TY - THES A1 - Huber, Saskia T1 - Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugehörigen Proteinfamilie T1 - Characterization of SAP47 in Drosophila melanogaster and its protein familiy N2 - In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugehörige Proteinfamilie charakterisiert. N2 - A synapse associated protein, SAP47, and its protein family is characterized. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Drosophila KW - Synapse KW - SAP47 KW - BSD KW - Drosophila KW - synapse KW - SAP47 KW - BSD Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777 ER - TY - THES A1 - Spall, Thomas T1 - Optische Visualisierung neuronaler Aktivität : Etablierung des in-vivo Calcium-Imaging mit dem genetisch codierten Sensor Yellow Cameleon 2.1 und Untersuchung der olfaktorischen Codierung im Gehirn von Drosophila melanogaster T1 - Optical visualization of neuronal activity: Establishment of Calcium Imaging using the genetically expressed Sensor Yellow Cameleon 2.1 and Examination of olfactory Coding in the brain of Drosophila melanogaster N2 - Die Messung der räumlich aufgelösten Aktivität von neuronalen Zellverbänden ist ein wichtiges Werkzeug, um die Funktionsweise von Gehirnen zu verstehen. Für diese Arbeit diente die Fruchtfliege Drosophila melanogaster mit ihrer gut beschriebenen Genetik und Neurobiologie als Untersuchungsobjekt. Bei der vorgelegten Arbeit lag eine zweigeteilte Aufgabenstellung vor: Zum einen wurde die Technik des in – vivo Calcium – Imagings mit Hilfe des genetisch codierten Sensors Yellow Cameleon 2.1 am Lehrstuhl komplett neu etabliert, zum anderen wurde mit der neuen Technik das Zusammenspiel der funktionellen Elemente neuronaler Systeme anhand der Fliegenolfaktorik untersucht. Sowohl die Experimente zur Depolarisation durch KCl, als auch die Experimente zur olfaktorischen Codierung, wurden mit dem Calciumsensor Yellow Cameleon 2.1 durchgeführt. Es wurde ausgehend von der Vorgängerversion Yellow Cameleon 2.0 durch gezielte Mutagenese von Sören Diegelmann erstellt. Eine Photomultiplier – basierte in – vitro Funktionsanalyse des rekombinanten Sensorproteins ergab eine Zunahme der Ratio EYFP / ECFP mit steigender Calciumkonzentration. Dabei konnte auch der ratiometrische FRET – Effekt des Cameleons verdeutlicht werden: Mit steigender Calciumkonzentration verschiebt sich das Verhältnis von EYFP – Fluoreszenz zu ECFP – Fluoreszenz zu höheren Ratiowerten. Durch Zugabe des Calciumchelators EGTA konnte außerdem die reversible Arbeitsweise des Sensors nachgewiesen werden. Das in die Fliege eingebrachte Yellow Cameleon 2.1 – Konstrukt wurde mittels der GAL4 – UAS – Technik in verschiedenen olfaktorischen Gehirnzentren exprimiert. Von besonderer Relevanz für die Experimente zur olfaktorischen Codierung war dabei die GAL4 – Treiberlinie GH146. Mit ihrer Hilfe konnte das Fusionsprotein in den olfaktorischen Projektionsneuronen des Fliegengehirns exprimiert, und so die Duftrepräsentation im postsynaptischen Neuropil der Antennalloben bzw. in den präsynaptischen Neuropilen der Calyces und des lateralen Protocerbrums untersucht werden: Die Stimulation von 3 individuellen Fliegen mit den Düften Benzaldehyd, Isoamylacetat und Octanol liefert duftspezifische neuronale Aktivitätsmuster im Antenallobus. Die auf die Duftstimuli mit Calciumsignalen reagierenden Areale haben eine Größe von 10 – 30 µm, liegen also in der Größenordnung von individuellen Glomeruli. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben zeigt außerdem einen kombinatorischen Aspekt: Jeder Duft evoziert ein charakteristisches Aktivitätsmuster bestehend aus einem oder mehreren Glomeruli. Die Aktivitätsmuster verschiedener Düfte können sich überlagern, d.h. individuelle Glomeruli können durch verschiedene Düfte aktiviert werden, das gesamte Aktivitätsmuster, d.h. die Summe der aktivierten Glomeruli eines bestimmten Duftes, ist jedoch charakteristisch. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben von Drososophila geschieht also in Form eines glomerulären Codes, ein Prinzip der Duftverarbeitung, das auch in anderen Insekten und Vertebraten nachgewiesen werden konnte. Für den Calyx des Pilzkörpers ergaben sich innerhalb eines Individuums, bei wiederholter Stimulation mit demselben Duft, ebenfalls duftspezifische Aktivitätsmuster. Dabei waren die auf den Duftstimulus hin antwortenden neuronalen Areale diskret über den Calyx hinweg verteilt. Insgesamt zeigt das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Aktivitätsmuster für einen gegebenen Duft, dass im Calyx, wie in den Antennalloben, eine duftspezifische räumliche Repräsentation vorliegt. Der kombinatorische Aspekt der Codierung konnte auch hier beobachtet werden. Die einzelnen Spots der im Calyx gemessenen Aktivitätsmuster liegen in der Größenordnung von 5 +/- 2 µm und entsprechen somit in ihrer Größe den elektronenmikroskopisch beschriebenen Microglomeruli. Durch die Calcium – Imaging Experimente am lateralen Protocerebrum konnte nachgewiesen werden, dass die Erhöhung der Duftkonzentration eine räumliche Ausdehnung des aktivierten Neuropils zur Folge hat. Die EYFP –, ECFP – und Ratio – Intensitäten, die aus einer “Region of Interest“ im anterioren Bereich des lateralen Protocerebrums berechnet wurden, zeigen weiterhin, dass mit steigender Duftkonzentration auch die Stärke des Calciumsignals zunimmt. Dabei gibt es zwischen den 4 getesteten Düften statistisch signifikante Unterschiede: Methylcyclohexanol evoziert über den gesamten Verdünnungsbereich hinweg die schwächste neuronale Aktivität, Isoamylacetat evoziert in den Verdünnungsstufen 10-3 und 10-1 die stärkste neuronale Aktivität. D.h. neben der räumlichen Ausdehnung des Signals, führt die Konzentrationserhöhung auch zu einer gesteigerten Intensität des Calciumsignals, wobei sich die Signalintensitäten für verschiedene Düfte und Verdünnungsstufen unterscheiden können. Mit der verwendeten Versuchsanordnung und Datenauswertung, war es jedoch bislang nicht möglich eine räumliche Repräsentation der Düfte im lateralen Protocerebrum nachzuweisen. N2 - Measuring the spatiotemporal activity of neuronal cell populations is an important tool towards a further understanding of brain functions. This thesis investigates the brain activity of the model system Drosophila melanogaster with its well described genetics and neurobiology, thereby consisting of two major parts: On the one hand the in – vivo Calcium – Imaging technique by means of the genetically encoded sensor Yellow Cameleon 2.1, had to be newly established in our laboratory, on the other hand the interaction of functional elements within the neuronal olfactory pathway of the fruitfly was to be examined using this new technique. Both the experiments on KCl – induced depolarization and the experiments on olfactory coding were accomplished with the Yellow Cameleon 2.1 sensor. This molecular probe was generated by Sören Diegelmann by targeted in – vitro mutagenesis of the previous version Yellow Cameleon 2.0. A photomultiplier based in – vitro functional analysis of the recombinant sensor protein resulted in an increase of Calcium signals with rising Calcium ion concentrations, thereby revealing the ratiometric FRET effect of the Cameleons: With rising Calcium concentration the relationship between EYFP – fluorescence and ECFP – fluorescence shifts towards higher ratio values EYFP / ECFP. By application of the Calcium chelator EGTA the reversible function of the sensor could be demonstrated as well. By means of the GAL4 – UAS – technique, the Yellow Cameleon 2.1 construct transformed into the fly`s germline could be expressed in different olfactory brain centers. In the present work the GAL4 – strain GH146 was of special relevance for the experiments on olfactory coding. The GH146 – driven Cameleon 2.1 line expresses the sensor protein in olfactory projection neurons of the fly`s brain and therefore permits the examination of odorant coding within the postsynaptic neuropile of the antennal lobes, the presynaptic neuropiles of the calyces and the lateral protocerebrum, respectively: The stimulation of 3 individual flies with the odorants benzaldehyde, isoamylacetate and octanol revealed odorant – specific spatial activity patterns within the antennal lobes. The areas activated by the odorant stimulation were of similar size as individual glomeruli (~10 – 30 µm). The glomerular – like odor representation in the antennal lobes shows a combinatorial aspect: Each