TY - THES A1 - Tribl, Florian T1 - Isolierung und Charakterisierung Neuromelanin-assoziierter Proteine aus Neuromelanin-Granula des menschlichen Gehirns mittels subzellulärer Proteomanalyse T1 - - N2 - Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen Untersuchungen zur Bildung des Pigments Neuromelanin, das die Ursache für die dunkle Farbgebung der humanen Substantia nigra pars compacta ist. Eine Beteiligung von Neuromelanin an den pathobiochemischen Ereignissen bei Parkinson-Krankheit erklärt das klinische Interesse an Neuromelanin. Die Untersuchungsmöglichkeiten von Neuromelanin sind limitiert: einerseits ist eine chemische Strukturaufklärung aufgrund der Unlöslichkeit dieses amorphen Polymers kaum zu bewerkstelligen, andererseits wird mangels geeigneter biologischer Testsysteme ein Einblick in die Biogenese von Neuromelanin verwehrt. Zurzeit wird die Bildung von Neuromelanin anhand der beiden konkurrierenden Hypothesen als Autoxidation von Dopamin oder durch Beteiligung eines Enzyms („Tyrosinase-Konzept“) erklärt. In dieser Arbeit wurden beide hypothetischen Ansätze bearbeitet, wobei einer enzymatischen Biogenese von Neuromelanin die Präferenz gegeben wird. Zur globalen Untersuchung von Neuromelanin-Granula wurde nun erstmals eine Isolierung der Pigment-haltigen Organelle vorgestellt, die die Basis für eine umfassende Proteomanalyse mittels 1-D-SDS-PAGE und ESI-Tandem-Massenspektrometrie bildete. Mit diesem methodischen Ansatz wurden ingesamt 73 Proteinen identifiziert. Diese waren vor allem lysosomalen Proteinen zuordenbar, z.B. charakteristischen Membranproteinen (LAMP-1), sämtlichen Proteasen, Proteinen des Metabolismus von (Glyco-)Lipiden und Glycoproteinen, aber auch Proteinen des Cytosols und des vesikulären Verkehrs. Entscheidend war die Anwesenheit von Proteinen des Endoplasmatischen Reticulums (ER); Calnexin gilt als ein melanogenes Chaperon, das nicht in Lysosomen vorkommt, dagegen aber in Lysosomen-verwandten Organellen. Im Vergleich mit bereits existierenden Proteinprofilen von Lysosomen und Lysosomen-verwandten Organellen zeigten die in Neuromelanin-Granula identifizierten lysosomalen Proteine und Proteine des ER, dass diese Organellen der humanen Substantia nigra keine konventionellen Lysosomen sind, sondern mit hoher Wahrscheinlichkeit der Gruppe der Lysosomen-verwandten Organellen zuzuordnen sind. N2 - This work focusses on the formation of the polyphenolic pigment neuromelanin, which accounts for the dark colour of the human substantia pars compacta. A contribution of neuromelanin to the patho-biochemical events in Parkinson’s disease is suggested, which is the reason for the clinical interest in this pigment. The analytical approaches to investigate neuromelanin are limited: on the one hand, an elucidation of the chemical structure is hardly possible to accomplish due to the insolubility of this amorphous polymer, on the other hand, the lack of appropriate biological test systems prevents insight into the biogenesis of neuromelanin. Currently the formation of neuromelanin is addressed by two competing hypotheses either by autoxidation of dopamine (“autoxidative concept”), or by contribution of an enzyme (“tyrosinase concept”). This work covered both hypothetical approaches, but the concept of an enzymatic biogenesis of neuromelanin is preferred. Aiming at a global analysis of these pigmented organelles, the isolation of neuromelanin granules was introduced for the first time, which formed the basis for an extensive proteomic analysis by 1-D SDS-PAGE and ESI tandem mass spectrometry. Subsequently, the analyses by mass spectrometry facilitated the identification of 73 proteins, most of which were attributable to lysosomal proteins, e.g. characterisitcal membrane proteins (LAMP-1), various proteases, proteins engaged in the metabolism og (glycol)-lipids and glycoproteins, but also cytosolic proteins and proteins involved in vesicular traffic. Intriguingly, there were proteins identified which originate form the endoplasmic reticulum (ER), most notably calnexin, a melanogenic chaperone, which is not found in lysosomes but in lysosome-related organelles. By comparison of yet existing protein profiles of lysosomes and lysosome-related organelles it became clear that neuromelanin granules from the human substatia nigra are no conventional lysosomes, but should rather be attributed to the group of lysosome-related organelles. KW - Melanin KW - Organell KW - Proteomanalyse KW - Parkinson-Krankheit KW - Proteom KW - Massenspektrometrie KW - Parkinson KW - Neuromelanin KW - Organelle KW - proteome KW - mass spectrometry KW - parkinson KW - neuromelanin KW - organelle Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16117 ER - TY - THES A1 - Simon, Karoline T1 - Development and Evaluation of a Generic HPLC-Tandem MS Screening Method for the Detection of Potential Biomarkers for Reactive Intermediates T1 - Entwicklung und Evaluierung einer generischen HPLC-Tandem MS Methode zur Detektion potentieller Biomarker für Reaktive Intermediate N2 - Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices. N2 - Konjugation reaktiver Intermediate mit Proteinen oder DNA kann zu toxischen Effekten wie Hepatotoxizität, Neutropenie, Allergien, Tumoren u.a. führen. Zwischen 1975 und 1999 wurden 2.9% der zugelassenen Arzneistoffe wegen Auftretens solcher unerwünschten, toxischen Nebenwirkungen vom Markt genommen. Daher stellen Substanzen, die reaktive Intermediate bilden können, ein großes Problem in der Arzneistoffentwicklung dar. Aus diesem Grund ist die pharmazeutische Forschungsindustrie daran interessiert, solche potenziell toxischen Substanzen bereits in frühen Phasen der Arzneistoffentwicklung zu erfassen. Elektrophile, reaktive Intermediate sind instabil und reagieren schnell mit nukleophilen Substraten. Die Konjugation reaktiver Intermediate mit Glutathion stellt hierbei einen der Hauptmechanismen der Detoxifizierung im Organismus dar. In vivo können enzymatisch geregelte Reaktionen das Glutathionaddukt abbauen und so zur Bildung renal ausscheidbarer Merkaptursäuren führen, die auch zu den entsprechenden Sulfoxiden oxidiert werden können. Man kann Merkaptursäuren aber auch direkt durch Konjugation mit N-Acetyl-L-cystein gewinnen. So können reaktive Intermediate in vitro generiert und als Merkaptursäuren detektiert und nicht-invasiv auch in vivo erfasst werden. Ziel dieser Arbeit war es, eine HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur einfachen und schnellen Detektion und Charakterisierung von bekannten und unbekannten Merkaptursäuren als Biomarker für die Bildung reaktiver Metabolite in verschiedenen Matrices zu entwickeln und zu evaluieren. Für alle untersuchten Merkaptursäuren und deren Sulfoxide war ein Neutralverlust von 129 Da (im negativen Ionenmodus) charakteristisch. Dieser entstand durch Spaltung der Schwefel-Kohlenstoff-Bindung im Merkaptursäureanteil und diente als Basis für die Entwicklung der HPLC-MS/MS-Methode. Dafür wurde ein CNL-Scan auf 129 Da im negativen Ionenmodus durchgeführt. Der CNL-Scan konnte unter Verwendung der vorhandenen Ionenfalle mit zwei Produkt-ionen-Scans (EPI) mit unterschiedlichen Kollisionsenergien kombiniert und für eine Charakterisierung der detektierten Signale verwandt werden. Nach Optimierung der Instrument- und HPLC-Parameter wurden für die einzelnen Referenzsubstanzen Nachweisgrenzen im Bereich von 0.3 bis 15.5 pmol on column (entspricht einem Bereich von 20 ng/ml bis 800 ng/ml) in Rattenurin bestimmt. Für die In-vitro-Evaluierung der CNL-Screening-Methode wurden die Modellsubstanzen Paracetamol, Diclofenac, Troglitazon, Bifonazol, Clozapin, Carbamazepin und Bisphenol A auf die Bildung reaktiver Intermediate hin untersucht, die durch Zusatz von N-acetylcystein abgefangen wurden. Um eventuell Aufschluß über gewebe- oder speziesspezifische Toxizitäten von Arzneistoffen zu bekommen, wurden die Modellsubstanzen in stimulierten neutrophilen Granulozyten und in Ratten- und Humanlebermikrosomen inkubiert. Speziesspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit Ratten- und Humanlebermikrosomen wurden bei Paracetamol und Diclofenac beobachtet. Organspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit neutrophilen Granulozyten und humanen Lebermikrosomen wurden bei Diclofenac, Carbamazepin, Clozapin und Bifonazol gefunden. Die HPLC-MS/MS-Screening-Methode wurde durch Messungen von Ratten- und Humanurinproben auch in vivo evaluiert. Arzneistoffbezogene Merkaptursäuren wurden in Urinproben