaryot Pichia pastoris durchgeführte Expressionsanalysen, waren leider erfolglos und weder die Expression des Volllängen-Mrr1 noch seiner verkürzten Proteinvarianten konnte nachgewiesen werden. Um Proteinaggregation zu umgehen, wurde deshalb ein N-terminal, um 249 Aminosäuren, verkürztes Proteinkonstrukt, Mrr1 ‚250‘, in E. coli exprimiert und erfolgreich, ohne Aggregation, gereinigt. Zusätzlich zum wildtypischen Mrr1 ‚250‘ Protein wurden auch ausgewählte Varianten kloniert, exprimiert und gereinigt, allerdings mit unterschiedlicher Ausbeute und Reinheit. Da das verkürzte Mrr1 ‚250‘ Protein noch immer fast alle in der Literatur beschriebenen Regulierungsdomänen besitzt, wurde es zur Kristallisation und für einen initialen Vergleich zwischen Wildtyp und Varianten genutzt. So konnte zum Beispiel die vermutete Dimerisierung des Transkriptionsfaktors sowohl für das Wildtypprotein als auch für die Varianten gezeigt werden. Eine weiterführende Untersuchung der Sekundärstruktur mittels zirkular Dichroismus Messungen zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mutanten und dem Wildtypprotein. Allerdings erscheinen die Funktionsgewinn Varianten von Mrr1 in vitro instabiler als das Wildtypprotein, was sich durch stärkeren Abbau der Variantenproteine zeigt. Ob diese Beobachtungen allerdings vom verkürzten Protein auf das Gesamtprotein und dessen in vitro und in vivo Stabilität übertragbar sind, ist derzeit noch unklar. Kristallisationsansätze, die mit den verschiedenen Varianten des Mrr1 ‚250‘ Konstrukts durchgeführt wurden, führten zu sehr wenigen, nadelförmigen oder kubischen Kristallen, die kaum reproduzierbar waren und schlecht diffraktierten. Bisher konnten deshalb keine strukturellen Daten für den untersuchten Transkriptionsfaktor erhalten werden.  
Noch immer sind Infektionen, die durch M. tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, verursacht werden die Haupttodesursache im Bereich der bakteriellen Infektionen. In diesem Zusammenhang stellen vor allem lange Behandlungszeiten, das vermehrte Auftreten resistenter Stämme und das Vorkommen persistierender Bakterien, die Jahrzehnte in ihrem Wirt überdauern können, nach wie vor große Herausforderungen dar und die Entwicklung neuer Tuberkulosemedikamente ist dringend erforderlich. Sowohl der Cholesterinimport als auch dessen Stoffwechselweg wurden als vielversprechende Wirkstoffziele identifiziert. Nicht zuletzt, da beide Mechanismen eine wichtige Rolle während der chronischen Phase der Tuberkuloseinfektion und für persistierende Bakterien zu spielen scheinen.
Im Laufe dieser Arbeit wurde die 3-ketoacyl-CoA Thiolase FadA5 aus M. tuberculosis strukturell charakterisiert und auf ihre Tauglichkeit als spezifisches Wirkstoffziel hin untersucht. FadA5 katalysiert den letzten Schritt der β-Oxidation im Zuge des Seitenkettenabbaus von Cholesterin. Wir konnten die Proteinstruktur des FadA5 Proteins mittels Röntgenkristallographie ermitteln und erhielten zwei unterschiedliche apo-Strukturen sowie drei Komplexstrukturen. In den Komplexstrukturen waren entweder Acetyl-CoA, CoA oder ein hydrolisiertes Steroid-CoA, welches das natürliche Produkt von FadA5 darstellt, an das Enzym gebunden. Die Strukturanalyse der apo-Strukturen lies für eine der beiden Modelle die typische Thiolasefaltung erkennen, welche für biosynthetische und degradative Enzyme dieser Klasse üblich ist. In der zweiten apo-Struktur konnte diese Faltung nur teilweise identifiziert werden. Das Protein liegt in allen erhaltenen Strukturen als Dimer vor, was auch in Lösung beobachtet werden konnte und darauf hinweist, dass das Dimer die katalytisch aktive Form des Proteins darstellt. Neben der charakteristischen Faltung, wurde das aktive Zentrum, bestehend aus zwei Cysteinen und einem Histidin, sowie die für Thiolasen übliche Coenzym A Bindetasche identifiziert. Die erhaltenen apo-Strukturen unterschieden sich deutlich voneinander. Die zuvor beschriebene typische Dimer-Interaktionsfläche wird auch in den Komplexstrukturen beobachtet. Dahingegen war die Thiolasefaltung in der zweiten Apo-Struktur nur teilweise vorhanden, da beispielsweise eine Domäne, die 30 Aminosäuren umfasst, umorientiert vorlag. Die Bildung zweier Disulfidbrücken, welche beide katalytischen Cysteine involviert, verursachte die beschriebene Umorientierung und damit gepaart eine wahrscheinliche Inaktivität des Enzyms. Trotz der beschriebenen Umorientierung und Disulfidbrückenbildung liegt das Protein noch immer als Dimer vor, allerdings mit einer deutlich verschobenen Interaktionsfläche. Der Vergleich der beiden apo-Strukturen in Kombination mit einer vorläufigen Aktivitätsanalyse, die von unseren Kollaborationspartnern durchgeführt wurde, lassen vermuten, dass FadA5 durch Oxidation inaktiviert und durch Reduktion reaktiviert werden kann. Ob diese Redoxregulierung biologisch relevant ist, muss noch geklärt werden, allerdings wäre dies der erste beschriebene Fall einer redoxregulierten bakteriellen Thiolase.
Die Komplexstrukturen stellen verschiedene Stufen der Thiolasereaktion dar. In einigen dieser Strukturen lag FadA5 am katalytischen Cystein acetyliert vor und befand sich im Komplex mit acetyl-CoA oder CoA. Durch eine weitere Struktur, in der FadA5 im Komplex mit einem hydrolisierten Steroid-CoA vorlag, konnten wichtige Einblicke in die Enzymdynamik während der Ligandenbindung und Freisetzung gewonnen werden. Die Steroid gebundene Struktur stellt derzeit ein einzigartiges Beispiel einer Thiolase im Komplex mit einem großen, mehrere Ringsysteme umfassenden Liganden dar. Das charakterisierte Enzym diente als Ausgangspunkt für Modellierungsversuche und Vergleiche mit humanen Thiolasen. Diese Analysen erlaubten initiale Schlussfolgerungen bezüglich einer Verwendung von FadA5 als spezifisches Wirkstoffziel gegen Tuberkuloseinfektionen, im Kontext verwandter humaner Enzyme. Zusätzliche Untersuchungen ermöglichten die Ausarbeitung einer spezifischen Leitsubstanz, die auf den analysierten Interaktionen zwischen dem aktiven Zentrum von FadA5 und den gebundenen Liganden basiert.
KW  - Multidrug-Resistenz
KW  - Candida albicans
KW  - Tuberkulose
KW  - Röntgenkristallographie
KW  - Cholesterinstoffwechsel
KW  - Structural Biology
KW  - Transcription factor
KW  - Thiolase
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108400
ER  -