odorant induces a characteristic acitivity pattern consisiting of one or more glomeruli. Activity patterns evoked by different odorants can overlap, i.e. individual glomeruli can be activated by different odorants. In spite of from this combinatorial aspect, the activity pattern for a given odorant remains specific. Odorants are therefore represented in a glomerular code within the antennal lobes of Drosophila. The glomerular code represents an olfactory processing principle which could be demonstrated for other insects and vertebrates as well. Repeated stimulation of an individual fly with the same odorant revealed that intraindividual optical recordings from the mushroom body calyx were reproducible and generated odorant – specific activity patterns as well. The response patterns to different odorants were clearly spatially organized, with discrete areas of activity distributed over the calyx area. The reproducibility of the different patterns strongly suggest that odorant representations within the calyx are spatially specific, i. e. the spatial glomerular code of the antennal lobes could be somehow transformed into a spatial odorant – specific acitvity pattern in the calyx. Interestingly, the combinatorial aspect of olfactory encoding could be seen in the calyces as well. The spots of activity observed in the calyx are within the range of 5 +/- 2 µm and thus correspond in size to the boutons forming the presynaptic part of the so called microglomeruli described by electron microscopy. The Calcium – Imaging experiments at the level of the lateral protocerebrum showed a spatial expansion of the activated neuropiles with increasing odorant concentrations. The EYFP – , ECFP – intensities and their ratio values, which were computed from a region of interest within the anterior range of the lateral protocerbrum, reveal an increase in signal intensity with rising odorant concentrations. Within this reference the 4 odorants examined show satistically significant differences: methlycyclohexanol evoked the weakest Calcium signals over the entire dilution range, isoamylacetate evoked the strongest Calcium signals at the dilutions 10-3 and 10-1. This means that apart from the spatial expansion of the signal, the concentration increase leads to an increase in signal intensity, while the signal intensities for different odorants at a given dilution can differ. However, using the described experimental assembly and data evaluation, it was not possible to prove a spatial odorant representation within the lateral protocerebrum. KW - Terpyridinderivate <2 KW - 2':6' KW - 2"-> KW - Polymerkomplexe KW - Fluoreszenz KW - Drosophila KW - optisches Imaging KW - Yellow Cameleon 2.1 KW - olfaktorische Codierung KW - Drosophila KW - optical Imaging KW - Yellow Cameleon 2.1 KW - olfactory coding Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11575 ER - TY - THES A1 - Pick, Simon T1 - Kinematik und visuelle Steuerung des Kletterverhaltens und der Beinplatzierung der Fliege Drosophila melanogaster und Übertragung auf die Robotik T1 - Kinematics and visual control of climbing behaviour and leg placement in the fly Drosophila melanogaster and applications to robotics N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden visuelle Einflüsse auf die Beinplatzierung beim Laufen und auf das Kletterverhalten der Fliege Drosophila melanogaster analysiert. Während sich die Beinplatzierung als vorwiegend taktil gesteuert herausstellte, ist das Klettern sowohl bezüglich der Entscheidung zur Durchführung (Motivationssteuerung) als auch bezüglich der Ausführung selbst unter präziser visueller Kontrolle. Für die Untersuchungen wurde ein Lücken-Überwindungsparadigma entwickelt und die Kinematik des Kletterns über verschieden breite Lücken mit einer eigens entwickelten 3D-Hochgeschwindigkeits-Videoanlage erstmals quantitativ beschrieben. Drei wesentliche Verhaltensanpassungen sorgen dafür, dass die Fliegen die maximal mögliche Spannbreite ihrer Beine voll ausnützen und Lücken von bis zu 170% der eigenen Körperlänge überqueren können. Das Kletterverhalten wird abhängig von der Lückenbreite initiiert und sinnlose Versuche an unüberwindbar breiten Lücken vermieden. Die visuelle Lückenbreitenmessung wurde analysiert; sie beruht auf der Auswertung von Bewegungsparallaxe beim Anlauf. Einige Erkenntnisse aus der Laufforschung an Fliegen wurden auf einem im Rahmen dieser Arbeit modifizierten hexapoden Laufroboter umgesetzt und die Verbesserungen quantifiziert. N2 - This work started out to analyze visual influences on leg placement and on the climbing behavior of the fly Drosophila melanogaster. Whereas leg placement turned out to be predominantly under tactile control, climbing is indeed under tight visual control both with regard to the decision to initiate the behavior (motivational control) as well as with regard to the execution of climbing. A gap-crossing paradigm has been developed to facilitate a detailed study and the kinematics of climbing over gaps of various widths has been quantified using a 3D high-speed video analysis system developed for this purpose. Three major behavioral adaptations help the fly to exploit fully the limits of its leg span in order to overcome gaps of up to 170% of its own body length. Climbing is initiated dependent on gap width. Vain attempts to overcome insurmountably broad gaps are avoided. Analysis showed that the fly uses parallax motion generated during the approach to estimate the width of a gap. Some of the results of the research on the fly’s walking behavior have been implemented in a modified hexapod walking robot, and the improvements have been quantified. KW - Taufliege KW - Kinematik KW - Klettern KW - Verhaltensanpassung KW - Drosophila KW - Verhalten KW - Klettern KW - Laufen KW - Robotik KW - Drosophila KW - behaviour KW - climbing KW - walking KW - robotics Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12737 ER - TY - THES A1 - Bolt-Ulschmid, Julia Katharina T1 - Charakterisierung von Adenylatkinasen aus Plasmodium falciparum und Thioredoxinreduktase-assoziierten Proteinen aus Dipteren T1 - Charakterisierung von Adenylatkinasen aus Plasmodium falciparum and Thioredoxin reductase-associiated Proteins of insects N2 - In Säugetieren existieren im wesentlichen zwei Abwehrsysteme gegen oxidativen Streß, in welchen die Glutathionreduktase (GR) und Thioredoxinreduktase (TrxR) Schlüsselenzyme sind. Ein einzelnes Gen der Taufliege, genannt dmtrxr-1, kodiert sowohl für die durch alternatives Splicing entstehende cytoplasmatische und mitochondriale Form der DmTrxR-1. Zum Teil innerhalb des dmtrxr-1-Gens findet sich auf dem Komplementärstrang ein weiteres Gen, welches sniffer genannt wurde. In Kooperation wurde nachgewiesen, daß dieses Gen essentiell zur Verhinderung alterungsbedingter Neurodegeneration ist. Durch biochemische Charakterisierung konnte das rekombinant hergestellte Produkt dieses Gens in der vorliegenden Arbeit als Carbonylreduktase, ein zu den Kurzketten-Dehydrogenasen (short-chain dehydrogenases) gehörendes Enzym, identifiziert werden. Sniffer weist das für Carbonylreduktasen typische Substratspektrum mit Phenanthrenequinone als bestem Substrat auf und wird von Flavonoiden wie Quercetin und Rutin sowie Hydroxymercuribenzoat gehemmt. In verschiedenen Ansätzen konnten Kristalle des rekombinanten Proteins gewonnen werden, die inzwischen in Kooperation vermessen wurden und so zu einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,7 Angström führten. Durch diese Arbeiten konnte zum ersten Mal eine Verbindung zwischen einem charakterisierten Gen (snifffer), oxidativem Streß und neurodegenerativen Effekten auf molekularer Ebene nachgewiesen werden. Parasiten haben während ihres Lebenszyklus einen hohen Bedarf an Energie und sind abhängig von einer starken Syntheseleistung. Zur Bewältigung dieses Stresses benötigen sie hohe Aktivitäten an Adenylatkinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) und GTP-AMP-Phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  GDP + ADP). Beide Enzyme wurden in Blutstadien des Malariaparasiten Plasmodium falciparum identifiziert und die entsprechenden Gene der PfAK und PfGAK auf den Chromosomen 10 und 4 respektive lokalisiert. Klonierung und heterologe Expression in E. coli ergab enzymatisch aktive Proteine mit einer Größe von 28,9 (PfAK), bzw. 28,0 kDa (PfGAK). Das rekombinante Protein der PfAK entspricht in seinen biochemischen Charakteristika denen