von Ratten gemessen, die über eine Schlundsonde Paracetamol (20 mg/kg und 640 mg/kg K.G.) bzw. Diclofenac (10 mg/kg und 20 mg/kg K.G.) zugeführt bekommen hatten. Humanurin wurde nach Gabe einer therapeutischen Dosis von 500 mg Paracetamol und einer subtherapeutischen Dosis von 50 mg analysiert. Neben der bekannten Merkaptursäure des N-acetylbenzochinonimins (NAPQI) wurde ein weiterer Metabolit (m/z 327) dosisabhängig in den Urinproben von Ratte und Mensch detektiert. Durch nähere Untersuchungen zur Identifizierung dieses Metaboliten anhand von Referenzsubstanzen und deren Massenspektren konnte nachgewiesen werden, dass das Merkapturat des NAPQI zu stereoisomeren Sulfoxiden oxidiert wurde. Bei den Diclofenac-Proben wurde zum ersten Mal ein Metabolit mit m/z 441 in Rattenurin detektiert und charakterisiert, der nur in Inkubationen mit stimulierten neutrophilen Granulozyten, jedoch nicht mit Lebermikrosomen gebildet wurde. Mit der entwickelten HPLC-MS/MS Screening Methode konnten weitere, vom Arzneistoff unabhängige Merkaptursäuren im Urin detektiert und charakterisiert werden. Schließlich zeigen die Ergebnisse zur In-vitro- und In-vivo-Evaluierung die Vorteile dieser schnellen und generischen HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur Detektion von Merkaptursäuren, die mit minimaler Probenvorbereitung und hohem Probendurchsatz für verschiedene Matrices eingesetzt werden kann. KW - Acetylcysteinderivate KW - Reaktive Zwischenstufe KW - Biomarker KW - HPLC-MS KW - Merkaptursäuren KW - Biomarker KW - Massenspektrometrie KW - reaktive Metabolite KW - mercapturic acids KW - biomarker KW - mass spectrometry KW - reactive metabolites Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21916 ER - TY - THES A1 - Deubel, Alexandra T1 - Charakterisierung des Verunreinigungsprofils von Erythromycin mittels chromatographischer Methoden und massenspektrometrischer Detektion T1 - Characterization of the Impurity Profile of Erythromycin by means of chromatographic methods and mass spectrometric Detection N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden analytische Methoden zur Bestimmung des Verunreinigungsprofils von Erythromycin entwickelt, die der bestehenden Ph.Eur.-Methode überlegen sind. Die neue HPLC-Methode ist in der Lage, alle verwandten Verbindungen mit angemessener Präzision nachzuweisen und zu quantifizieren. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten alle Hauptkomponenten und verwandten Verbindungen der Base, ihrer Ester und Salze eindeutig identifiziert und quantifiziert werden. Zudem konnten zwei neue verwandte Verbindungen von Erythromycin gefunden und als N,N-Didemethylerythromycin A und Anhydroerythromycin F identifiziert werden. N2 - Within this work analytical methods for determination of the impurity profile of erythromycin were developed. These methods show clear improvements compared to the current methods described in the Ph.Eur. The new HPLC method is able to separate and quantify all related substances with an acceptable precision. The mass spectrometry shows the suitability for the direct qualitative and quantitative analysis of the base, ester and salts of erythromycin. Moreover using ion trap two new, unexpected EA related substances could be detected and identified as N,N-didemethylerythromycin A and anhydroerythromycin F. KW - Erythromycin KW - Verunreinigung KW - HPLC KW - Massenspektrometrie KW - Erythromycin KW - HPLC KW - MS KW - Verunreinigungsprofil KW - neue Verunreinigungen KW - erythromycin KW - HPLC KW - mass spectrometry KW - new impurities Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20160 ER - TY - THES A1 - Wolpert, Daniel T1 - Quantum Control of Photoinduced Chemical Reactions T1 - Quantenkontrolle von photoinduzierten chemischen Reaktionen N2 - The control of quantum mechanical processes, especially the selective manipulation of photochemical reactions by shaped fs laser pulses was successfully demonstrated in many experiments in the fields of physics, chemistry and biology. In this work, attention is directed to the control of two systems that mark a bridge to real synthetic chemistry. In a liquid phase environment the outcome of the photo-induced Wolff rearrangement of an industrially relevant diazonaphthoquinone compound, normally used in photoresists (e.g. Novolak) was optimized using shaped fs laser pulses. In the second series of experiments chemical reactions on a catalyst metal surface which comprise laser induced molecular bond formation channels were selectively manipulated for the first time. The control of liquid phase reactions necessitates adequate spectroscopic signals that are characteristic for the formed product species. Therefore, a pump-probe setup for transient absorption spectroscopy in the mid-infrared for the purpose of investigating ultrafast structural changes of molecules during photoreactions was constructed. This versatile setup enables to monitor structural changes of molecules in the liquid phase and to find appropriate feedback signals for the control of these processes. Prior to quantum control experiments, the photoinduced Wolff-rearrangement reaction of 2-diazo-1-naphthoquinone (DNQ) dissolved in water and methanol was thoroughly investigated. Steady state absorption measurements in the mid-infrared in combination with quantum chemical density functional theory (DFT) calculations revealed the characteristic vibrational bands of DNQ and of possible products. A mid-infrared transient absorption study was performed, to illuminate the structural dynamics of the ultrafast rearrangement reaction of DNQ. The experimental observations indicate, that the Wolff rearrangement reaction of DNQ proceeds within 300 fs. A model for the relaxation dynamics of the ketene photoproduct and DNQ after photoexcitation can be deduced that fits the measured data very well. The object of the quantum control experiments on DNQ was the improvement of the ketene yield. It was shown that the ketene formation after Wolff rearrangement of DNQ is very sensitive to the shape of the applied excitation laser pulses. The variation of single parameters, like the linear chirp as well as the pulse separation of colored double pulses lead to the conclusion that the well known intrapulse dumping mechanism is responsible for the impact of the frequency ordering within the excitation pulse on the photoproduct yield. Adaptive optimizations using a closed learning loop basically lead to the same result. Adaptive fs quantum control was also applied to surface reactions on a catalyst metal surface for the first time. Therefore, the laser-induced catalytic reactions of carbon monoxide (CO) and hydrogen (H2) on a Pd(100) single crystal surface were studied. This photochemical reaction initiated with fs laser pulses has not been observed before. Several product molecules could be synthesized, among them also species (e.g. CH^3+) for whose formation three particles are involved. The systematic variation of different parameters showed that the reactions are sensitive to the catalyst surface, the composition of the adsorbate and to the laser properties. A pump-probe study revealed that they occur on an ultrafast time scale. These catalytic surface reactions were then investigated and improved with phaseshaped fs laser pulses. By applying a feedback optimal control scheme, the reaction outcome could be successfully manipulated and the ratio of different reaction channels could be selectively controlled. Evidence has been found that the underlying control mechanism is nontrivial and sensitive to the specific conditions on the surface. The experiments shown here represent the first successful experiment on adaptive fs quantum control of a chemical reaction between adsorbate molecules on a surface. In contrast to previous quantum control experiments, reaction channels comprising the formation of new molecular bonds rather than the cleavage of already existing bonds are controlled. This work successfully showed that quantum control can be extended to systems closer to situations encountered in synthetic chemistry as was demonstrated in the two examples of the optimization of a complicated rearrangement reaction and the selective formation of chemical bonds with shaped fs laser pulses. N2 - Die Kontrolle quantenmechanischer Prozesse, insbesondere die selektive Manipulation photochemischer Reaktionen mit Hilfe geformter fs-Laserpulse wurde auf den Gebieten der Physik, Chemie und Biologie in vielen