TY - JOUR A1 - Sander, Bodo A1 - Xu, Wenshan A1 - Eilers, Martin A1 - Popov, Nikita A1 - Lorenz, Sonja T1 - A conformational switch regulates the ubiquitin ligase HUWE1 JF - eLife N2 - The human ubiquitin ligase HUWE1 has key roles in tumorigenesis, yet it is unkown how its activity is regulated. We present the crystal structure of a C-terminal part of HUWE1, including the catalytic domain, and reveal an asymmetric auto-inhibited dimer. We show that HUWE1 dimerizes in solution and self-associates in cells, and that both occurs through the crystallographic dimer interface. We demonstrate that HUWE1 is inhibited in cells and that it can be activated by disruption of the dimer interface. We identify a conserved segment in HUWE1 that counteracts dimer formation by associating with the dimerization region intramolecularly. Our studies reveal, intriguingly, that the tumor suppressor p14ARF binds to this segment and may thus shift the conformational equilibrium of HUWE1 toward the inactive state. We propose a model, in which the activity of HUWE1 underlies conformational control in response to physiological cues—a mechanism that may be exploited for cancer therapy. KW - Medicine KW - Structural Biology KW - Molecular Biophysics KW - HUWE1 KW - HECT Ligase KW - Ubiquitin KW - P14ARF KW - X-Ray Chrystallography KW - Enzyme Regulation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171862 VL - 6 ER - TY - THES A1 - Chouhan, Nitin Singh T1 - Time-odor learning in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Olfaktorisches Zeitgedächtnis bei \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Endogenous clocks help animals to anticipate the daily environmental changes. These internal clocks rely on environmental cues, called Zeitgeber, for synchronization. The molecular clock consists of transcription-translation feedback loops and is located in about 150 neurons (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich-Förster, 2005). The core clock has the proteins Clock (CLK) and Cycle (CYC) that together act as a transcription activator for period (per) and timeless (tim) which then, via PER and TIM block their own transcription by inhibiting CLK/CYC activity (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Light signals trigger the degradation of TIM through a blue-light sensing protein Cryptochrome (CRY) and thus, allows CLK/CYC to resume per and tim transcription (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Therefore, light acts as an important Zeitgeber for the clock entrainment. The mammalian clock consists of similarly intertwined feedback loops. Endogenous clocks facilitate appropriate alterations in a variety of behaviors according to the time of day. Also, these clocks can provide the phase information to the memory centers of the brain to form the time of day related associations (TOD). TOD memories promote appropriate usage of resources and concurrently better the survival success of an animal. For instance, animals can form time-place associations related to the availability of a biologically significant stimulus like food or mate. Such memories will help the animal to obtain resources at different locations at the appropriate time of day. The significance of these memories is supported by the fact that many organisms including bees, ants, rats and mice demonstrate time-place learning (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Previous studies have shown that TOD related memories rely on an internal clock, but the identity of the clock and the underlying mechanism remain less well understood. The present study demonstrates that flies can also form TOD associated odor memories and further seeks to identify the appropriate mechanism. Hungry flies were trained in the morning to associate odor A with the sucrose reward and subsequently were exposed to odor B without reward. The same flies were exposed in the afternoon to odor B with and odor A without reward. Two cycles of the 65 reversal training on two subsequent days resulted in the significant retrieval of specific odor memories in the morning and afternoon tests. Therefore, flies were able to modulate their odor preference according to the time of day. In contrast, flies trained in a non-reversal manner were unable to form TOD related memories. The study also demonstrates that flies are only able to form time-odor memories when the two reciprocal training cycles occur at a minimum 6 h interval. This work also highlights the role of the internal state of flies in establishing timeodor memories. Prolonged starvation motivates flies to appropriate their search for the food. It increases the cost associated with a wrong choice in the T-maze test as it precludes the food discovery. Accordingly, an extended starvation promotes the TOD related changes in the odor preference in flies already with a single cycle of reversal training. Intriguingly, prolonged starvation is required for the time-odor memory acquisition but is dispensable during the memory retrieval. Endogenous oscillators promote time-odor associations in flies. Flies in constant darkness have functional rhythms and can form time-odor memories. In contrast, flies kept in constant light become arrhythmic and demonstrated no change in their odor preference through the day. Also, clock mutant flies per01 and clkAR, show compromised performance compared to CS flies when trained in the time-odor conditioning assay. These results suggest that flies need a per and clk dependent oscillator for establishing TOD related memories. Also, the clock governed rhythms are necessary for the timeodor memory acquisition but not for the retrieval. Pigment-Dispersing Factor (PDF) neuropeptide is a clock output factor (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). pdf01 mutant flies are unable to form significant time-odor memories. PDF is released by 8 neurons per hemisphere in the fly brain. This cluster includes the small (s-LNvs) and large (l-LNvs) ventral lateral neurons. Restoring PDF in these 16 neurons in the pdf01 mutant background rescues the time-odor learning defect. The PDF neuropeptide activates a seven transmembrane G-protein coupled receptor (PDFR) which is broadly expressed in the fly brain (Hyun et al., 2005). The present study shows that the expression of PDFR in about 10 dorsal neurons (DN1p) is sufficient for robust time-odor associations in flies. 