der authentischen PfAK. Dies gilt auch für eine mögliche Assoziation mit einem stabilisierenden Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa und der hohen Substratspezifität für das Monophosphat-Nukleotid AMP. Die Spezifität für das Triphosphat-Substrat ist weniger stringent. Das beste Triphosphat-Substrat ist ATP mit einem Vmax-Wert von 75 U/mg und einem kcat von 2800 min-1. Die Sequenz der PfAK enthält eine amphiphatische Helix, welche als notwendig für die Translokation zytosolischer Adenylatkinasen in den Intermembranraum der Mitochondrien beschrieben wurde. Die PfGAK bevorzugt GTP und AMP als Substrat (100 U/mg; kcat = 2800 min-1 bei 25°C) und zeigt als Besonderheit keine messbare Aktivität mit ATP. Im Gegensatz zu ihrem Ortholog im Menschen (AK3) enthält die Sequenz der PfGAK ein Zinkfinger-Motiv und bindet Eisenionen. Erste Immunfluoreszenz-Analysen lokalisieren die PfGAK in den Mitochondrien. PfAK und PfGAK werden von den Dinukleosid-Pentaphosphat-Verbindungen AP5A beziehungsweise GP5A gehemmt. Die Ki-Werte liegen mit ca. 0.2 µM ungefähr 250-fach niedriger als die KM-Werte der entsprechenden Nukleotidsubstrate. Zur Lösung der vor allem im Rahmen einer rationalen Medikamentenentwicklung notwendigen Kristallstruktur des Zielmoleküls konnten bereits Kristalle der PfGAK erhalten werden. N2 - In mammalia, two major systems with glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR) as key enzymes defend the organism against oxidative stress. The single copy gene dmtrxr-1 codes for both the cytoplasmic and mitochondrial form of DmTrxR-1, generated by alternative splicing. Another gene, located on the complementary strand partially within the dmtrxr-1 gene, could be identified and was named sniffer. This gene is essential for prevention of age-related neuro-degeneration, as could be shown in a cooperation with the group of Prof. Schneuwly. In this thesis, biochemical characterization of the recombinant protein identified sniffer as a carbonyl reductase, an enzyme belonging to the short-chain-dehydrogenases. Sniffer shows the typical substrate spectrum of carbonyl reductases with phenthrenequinone as best substrate and is inhibited by the flavonoids quercetin and rutin and also by hydroxymercurybenzoate (HMB). Protein crystals could be obtained under different conditions. In a cooperation with the group of Prof. Klebe, these already lead to a crystal structure with a resolution of 1.7 angstrom. The work on sniffer is the first that directly links a characterized gene (sniffer), oxidative stress and neurodegeneration on the molecular level. For coping with energetic and synthetic challenges, parasites require high activities of adenylate kinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) and GTP:AMP phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  2 ADP). These enzymes were identified in bloodstream stages of Plasmodium falciparum. The genes encoding PfAK and PfGAK are located on chromosomes 10 and 4, respectively. Molecular cloning and heterologous expression in E. coli yielded enzymatically active proteins of 28.9 (PfAK) and 28.0 kDa (PfGAK). Recombinant PfAK resembles authentic PfAK in its biochemical characteristics including the possible association with a stabilizing protein and the high specificity for AMP as the mononucleotide substrate. Specificity is less stringent for the triphosphate, with ATP as the best substrate (75 U/mg; kcat = 2160 min-1). PfAK contains the sequence of the amphiphatic helix that is known to mediate translocation of the cytosolic protein into the mitochondrial intermembrane space. PfGAK exhibits substrate preference for GTP and AMP (100 U/mg; kcat = 2800 min-1); notably, there is no detectable activity with ATP. In contrast to its human orthologue (AK3), PfGAK contains a zinc finger motif and binds ionic iron. The dinucleoside pentaphosphate compounds AP5A and GP5A inhibited PfAK and PfGAK, respectively, with Ki values of appr. 0.2 µM which is more than 250-fold lower than the KM values determined for the nucleotide substrates. The disubstrate inhibitors are useful for studying the enzymatic mechanism of PfAK and PfGAK as well as their function in adenine nucleotide homeostasis; in addition, the chimeric inhibitors represent interesting lead compounds for developing nucleosides to be used as antiparasitic agents. To elucidate the structure which is necessary for the use as a drug target, crystallization studies have been performed and the first crystals could be obtained. KW - Taufliege KW - Plasmodium falciparum KW - Adenylatkinase KW - Carbonyl-Reductase KW - Malaria KW - Plasmodium KW - Adenylatkinase KW - Carbonylreduktase KW - Drosophila KW - Malaria KW - Plasmodium KW - adenylate kinase KW - carbonyl reductase KW - drosophila Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10752 ER - TY - THES A1 - Fischer, Matthias T1 - Lokalisierung eines Gedächtnisses bei Drosophila melanogaster T1 - Localization of a Memory in Drosophila N2 - Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis von Drosophila melanogaster in den Pilzkörpern lokalisiert ist. Zu Beginn dieser Doktorarbeit war bekannt, daß die Pilzkörper notwendig für das Geruchsgedächtnis sind. Drei unabhängige Methoden der Ablation bzw. Veränderung der biochemischen Eigenschaften der Pilzkörper hatten zu dem selben Ergebnis geführt, daß funktionierende Pilzkörper unentbehrlich für den Aufbau eines Geruchsgedächtnisses sind. Noch informativer als ein Experiment, in dem durch Zerstörung einer Struktur eine Leistung unmöglich gemacht wird ist der umgekehrte Weg, der durch einen gewebespezifischen „rescue“ die Leistung wiederherstellt. Dazu wurde in dieser Arbeit das wildtypische Allel des Gens rutabaga in rut-mutanten Fliegen mit Hilfe des Gal4/UAS-Systems ausschließlich in den Pilzkörpern, bzw., im Gegenexperiment, nur außerhalb der Pilzkörper zur Expression gebracht. rut kodiert für die Adenylatcyclase I, die mit synaptischer Plastizität bei Drosophila, Aplysia und Mäusen in Verbindung gebracht wird. Man geht davon aus, daß synaptische Plastizität die molekulare Grundlage für Lernen und Gedächtnis ist. Die AC I stellt cAMP her, dessen Menge und präzise Regulation die Übertragungsstärke an Neuronen beeinflußt. Eine Störung dieses Signalweges z. B. durch die rut-Mutation führt zu einer Beeinträchtigung des Gedächtnisses bei Drosophila. rut wurde mit Hilfe des in Drosophila etablierten Gal4/UAS-Systems exprimiert: Der gewebespezifisch aktive Hefe-Transkriptionsfaktor Gal4 führt dazu, daß das hinter einen Gal4-spezifischen UAS-Promotor klonierte wildtypische rut-Gen in denjenigen Zellen transkribiert wird, in denen der Transkriptionsfaktor vorhanden ist. Dies wurde in einer rut-Mutante durchgeführt, so daß in allen anderen Zellen keine funktionierende AC I vorhanden war. Die rut-abhängige synaptische Plastizität wurde damit ausschließlich auf die gewünschten Regionen beschränkt. Das Expressionsmuster der Gal4-Linien wurde durch Immuncytochemie (Anti-Tau) sichtbar gemacht. Diese Fliegen wurden in einem klassischen Konditionierungsexperiment auf ihr Geruchs-Gedächtnis untersucht. Dazu wurden einer Gruppe von Fliegen nacheinander 2 Gerüche präsentiert, von denen einer mit Elektroschocks gepaart war. Nach ca. 2 min konnten diese Fliegen sich für einen der beiden Gerüche entscheiden, die nun gleichzeitig aus 2 unterschiedlichen Richtungen dargeboten wurden. Je nach Lernleistung entschieden sich mehr oder weniger Fliegen für den vorher unbestraften Geruch. Es ergab sich, daß der Ort im Gehirn, an dem die wildtypische AC I exprimiert wurde, über die Höhe des Gedächtniswertes entschied: Die AC I ausschließlich in den Pilzkörpern gewährte ein völlig normales Gedächtnis, wogegen die AC I außerhalb der Pilzkörper das Gedächtnis nicht gegenüber der rut-Mutante verbessern konnte. Die Analyse der Expressionsverteilung von insgesamt 9 getesteten Fliegenlinien mißt überdies dem -Lobus des Pilzkörpers eine besondere Bedeutung bei und läßt den Schluß zu, daß das hier untersuchte Gedächtnis ausschließlich in den -Loben lokalisiert ist. Dieses erfolgreiche rut-„rescue“ - Experiment zeigt, daß rut-abhängige synaptische Plastizität ausschließlich in den Pilzkörpern ausreichend für ein wildtypisches Gedächtnis ist. Dieses Ergebnis vervollständigt die Erkenntnisse von den Pilzkörper-Ablationsexperimenten insofern, als nun die Aussage zutrifft, daß die Pilzkörper notwendig und hinreichend für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis sind. N2 - Memories are thought to be due to lasting synaptic modifications in the brain. The search for memory traces has relied predominantly on determining regions that are necessary for the process. However, a more informative approach is to define the smallest sufficient set of brain structures. The rutabaga adenylyl cyclase, an enzyme that is ubiquitously expressed in the Drosophila brain and that mediates synaptic plasticity, is needed exclusively in the Kenyon cells of the mushroom bodies for a component of olfactory short-term memory. This demonstrates that synaptic plasticity in a small brain region can be sufficient for memory formation. KW - Gedächtnis KW - Drosophila KW - Pilzkörper KW - rutabaga KW - memory KW - Drosophila KW - mushroom-body KW - rutabaga Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8050 ER - TY - THES A1 - Schwenkert, Isabell T1 - Phenotypic characterization of hangover at the neuromuscular junction T1 - Phänotypische Charakterisierung von hangover an der neuromuskulären Synapse N2 - Ethanoltoleranz beruht vermutlich auf Veränderung in synaptischer Plastizität; da die Mechanismen, die zu dieser Anpassung der Synapsen führen, in hang-Mutanten offensichtlich defekt sind, war es Ziel dieser Arbeit zu erklären, wie HANG zu synaptischer Plastizität beiträgt. In diesem Zusammenhang war es besonders wichtig herauszufinden, in welchem neuronalen Prozeß HANG eine Rolle spielt. Antikörperfarbungen gegen HANG zeigten, da das Protein in allen neuronalen Zellkernen larvaler und adulter Gehirne vorhanden ist. Gehirne der hangAE10 Mutante zeigen keine Färbung, was bestätigt, da diese Tiere Nullmutanten für HANG sind. Eine genauere Analyse der Verteilung von HANG im Zellkern ergab, daß HANG in einem punktartigen Muster an bestimmten Stellen im Kern angereichert ist; diese HANG-Aggregate sind an der Innenseite der Kernmembran lokalisiert und colokalisieren nicht mit dem Chromatin. Auf der Basis dieser Ergebnissen wurde postuliert, daß HANG vermutlich an der Stabilisierung, Prozessierung oder dem Export von mRNAs beteiligt ist. Da synaptische Plastizität gut an den einzelnen Neuronen der neuromuskulären Synapse von Drosophila-Larven studiert werden kann, wurde die Morphologie der Motorneurone dritter Larven am Muskelpaar 6/7 des Segments A4 untersucht. Diese Untersuchungen zeigten, da Boutonanzahl und Axonlänge in hangAE10-Larven um 40 % erhöht sind. Außerdem zeigen einige Boutons der hang-Mutanten eine abnormale, sanduhrförmige Form, was darauf hinweist, daß sie nach Initiation der Bouton-Teilung möglicherweise in einem halb-separierten Zustand geblieben sind. Die Zunahme an Boutons in den Mutanten ist im wesentlichen auf eine Zunahme der Anzahl der Typ Ib-Boutons zurückzuführen. Die Analyse der Verteilung verschiedener synaptischer Marker in hangover-Mutanten ergab keine Hinweise auf Abnormalitäten im Zytoskelett oder in der Ausbildung der prä-und postsynaptischen Strukturen. Des weiteren ist die Anzahl der aktiven Zonen relativ zur Boutonoberfläche nicht verändert; da hang-Mutanten aber mehr synaptische Boutons pro synaptischem Terminal besitzen, kann man insgesamt von einer Zunahme der Anzahl der aktiven Zonen ausgehen. Die präsynaptische Expression von HANG in den Mutanten rettet die erhöhte Boutonanzahl und die verlängerten Axone, was ebenfalls beweist, daß die beobachteten synaptischen Defekte auf das Fehlen von HANG und nicht auf Sekundärmutationen zurückzuführen sind. Eine postsynaptische Expression der hangover cDNA in den Mutanten dagegen rettet den Phänotyp nicht. Die Anzahl der synaptischen Boutons wird unter anderem durch cAMP-Levels bestimmt, welche somit synaptische Plastizität regeln. Da hang-Mutanten eine erhöhte Boutonanzahl aufweisen, führte dies zu der Spekulation, daß der Phänotyp dieser Mutanten möglicherweise auf veränderte cAMPlevels zurückzuführen ist. Um dies zu überprüfen, wurde die Morphologie der neuromuskulären Synapsen von hangAE10-Larven mit denen von dnc1 verglichen, welche Defekte in der cAMP-Kaskade aufweisen. Einige Aspekte des Phänotyps (z. B. die Zunahme der Boutonanzahl und das Verhaltnis von aktiven Zonen pro Boutonfläche) sind sehr ¨ahnlich; jedoch unterscheiden sich die beiden Mutanten in anderen morphologischen Aspekten. Die Expression eines UAS-dnc-Transgens in hangover-Mutanten modifizierte den hang-Phänotyp ebenfalls nicht. Auf der Basis der Ergebnisse dieser Arbeit wurde ein Modell für die Funktion von HANG erstellt, nach dem dieses Protein vermutlich am Isoform-spezifischen Spleißen bestimmter Transkripte beteiligt ist, deren Produkte für die synaptische Plastizität an der neuromuskulären Synapse benötigt werden. N2 - The development of ethanol tolerance is due to changes in synaptic plasticity. Since the mechanisms mediating synaptic plasticity are probably defective in the mutant hangAE10, it was a goal of the present study to find out how HANG contributes to synaptic plasticity. In particular, it was important to clarify in which neuronal process HANG plays a role. Antibody stainings against HANG revealed that the protein is localized in all neuronal nuclei of larval and adult brains; the staining is absent in hangAE10, thus confirming that this P-element insertion stock is a protein null for HANG. Detailed analysis of the subnuclear distribution of HANG showed that HANG immunoreactivity is enriched at distinct spots in the nucleus in a speckled pattern; these speckles are found at the inside of the nuclear membrane and do not colocalize with chromatin nor with the nucleolus; thus, HANG is probably involved in the stabilization, processing or export of RNAs. As synaptic plasticity can be studied in single neurons at the larval neuromuscular junction, the morphology of the synaptic terminals of hangAE10 mutants was analyzed at muscle 6/7, segment A4. These studies revealed that hangAE10 mutants display a 40 % increase in bouton number and axonal branch length; in addition, some boutons have an abnormal hourglass-like shape, suggesting that they are arrested in a semi-separated state following the initiation of bouton division. The increase in bouton number of hang mutants is mainly due to an increase in numbers of type Ib boutons. The analysis of the distribution of several synaptic markers in hang mutants did not show abnormalities. The presynaptic expression of HANG in hang mutants rescues the increase in bouton number and axonal branch length, thus proving that the phenotypes seen in the P-element insertion hangAE10 are attributable to the lack of HANG rather than to effects of the P-element marker rosy or to a secondary hit on the same chromsome during mutagensis. This finding is further supported by the fact that postsynaptic expression of HANG does not rescue the abnormal NMJ morphology of hangAE10. Alterations in cAMP levels regulate the number of boutons; since hang mutants display an increase in bouton number, the questions was whether this morphological abnormality was due to defects in cAMP signalling. To test this hypothesis, hangAE10 NMJs were compared to those of the hypomorphic allele dnc1 that has a defective cAMP cascade. Some aspects of the NMJ phenotype (e.g. the increase in bouton number and the unaltered ratio of active zones per bouton area) are similar in hangAE10 and dnc1, other differ. Expression of a UAS-dnc transgene in hangAE10 mutants does not modify the phenotype. In summary, the results of this study indicate that nuclear protein HANG might be involved in isoform-specific splicing of genes required for synaptic plasticity at the NMJ. KW - Taufliege KW - Kater KW - Motorische Endplatte KW - Phänotyp KW - hangover KW - Drosophila KW - neuromuskuläre Synapse KW - hangover KW - Drosophila KW - neuromuscular junction Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14977 ER - TY - THES A1 - Schindelin, Johannes T1 - The standard brain of Drosophila melanogaster and its automatic segmentation T1 - Das Standardgehirn von Drosophila melanogaster und seine automatische Segmentierung N2 - In this thesis, I introduce the Virtual Brain Protocol, which facilitates applications of the Standard Brain of Drosophila melanogaster. By providing reliable and extensible tools for the handling of neuroanatomical data, this protocol simplifies and organizes the recurring tasks involved in these applications. It is demonstrated that this protocol can also be used to generate average brains, i.e. to combine