Experimenten erfolgreich gezeigt. In dieser Arbeit wird das Augenmerk auf die Kontrolle zweier Systeme gerichtet, die eine Brücke zur synthetischen Chemie darstellen. In der flüssigen Phase wurde das Resultat der photoinduziertenWolff Umlagerung einer industriell relevanten Diazonaphthoquinone Verbindung, die gewöhnlich in Photolacken (z.B. Novolak) Verwendung findet, durch geformte fs-Laserpulse optimiert. In der zweiten Reihe von Experimenten wurden chemische Reaktionen auf einer Katalysator-Metalloberfläche, die Kanäle mit laserinduzierter molekularer Bindungsknüpfung beinhalten, zum ersten Mal selektiv beeinflusst. Für die Kontrolle von Reaktionen in der flüssigen Phase benötigt man geeignete spektroskopische Messsignale, die charakteristisch für die gebildeten Produktspezies sind. Zu diesem Zweck wurde ein Versuchsaufbau für Anrege-Abfrage Experimente zur transienten Absorptionsspektroskopie im mittleren Infrarot aufgebaut, um ultraschnelle strukturelle Veränderungen von Molekülen während Photoreaktionen zu untersuchen. Dieser vielseitige Versuchsaufbau ermöglicht die Messung struktureller Veränderungen in Molekülen in flüssiger Phase und damit das Auffinden geeigneter Rückkopplungssignale zur Kontrolle dieser Prozesse. Vor den Quantenkontrollexperimenten wurde die photoinduzierte Wolff Umlagerung von 2-Diazo-1-Naphthoquinone (DNQ) in den Lösungsmitteln Wasser und Methanol sorgfältig untersucht. Lineare Absorptionsmessungen im mittleren Infrarot in Verbindung mit quantenchemischen Dichtefunktionaltheorie (DFT) Rechnungen lieferten die charakteristischen Schwingungsbanden von DNQ und möglichen Photoprodukten. Untersuchungen mit transienter Absorptionsspektroskopie im mittleren Infrarot wurden durchgeführt, um die strukturelle Dynamik der ultraschnellen Umlagerungsreaktion von DNQ zu beleuchten. Die experimentellen Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Wolff Umlagerung von DNQ innnerhalb von 300 fs abläuft. Ein Modell für die Relaxationsdynamik des Keten Photoprodukts und DNQ, dass die gemessenen Daten sehr gut beschreibt wurde abgeleitet. Das Ziel der Quantenkontrollexperimente an DNQ war die Erhöhung der Ketenausbeute. Es wurde gezeigt, dass die Bildung des Keten nach der Wolff Umlagerung des DNQ empfindlich auf die Form der Anregungspulse reagiert. Die Variation einzelner Parameter, wie des linearen Chirps sowie des Pulsabstands von farbigen Doppelpulsen führen zu dem Schluss, dass der gut bekannte Intrapuls-Abregemechanismus verantwortlich für den Einfluss der Frequenzfolge innerhalb des Anregepulses auf die Ausbeute des Photoprodukts ist. Adaptive Optimierungen führen zum gleichen Ergebnis. Adaptive Quantenkontrolle wurde auch erstmalig auf Oberflächenreaktionen auf einer Katalysator-Metalloberfläche angewendet. Dazu wurden die laserinduzierten katalytischen Oberflächenreaktionen von Kohlenmonoxid (CO) und Wasserstoff (H2) auf einer Pd(100) Einkristalloberfläche untersucht. Diese photochemische Reaktion, die durch fs-Laserpulse ausgelöst wird wurde bisher noch nicht beobachtet. Mehrere Produktmoleküle konnten synthetisiert werden, darunter auch Moleküle für deren Bildung mindestens drei Eduktmoleküle zusammenkommen und reagieren müssen. Die systematische Änderung verschiedener Parameter zeigte, dass die Reaktionen von der Katalysatoroberfläche, der Zusammensetzung des Adsorbats und den Eigenschaften der fs-Laserpulse abhängen. Eine Anrege-Abfrage Untersuchung machte deutlich, dass die Reaktionen auf einer ultrakurzen Zeitskala ablaufen. Diese katalytischen Oberflächenreaktionen wurden im Anschluss mit Hilfe von phasengeformten fs-Laserpulsen weiter untersucht und gezielt gesteuert. In adaptiven Quantenkontrollexperimenten konnte das Reaktionsergebnis sowie das Verhältnis unterschiedlicher Reaktionskanäle selektiv manipuliert werden. Es wurden Hinweise gefunden, dass der zugrundeliegende Kontrollmechanismus nichttrivial ist und von den genauen Bedingungen auf der Oberfläche abhängt. Diese Experimente stellen die ersten erfolgreichen adaptiven Quantenkontrollexperimente an einer chemischen Reaktion zwischen Adsorbatmolekülen auf einer Oberfläche dar. Im Gegensatz zu bisherigen Quantenkontrollexperimenten wurden hierbei Reaktionskanäle optimiert, die die Formung und nicht nur den Bruch einer molekularen Bindung umfassen. Diese Arbeit zeigt, dass die Methoden der Quantenkontrolle auf Systeme, die den Situationen in der synthetischen Chemie nahekommen, erfolgreich angewendet werden können, wie mit den zwei Beispielen, der Optimierung einer komplizierten Umlagerungsreaktion und der selektiven Bildung chemischer Bindungen mit geformten fs-Laserpulsen demonstriert wurde. KW - Nichtlineare Spektroskopie KW - Infrarotspektroskopie KW - Massenspektrometrie KW - Laserchemie KW - Femtosekundenpulse KW - Pulsformung KW - Quantenkontrolle KW - quantum control KW - pulse shaping KW - femtosecond pulses KW - time-of-flight mass spectrometry KW - infrared spectroscopy KW - nonlinear spectroscopy Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27171 ER - TY - THES A1 - Menzel, Michael T1 - Olivenöl: Untersuchungen zur Herkunft und Authentizität mittels Multielement-Isotopenverhältnismassenspektrometrie T1 - Olive oil: Analysis of origin and authenticity by means of Isotope Ratio Mass Spectrometry N2 - Natives Olivenöl, ein wegen seiner allgemein als positiv betrachteten Wirkung auf die menschliche Gesundheit geschätztes, teures Öl, lässt sich nur aus Oliven hoher Qualität produzieren. Es gibt Autoren, die davon ausgehen, dass lediglich ein kleiner Teil (etwa 10 %) der geernteten Oliven geeignet ist, Spitzenqualitäten an nativen Ölen hervorzubringen. Den-noch finden sich in den Supermarktregalen fast nur Öle der höchsten Qualitätsstufe „extra nativ“. Man vermutet, dass dieses offensichtliche Missverhältnis von der Verwendung illegal teilraffinierter desodorierter Öle (so z.B. Lampantöle) herrührt, um diese minderwertigen Ölsorten so zu „extra nativen“ Ölen unerlaubt aufzuwerten. Darüber hinaus erscheint es als wahrscheinlich, dass Olivenöle aus Ländern, die traditionell eine niedrige Qualität produzieren (meist außerhalb der EU), unter falscher Herkunftsangabe verkauft werden. Von legislativer Seite betrachtet, regelt die EU-Verordnung VO (EWG) Nr. 2068/91 Analysenmethoden und Qualitätsklassen speziell für Olivenöle. Da diese Angaben nicht mehr den aktuellen An-forderungen genügen und somit keine zuverlässige Basis zu Authentizitätsbewertungen lie-fern, ist die Entwicklung neuer Ansätze zur Authentizitäts- und Herkunftsanalytik von Oliven-ölen unausweichlich. Eine in vielen anderen Bereichen bewährte Methode ist hierbei die der Isotopenverhältnismassenspektroskopie (IRMS). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand der IRMS eine Methode zu entwickeln, mit der die Authentizität hochwertiger nativer Olivenöle überprüft werden kann. Im Gegensatz zu den wenigen in der Literatur veröffentlichten Modelluntersuchungen sollte dies durch Scree-ning einer hohen Anzahl von Ölproben aus Groß- und Einzelhandel geschehen; so wurden von uns 165 Olivenöle untersucht, davon 50 aus Italien, 29 aus Spanien, 27 aus Frankreich, 23 aus Griechenland, 20 „Billigöle“ unbekannter Herkunft, 4 aus der Türkei, jeweils 3 aus Chile und Tunesien, jeweils 2 aus Portugal und Australien sowie jeweils 1 Öl aus Israel und den USA (Kalifornien). In Anbetracht der experimentellen Unzulänglichkeiten, die sich bei Messung von Ölproben, die unter kontrollierten Wachstums- und/oder Extraktionsbedingun-gen erhalten wurden, ergeben, wurde bewusst nahezu ausschließlich Handelsware unter-sucht. Zunächst erfolgten Bestimmungen der Wasserstoff-, Kohlenstoff- und Sauerstoff-Isotopenverhältnisse der Olivenöle mittels Elementaranalysator- Isotopenverhältnismassen-spektroskopie (EA-IRMS); die ermittelten Bereiche der Isotopenverhältnisse lagen für Was-serstoff zwischen δ2HVSMOW= -161 und -114 ‰, für Kohlenstoff zwischen δ13CVPDB= -31,7 und -26,1 ‰, und zwischen δ18OVSMOW= 15,8 und 31,1 ‰ für Sauerstoff. Zudem wurde das Wasserstoff- und Kohlenstoff-Isotopenverhältnis des mittels Säulenchromatographie (SC) aus den Ölen jeweils isolierten Squalens ebenfalls anhand von EA-IRMS Analysen bestimmt. Die IRMS-Werte lagen zwischen δ2HVSMOW= -174 und -144 ‰ sowie δ13CVPDB= -32,3 und -26,6 ‰. Ferner erfolgten IRMS-Messungen in der Kopplung mit der Kapillargaschromatographie (HRGC-IRMS). So wurden die Wasserstoff-Isotopenverhältnisse von Palmitinsäure- und Öl-säuremethylester (Palmitinsäuremethylester