66 In conclusion, flies use distinct endogenous oscillators to acquire and retrieve time-odor memories. The first oscillator is light dependent and likely signals through the PDF neuropeptide to promote the usage of the time as an associative cue during appetitive conditioning. In contrast, the second clock is light independent and specifically signals the time information for the memory retrieval. The identity of this clock and the underlying mechanism are open to investigation. N2 - Die endogenen circadianen Uhren helfen Tieren, die täglichen Veränderungen der Umwelt zu antizipieren. Diese internen Uhren stützen sich auf externe Umweltreize, sogenannte Zeitgeber, die den Tagesrhythmus vorgeben. Im Fliegengehirn bilden etwa 150 Neuronen die zentrale innere Uhr (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich- Förster, 2005). Diese Neuronen exprimieren die molekulare Uhr, die aus Transkriptions- Translations-Feedback-Schleifen besteht. Die Uhr besitzt die Proteine Clock (CLK) und Cycle (CYC), die zusammen die Transkription von period (per) und timeless (tim) aktivieren. PER und TIM bilden dann ein Heterodimer um die Transkription von clk und cyc zu blockieren (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Lichtsignale lösen den Abbau von TIM durch das für blaues Licht sensitive‚ 'Sensing Protein Cryptochrome‘ (CRY) aus, daß wiederum CLK und CYC freisetzt um die per und tim Transkription wieder aufzunehmen (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Daher wirkt Licht als wichtiger Zeitgeber. Die innere Uhr der Säuger besteht aus ähnlich miteinander verflochtenen Rückkopplungsschleifen. Die internen Uhren ermöglichen und erleichtern Verhaltensveränderungen in einer Vielzahl von Situation, entsprechend der Tageszeit. Zudem wird die Information den jeweiligen Speicherorten im Gehirn bereit gestellt, um zeitbezogene Gedächtnisbildung zu ermöglichen. Zeitabhängige Gedächtnisbildung sorgt für eine angemessene Nutzung der Ressourcen und sichert gleichzeitig das Überleben des Tieres. Zum Beispiel können Tiere Zeit-Ort-Assoziationen im Zusammenhang mit der Verfügbarkeit einer biologisch wichtigen Ressource, wie Nahrung oder Paarungspartnern bilden. Solche Assoziationen helfen dem Tier Ressourcen an verschiedenen Orten, abhängig von der Tageszeit, zu erschließen. Die Wichtigkeit dieser Fähigkeit wird durch die Tatsache gestützt, daß zum Beispiel Bienen, Ameisen, Ratten und Mäuse ein zeitlich abhängiges Ortgedächtnis bilden können (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Frühere Studien haben gezeigt, daß zeitbezogene Erinnerungen auf einer internen Uhr beruhen. Die genaue Identität dieser Uhr und die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht ausreichend bekannt. In der vorliegenden Studie wird gezeigt, daß Fliegen in der Lage sind ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Zudem wird versucht die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren. Hungrige Fliegen werden zu verschiedenen Tageszeiten konditioniert verschiedene Gerüche mit einer Saccharose-Belohnung zu assoziieren. Morgens ist Geruch A mit Zucker gepaart während Geruch B ohne Zucker präsentiert wird, am Nachmittag ist Geruch B belohnt, Geruch A nicht. Dieses reziproke Training wird an zwei aufeinander folgenden Tagen durchgeführt. Am dritten Tag werden die Fliegen entweder am Morgen oder Nachmittag auf ihre Geruchspräferenz zwischen A und B getestet. Die Fliegen modulieren ihre Geruchspräferenz abhängig von der Tageszeit. Im Gegensatz dazu sind Fliegen, die nicht mittels eines reziproken Trainings konditioniert wurden, nicht in der Lage, ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Die Ergebnisse zeigen auch, daß Fliegen nur dann in der Lage sind zeitbezogene Erinnerungen zu bilden, wenn die beiden reziproken Trainingszyklen mindestens 6 h voneinander getrennt durchgeführt werden. Die Arbeit ebeleuchtet zudem die Rolle des internen Zustands der Fliegen im Kontext des zeitabhängigen olfaktorischen Gedächtnisses. Länger andauernder Hunger motiviert die Fliegen stärker ihre Suche nach Nahrung zeitlich anzupassen. Schon ein Zyklus reziproken Trainings reicht für die Bildung Zeit-spezifischen Geruchsgedächtnisses aus. Die Erhöhung der Kosten, die mit einer falschen Wahl in einem T-maze-Test verbunden ist, kann offenbar zeitabhängige Änderungen der Geruchspräferenzen in Fliegen begünstigen. Erstaunlicherweise begünstigt der Hunger speziell die Gedächtnisbildung, ist jedoch für den Test nicht erforderlich. Endogene circadiane Oszillatoren werden für das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis der Fliegen gebraucht. Fliegen, die im Dauerdunkel gehalten wurden, zeigen rhythmisches Verhalten so wie zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis. Im Gegensatz dazu sind im Dauerlicht aufgezogene Fliegen arrhythmisch und zeigen kein Zeit-spezifisches Geruchsgedächtnis. Zudem sind auch die arrhythmischen Mutanten per01 und clkAR in der Zeit-Geruchskonditionierung gestört. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Fliegen einen per- und clk-abhängigen Oszillator benötigen, der von externen Lichtsignalen abhängig ist, um ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Außerdem wird der durch die innere Uhr vorgegebene Rhythmus nur während der Gedächtnisbildung und nicht für das Abrufen des Gelernten benötigt. Pigment dispersing factor (PDF) ist ein Neuropeptid, das von Neuronen der inneren Uhr gebildet wird (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). Die pdf01-Mutante ist nicht in der Lage ein signifikantes zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. PDF wird von jeweils einer Gruppe von 8 Neuronen pro Hemisphäre, die die kleinen und großen ventral-lateralen Neuronen umfaßt, sezerniert. Die Wiederherstellung der Expression von PDF in diesen 16 Neuronen im pdf01 Mutanten Hintergrund, rettet das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis. Das PDF-Neuropeptid aktiviert einen sieben-Transmembran-G-Protein- gekoppelten Rezeptor (PDFR), der weit verbreitet im Fliegenhirn exprimiert wird (Hyun et al., 2005). Diese Studie zeigt, daß die Expression von PDFR in ~ 10 dorsalen Neuronen (DN1p) für eine robuste zeitabhängige olfaktorische Gedächtnisbildung in Fliegen ausreicht. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Fliegen verschiedene endogene Oszillatoren benutzen um ein zeitabhängiges olfaktorische Gedächtnis zu bilden und abzurufen. Der erste Oszillator ist lichtabhängig und wahrscheinlich durch das PDF- Neuropeptid vermittelt. Es ermöglicht die Verwendung der Information 'Zeit' als assoziatives Signal während der appetitiven Konditionierung. Im Gegensatz dazu ist die zweite Uhr lichtunabhängig und vermittelt speziell die Zeitinformation für die Gedächtnisabfrage. Die Identität der zweiten Uhr und der zugrunde liegende Mechanismus sowie die zugrunde liegende Kommunikation zwischen den Neuronen, bedarf weiterer Untersuchungen. KW - Learning and memory KW - Circadian rhythms KW - Odor-feeding-time memory KW - Taufliege KW - Tagesrhythmus KW - Geruchswahrnehmung KW - Konditionierung KW - Molekulargenetik Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145675 ER - TY - THES A1 - Stritt, Simon T1 - The role of the cytoskeleton in platelet production and the pathogenesis of platelet disorders in humans and mice T1 - Die Rolle des Zytoskeletts in der Thrombopoese und der Pathogenese von Thrombozytopathien im Menschen und der Maus N2 - Platelets are continuously produced from megakaryocytes (MK) in the bone marrow by a cytoskeleton-driven process of which the molecular regulation is not fully understood. As revealed in this thesis, MK/ platelet-specific Profilin1 (Pfn1) deficiency results in micro- thrombocytopenia, a hallmark of the Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) in humans, due to accelerated platelet turnover and premature platelet release into the bone marrow. Both Pfn1-deficient mouse platelets and platelets isolated from WAS patients contained abnormally organized and hyper-stable microtubules. These results reveal an unexpected function of Pfn1 as a regulator of microtubule organization and point to a previously unrecognized mechanism underlying the platelet formation defect in WAS patients. In contrast, Twinfilin2a (Twf2a) was established as a central regulator of platelet reactivity and turnover. Twf2a-deficient mice revealed an age-dependent macrothrombocytopenia that could be explained by a markedly decreased platelet half-life, likely due to the pronounced hyper-reactivity of \(Twf2a^{-/-}\) platelets. The latter was characterized by sustained integrin acti- vation and thrombin generation in vitro that translated into accelerated thrombus formation in vivo. To further elucidate mechanisms of integrin activation, Rap1-GTP-interacting adaptor molecule (RIAM)-null mice were generated. Despite the proposed critical role of RIAM for platelet integrin activation, no alterations in this process could be found and it was concluded that RIAM is dispensable for the activation of β1 and β3 integrins, at least in platelets. These findings change the current mechanistic understanding of platelet integrin activation. Outside-in signaling by integrins and other surface receptors was supposed to regulate MK migration, but also the temporal and spatial formation of proplatelet protrusions. In this the- sis, phospholipase D (PLD) was revealed as critical regulator of actin dynamics and podo- some formation in MKs. Hence, the unaltered platelet counts and production in \(Pld1/2^{-/-}\) mice and the absence of a premature platelet release in the bone marrow of \(Itga2^{-/-}\) mice question the role of podosomes in platelet production and raise the need to reconsider the proposed inhibitory signaling by α2β1 integrins on proplatelet formation. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) has been implicated as a downstream effector of the in- hibitory signals transmitted via α2β1 integrins. Besides Rho-GTPase signaling, also \(Mg^{2+}\) and transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) channel α-kinase are known regulators of NMMIIA activity. In this thesis, TRPM7 was identified as major regulator of \(Mg^{2+}\) homeostasis in MKs and platelets. Furthermore, decreased \([Mg^{2+}]_i\) led to deregulated NMMIIA activity and altered cytoskeletal dynamics that impaired thrombopoiesis and resulted in macrothrombocytopenia in humans and mice. N2 - Thrombozyten werden kontinuierlich durch einen Zytoskelett-getriebenen Prozess von Megakaryozyten (MK) im Knochenmark gebildet. Die zugrunde liegenden molekularen Me- chanismen sind jedoch weitestgehend unverstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass eine MK/ Thrombozyten-spezifische Profilin1 (Pfn1) Defizienz eine Mikrothrombozytopenie verursacht, die das Hauptmerkmal des Wiskott- Aldrich Syndroms (WAS) im Menschen ist. Die reduzierte Thrombozytenzahl konnte auf eine beschleunigte Entfernung der Thrombozyten aus der Zirkulation sowie deren vorzeitige Freisetzung im Knochenmark zurückgeführt werden. Sowohl Thrombozyten von Pfn1- defizienten Mäusen, als auch von Patienten mit WAS wiesen abnormal organisierte und hyper-stabile Mikrotubuli auf. Die im Rahmen dieser Thesis gewonnenen Ergebnisse zeigen eine unerwartete Funktion von Pfn1 als Regulator der Mikrotubuliorganisation und weisen auf einen bisher nicht erkannten Mechanismus hin, welcher dem Thrombozytenproduktionsde- fekt in Patienten mit WAS zugrunde liegt. Im Gegensatz hierzu konnte Twinfilin2a (Twf2a) als zentraler Regulator der Thrombozyten- reaktivität und Lebenspanne etabliert werden. Mäuse mit einer Twf2a Defizienz zeigten eine progressive Makrothrombozytopenie, die durch eine stark reduzierte Lebenspanne der Thrombozyten erklärt werden konnte. Letzteres war höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte Empfindlichkeit von Twf2a-defizienten Thrombozyten gegenüber von aktivierenden Stimuli bedingt. Die Hyperreaktivität von Twf2a-defizienten Thrombozyten zeigte sich durch eine verlängerte Aktivierung der Integrine und erhöhter Thrombingenerierung in vitro sowie be- schleunigter Thrombusbildung in vivo. Um die Mechanismen der Integrinaktivierung besser zu charakterisieren, wurden Rap1-GTP- interacting adaptor molecule (RIAM)-null Mäuse generiert. Obwohl RIAM eine zentrale Rolle in der thrombozytären Integrinaktivierung zugeschriebenen wurde, konnten keine Defekte in diesem Prozess in RIAM-null Thrombozyten identifiziert werden. Dies führte zu der Schluss- folgerung, dass RIAM für die Aktivierung von β1 und β3 Integrinen in Thrombozyten nicht benötigt wird. Diese Erkenntnisse verändern das gegenwärtige mechanistische Verständnis der Integrinaktivierung in Thrombozyten. Die outside-in Signalgebung durch Integrine und andere Oberflächenrezeptoren reguliert die Migration sowie die zeitliche und räumliche Bildung von proplatelets durch MKs. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass Phospholipase D (PLD) ein zentraler Regulator der Aktindynamik und Podosomenbildung in MKs ist. Die normale Thrombozytenzahl und -Produktion in \(Pld1/2^{-/-}\) Mäusen sowie die fehlende vorzeitige Freisetzung von Thrombozytenim Knochenmark von \(Itga2^{-/-}\) Mäusen, stellen die Funktion von Podosomen in der Throm- bozytenproduktion in Frage. Ferner zeigen diese Ergebnisse, dass die Rolle der inhibitori- schen Signalgebung durch α2β1 Integrine in der proplatelet-Bildung noch einmal überdacht werden muss. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) wird als Effektorprotein im α2β1 Integrinsignalweg ange- sehen. Neben Signalen, die durch Rho-GTPasen vermittelt werden, regulieren auch \(Mg^{2+}\) und die α-Kinase des transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) Kanals die Akti- vität von NMMIIA. Im Rahmen dieser Thesis wurde TRPM7 als Hauptregulator der \(Mg^{2+}\) Homöostase in MKs und Thrombozyten identifiziert. Darüber hinaus führten erniedrigte intra- zelluläre \(Mg^{2+}\) Konzentrationen zu einer veränderten NMMIIA Aktivität und Zytoskelettdyna- mik. Diese Defekte beeinträchtigten die Thrombopoese und verursachten eine Makrothrom- bozytopenie im Menschen und der Maus. KW - Thrombozytopoese KW - Thrombozytopathie KW - Megakaryopoese KW - Zellskelett KW - Thrombozyt KW - Zytoskelett Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122662 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Dominik T1 - Structural Characterization of the TFIIH Subunits p34 and p44 from C. thermophilum T1 - Strukturelle Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 aus C. thermophilum N2 - Several important cellular processes, including transcription, nucleotide excision repair and cell cycle control are mediated by the multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these pathways. This becomes especially important in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in some of the TFIIH subunits. In an attempt to structurally characterize the TFIIH complex, we harnessed the qualities of the eukaryotic thermophile Chaetomium thermophilum, a remarkable fungus, which has only recently been recognized as a novel model organism. Homologues of TFIIH from C. thermophilum were expressed in E. coli, purified to homogeneity and subsequently utilized for crystallization trials and biochemical studies. The results of the present work include the first crystal structure of the p34 subunit of TFIIH, comprising the N-terminal domain of the protein. The structure revealed a von Willebrand Factor A (vWA) like fold, which is generally known to be involved in a multitude of protein-protein interactions. Structural comparison allowed to delineate similarities as well as differences to already known vWA domains, providing insight into the role of p34 within TFIIH. These results indicate that p34 assumes the role of a structural scaffold for other TFIIH subunits via its vWA domain, while likely serving additional functions, which are mediated through its C-terminal zinc binding domain and are so far unknown. Within TFIIH p34 interacts strongly with the p44 subunit, a positive regulator of the XPD helicase, which is required for regulation of RNA Polymerase II mediated transcription and essential for eukaryotic nucleotide excision repair. Based on the p34 vWA structure putative protein-protein interfaces were analyzed and binding sites for the p34 p44 interaction suggested. Continuous crystallization efforts then led to the first structure of a p34 p44 minimal complex, comprising the N-terminal vWA domain of p34 and the C-terminal C4C4 RING domain of p44. The structure of the p34 p44 minimal complex verified the previous hypothesis regarding the involved binding sites. In addition, careful analysis of the complex interface allowed to identify critical residues, which were subsequently mutated and analyzed with respect to their significance in mediating the p34 p44 interaction, by analytical size exclusion chromatography, electrophoretic mobility shift assays and isothermal titration calorimetry. The structure of the p34 p44 complex also revealed a binding mode of the p44 C4C4 RING domain, which differed from that of other known RING domains in several aspects, supporting the hypothesis that p44 contains a novel variation of this domain. N2 - Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Transkription, die Nukleotid-Exzisionsreparatur und die Kontrolle des Zellzyklus sind abhängig vom vielschichtigen Zusammenspiel der zehn Protein-Untereinheiten des allgemeinen Transkriptionsfaktors II H (TFIIH). Zur Aufklärung der genauen Funktion dieses Komplexes ist ein besseres Verständnis seiner molekularen Struktur essentiell. Besondere Bedeutung erhält der TFIIH dabei im Hinblick auf verschiedene schwerwiegende Krankheiten, wie z.B. Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und Trichothiodystrophie (TTD), die als Folge von einzelnen Punkt-Mutationen in bestimmten Untereinheiten des Komplexes entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden zur strukturellen Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 die homologen Proteine aus Chaetomium thermophilum verwendet. Hierbei handelt es sich um einen eukaryotischen und thermophilen Pilz, der erst kürzlich als neuer und vielversprechender Modellorganismus an Bedeutung gewann. Die TFIIH Homologe aus C. thermophilum wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und anschließend für Kristallisations-Versuche eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Proteine mittels verschiedener biochemischer Verfahren analysiert. Die erzielten Resultate beinhalten unter anderem die erste Kristall-Struktur der p34 Untereinheit des TFIIH und zeigen eine von Willebrand Faktor A (vWA) ähnliche Domäne im N-terminalen Bereich des Proteins. Vergleiche mit bereits bekannten vWA Proteinen liefern Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede und erlauben erste Einblicke in die Funktion der p34 Untereinheit innerhalb des TFIIH Komplexes. Die gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass p34 über seine vWA Domäne anderen TFIIH Untereinheiten als strukturelles