recordings of several brains with the same features such that the common features are emphasized. One of the most important steps of the Virtual Insect Protocol is the aligning of newly recorded data sets with the Standard Brain. After presenting methods commonly applied in a biological or medical context to align two different recordings, it is evaluated to what extent this alignment can be automated. To that end, existing Image Processing techniques are assessed. I demonstrate that these techniques do not satisfy the requirements needed to guarantee sensible alignments between two brains. Then, I analyze what needs to be taken into account in order to formulate an algorithm which satisfies the needs of the protocol. In the last chapter, I derive such an algorithm using methods from Information Theory, which bases the technique on a solid mathematical foundation. I show how Bayesian Inference can be applied to enhance the results further. It is demonstrated that this approach yields good results on very noisy images, detecting apparent boundaries between structures. The same approach can be extended to take additional knowledge into account, e.g. the relative position of the anatomical structures and their shape. It is shown how this extension can be utilized to segment a newly recorded brain automatically. N2 - In dieser Arbeit wird das Virtual Brain Protocol vorgestellt, das die Anwendungen rund um das Standardgehirn von \dm\ erleichtert. Durch das Bereitstellen robuster und erweiterbarer Werkzeuge zum Verarbeiten neuroanatomischer Datensätze ermöglicht es ein strukturiertes Abarbeiten der häufig benötigten Vorgänge im Zusammenhang mit der Arbeit mit dem Standardgehirn. Neben der Einpassung neuer Daten in das Standardgehirn kann dieses Protokoll auch dazu verwendet werden, sogenannte Durchschnittshirne zu erstellen; Aufnahmen mehrerer Hirne mit der gleichen zu zeigenden Eigenschaft können zu einem neuen Datensatz kombiniert werden, der die gemeinsamen Charakteristika hervorhebt. Einer der wichtigsten Schritte im Virtual Insect Protocol ist die Alignierung neuer Datensätze auf das Standardgehirn. Nachdem Methoden vorgestellt werden, die üblicherweise im biologischen oder medizinischen Umfeld angewendet werden, um Hirne aufeinander zu alignieren, wird evaluiert, inwiefern dieser Prozess automatisierbar ist. In der Folge werden diverse bildverarbeitende Methoden in dieser Hinsicht beurteilt. Es wird demonstriert, dass diese Verfahren den Anforderungen sinnvoller Alignierungen von Hirnen nicht genügen. Infolgedessen wird genauer analysiert, welche Umstände berücksichtigt werden müssen, um einen Algorithmus zu entwerfen, der diesen Anforderungen genügt. Im letzten Kapitel wird ein solcher Algorithmus mithilfe von Methoden aus der Informationstheorie hergeleitet, deren Verwendung das Verfahren auf eine solide mathematische Basis stellt. Es wird weiterhin gezeigt, wie Bayesische Inferenz angewendet werden kann, um die Ergebnisse darüber hinaus zu verbessern. Sodann wird demonstriert, daß dieser Algorithmus in stark verrauschten Bilddaten ohne zusätzliche Informationen Grenzen zwischen Strukturen erkennen kann, die mit den sichtbaren Grenzen gut übereinstimmen. Das Verfahren kann erweitert werden, um zusätzliche Informationen zu berücksichtigen, wie etwa die relative Position anatomischer Strukturen sowie deren Form. Es wird gezeigt, wie diese Erweiterung zur automatischen Segmentierung eines Hirnes verwendet werden kann. KW - Taufliege KW - Gehirn KW - Segmentierung KW - Bildverarbeitung KW - Drosophila KW - Segmentierung KW - Kantenerkennung KW - Statistik KW - Bildverarbeitung KW - Drosophila KW - segmentation KW - EdgeDetection KW - statistics KW - ImageProcessing Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15518 ER - TY - THES A1 - Masek, Pavel T1 - Odor intensity learning in Drosophila T1 - Duftintensitätslernen bei Drosophila N2 - It has been known for a long time that Drosophila can learn to discriminate not only between different odorants but also between different concentrations of the same odor. Olfactory associative learning has been described as a pairing between odorant and electric shock and since then, most of the experiments conducted in this respect have largely neglected the dual properties of odors: quality and intensity. For odorant-coupled short-term memory, a biochemical model has been proposed that mainly relies on the known cAMP signaling pathway. Mushroom bodies (MB) have been shown to be necessary and sufficient for this type of memory, and the MB-model of odor learning and short-term memory was established. Yet, theoretically, based on the MB-model, flies should not be able to learn concentrations if trained to the lower of the two concentrations in the test. In this thesis, I investigate the role of concentration-dependent learning, establishment of a concentration-dependent memory and their correlation to the standard two-odor learning as described by the MB-model. In order to highlight the difference between learning of quality and learning of intensity of the same odor I have tried to characterize the nature of the stimulus that is actually learned by the flies, leading to the conclusion that during the training flies learn all possible cues that are presented at the time. The type of the following test seems to govern the usage of the information available. This revealed a distinction between what flies learned and what is actually measured. Furthermore, I have shown that learning of concentration is associative and that it is symmetrical between high and low concentrations. I have also shown how the subjective quality perception of an odor changes with changing intensity, suggesting that one odor can have more than one scent. There is no proof that flies perceive a range of concentrations of one odorant as one (odor) quality. Flies display a certain level of concentration invariance that is limited and related to the particular concentration. Learning of concentration is relevant only to a limited range of concentrations within the boundaries of concentration invariance. Moreover, under certain conditions, two chemically distinct odorants could smell sufficiently similarly such, that they can be generalized between each other like if they would be of the same quality. Therefore, the abilities of the fly to identify the difference in quality or in intensity of the stimuli need to be distinguished. The way how the stimulus is analyzed and processed speaks in favor of a concept postulating the existence of two separated memories. To follow this concept, I have proposed a new form of memory called odor intensity memory (OIM), characterized it and compared it to other olfactory memories. OIM is independent of some members of the known cAMP signaling pathway and very likely forms the rutabaga-independent component of the standard two-odor memory. The rutabaga-dependent odor memory requires qualitatively different olfactory stimuli. OIM is revealed within the limits of concentration invariance where the memory test gives only sub-optimal performance for the concentration differences but discrimination of odor quality is not possible at all. Based on the available experimental tools, OIM seems to require the mushroom bodies the same as odor-quality memory but its properties are different. Flies can memorize the quality of several odorants at a given time but a newly formed memory of one odor interferes with the OIM stored before. In addition, the OIM lasts only 1 to 3 hours - much shorter than the odor-quality memory. N2 - Assoziatives olfaktorisches Lernen bei Drosophila wurde ursprünglich als die Paarung eines Duftes mit einem elektrischen Bestrafungsreiz beschrieben. Seit langem ist dazu bekannt, daß Drosophila nicht nur lernen kann zwei Düfte zu unterscheiden, sondern auch verschiedene Konzentrationen desselben Dufts. Jedoch wird in den meisten auf diese Art durchgeführten Experimenten die Duftintensität weitestgehend ignoriert. - Für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis wurde ein biochemisches Modell vorgeschlagen, welches sich hauptsächlich auf die bekannte cAMP-Signalkaskade stützt. Es wurde gezeigt, dass die Pilzkörper (mushroom bodies, „MB“) notwendig und hinreichend für diese Art der Gedächtnisbildung sind und ein MB-Modell für Duftlernen und Kurzzeitgedächtnis konnte etabliert werden. Interessanterweise sollten Fliegen nach diesem Modell Konzentrationsunterschiede nur in einer Richtung lernen können. Sie würden den gelernten Duft nur gegenüber einer niedrigeren Konzentration wiedererkennen. In der vorliegenden Doktorarbeit habe ich das konzentrationsabhängige Duftlernen und seine Beziehung zum MB-Modell untersucht. Dabei hat sich gezeigt, dass die Fliege eine Gedächtnisspur für Geruchsintensität anlegt. Um den Unterschied zwischen dem Lernen einer Qualität und dem einer Intensität des gleichen Duftes hervorzuheben, habe ich versucht, den Reiz, der eigentlich von der Fliege gelernt wird, zu charakterisieren. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass die Fliege während des Trainings alle in diesem Zeitabschnitt präsentierten Reize erlernt. Erst der dem Training folgende Test scheint den Gebrauch der verfügbaren Information festzulegen. Diese Erkenntnis ist eine wesentliche Grundlage um zwischen dem Testergebnis und dem, was die Fliege gelernt hat zu unterscheiden. Ich habe außerdem gezeigt, daß das Konzentrationslernen eine Form assoziativen Lernens ist und, dass entgegen der Erwartung nach dem MB-Modell eine Symmetrie zwischen den Lernwerten für die hohe und niedrige Konzentration besteht. Es gibt keinen Beweis dafür, dass Fliegen eine Vielfalt von Konzentrationen desselben Duftes als ein und dieselbe (Duft-)Qualität wahrnehmen. Die Ergebnisse legen vielmehr nahe, dass sich bei einer größeren Veränderung der Intensität eines Duftes für die Fliege (wie in vielen Fällen auch beim Menschen) seine Qualität verändert. Demzufolge ist mit jedem Geruchsstoff mehr als nur eine Fliegen-subjektive Geruchsqualität verbunden. Fliegen zeigen andererseits in engen Grenzen Konzentrationsinvarianz. Sie generalisieren zwischen Konzentrationen eines Duftes innerhalb einer Konzentrationsdekade. Deshalb ist das Konzept des Konzentrationslernens nur für ein begrenztes Konzentrationsspektrum innerhalb der Grenzen der Konzentrationsinvarianz relevant. Des weiteren habe ich gezeigt, dass unter besonderen Bedingungen zwei chemisch verschiedene Düfte generalisiert werden können. Möglicherweise haben die beiden Düfte hinreichend "ähnliche" oder gleiche Fliegen-subjektive Qualität und können nur nach der Intensität unterschieden werden. Die Fliege hat die Fähigkeit im Test Unterschiede einerseits in der Qualität und andererseits in der Intensität des Reizes zu ermitteln. Die Art und Weise, wie der Reiz analysiert und verarbeitet wird, erfordern ein Konzept zweier getrennter Gedächtnisse. Dementsprechend habe ich eine neue Gedächtnisart, ein sogenanntes Duftintensitätsgedächtnis (OIM) vorgeschlagent und versucht dieses neben anderen olfaktorischen Gedächtnissen einzuordnen. Das OIM ist unabhängig bezüglich einiger Bestandteile des bekannten cAMP-Signalwegs und stellt höchstwahrscheinlich den rutabaga-unabhängigen Teil des Zwei-Düfte-Lernens dar. Das rutabaga-abhängige Duftgedächtnis benötigt qualitativ verschiedene Duftreize. Das OIM reicht lediglich für eine suboptimale Leistung aus, funktioniert aber in den Grenzen der Konzentrationsinvarianz, innerhalb derer die Diskriminierung und damit auch das Lernen der Duftqualität nicht möglich sind. Das OIM scheint wie die Duftqualitätsgedächtnisse die Pilzkörper zu benötigen. Aber die Art der Speicherung ist von der der Duftqualitätsgedächtnisse verschieden. Fliegen können viele Duftqualitäten zu einem bestimmten Zeitpunkt aus dem Gedächtnis abrufen, jedoch interferiert ein neu gebildetes Gedächtnis eines bestimmten Duftes mit dem bereits gespeicherten OIM. Außerdem ist das OIM für nur 1-3 Stunden stabil, was erheblich kürzer als beim Duftgedächtnis ist. KW - Taufliege KW - Geruchswahrnehmung KW - Gedächtnis KW - Lernen KW - Intensität KW - Olfaktorik KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Drosophila KW - intensity KW - olfaction KW - memory KW - learning KW - Drosophila Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15546 ER - TY - THES A1 - Cruz, Alexandre Bettencourt da T1 - Molecular and functional characterization of the swiss-cheese and olk mutants in Drosophila melanogaster : two approaches to killing neurons T1 - Molekulare und funktionelle Untersuchung der swiss-cheese und olk Mutanten in Drosophila melanogaster N2 - In this thesis two genes involved in causing neurodegenerative phenotypes in Drosophila are described. olk (omb-like), a futsch allele, is a micotubule associated protein (MAP) which is homologous to MAP1B and sws (swiss cheese) a serine esterase of yet unknown function within the nervous system. The lack of either one of these genes causes progressive neurodegeneration in two different ways. The sws mutant is characterized by general degeneration of the adult nervous system, glial hyperwrapping and neuronal apoptosis. Deletion of NTE (neuropathy target esterase), the SWS homolog in vertebrates, has been shown to cause a similar pattern of progressive neural degeneration in mice. NTE reacts with organophosphates causing axonal degeneration in humans. Inhibition of vertebrate NTE is insufficient to induce paralyzing axonal degeneration, a reaction called "aging reaction" is necessary for the disease to set in. It is hypothesized that a second "non-esterase" function of NTE is responsible for this phenomenon. The biological function of SWS within the nervous system is still unknown. To characterize the function of this protein several transgenic fly lines expressing different mutated forms of SWS were established. The controlled expression of altered SWS protein with the GAL4/UAS system allowed the analysis of isolated parts of the protein that were altered in the respective constructs. The characterization of a possible non-esterase function was of particular interest in these experiments. One previously described aberrant SWS construct lacking the first 80 amino acids (SWSΔ1-80) showed a deleterious, dominant effect when overexpressed and was used as a model for organophosphate (OP) intoxication. This construct retains part of its detrimental effect even without catalytically active serine esterase function. This strongly suggests that there is another characteristic to SWS that is not defined solely by its serine esterase activity. Experiments analyzing the lipid contents of sws mutant, wildtype (wt) and SWS overexpressing flies gave valuable insights into a possible biological function of SWS. Phosphatidylcholine, a major component of cell membranes, accumulates in sws mutants whereas it is depleted in SWS overexpressing flies. This suggests that SWS is involved in phosphatidylcholine regulation. The produced α-SWS antibody made it possible to study the intracellular localization of SWS. Images of double stainings with ER (endoplasmic reticulum) markers show that SWS is in great part localized to the ER. This is consistent with findings of SWS/ NTE localization in yeast and mouse cells. The olk mutant also shows progressive neurodegeneration but it is more localized to the olfactory system and mushroom bodies. Regarding specific cell types it seemed that specifically the projection neurons (PNs) are affected. A behavioral phenotype consisting of poor olfactory memory compared to wt is also observed even before histologically visible neurodegeneration sets in. Considering that the projection neurons connect the antennal lobes to the mushroom bodies, widely regarded as the "learning center", this impairment was expected. Three mutants where identified (olk1-3) by complementation analysis with the previously known futschN94 allele and sequencing of the coding sequence of olk1 revealed a nonsense mutation early in the protein. Consistent with the predicted function of Futsch as a microtubule associated protein (MAP), abnormalities are most likely due to a defective microtubule network and defects in axonal transport. In histological sections a modified cytoskeletal network is observed and western blots confirm a difference in the amount of tubulin present in the olk1 mutant versus the wt. The elaboration of neuronal axons and dendrites is dependent on a functional cytoskeleton. Observation of transport processes in primary neural cultures derived from olk1 mutant flies also showed a reduction of mitochondrial transport. Interaction with the fragile X mental retardation gene (dfmr1) was observed with the olk mutant. A dfmr1/ olk1 double mutant shows an ameliorated phenotype compared to the olk1 single mutant. tau, another MAP gene, was also shown to be able to partially rescue the olk1 mutant. N2 - In dieser Arbeit werden zwei neurodegenerative Mutanten in Drosophila beschrieben. Zum einen drei Allele des futsch Gens namens olk (omb-like). futsch wurde bereits als Mikrotubuli assoziertes Protein (MAP) beschrieben und ist als MAP1B Ortholog identifiziert worden. Zum anderen sws (swiss cheese), eine Serinesterase, deren Funktion im Nervensystem noch unbekannt ist. In sws mutanten Fliegen ist Vakuolisierung im gesamten Gehirn sichtbar, es handelt sich um einen generellen, progressiven, neurodegenerativen Phänotyp. Neuronale Apoptose wie auch multiple Membranhüllen um Gliazellen sind für die sws Mutanten charakteristisch. Die biologische Funktion von SWS innerhalb des Nervensystems ist bisher noch nicht geklärt. Vertebraten, die für das sws Ortholog NTE (neuropathy target esterase) mutant sind, zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie sws mutante Fliegen. Auch Vergiftung von NTE mit Organophosphaten kann zu axonaler Degeneration führen. Dabei ist jedoch die Inhibition von NTE nicht ausreichend um die Axondegeneration hervorzurufen. Eine weitere Reaktion, die sogenannte "Aging reaction" is notwendig um die paralysierende Wirkung auszulösen. Eine These besagt, dass NTE eine zweite, von der Esterasefunktion unabhängige Funktion ("Nicht-Esterase" Funktion) besitzt, die diese Wirkung auslöst. Zur Aufklärung der physiologischen Funktion von SWS wurden verschiedene transgene Fliegenlinien etabliert. Diese produzieren verschiedene, mutierte Formen des SWS Proteins, dessen Expression mit Hilfe des GAL4/ UAS Systems genau gesteuert werden kann. Diese Methode erlaubt eine eingehende Untersuchung einzelner Proteindomänen, die in den jeweiligen Konstrukten verändert waren. Insbesondere die Charakterisierung der möglichen "Nicht-Esterase" Funktion war von Interesse. Eine bereits beschriebene mutante Form des SWS Proteins, dem die ersten 80 Aminosäuren fehlen (SWSΔ1-80), zeigte einen dominanten degenerativen Effekt. Die Überexpression von SWSΔ1-80 führt, wie auch die Vergiftung mit bestimmten Organophosphaten, zur Degeneration der betroffenen Zellen und wurde deshalb als Modell für Organophosphatvergiftung herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Konstrukt auch dann einen schädlichen Effekt zeigt, wenn die katalytische Serinesterasefähigkeit durch Mutation entfernt wurde. Dies deutet die Möglichkeit an, dass SWS eine, von der Esteraseaktivität unhabhängige, Funktion ausüben kann. Ein Vergleich des Lipidgehalts von sws Mutanten mit wt und SWS überexprimierenden Fliegen gab wertvolle Hinweise auf eine mögliche biologische Funktion von SWS. Der Gehalt an Phosphatidylcholin, ein Hauptbestandteil von Zellmembranen, scheint in sws Mutanten erhöht zu sein, während es in SWS überexprimierenden Fliegen in geringeren Mengen zu finden ist. Dies weist darauf hin, dass SWS an der Phosphatidylcholinregulation beteiligt sein könnte. Der in dieser Arbeit hergestellte α-SWS Antikörper ermöglichte eine genauere intrazelluläre Lokalisation des SWS Proteins. Doppelfärbungen mit einem ER (Endoplasmatisches Retikulum) Marker zeigen, dass ein grosser Anteil von SWS im ER zu finden ist. Dies stimmt mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnisse zur Lokalisation von SWS/ NTE in Hefe- und Mauszellen überein. Die olk Mutante zeigt ebenfalls progressive Neurodegeneration, die Effekte sind jedoch lokaler, insbesondere das olfaktorische System und die Pilzkörper sind betroffen. Die Projektionsneurone (PN) degenerieren in dieser Mutante innerhalb von etwa 20 Tagen. Noch vor der histologisch sichtbaren Degeneration ist bereits ein Verhaltensphänotyp erkennbar, der sich in schlechter, olfaktorischen Lernleistung äussert. Projektionsneurone verbinden die Antennalloben und die Pilzkörper, die als "Lernzentren" gelten, daher entspricht ein Lerndefekt den Erwartungen. Die drei olk Mutanten (olk1-3) wurden durch Komplementationstests mit dem publizierten futschN94 Allel als weitere futsch Allele identifiziert. In olk1 zeigte die Sequenzierung der kodierenden Sequenz eine Mutation, die frühzeitig zu einem Stopcodon im Protein führt. Die Degenerationserscheinungen in der Mutanten sind vermutlich auf Defekte im Mikrotubulinetzwek und axonalen Transport zurück zu führen. In histologischen Gehirnschnitten sind Veränderungen im Zytoskelett zu beobachten und Western Blots deuten auf einen erhöhten Tubulingehalt in der olk1 Mutante hin. Für die Entwicklung von Axonen und Dendriten ist ein intaktes Zytoskelett unentbehrlich. Transportprozesse sind in olk1 Mutanten ebenso betroffen, insbesondere ist der mitochondriale Transport reduziert. Das fragile X mental retardation Gen (dfmr1) interagiert mit der olk Mutante, so dass eine dfmr1/ olk1 Doppelmutante einen weniger starken Phänotyp zeigt als die olk1 Mutante. tau, ein weiteres MAP Gen, besitzt ebenso die Fähigkeit den olk1 Phänotyp partiell zu suprimieren. KW - Taufliege KW - Nervendegeneration KW - Molekulargenetik KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese KW - Drosophila KW - neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17734 ER - TY - THES A1 - Ritze, Yvonne T1 - Die Rolle des Neurotransmitters Serotonin bei der Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz in Drosophila melanogaster T1 - The role of the neurotransmitter serotonin in the developement of ethanol sensitivity and tolerance in Drosophila melanogaster N2 - Der Neurotransmitter Serotonin spielt ein Rolle bei der Entwicklung von Ethanoltoleranz und Alkoholismus. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Funktion von Serotonin (5HT) im Bezug auf Ethanolsensitivität und Toleranz in Drosophila melanogaster. Pharmakologisch wurden die 5HT Konzentrationen durch Füttern eines Vorläufers der 5HT Synthese kurzeitig erhöht oder mit einem Syntheseinhibitor reduziert. Die Veränderung der 5HT Konzentrationen mittels dieser Pharmaka hatte jedoch keinen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanolsensitivität oder Toleranz. 5HT wird durch den 5HT Transporter (SERT) aus dem synaptischen Spalt in die Präsynapse wieder aufgenommen. Die kurzzeitige Fütterung des SERT Inhibitors Paroxetin führt zu erhöhter Ethanolsensitivität und reduzierter Toleranz. Ein ähnlicher Phänotyp wurde in der hypomorphen sert55 Mutante, die eine reduzierte dsert Expression aufweist, beobachtet. Dies legt nahe, dass kurz- wie langfristige Reduktion der SERT Funktion die Entwicklung einer vollständigen Ethanoltoleranz verhindern. Folglich hat die Verlängerung der 5HT Signaltransduktion im synaptischen Spalt, nicht aber die allgemeine Erhöhung von 5HT Konzentrationen im Fliegengehirn einen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanoltoleranz. Zur genauen Bestimmung der SERT Expression im adulten Gehirn der Fliege wurde ein Drosophila SERT (dSERT) Antikörper hergestellt. Mit Hilfe dieses Antikörpers konnte gezeigt werden, dass der dSERT mit serotonergen Somata, Axonen und Dendriten kolokalisiert. Ferner sollten 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt durch Überexpression des wildtypischen dsert in einem Großteil der Neurone mit Hilfe des UAS/GAL4 Systems reduziert werden. Diese Fliegen wiesen weder eine veränderte 5HT Konzentration in den Köpfen auf noch war die Ethanolsensitivität bzw. Toleranz verändert. Das kann einerseits daran liegen, dass der dSERT nicht in die Membran integriert wird oder andererseits daran, dass unser Konstrukt nicht funktional ist. Die Überexpression eines inaktiven dSERTs sollte theoretisch zur Erhöhung von 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt führen. Wurde ein inaktiver dSERT in den meisten Neuronen der Fliege exprimiert, erhöhten sich zwar die 5HT Konzentrationen in den Köpfen der Fliegen, dennoch war das ethanolinduzierte Verhalten nicht verändert. Zusätzlich wurde untersucht, welchen Einfluss die Inhibition der 5HT Ausschüttung auf die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz hat. Zur Inhibition der Neurotransmission in serotonergen Zellen wurde ein Tetanus Toxin (TNT) Transgen in Verbindung mit verschiedenen GAL4 Treiberlinien eingesetzt. Die Inhibition von serotonergen und dopaminergen Neuronen mit Hilfe einer GAL4 Linie, die einen Abschnitt des Gens der Dopamin Decarboxylase (ddc) beinhaltet, führte zu keiner Veränderung von Ethanolsensitivität bzw. Toleranz. Für weitere GAL4 Linien wurde zunächst das Expressionsmuster neuroanatomisch untersucht. Von vier ausgewählten GAL4 Linien zeigten zwei Expression in