δ2HVSMOW= -156 und -95 ‰, Ölsäuremethylester δ2HVSMOW= -157 und -107 ‰) ermittelt und durch die Bestimmung deren relativer Gehalte im Öl ergänzt (Schwankungsbreite zwischen 15 und 35 % für Palmitinsäure sowie zwischen 39 und 78 % für Ölsäure). Mittels multidimensionaler Skalierung (MDS) erfolgte eine statistische Betrachtung und Auswertung der einzelnen Datensätze sowie aller erhaltenen Daten in Kombination. Dabei zeigte sich, dass mittels massenspektrometrischer Stabilisotopenuntersuchung eine Bewertung der Herkunft und Qualität von Olivenölen nicht möglich ist. Dies steht im Wider-spruch zu den Ergebnissen einiger in der Literatur publizierter Studien, bei denen unter kon-trollierten Bedingungen gewonnene Olivenöle (d.h. die wenn stets gleiche Bedingungen an Sorte, Extraktion und Wachstum herrschten) mit der Stabilisotopenanalytik im Nachhinein definiert werden konnten. Anhand der von uns durchgefühten Screening-Untersuchungen einer hohen Anzahl Proben konnte jedoch gezeigt werden, dass unter realistischen Kontrollbedingungen (mit nicht vorselektierter Probenauswahl) eine Untersuchung mittels IRMS zur Beurteilung von Herkunft und Qualität von Olivenölen nicht hilfreich ist. N2 - The virgin olive oil is considered to be a healthy, high-priced and appreciated oil that can only be produced from olives of high quality. Some authors estimate that only a small part (about 10%) of harvested olives are suitable to produce high quality virgin oils. Nevertheless, in the supermarkets one finds almost solely olive oils of the highest category, i.e. “extra virgin”. It is supposed that this inadequacy derives from from illegal partial raffination processes (mainly desodoration) to ”recycle“ low-quality “lampant oils” with the objective to sell these as virgin olive oils of best geographical indication. Additionally, it is assumed that olive oils produced in countries with traditionally lower quality standards (mainly outside of the European Union) are sold under wrong description of their origin. From the legislative point of view, EU regulation provides olive oils´ analysis methods and defines its quality categories. As these legislative analytical methods are considered to be out of date, they cannot serve as a reliable tool to authenticate oil quality; hence, the development of new approaches is needed. Isotope ratio mass spectroscopy (IRMS), a powerful tool used for authenticity assessment in many other domains, could be a promising method. The aim of this study was to elaborate an IRMS based method to distinguish real high quality virgin olive oils from the not authentic ones. In contrast to the limited data presented in litera-ture, this should performed by screening a large number of commercial oil samples mainly from supermarkets and wholesale trade; therefore 165 olive oils were investigated, among them 50 from Italy; 29 from Spain; 27 from France; 23 from Greece; 20 low-quality oils (origin not declared); 4 from Turkey; 3 from Chile and Tunisia, respectively; 2 from Portugal and Australia, respectively; and one from Israel and the U.S. (California), respectively. Aware of the inadequateness in measuring oil samples derived from controlled extraction and/or growth processes, we decided to choose this more practice-oriented way of investigation by measuring commercial samples. In the first series of our studies, the hydrogen, carbon and oxygen isotope ratios of the oils were determined via EA-IRMS; hydrogen values ranged between δ2HVSMOW= -161 and -114 ‰, carbon values varied between δ13CVPDB= -31,7 and -26,1 ‰ and oxygen isotope ratios varied between δ18OVSMOW= 15,8 and 31,1 ‰. Additionally, the sqalen´s hydrogen and carbon isotope ratios were measured via EA-IRMS after isolation by means of column chromatog-raphy (values ranging between δ2HVSMOW= -174 and -144 ‰, δ13CVPDB= -32,3 and -26,6 ‰). Last but not least, hydrogen isotope ratios of fatty acid methyl esters of palmitic and oleic acid were determined using HRGC-IRMS (values ranging between δ2HVSMOW= -156 and -95 ‰ for palmitic acid methylester and δ2HVSMOW= -157 and -107 ‰ for oleic acid methylester); additionally, their relative concentration was measured (palmitic acid 15-35 %, oleic acid 39-78 %). By means of multidimensional scaling (MDS), statistical examinations of the single data sets and of all data together were performed. It was shown that IRMS based methods are not a satisfactory tool to detect oil falsifications or a misleading indication of origin. In contrast to the data presented in literature, it has to be concluded that isotope ratio analysis a posteriori (that means no limitations in the area of origin or controlled extraction or growth processes) can not be used to characterise oil quality. In this respect, the contribution of such controlled studies can be considered as very limited. The developement of new, non-IRMS based methods to control olive oil quality should be advanced. KW - Massenspektrometrie KW - Isotopenhäufigkeit KW - Authentizität KW - Olivenöl KW - Herkunftsnachweis KW - Isotopenhäufigkeit KW - Isotopenmassenspektroskopie KW - IRMS KW - FSME KW - Öl KW - Kaltgepresstes Öl KW - Multidimensionale Skalierung KW - Squalen KW - Ölsäure KW - Terpene KW - Isotpe ratio mass spectrometry KW - olive oil KW - squalene KW - fatty acid methyl ester KW - authenticity Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54633 ER - TY - THES A1 - Börner, Juliane T1 - Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor für das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie T1 - Characterization of the phosphorylation sites of Guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide, by mass spectrometry application N2 - Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekundären Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erhöht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-überexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Domäne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten übereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem stärker ausgeprägt war als bei der ANP-abhängigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivität und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivität des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle trägt zum Verständnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zusätzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen möglich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben können. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP), via its guanylyl cyclase A (GC-A) receptor and intracellular guanosine 3’,5’-cyclic monophosphate production, is critically involved in the regulation of blood pressure. In patients with chronic heart failure, the plasma levels of ANP are increased, but the cardiovascular actions are severely blunted, indicating a receptor or postreceptor defect. Studies on metabolically labelled GC-A-overexpressing cells have indicated that GC-A is extensively phosphorylated, and that ANP induced homologous desensitisation of GC-A correlates with receptor dephosphorylation, a mechanism which might contribute to a loss of function in vivo. In this study, tandem MS analysis of the GC-A receptor, expressed in the human embryonic kidney cell line HEK 293, revealed that the intracellular domain of the receptor is phosphorylated at multiple residues: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 and Thr513. MS quantification based on multiple reaction monitoring demonstrated that ANP-provoked homologous desensitisation was accompanied by a complex pattern of receptor phosphorylation and dephosphorylation. The population of completely phosphorylated GC-A was diminished which is in agreement with published data. However, the phosphorylation of GC-A at Ser487 was selectively enhanced after exposure to ANP. In contrast, the Angiotensin II-provoked heterologous desensitisation resulted in a complete reduction of phosphorylation, which was even more intensive than after ANP-dependend desensitisation. The functional relevance of the newly identified phosphorylation site at serin 487 was analysed by site-directed mutagenesis. The substitution of Ser487 by alanine which mimics dephosphorylation resulted in a receptor which could be activated and desensitised like the GC-A wild-type receptor. However, the substitution by glutamate (which mimics phosphorylation) blunted the activation of the GC-A receptor by ANP, but prevented further desensitisation. These