Gerüst dient, während die C-terminale Zinkfinger-Domäne des Proteins sehr wahrscheinlich zusätzliche Aufgaben übernimmt, die bisher noch nicht genau bekannt sind. Innerhalb des TFIIH Komplexes ist p34 eng mit der p44 Untereinheit assoziiert. Letztere ist als positiver Regulator der XPD Helikase bekannt, die im Rahmen der RNA Polymerase II vermittelten Transkription und der eukaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparatur eine entscheidende Rolle spielt. Basierend auf der erzielten p34ct vWA Struktur wurden verschiedene Interaktions-Flächen zwischen p34 und p44 analysiert und mögliche Bindestellen für die beiden Proteine ermittelt. Weitere Kristallisations-Experimente ermöglichten schließlich die Aufklärung der Struktur eines p34 p44 Minimal-Komplexes, bestehend aus der N-terminalen vWA Domäne von p34 und der C-terminalen C4C4 RING Domäne von p44. Die gewonnenen Struktur-Daten bestätigten die zuvor ermittelte Bindestelle der beiden Proteine. Eine genauere Untersuchung der Kontakt-Fläche zwischen p34 und p44 lieferte darüber hinaus entscheidende Hinweise auf besonders wichtige Interaktions-Bereiche und Aminosäuren, die im Folgenden mutiert wurden, um deren Bedeutung für die Komplexbildung zu ermitteln. Mit Hilfe der analytischen Größenausschluss-Chromatographie, elektro-phoretischer Mobilitäts-Verlagerungs-Assays und isothermaler Titrations-Kalorimetrie konnten hierbei verschiedene Aminosäuren identifiziert werden, die für eine stabile p34 p44 Interaktion erforderlich sind. Ferner zeigte die Struktur des p34 p44 Minimal-Komplexes eine Bindungsweise der p44 C4C4 RING Domäne, die sich von der anderer, bereits bekannter RING Domänen in verschiedenen Punkten unterschied. Diese Erkenntnis bestätigt die zuvor aufgestellte Hypothese, dass es sich im Falle von p44 um eine neue Variante der bereits gut charakterisierten RING Domäne handelt. KW - DNA-Reparatur KW - Transkription KW - Transkriptionsfaktor KW - TFIIH KW - General Transcription Factor II H KW - p34 KW - p44 KW - Tfb4 KW - Ssl1 KW - Chaetomium thermophilum Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104851 ER - TY - THES A1 - Lyga, Sandra T1 - Glycoprotein hormone receptor signaling in the endosomal compartment T1 - Glykoproteinhormon-Rezeptor Signaltransduktion im endosomalen Kompartiment N2 - G protein-coupled receptors (GPCRs) are the major group of cell-surface receptors that transmit extracellular signals via classical, G protein-dependent pathways into the cell. Although GPCRs were long assumed to signal exclusively from the cell-surface, recent investigations have demonstrated a possibly completely new paradigm. In this new view, GPCR continues signaling via 3´,5´-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) after their agonist-induced internalization of ligand/receptor complexes into an intracellular compartment, causing persistent cAMP elevation and apparently specific signaling outcomes. The thyroid stimulating hormone (TSH) receptor is one of the first GPCRs, which has been reported to show persistent signaling after ligand removal (Calebiro et al., 2009). In the meantime, signaling by internalized GPCR become a highly investigated topic and has been shown for several GPCRs, including the parathyroid hormone receptor (Ferrandon et al., 2009), D1 dopamine receptor (Kotowski et al., 2011) and beta2-adrenergic receptor (Irannejad et al., 2013). A recent study on the beta2-adrenergic receptor revealed that internalized receptor not only participates in cAMP signaling, but is also involved in gene transcription (Tsvetanova and von Zastrow, 2014). However, a biological effect of GPCR signaling at intracellular sites, which would demonstrate its physiological relevance, still remained to be shown. To investigate GPCR signaling from intracellular compartment under physiological condition, two different cellular models were utilized in the present study: intact ovarian follicles expressing luteinizing hormone (LH) receptors and primary thyroid cells expressing TSH receptors. Intact ovarian follicles were obtained from a transgenic mouse expressing, a Förster/Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sensor for cAMP to monitor cAMP/LH receptor signaling. This study provides the first accurate spatiotemporal characterization of cAMP signaling, which is derived from different cell layers of an intact ovarian follicle. Additionally, it could be shown that cAMP diffusion via gap junctions is implicated in spreading the LH-induced cAMP signals from one the outermost (mural granulosa) to the innermost (cumulus oophorus) cell layer of an ovarian follicle. Interestingly, LH receptor stimulation was associated with persistent cAMP signaling after LH removal and negligible desensitization of the cAMP signal. Interfering with receptor internalization with a dynamin inhibitor dynasore did not only prevent persistent LH-induced cAMP signaling, but also impaired the resumption of meiosis in follicle-enclosed oocytes, a key biological effect of LH. In order to investigate the downstream activation of protein kinase A (PKA) in primary thyroid cells, FRET sensors with different subcellular localization (plasma membrane, cytosol and nucleus) were transiently transfected into primary thyroid cells of wild-type mice via electroporation. Interestingly, TSH stimulation causes at least two distinct phases of PKA activation in the global primary thyroid cell, which are temporally separated by approximately 2 min. In addition, PKA activation in different subcellular compartments are characterized by dissimilar kinetics and amplitudes. Pharmacological inhibition of TSH receptor internalization largely prevented the second (i.e. late) phase of PKA activation as well as the subsequent TSH-dependent phosphorylation of CREB and TSH-dependent induction of early genes. These results suggest that PKA activation and nuclear signaling require internalization of the TSH receptor. Taken together, the data of the present study provide strong evidence that GPCR signaling at intracellular sites is distinct from the one occurring at the cell-surface and is highly physiologically relevant. N2 - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) umfassen die größte Gruppe von Rezeptoren in der Zellmembran und übermitteln extrazelluläre Signale via G-Protein-abhängige Signalwege in das Zellinnere. Obwohl lange