serotonergen Neuronen. Die sert1+2-GAL4 Linie mit einem Stück Promotorregion des dsert zeigt Expression in 46% der serotonergen Neuronen. Wurden diese mit Hilfe von Tetanus Toxin inhibiert, zeigten die Fliegen eine leicht aber signifikant erhöhte Ethanolsensitivität und eine unveränderte Toleranz. Die zweite GAL4 Linie enthält ein Stück Promotorregion des 5HT1b Rezeptors und zeigt Expression in ebenfalls 46% der serotonergen Neurone, weitgehend überlappend mit der Expression der Linie sert1+2-GAL4. Jedoch exprimiert die 5htr1b-GAL4 Linie zusätzlich in vier serotonergen Neuronen, in elf dopaminergen und einem unbekannten Neuron. Interessanterweise ist nach Inhibition der Neurotransmission in diesen Neuronen eine stark erhöhte Ethanolsensitivität sowie eine reduzierte Ethanoltoleranz zu beobachten. Folglich könnte die Inhibition der Neurotransmission in dopaminergen Neuronen für die Reduktion der Ethanolsensitivität verantwortlich sein. Deshalb wurde die Neurotransmitteraussschüttung in dopaminergen Neuronen mit Hilfe der th-GAL4 Linie und TNT unterdrückt und diese Fliegen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Ethanolsensitivtät und/oder Toleranz zu entwickeln. Nach Inhibition der von th-GAL4 getriebenen dopaminergen Neurone wurde eine erhöhte Ethanolsensitivität gemessen, aber keine signifikant veränderte Ethanoltoleranz. Da die ddc-GAL4 Linie im Vorfeld keinen ethanolinduzierten Verhaltensphänotyp gezeigt hat, sollte bestimmt werden, welche dopaminergen Neuronen der 5htr1b-GAL4 sowie der th-GAL4 Linie für die erhöhte Ethanolsensitivität verantwortlich sind. Serotonerge Neuronengruppen, die in die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz involviert sein könnten, sind SE1, SE2, SE3, LP1, LP2, SP1, SP2 und IP, während es sich bei den dopaminergen Neuronengruppen um PAL1, PPL1, PPM2, PPM3 und SVP1 handeln könnte. Einige Neurone der 5htr1b-GAL4 Linie projizieren in den Ellipsoidkörper, eine Struktur des Zentralkomplexes, für die bereits gezeigt wurde, dass sie in die Entwicklung vonEthanoltoleranz involviert ist. Jedoch muss näher untersucht werden, welche Neuronen für die Innervation verantwortlich sind. Dafür sollten GAL4 Linien verwendet werden, die eine ähnliche Expression wie die 5htr1b-GAL4 Linie, aber ausschließlich im Ellipsoidkörper, zeigen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass serotonerge und dopaminerge Neurone in die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz in Drosophila melanogaster involviert sind. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine veränderte 5HT Signaltransduktion zu einer reduzierten Toleranz führt. Weiterführend ist die Identifizierung von serotonergen Neuronen, die für die Entwicklung von Ethanolsensitivität und/oder Toleranz verantwortlich sind, von großem Interesse. Ziel ist es, die neuronalen Schaltkreise aufzudecken, die den Phänomenen Ethanolsensitivität und Toleranz zugrundeliegen. N2 - Serotonin dysregulation is strongly implicated in the development of ethanol tolerance and alcoholism. This work examined the role of the neurotransmitter 5HT in the development of ethanol sensitivity and tolerance in Drosophila melanogaster. Using a pharmacologic approach 5HT concentrations were increased after feeding a 5HT precursor or decreased after feeding a 5HT synthesis inhibitor. This change of 5HT concentrations did not influence the development of ethanol sensitivity or tolerance. Reuptake of 5HT into the pre-synapse is regulated via a 5HT transporter (SERT). After feeding the SERT reuptake inhibitor Paroxetin an increase in ethanol sensitivity and a reduction in tolerance was observed. A reduction of SERT expression in the hypomorph sert55 mutant leads to a similar phenotype. Supposing short-term as well as long-term reduction of SERT function inhibits the development of normal ethanol tolerance. Therefore, the prolonged 5HT signalling within the synaptic cleft, but not the overall raising of 5HT concentrations in fly brains has an influence on the development of ethanol tolerance. To determine the SERT expression in the adult brain of the fly, a Drosophila SERT (dSERT) antibody was generated. This antibody co-localizes with serotonergic somata, axons and dendrites. Furthermore, 5HT concentrations were reduced in the synaptic cleft, through over-expression of a wildtype dSERT in most neurons using the UAS/GAL4 system. Those flies neither showed a change in 5HT concentrations in heads, nor a changed development of ethanol sensitivity and tolerance. On the one hand this can be due to dSERT that is not integrated in the membrane of the pre-synapse or on the other hand that our construct is not functioning. Over-expression of an inactive dSERT should theoretically lead to an increased 5HT signalling in the synaptic cleft. The inactive dSERT was expressed in most neurons and increased 5HT concentrations in heads, but had no influence on ethanol induced behavior. Moreover it was investigated, what influence the inhibition of 5HT neurotransmission has on the development of ethanol sensitivity and tolerance. To inhibit the neurotransmission of serotonergic cells a tetanus toxin transgene in combination with various GAL4 driver lines was used. The inhibition of serotonergic and dopaminergic neurons using a GAL4 driver line that contains a fragment of the dopamine decarboxylase gene does not influence ethanol sensitivity, or tolerance. For additional GAL4 lines first the expression pattern was studied by neuroanatomy. Out of four selected GAL4 lines two showed expression in serotonergic neurons. The sert1+2-GAL4 line which included a fragment of the dsert promotor region shows expression in 46% of the serotonergic neurons. Inhibition of those neurons with tetanus toxin shows a slight, but significant increase in ethanol sensitivity, but normal tolerance. The second GAL4 line contains a promotor fragment of the 5HT1b receptor gene and also expresses GAL4 in 46% of the serotonergic neurons, largely overlapping with the expression pattern of the sert1+2-GAL4 line. However, the 5htr1b-GAL4 line in addition expresses GAL4 in four serotonergic, eleven dopaminergic and one unknown neuron. Interestingly, after inhibition of those neurons, increased ethanol sensitivity and reduced tolerance was observed. The inhibition of neurotransmission in those dopaminergic neurons could be responsible for increased ethanol sensitivity. In the next step, we therefore inhibited neurotransmission exclusively in dopaminergic neurons using a GAL4 line with a gen fragment of the enzyme tyrosine hydroxylase (th-GAL4) and tested those flies for ethanol sensitivity and tolerance. After inhibition of neurons driven by the th-GAL4 line increased ethanol sensitivity was measured, but normal tolerance. We wanted to find out, which dopaminergic neurons of the 5htr1b-GAL4 and the th-GAL4 line are responsible for increased ethanol sensitivity. Serotonergic groups of neurons that could be involved in the development of ethanol sensitivity and tolerance are SE1, SE2, SE3, LP1, LP2, SP1, SP2 and IP, whereas dopaminergic neurons that might play a role could belong to the groups PAL1, PPL1, PPM2, PPM3 and SVP1. Some neurons of the 5htr1b-GAL4 line project into the ellipsoid body, a structure of the central complex that was shown previously to be involved in the development of ethanol tolerance. Therefore it should be investigated which neurons are responsible for the innervation of the ellipsoid body. In this case GAL4 lines should be used, that show a similar expression pattern as our 5htr1b-GAL4 line, but exclusively express GAL4 in neurons that project into the ellipsoid body, to investigate if inhibition of a small subset of neurons influences ethanol sensitivity and/or tolerance. In this work, for the first time, the involvement of the serotonergic and dopaminergic system in the development of ethanol sensitivity and tolerance was demonstrated in the fly. Furthermore we showed that modified 5HT signalling leads to a reduced tolerance. The next step is to identify serotonergic and dopaminergic neurons that are responsible for the development of ethanol sensitivity and tolerance. Our intention is to reveal neuronal frameworks that underlie ethanol sensitivity and tolerance. KW - Ethanol KW - Drosophila KW - Serotonin KW - Serotonintransporter KW - Ethanol KW - Drosophila KW - Serotonin KW - Serotonintransporter Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26271 ER -