data corroborate previous studies suggesting that the responsiveness of GC-A to ANP is regulated by phosphorylation. However, in addition to the dephosphorylation of the previously postulated sites (Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510), homologous desensitisation seems to involve the phosphorylation of GC-A at Ser487. Identification and characterisation of this phosphorylation site therefore contribute to the understanding of homologous desensitisation. Additionally, some of the detected phosphorylated residues were detected in cells endogenously expressing the GC-A receptor. Therefore future analyses of the mechanisms which are involved in the activation and desensitisation under pathophysiological conditions might be possible. KW - Guanylatcyclase KW - Phosphorylierung KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Massenspektrometrie KW - Guanylyl cyclase A KW - phosphorylation sites KW - atrial natriuretic peptide KW - mass spectrometry Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914 ER - TY - THES A1 - Nuwal, Tulip T1 - Characterization of Synapsin, Tubulin-Binding Chaperone E-like, And Their Putative Interactions With Synapse Associated Protein Of 47 kDa In Drosophila melanogaster N2 - In this thesis we have used Drosophila melanogaster as a model organism to investigate proteins and their putative interacting partners that are directly or indirectly involved in the release of neurotransmitters at the synapse. We have used molecular techniques to investigate conserved synaptic proteins, synapsin and synapse associated protein of 47 kD (SAP47), and a putative interaction partner of SAP47, tubulin binding chaperone E-like (TBCEL). SAP47 and synapsins are highly conserved synaptic vesicle associated proteins in Drosophila melanogaster. To further investigate the role and function of Sap47 and Syn genes, we had earlier generated the null mutants by P-element mutagenesis (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western blots and ELISA of brain homogenates from Sap47156 null mutants showed the presence of up-regulated phospho-synapsin in comparison to wild-type (CS) and the presence of up-regulated phospho-synapsin was partially abolished when a pan-neuronal rescue of SAP47 was performed by the Gal4- UAS technique. Thus, the results suggest a qualitative and quantitative modulation of synapsin by SAP47. At the transcript level, we did not observe any difference in content of Syn transcript in Sap47156 and wild-type CS flies. The question of a direct molecular interaction between SAP47 and synapsin was investigated by co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments and we did not find any stable interactions under the several IP conditions we tested. The possibility of Sap47 as a modifier of Syn at the genetic level was investigated by generating and testing homozygous double null mutants of Sap47 and Syn. The Syn97, Sap47156 double mutants are viable but have a reduced life span and decreased locomotion when compared to CS. In 2D-PAGE analysis of synapsins we identified trains of spots corresponding to synapsins, suggesting that synapsin has several isoforms and each one of them is posttranslationally modified. In an analysis by Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D- PAGE) and Western blot we observed synapsin and SAP47 signals to be present at 700-900 kDa and 200-250 kDa, respectively, suggesting that they are part of large but different complexes. We also report the possibility of Drosophila synapsin forming homo- and heteromultimers, which has also been reported for synapsins of vertebrates. In parallel to the above experiments, phosphorylation of synapsins in Drosophila was studied by IP techniques followed by 1D-SDS gel electrophoresis and mass spectrometry (in collaboration with S. Heo and G. Lubec). We identified and verified 5 unique phosphorylation sites in Drosophila synapsin from our MS analysis. Apart from phosphorylation modifications we identified several other PTMs which have not been verified. The significance of these phosphorylations and other identified PTMs needs to be investigated further and their implications for synapsin function and Drosophila behavior has to be elucidated by further experiments. In a collaborative project with S. Kneitz and N. Nuwal, we investigated the effects of Sap156 and Syn97 mutations by performing a whole Drosophila transcriptome microarray analysis of the individual null mutants and the double mutants (V2 and V3). We obtained several candidates which were significantly altered in the mutants. These genes need to be investigated further to elucidate their interactions with Sap47 and Syn. In another project, we investigated the role and function of Drosophila tubulin- binding chaperone E-like (Tbcel, CG12214). The TBCEL protein has high homology to vertebrate TBCE-like (or E-like) which has high sequence similarity to tubulin-binding chaperone E (TBCE) (hence the name TBCE-Like). We generated an anti-TBCEL polyclonal antiserum (in collaboration with G. Krohne). According to flybase, the Tbcel gene has only one exon and codes for two different transcripts by alternative transcription start sites. The longer transcript RB is present only in males whereas the shorter transcript RA is present only in females. In order to study the gene function we performed P- element jump-out mutagenesis to generate deletion mutants. We used the NP4786 (NP) stock which has a P(GawB) insertion in the 5’ UTR of the Tbcel gene. NP4786 flies are homozygous lethal due to a second-site lethality as the flies are viable over a deficiency (Df) chromosome (a deletion of genomic region spanning the Tbcel gene and other upstream and downstream genes). We performed the P-element mutagenesis twice. In the first trial we obtained only revertants and the second experiment is still in progress. In the second attempt, jump-out was performed over the deficiency chromosome to prevent homologous chromosome mediated double stranded DNA repair. During the second mutagenesis an insertion stock G18151 became available. These flies had a P-element insertion in the open reading frame (ORF) of the Tbcel gene but was homozygous viable. Western blots of fresh tissue homogenates of NP/Df and G18151 flies probed with anti-TBCEL antiserum showed no TBCEL signal, suggesting that these flies are Tbcel null mutants. We used these flies for further immunohistochemical analyses and found that TBCEL is specifically expressed in the cytoplasm of cyst cells of the testes and is associated with the tubulin of spermatid tails in wild-type CS, whereas in NP/Df and G18151 flies the TBCEL staining in the cyst cells was absent and there was a disruption of actin investment cones. We also found enrichment of TBCEL staining around the actin investment cone. These results are also supported by the observation that the enhancer trap expression of the NP4786 line is localised to the cyst cells, similar to TBCEL expression. Also, male fertility of NP/Df and G18151 flies was tested and they were found to be sterile with few escapers. Thus, these results suggest that TBCEL is involved in Drosophila spermatogenesis with a possible role in the spermatid elongation and individualisation process. N2 - In dieser Arbeit benutzte ich Drosophila melanogaster als Modellorganismus für die Untersuchung von Proteinen und ihren möglichen Interaktionspartnern, die direkt oder indirekt an der Freisetzung von Neurotransmittern an der Synapse beteiligt sind. Für die Untersuchung der konservierten synaptischen Proteine Synapsin (SYN) und Synapsen-assoziertes Protein von 47 kDa (SAP47), sowie ihrer möglichen Interaktionspartner, bediente ich mich molekularer Methoden. SAP47 und SYN sind hoch konservierte Proteine von Drosophila melanogaster, die mit synaptischen Vesikeln assoziert sind. Um die Rolle und Funktion der Sap47- und Syn-Gene näher zu beleuchten, wurden bereits früher mit Hilfe von P-Element Mutagenesen Null Mutanten generiert (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western Blots und ELISA der Gehirnhomogenate der Sap47156 Nullmutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp (CS) das Vorhandensein von hochreguliertem phospho-Synapsin. Dieser Effekt ließ sich durch ein panneuronales Rescue wieder partiell rückgängig machen. Diese Ergebnisse lassen eine qualitative sowie quantitative Modulation von SYN druch SAP47 vermuten. Auf der Transkriptebene konnte ich keinen Unterschied im Gehalt