Zeit die Wissenschaft davon ausging, das GPCR ausschließlich an der Zelloberfläche Signale weiterleiten, zeigen Studien der letzten Jahre eine vollkommen neuartige Signalweiterleitung aus dem Zellinneren. In dieser neuen Sichtweise, vermitteln GPCR nach Agonist-induzierter Internalisierung des Liganden/Rezeptor-Komplexes in das Zellinnere weiterhin zyklische Adenosin-3´,5´-monophosphat (cAMP)-Signale, was zu einer dauerhaften cAMP-Erhöhung und einem spezifischen Ergebnis der Signaltransduktion führt. Einer der ersten GPCR, für den gezeigt wurde, dass Signale aus dem Zelleninneren übertragen werden können, war der Thyreoidea-stimulierendes Hormon (TSH) Rezeptor. In der Zwischenzeit wurde die Signalübertagung von bereits internalisierten Rezeptoren für weitere GPCR gezeigt, inklusive des beta2-adrenergen Rezeptors. Vor kurzem demonstrierte eine Studie des beta2-adrenerge Rezeptors, dass die intrazellulare GPCR-Signalübertragung nicht nur an der cAMP-Weiterleitung sondern auch an der Gentranskription beteiligt ist. Bis jetzt konnte jedoch noch kein Zusammenhang zwischen der GPCR-Signaltransduktion aus dem Zellinneren und einem biologischen Effekt mit physiologischer Relevanz hergestellt werden. Um GPCR-Signaltransduktion im Zellinneren unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen, wurden in der aktuellen Arbeit zwei unterschiedliche zelluläre Modelle verwendet: Intakte Follikel eines Ovars, welche luteinisierende Hormon (LH) Rezeptoren exprimieren und TSH-Rezeptoren-exprimierende primäre Schilddrüsenzellen. Die Follikel wurden aus einer transgenen Maus, die einen Förster/Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Sensor für cAMP exprimiert, gewonnen, um cAMP/LH-Signaltransduktion zu messen. Diese Arbeit zeigt die erste exakte, zeitliche und räumliche Charakterisierung der LH- induzierten cAMP-Signaltransduktion in intakten Follikeln des Ovars. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Diffusion von cAMP via Gap Junctions ein wichtiger Bestandteil bei der Übermittlung des LH-induzierten cAMP-Signals von der äußeren (Mural granulosa) zur inneren (Cumulus oophorus) Zellebene eines Follikels darstellt. Interessanterweise ergab die LH- Rezeptor Stimulation nach Entfernung des Liganden LH ein anhaltendes cAMP-Signal sowie eine unwesentliche Desensitization des cAMP-Signals. Die Inhibition der Rezeptorendozytose mit Dynasore verhinderte nicht nur das LH-induzierte anhaltende cAMP-Signal sondern beeinflusste auch die Wiederaufnahme der Meiose durch die Follikel-eingeschlossene Oozyte, einer der wichtigsten biologischen Aufgaben von LH. Um den Einfluss der TSH-Rezeptorinternalisierung auf die PKA-Aktivität zu untersuchen, wurden primäre Schilddrüsenzellen von FVB-Mäusen, mit FRET-basierenden Protein Kinase A (PKA) Sensor exprimiert werden, via Elektroporation transfiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine TSH- vermittelte Stimulation des Rezeptors mindestens zwei kinetisch und räumlich unterschiedliche PKA-Signale in Schilddrüsenzellen auslöst, die zeitlich voneinander getrennt sind. Durch die Inhibierung des TSH-Rezeptorinternalisierung konnte gezeigt werden, dass das zweite PKA-Signal sowie die darauffolgende TSH-abhängige Phosphorylierung des Trankriptionsfaktors CREB und die TSH-abhängige Regulierung von Gen Expression vermindert ist. Diese Befunde geben Aufschluss über die Notwendigkeit der Internalisierung des Rezeptors in das Zellinnere für eine effektive PKA- und Zellkern-Signaltransduktion. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit neue, und wichtige Erkenntnisse über den Mechanismus der GPCR-Signalweiterleitung im Zellinneren und erstmals einen Einblick über die biologische Relevanz der Rezeptorinternalisierung liefern. KW - GPCR KW - Receptor signaling KW - Glycoprotein hormone KW - Receptor internalization KW - cAMP signaling KW - PKA signaling Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139994 ER - TY - THES A1 - ElBashir, Rasha T1 - Development of New Mass Spectrometry-based Methods for the Analysis of Posttranslational Modifications T1 - Entwicklung neuer massenspektrometrischer Methoden für die Analyse posttranslationaler Proteinmodifikationen N2 - Posttranslational modifications (PTMs) play a crucial role in many cellular processes. They are reversible, dynamic, and highly regulated events that alter the properties of proteins and increase their functional diversity. The identification and quantification of PTMs are critical for deciphering the molecular mechanisms of PTMs-related biological processes and disease treatment and prevention. Two of the most common and important PTMs that regulate many protein functions are acetylation and phosphorylation. An important role of acetylation is the regulation of DNA/RNA-protein interactions. A prominent example for this are histones, whose tail regions are lysine-rich and can be highly acetylated at their N-terminal domain. In spite of the utmost importance of this PTM, methods that allow the accurate measuring the site-specific acetylation degree are missing. One of the challenges in quantifying the acetylation degree at an individual lysine residue of the histones N-termini is the occurrence of multiple lysines in close proximity. Herein, we describe the development of the ”Fragment Ion Patchwork Quantification,” a new mass spectrometry-based approach for the highly accurate quantification of sites-pecific acetylation degrees. This method combines 13C1-acetyl derivatization on the protein level, proteolysis by low-specificity proteases and quantification on the fragment ion level. Acetylation degrees are determined from the isotope patterns of acetylated b and y ions. We have shown that this approach allows determining the site-specific acetylation degrees of all lysine residues for all core histones of Trypanosoma brucei. In addition, we demonstrate the use of this approach to identify the substrate sites of histone acetyltransferases and to monitor the changes in acetylation of the histones of canonical nucleosome and transcription start site nucleosomes. Phosphorylation is one of the most common and most important PTMs. The analysis of the human genome showed that there are about 518 kinases and more than 500,000 phosphorylation sites are believed to exist in the cellular proteome. Protein phosphorylation plays a crucial role in signaling many different cell processes, such as intercellular communication, cell growth, differentiation of proliferation and apoptosis. Whereas MS-based identification and relative quantification of singly phosphorylated peptides have been greatly improved during the last decade, and large-scale analysis of thousands of phosphopeptides can now be performed on a routine-base, the analysis of multi-phosphorylated peptides is still lagging vastly behind. The low pKa value of phosphate group and the associated negative charge are considered the major source of the problems with the analysis of multi-phosphorylated peptides. These problems include the formation of phosphopeptide-metal complexes during liquid chromatography (e.g. Fe 3+), which leads to a drastic deterioration of the chromatographic properties of these peptides (peak tailing), the decreased ionization efficiencies of phosphorylated peptides compared to their unphosphorylated counterparts, the labile nature of phosphate during CID/HCD fragmentation, and the unsuitability of low-charged phosphopeptides for ETD fragmentation are the most important factors that hinder phosphorylation analysis by LC-MS/MS. Here we aimed to develop a method for improving the identification of multi-phosphorylated peptides as well as the localization of phosphorylation sites by charge-reversal derivatization of the phosphate groups. This method employs a carbodiimide-mediated phosphoramidation to converted the phosphates to stable aromatic phosphoramidates. This chemical modification of phosphosite(s) reversed the negative charge of the phosphate group(s) and increased the number of the positive charges within the phosphopeptide. This modification prevented the formation of phosphopeptide-metal ion complexes that dramatically decreases or completely diminishes the signal intensity of protonated phosphopeptides, specifically multi-phosphorylated peptides. Furthermore, the increased net charge the (phospho-)peptides made them suitable for ETD fragmentation, which generated a high number of fragment ions with high intensities that led to a better phosphopeptide identification and localization of phosphosite(s) with high confidence. N2 - Posttranslationale Modifikationen (PTMs) spielen eine entscheidende Rolle in vielen zellulären Prozessen. Sie sind reversible, dynamische und hochregulierte Ereignisse, die die Proteineneigenschaften verändern und ihre funktionale Diversität erhöhen. Die Identifizierung und Quantifizierung von PTMs sind wesentlich für die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von PTM-regulierten biologischen Prozessen und für ein besseres Verständnis der Rolle posttranslationaler Modifikationen bei einer Vielzahl von Krankheiten. Zwei der bedeutendsten PTMs, welche die Funktion unzähliger Proteine regulieren sind die Acetylierung an Lysin-Resten und die Phosphorylierung an Serin-, Threonin- und Tyrosinresten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden eine neue Methode zur Bestimmung des positionsspezifischen Acetylierungsgrades, sowie verbesserte Methoden für die Analyse der Phosphorylierung mittels Flüssigchromatographie-gekoppelter Tandem Massenspektrometrie entwickelt. Wir haben eine neue MS-basierte Methode (”Fragment Ion Patchwork Quantification”) entwickelt, welche es erlaubt die Acetylierungsgrade an individuellen Positionen mit hoher Genauigkeit zu messen. Diese Methode kombiniert die 13C1- Acetylderivatisierung von intakte Proteine, die Proteolyse durch Proteasen mit niedriger Spezifität, und die Quantifizierung auf dem MS2-Level. Die Acetylierungsgrade werden aus den Isotopenmustern von acetylierten b- und y-Ionen bestimmt. Obwohl unsere Methode zur Quantifizierung der positionsspezifischen Acetylierungsgrade auf jedes beliebige Protein angewandt werden kann, stand bei der Methodenentwicklung die Analyse der Histonacetylierung aufgrund ihrer herausragenden Bedeutung bei der Regulation der Genexpression im Vordergrund. Wir haben gezeigt, dass mit dieser Methode die Bestimmung der positionsspezifischen Acetylierungsgrade an allen Lysin Resten aller Core-Histone von Nukleosomhistone von Trypanosoma brucei möglich ist. Darüber hinaus haben wir diese Methode angewandt, um die Substrat-Positionen von Histon Acetyltransferasen zu identifizieren und um quantitative Veränderungen der Acetylierung an Histonen aus kanonischen Nukleosomen sowie Nukleosomen an Transkriptionsstartstellen zu analysieren. Phosphorylierung ist eine der häufigsten und wichtigsten posttranslational Proteinmodifikationen. Im Verlauf des Sequenzierung des humanen Genoms wurden 518 Gene für Proteinkinasen entdeckt und es wird angenommen, dass im zellulären Proteom mehr als 500 000 Phosphorylierungsstellen existieren. Die Proteinphosphorylierung spielet eine entscheidende Rolle in der Signalisierung vieler verschiedener Zellprozesse wie zum Beispiel der interzellulären Kommunikation, dem Zellwachstum, der Differenzierung der Proliferation und der Apoptose. Während bei der massenspektrometrie-basierte Identifizierung und relativen Quantifizierung von einfach phosphorylierten Peptiden in den letzten große Fortschritte erzielt wurden, und die Analyse tausender Phosphopeptide mittlerweile häufig routinemäßig durchgeführt werden kann, bereitet die massenspektrometrische Analyse merhfach phosphorylierter Peptide nach wie vor große Probleme. Der niedrige pKa-Wert der Phosphatgruppe, und die damit einhergehende negative Ladung ist die Hauptursache für die Probleme bei der Analyse merhfach phosphorylierter Peptide. Die mehrfache negative Ladung dieser Peptide führt zu einer ausgeprägten Neigung zur Komplexbildung mit mehrwertigen Metallionen (wie z.B. Fe3+), welche zu einer drmatischen Verschlechterung der chromatographischen Eigenschaften dieser Peptide führt (Peak Tailing), zu einer Verschlechterung der Ionisierungseffizienz, und zu einem ungewöhnlich niedrigen Protonierungsgrad im Positivionen-Modus, welcher diese Peptide für eine Fragmentierung mittels ETD ungeeignet macht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels chemischer Modifikation der Phosphatgruppe versucht sowohl die Detektion von mehrfach-phosphorylierten Peptiden, als auch die Lokalisierung von Phosphorylierungsstellen zu verbessern. Hierfür wurden die Phosphatgruppen unter Verwendung des Aktivierungsreagenzes EDC in hydrolysestabile, aromatische Phosphoramidate überführt. Die