von Syn Transkript zwischen den Sap47156 und wildtypischen CS Fliegen feststellen. Das Vorhandensein einer direkten molekularen Interaktion zwischen SAP47 und SYN wurde in Co-Immunopräzipitations-Experimenten (CO-IP) untersucht. Ich konnte unter diversen getesteten IP Bedingungen keine stabilen Interaktionen finden. Die Möglichkeit, dass Sap47 auf der molekularen Ebene modifizierend auf das Syn-Gen wirkt, wurde durch das Erzeugen und Testen homozygoter doppelter Nullmutanten für Sap47 und Syn untersucht. Syn97, Sap47156 Doppelmutanten sind lebensfähig, zeigen jedoch eine im Vergleich zu CS reduzierte Lebensspanne und Lokomotion. In einer 2D-SDS-PAGE Analyse der Synapsine identifizierte ich Reihen von Synapsin-Signalen, die darauf schließen ließen, dass Synapsin über mehrere Isoformen verfügt, von denen jede mehrfach posttranslational modifiziert ist. In einer Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D-PAGE) mit anschließendem Western Blot konnte ich Synapsin und SAP47 Signale bei 700-900 kDa beziehungsweise 200-250 kDa feststellen, was darauf schließen ließ, dass sie als Komponenten von unterschiedlichen größeren Komplexen fungieren. Ich zeigte außerdem die Möglichkeit auf, dass Drosophila Synapsin Homo- und Heteromultimere bilden kann, was bereits für Synapsine von Wirbeltieren gezeigt wurde. Gleichzeitig mit den obigen Experimenten untersuchte ich durch IP Methoden, gefolgt von 1D SDS Gelelektrophorese und Massenspektroskopie (in Zusammenarbeit mit S. Heo und G. Lubec), die Phosphorylierung der Synapsine in Drosophila. In der MS Analyse konnte ich 5 distinkte Phosphorylierungs-Stellen des Drosophila Synapsins identifizieren und verifizieren. Zusätzlich zu den Modifikationen durch Phosphorylierung konnte ich einige andere posttranslationale Modifikationen zeigen, die jedoch nicht verifiziert wurden. Die Bedeutung dieser Phosphorylierung, sowie anderer identifizierter Modifikationen, sollte durch weitere Experimente beleuchtet werden. In einem Kollaborationsprojekt mit S. Kneitz und N. Nuwal untersuchte ich die Auswirkungen der Sap47156 und Syn97 Mutationen mithilfe einer Microarray Analyse des gesamten Drosophila Transkriptoms der individuellen Nullmutanten sowie Doppelmutanten (V2 und V3). Es wurden einige Kandidaten gefunden, die in den Mutanten signifikante Änderungen aufweisen. Diese Gene sollten weiterhin auf ihre Interaktionen mit Sap47 und Syn untersucht werden. In einem weiteren Projekt untersuchte ich die Rolle und Funktion des Drosophila tubulin binding chaperon E-like-Gens(Tbcel, CG12214). Das TBCEL Protein weist eine hohe Homologie zum Vertebraten TBCE-like (oder E-like) auf, welches über eine namensgebende hohe Sequenzähnlichkeit zum Tubulin bindenden Chaperon E (TBCE) verfügt. Ich erzeugte ein polyklonales anti-TBCEL Antiserum (in Kollaboration mit G. Krohne). Laut Flybase besitzt das Tbcel-Gen nur ein Exon und kodiert für zwei unterschiedliche Transkripte durch alternative Orte des Transkriptionsstarts. Das längere Traskript RB ist nur in Männchen vorhanden, während das kürzere Transkript RA sich nur in Weibchen finden lässt. Um eine Untersuchung der Genfunktion zu ermöglichen, führte ich eine P-Element jump-out-Mutagenese durch, mit der Deletions-Mutanten generiert werden sollten. Ich benutzte dazu den Stamm NP4786 (NP), welches eine P(GawB) Insertion in der 5´ UTR des Tbcel-Gens aufweist. NP4786 Fliegen sind aufgrund einer second-site Lethalität homozygot letal, da sie über einer chromosomalen Defizienz (Df) (einer Deletion der genomischen Region, die das Tbcel-Gen sowie benachbarte Gene umfasst) lebensfähig sind. Die P-Element jump-out-Mutagenese wurde von mir zweimal durchgeführt, wobei ich beim ersten Mal nur Revertanten erhielt, während der zweite Durchgang sich momentan noch in Arbeit befindet. Beim zweiten Versuch wurde der jump-out über dem Defizienz-Chromosom durchgeführt, um eine doppelsträngige DNA Reparatur durch das homologe Chromosom zu verhindern. Während der zweiten Mutagenese wurde ein Stamm G18151 verfügbar, bei welchem die P-Element Insertion im offenen Leseraster (Open reading frame: ORF) des Tbcel-Gens erfolgt war. Western Blots von frischem Gewebehomogenat der NP/Df und G18151 Fliegen zeigten nach dem Testen mit anti-TBCEL Antiserum kein Signal, was darauf schließen lässt, dass diese Fliegen Tbcel Nullmutanten sind. Ich verwendete diese Fliegen für weitere immunhistochemische Analysen und fand heraus, dass TBCEL im Wildtyp spezifisch im Zytoplasma der Cysten-Zellen der Hoden exprimiert wird, sowie mit dem Tubulin der Spermatidenschwänze assoziert ist, während es in den NP/Df und G18151 Fliegen keine TBCEL-Färbung der Cysten-Zellen gab. Des weiteren konnte eine Störung der Actin Kegel und eine Anreicherung von TBCEL um diese herum gezeigt werden. Diese Ergebnisse werden zusätzlich durch die Beobachtung unterstützt, dass die Enhancer-trap Expression der NP4786 Linie analog zu dem TBCEL in den Cysten-Zellen lokalisiert ist. Zusätzlich wurde die Fertilität der NP/Df und G18151 Männchen getestet und gezeigt, dass diese Tiere nahezu vollständig steril sind. Die Ergebnisse lassen daher vermuten, dass TBCEL an der Spermatogenese bei Drosophila beteiligt ist, sowie eine mögliche Rolle bei der Elongation und Individualisierung der Spermatiden spielt. KW - Taufliege KW - Synapsine KW - Molekularbiologie KW - synaptisch protein KW - synapsin KW - tubulin binding chaperone E-like KW - SAP47 KW - Massenspektrometrie KW - synaptic proteins KW - synapsin KW - tubulin binding chaperone E-like KW - SAP47 KW - mass spectrometry Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51683 ER - TY - THES A1 - Bank, Stephanie T1 - LC-ESI und MALDI-Massenspektrometrische Analyse nativer und derivatisierter Zucker und Glykane T1 - LC-ESI and MALDI mass spectrometric analysis of native and derivatised carbohydrates and glycans N2 - Glykane sind weitverbreitete Biomoleküle, die meist in Form von Glykokonjugaten, wie beispielsweise als Glykoproteine oder Glykolipide, vorliegen. Durch die Interaktion von Glykanen mit Glykan-bindenden Proteinen wird eine Vielzahl an biochemischen Prozessen ausgelöst, sowohl physiologischer, als auch pathologischer Art. Die Aufklärung der beteiligten Glykanstrukturen ist daher nicht nur wichtig für das Verständnis dieser Prozesse, sondern kann auch Hinweise auf verschiedene Erkrankungen geben. Die Identifizierung von Glykanstrukturen kann über verschiedene Wege erfolgen. In der instrumentellen Analytik spielt dabei vor allem die ESI- und MALDI Massenspektrometrie eine wichtige Rolle, da diese sowohl für Detektion, als auch Fragmentierung großer Biomoleküle geeignet sind. Um die Analyse von Zuckern mittels chromatographischer und massenspektrometrischer Methoden zu erleichtern, werden häufig Derivatisierungsreagenzien eingesetzt. Diese verringern die Polarität der Zucker und erleichtern die Detektion durch das Einbringen von Chromo- oder Fluorophoren. Zur Derivatisierung am reduzierenden Terminus von Glykanen und Zuckern eignen sich vor allem Aminierungsreagenzien oder Hydrazide. Hydrazide haben gegenüber anderen Derivatisierungsreagenzien den Vorteil einer einfachen, salzfreien Umsetzung, aus der ein stabiles Derivat mit geschlossenem terminalen Zuckerring hervorgeht. Für die vorliegende Arbeit wurde die Derivatisierung mit den neuen Hydrazid Reagenzien INH und BINH, sowie dem bereits von Dr. P. Kapková bearbeiteten BACH untersucht. Als Vergleich dienten die underivatisierten Kohlenhydrate, wie auch das standardmäßig eingesetzte Aminierungsreagenz 2-AB. Dabei sollte das Ver-halten verschiedener Zucker und Glykane in Bezug auf chromatographische Trennung, Signalintensität und Fragmentierung analysiert werden. Zunächst wurde die Umsetzung von Mono-, Di- und Trisacchariden mit den neuen Derivatisierungsreagenzien INH und BINH optimiert. Dadurch konnte bei beiden Substanzen die komplette Umsetzung der Zucker in ihre Derivate gewährleistet werden. Auch die Derivatisierung mit Hilfe der Mikrowelle konnte bei INH erfolgreich durchgeführt werden. Auf diese Weise ließ sich die Reaktionszeit, im Vergleich zu den im Thermo-mixer® benötigten 90 Minuten, auf 20 Minuten verkürzen. Aufgrund der großen Men-gen an Zucker und Derivatisierungsreagenz, die für die Umsetzung in der Mikrowelle nötig sind, war der Versuch jedoch nur für INH geeignet. Im nächsten Schritt wurde das Trennverhalten der verschiedenen Mono-, Di- und Tri-saccharid-Derivate auf RP-C18- und HILIC-Phasen untersucht. Bei den Monosaccha-riden konnte durch keines der Derivate eine vollständige Trennung auf einer der Pha-sen erreicht werden. Das beste Ergebnis wurde durch INH auf der HILIC-Säule erzielt, doch auch dort konnten die Epimere Glucose, Mannose und Galactose nicht vollstän-dig separiert werden. Die Trennung der Disaccharide Maltose, Cellobiose und Lactose konnte auf der HILIC-Phase mit allen Derivaten außer BACH erfolgreich durchgeführt werden, auf der RP-C18 erwies sich dagegen nur 2-AB als geeignet. Bei den Trisac-chariden 3'SLN und 6'SLN konnten sowohl underivatisierte Zucker, als auch sämtliche Derivate mittels HILIC getrennt werden. Auch auf der C18-Phase war eine Trennung der BINH, BACH und 2-AB-Derivate möglich. Des Weiteren konnte durch die Derivati-sierungen die Signalintensität gegenüber den underivatisierten Zuckern deutlich gesteigert werden. Nach ihrer Trennung lassen sich massegleiche Di- und Trisaccharide anhand des Fragmentierungsmusters unterscheiden. Während bei den underivatisierten Disaccha-riden Maltose, Cellobiose und Lactose die charakteristischen Fragmente nur schwach sichtbar waren, konnte mit Hilfe der Hydrazide INH, BINH und BACH die Differenzie-rung deutlich erleichtert werden. Die 2-AB-Derivatisierung zeigte dagegen keine Ver-besserung der Fragmentierungseigenschaften. Bei der Unterscheidung der Trisaccharide 3’SLN und 6’SLN waren ebenfalls sowohl underivatisierte, als auch Hydrazid-derivatisierte Zucker im Vorteil gegenüber den 2-AB-Derivaten. Die Derivatisierung der N-Glykane von Ribonuclease B und Ovalbumin führte bei der Analyse mittels MALDI-TOF zu einer deutlichen Steigerung der Sensitivität. Beispiels-weise ließen sich bei den Glykanen des Ovalbumins durch die Derivatisierungen drei zusätzliche Strukturen im Vergleich zu den nativen Glykanen detektieren. Auch das Fragmentierungsverhalten der Glykane am MALDI-TOF/TOF konnte mit Hilfe der Derivatisierungen erheblich verbessert werden. Besonders die Umsetzung mit BINH führte zu einer Vielzahl charakteristischer Ringfragmente, wodurch die Aufklärung der verschiedenen Glykanstrukturen deutlich vereinfacht wurde. Auch im Vergleich zu 2 AB zeigten die Hydrazid-Derivate sowohl bessere Fragmentierungseigenschaften, als auch eine einfachere Handhabung für die Messung mittels MALDI-MS. Eine weitere Möglichkeit zur Identifikation von Glykanstrukturen liegt in der spezifischen Bindung durch Lektine. Diese Untersuchung gibt des Weiteren auch einen Hinweis auf funktionelle Eigenschaften der Glykane. Dafür wird die hohe Affinität von Biotin-haltigen Derivatisierungsreagenzien zu Avidin und Streptavidin genutzt. Nach der auf diese Weise erfolgten Immobilisierung der Glykane können diese mittels spezifischer Lektine nachgewiesen werden. Die Eignung des neuen Derivatisierungsreagen-zes BINH für diese Zwecke wurde anhand eines Glykan-Arrays getestet. Dadurch ließ sich bestätigen, dass BINH-derivatisierte Glykane und Zucker sowohl in der Lage sind an Streptavidin zu binden, als auch durch Lektine nachgewiesen werden können. Daher kann davon ausgegangen werden, dass BINH grundsätzlich für den Einsatz in bio-chemischen Methoden geeignet ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Derivatisierung von Kohlenhydraten mit INH, BINH und BACH zu einer deutlichen Verbesserung der Trenn- und Fragmentierungseigenschaften führten. Dadurch konnten Identifizierung und Strukturanalyse sowohl von kleinen Zuckern, als auch von Glykanen erleichtert werden. Im Vergleich zu dem Standard-Derivatisierungsreagenz 2-AB zeigten die Hydrazide nicht nur im Bereich der Fragmentierungen, sondern auch durch die einfachere Derivatisierungsreaktion wesentliche Vorteile. N2 - Glycans are widely spreaded biomolecules, which are commonly presented as gly-coconjugates, e.g. glycoproteins or glycolipids. The interaction of glycans with glycan-binding proteins triggers numerous physiological and pathological processes in bio-chemistry. Therefore the determination of the participating glycanstructures is of immens interest for the understanding of such processes. The structures of the involved glycans may even provide evidence on several diseases. Identification of glycan structures can be performed by means of various techniques. Favorable techniques in analytical chemistry are ESI- and MALDI- mass spectrometry, since they can be used for the detection, as well as for the fragmentation of large bio-molecules. To simplify the analysis of carbohydrates by means of chromatographic and mass spectrometric methods, different derivatization reagents are available. The chemical modification of the sugars leads to a decrease in polarity and to an enhanced detection by coupling to chromo- or fluorophores. Derivatization at the reducing end of saccharides and glycans can be performed through reductive amination, or coupling to hydrazide reagents. The advantage of hydrazides in comparison to other derivatization reagents lies in a simple, salt-free reaction and results in a stable derivative with closed terminal sugar ring, as the reduction step is not necessary. The present work concentrates on the derivatization of sugars and glycans using the newly developed hydrazides INH and BINH, in addition to BACH, which was already used by Dr. P. Kapková [99]. The derivatives of those reagents were compared to the underivatized carbohydrates, as well as to the commonly used derivatization reagent 2 AB, in order to observe the characteristics related to liquid chromatography, signal intensity and fragmentation behavior. In the first step, the derivatization reaction of mono, di- and trisaccharides with INH and BINH was optimized, in order to ensure a complete transformation of the carbohy-drates into their derivatized equivalents. The derivatization with INH was also per-formed via microwave. In this way, the reaction time was reduced from 90 minutes us-ing the thermomixer®, to 20 minutes. Since this method required a high amount of sample, it was only performed with INH. Next, the chromatographic behaviour of the different saccharide derivatives was ana-lyzed by reversed phase and HILIC high performance liquid chromatography. In case of the monosaccharides, none of the mixtures of derivatives could be separated com-pletely on either of these columns. For HILIC the best effect was achieved with INH, even though glucose and its epimers, mannose and galactose could not be separated completely. On reversed phase, derivatization with BACH and 2-AB showed the best results for the separation of the monomers, but here as well the epimers were not dis-solved. The separation of the INH, BINH and 2-AB derivatives of the disaccharides maltose, cellobiose and lactose was performed successfully on HILIC, with RP-C18 only 2-AB was proved to be suitable. For the trisaccharides 3’SLN and 6’SLN the na-tive forms, as well as all of the derivatives were separated using HILIC. Even by using reversed-phase, the separation of the BINH, BACH and 2-AB derivatives was possible. Furthermore the signal intensity of the derivatized carbohydrates was considerably en-hanced compared to the native saccharides. The chromatography of sugars on HILIC phase showed presence of isomers (very probably the anomers) of the analyzed sug-ars. If the appearance of these isomers is not desirable, separation on reversed-phase can be applied. After separation, di- and trisaccharides of the same mass can be distinguished, based on their fragmentation pattern. Whereas the native disaccharides maltose, cellobiose and lactose showed only slight differences in fragmentation, the derivatization with INH, BINH and BACH increased the number of characteristic fragments. In contrast, with 2-AB no improvement was achieved. The discrimination between 3’SLN and 6’SLN was also simplified by derivatization with the different hydrazides. In contrast to the 2-AB derivatives, the native trisaccharides showed a high content of characteristic fragments as well. For the glycans of ribonuclease B and ovalbumin, the sensitivity was clearly improved through derivatization. In the case of ovalbumin, three additional structures were detected, compared to the native glycans. Regarding the fragmentation by means of MALDI TOF/TOF, the fragmentation behaviour of the glycans was considerably better after derivatization. Especially the BINH derivatives generated a high amount of characteristic cross-ring fragmentations. This way, the elucidation of different isomeric glycan structures was enhanced. Again, 2-AB had worse characteristics in terms of fragmentation behaviour and application properties, compared to the hydrazide derivatives. Another option for the investigation of glycan structures is the specific recognition by lectins. This kind of study also provides information on the functional properties of gly-cans. Biotinylated derivatives possess a high affinity to avidin and streptavidin. This feature is used to immobilise glycans on (strept-)avidin coated surfaces, so they can be further analyzed by specific lectins. Due to this, the suitability of BINH for functional studies was tested. In initial studies BINH derivatized glycans and sugars were con-firmed to bind to streptavidin and were recognized by lectins as well. Hence, it can be assumed that BINH derivatives are suitable for this kind of biochemical analysis. In summary, the derivatization of carbohydrates using INH, BINH and BACH improved the behaviour of the analytes during liquid chromatography and mass spectrometric fragmentation. Hence, identification and structural analysis of small saccharides, as well as glycans were considerably simplified. Compared to common derivatization reagents like 2-AB, the hydrazides showed significant advantages, not only in terms of mass spectrometric fragmentation, but also because of their simple derivatization reaction. KW - MALDI-MS KW - Glykane KW - Zucker KW - Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie KW - N-Glykane KW - Massenspektrometrie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106085 ER - TY - THES A1 - Heinig, Katja T1 - Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen bei pathologischen freien Antikörperleichtketten T1 - Identification of posttranslational modifications in pathological free light chains using mass spectrometry N2 - In dieser Arbeit wurden die freien Antikörperleichtketten von Patienten mit Multiplen Myelom bzw. mit Multiplen Myelom und AL-Amyloidose auf das Auftreten von posttranslationalen Modifikationen mit der Hilfe von MS/MS-Spektren analysiert. Beide Patientengruppen zeichnen sich durch eine Überproduktion von monoklonalen Antikörperleichtketten aus, wobei diese bei Multiplen-Myelom-Patienten löslich und bei den AL-Amyloidose-Patienten unlöslich vorliegen. Zur Vorbereitung der massenspektrometrischen Messungen wurden die FLCs aus den Knochenmarksüberständen der Patienten isoliert. Dafür wurde eine 2-Schritt-Aufarbeitungsmethode etabliert, bei der mit Hilfe einer Affinitätschromatographie und einer präparativen SDS-PAGE die FLCs aus einer komplexen Matrix isoliert werden konnten. Mit Hilfe der MS/MS-Messungen konnten Sulfonierungen, Methylierungen, Acetylierungen, Oxidierungen und eine O-Glykosylierung identifiziert werden. In einem weiteren Schritt wurden mittels Varianzanalyse Sequenzen von AL-Amyloidose- und Multiplen-Myelom-Patienten sowie von Kontrollprobanten hinsichtlich der Verteilung der Aminosäuren statistisch analysiert. Dabei konnten mehrere Stellen im FLC-Peptid identifiziert werden, an denen bestimmte Aminosäuren in Abhängigkeit der Subgruppe signifikant unterschiedlich vorkommen. N2 - This work analyzed posttranslational modifications of pathological free light chains (FLC) from patients who suffer from multiple myeloma or multiple myeloma and AL amyloidosis. Both patient groups show an overproduction of free light chains which are soluble in multi- ple myeloma patients and insoluble in AL amyloidosis patients. One reason for the different solubility of the free light chains may be the appearance of posttranslational modifications. In order to identity posttranslational modifications FLCs from bone marrow supernatant were isolated and mass spectrometrically analyzed using Orbitrap technology. All measurements were done with three samples of each patient subgroup. For the FLC purification a 2-step method was established which isolates FLCs with affinity chromatography and preparative SDS-PAGE. This method enables the purification of the FLCs from a complex matrix where the FLCs may not be the main component. Before mass spectrometric analyses the amino acid sequences of the FLCs were determined via PCR using FLC-specific primers. The subsequent mass spectrometric analyses verified between 92 % and 100 % of the amino acid sequences. The analysis of posttranslational modifications identified for each patient a sulfonation at cysteine C194 whose identity and localization were verified with HCD and ETD fragmen- tation mass spectrometry technology. A similar cysteine sulfonation of FLCs was found by Connors et al. [10] who identified an identical PTM on cysteine C214 in FLCs from AL amyloidosis patients. However, a sulfonation on cysteine C194 and in FLCs from multiple myeloma patients was not published before. Furthermore, a methylation of cysteine C194 was found for each sample. As for the sul- fonation, no disease-specific appearance of methylation could be revealed. This may be a consequence of a limited number of available samples. In addition, a GlcNAc-glycosylation in the N-terminus of the variable region was found for the patients SP 1070, WS 1199 and GI 1206. An exact localization of the PTM was not possible because of the loss of the PTM during HCD fragmentation and the lack of conve- nient ETD spectra. Moreover FLC sequences were analyzed statistically for the distribution of amino acids. Therefore, a multiple sequence alignment with sequences from multiple myeloma and AL amyloidosis patients as with sequences from healthy control group individuals was done. Subsequently, for each position in FLC sequence the most frequent amino acids were deter- mined and the frequencies of being the most frequent amino acid for each subgroup were calculated. As a result, positions 56 and 73 were identified where serine respectively leucine occur statistcally significantly more often in the control group than in the multiple myeloma or the AL amyloidosis subgroup. The comparison of the frequencies of the multiple myeloma and AL amyloidosis subgroup revealed significant differences at the positions 31 and 61. At the position 31 in AL amyloidosis subgroup asparagine appears more often than in the mul- tiple myeloma subgroup which may indicate that asparagine at this position enhances the bias to FLC accumulation. The position 31 was also described as influential by Stevens et al. [25], although in his studies an aspartic acid at this position increases the bias to aggregation. At position 61 an arginine exists more often in the multiple myeloma than in the AL amy- loidosis subgroup where the missing of an arginine at this position seems to enhance the tendency for FLC accumulation. This result is consistent with the findings by Hurle et al. [27, 28] and may be a result of a missing salt bridge from arginine R61 to aspartic acid D82. KW - Massenspektrometrie KW - Amyloidose KW - Plasmozytom KW - Posttranslationale Änderung KW - Mass spectrometry KW - Multiple Myeloma KW - AL amyloidosis KW - Posttranslational modification KW - Proteomics KW - AL-Amyloidose KW - Multiples Myelom Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108275 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Hans-Christian T1 - Deaktivierungsprozesse in isolierten aromatischen Heterocyclen und Pyrenen T1 - Deactivation processes in isolated aromatic heterocycles and pyrenes N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich eine neue Gasphasen-Apparatur für Photoelektronen-Imaging-Experimente simuliert, aufgebaut und in Verbindung mit einem ps-Lasersystem in Betrieb genommen. Neben dem Aufbau der Apparatur stand die Aufklärung der Dynamik angeregter Zustände von aromatischen Heterocyclen und Pyrenen im Fokus dieser Arbeit. Die untersuchten Moleküle wurden durch Resonanzverstärkte Mehrphotonenionisation in einem Molekularstrahlexperiment sowohl zeit-, als auch frequenzaufgelöst untersucht. N2 - In the presented work a new gas phase apparatus for photoelectron imaging experiments was succesfully simulated, constructed and together with a ps laser system put into operation. Besides the building of the new apparatus, the focus of this work was set to elucidate the excited state dynamics of selected aromatic heterocycles and pyrenes. The examined molecules were investigated by frequency- and time-resolved resonance enhanced multi photon ionisation spectroscopy using a molecular beam experiment. KW - Laserspektroskopie KW - Massenspektrometrie KW - Angeregter Zustand KW - time-resolved spectroscopy Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155445 ER -