durch diese Modifikation erzielte Ladungsumkehr führt wie erwartet zu einer verbesserten Signalintensität bei den entsprechend modifizierten Phosphopeptiden, sowie zu einem verbesserten Fragmentierungsverhalten bei ETD, und somit letztlich zu einer verbesserten Lokalisierbarkeit der Phosphatgruppe inerhalb des Peptids. KW - LC-MS KW - Posttranslationale Änderung KW - Acetylierung KW - Phosphorylierung KW - Quantifizierung KW - Mass Spectrometry KW - PTMs KW - Acetylation KW - Quantitation KW - Phosphorylation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153731 ER - TY - JOUR A1 - Tsoneva, Desislava A1 - Minev, Boris A1 - Frentzen, Alexa A1 - Zhang, Qian A1 - Wege, Anja K. A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Humanized Mice with Subcutaneous Human Solid Tumors for Immune Response Analysis of Vaccinia Virus-Mediated Oncolysis JF - Molecular Therapy Oncolytics N2 - Oncolytic vaccinia virus (VACV) therapy is an alternative cancer treatment modality that mediates targeted tumor destruction through a tumor-selective replication and an induction of anti-tumor immunity. We developed a humanized tumor mouse model with subcutaneous human tumors to analyze the interactions of VACV with the developing tumors and human immune system. A successful systemic reconstitution with human immune cells including functional T cells as well as development of tumors infiltrated with human T and natural killer (NK) cells was observed. We also demonstrated successful in vivo colonization of such tumors with systemically administered VACVs. Further, a new recombinant GLV-1h376 VACV encoding for a secreted human CTLA4-blocking single-chain antibody (CTLA4 scAb) was tested. Surprisingly, although proving CTLA4 scAb’s in vitro binding ability and functionality in cell culture, beside the significant increase of CD56\(^{bright}\) NK cell subset, GLV-1h376 was not able to increase cytotoxic T or overall NK cell levels at the tumor site. Importantly, the virus-encoded β-glucuronidase as a measure of viral titer and CTLA4 scAb amount was demonstrated. Therefore, studies in our “patient-like” humanized tumor mouse model allow the exploration of newly designed therapy strategies considering the complex relationships between the developing tumor, the oncolytic virus, and the human immune system. KW - humanized tumor KW - mouse model KW - subcutaneous human tumors KW - Oncolytic vaccinia virus Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170786 VL - 5 ER - TY - JOUR A1 - Radu, Laura A1 - Schoenwetter, Elisabeth A1 - Braun, Cathy A1 - Marcoux, Julien A1 - Koelmel, Wolfgang A1 - Schmitt, Dominik R. A1 - Kuper, Jochen A1 - Cianférani, Sarah A1 - Egly, Jean M. A1 - Poterszman, Arnaud A1 - Kisker, Caroline T1 - The intricate network between the p34 and p44 subunits is central to the activity of the transcription/DNA repair factor TFIIH JF - Nucleic Acids Research N2 - The general transcription factor IIH (TFIIH) is a multi-protein complex and its 10 subunits are engaged in an intricate protein–protein interaction network critical for the regulation of its transcription and DNA repair activities that are so far little understood on a molecular level. In this study, we focused on the p44 and the p34 subunits, which are central for the structural integrity of core-TFIIH. We solved crystal structures of a complex formed by the p34 N-terminal vWA and p44 C-terminal zinc binding domains from Chaetomium thermophilum and from Homo sapiens. Intriguingly, our functional analyses clearly revealed the presence of a second interface located in the C-terminal zinc binding region of p34, which can rescue a disrupted interaction between the p34 vWA and the p44 RING domain. In addition, we demonstrate that the C-terminal zinc binding domain of p34 assumes a central role with respect to the stability and function of TFIIH. Our data reveal a redundant interaction network within core-TFIIH, which may serve to minimize the susceptibility to mutational impairment. This provides first insights why so far no mutations in the p34 or p44 TFIIH-core subunits have been identified that would lead to the hallmark nucleotide excision repair syndromes xeroderma pigmentosum or trichothiodystrophy. KW - general transcription factor IIH (TFIIH) KW - DNA repair KW - protein–protein interaction KW - p44 KW - p34 Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170173 VL - 45 IS - 18 ER - TY - JOUR A1 - Maurer, Jana A1 - Hupp, Sabrina A1 - Bischoff, Carolin A1 - Foertsch, Christina A1 - Mitchell, Timothy J. A1 - Chakraborty, Trinad A1 - Iliev, Asparouh I. T1 - Distinct neurotoxicity profile of listeriolysin O from \(Listeria\) \(monocytogenes\) JF - Toxins N2 - Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs) are protein toxins that originate from Gram-positive bacteria and contribute substantially to their pathogenicity. CDCs bind membrane cholesterol and build prepores and lytic pores. Some effects of the toxins are observed in non-lytic concentrations. Two pathogens, \(Streptococcus\) \(pneumoniae\) and \(Listeria\) \(monocytogenes\), cause fatal bacterial meningitis, and both produce toxins of the CDC family—pneumolysin and listeriolysin O, respectively. It has been demonstrated that pneumolysin produces dendritic varicosities (dendrite swellings) and dendritic spine collapse in the mouse neocortex, followed by synaptic loss and astrocyte cell shape remodeling without elevated cell death. We utilized primary glial cultures and acute mouse brain slices to examine the neuropathological effects of listeriolysin O and to compare it to pneumolysin with identical hemolytic activity. In cultures, listeriolysin O permeabilized cells slower than pneumolysin did but still initiated non-lytic astrocytic cell shape changes, just as pneumolysin did. In an acute brain slice culture system, listeriolysin O produced dendritic varicosities in an NMDA-dependent manner but failed to cause dendritic spine collapse and cortical astrocyte reorganization. Thus, listeriolysin O demonstrated slower cell permeabilization and milder glial cell remodeling ability than did pneumolysin and lacked dendritic spine collapse capacity but exhibited equivalent dendritic pathology. KW - medicine KW - listeriolysin O KW - meningitis KW - acute slices KW - variocosities KW - dendritic spines Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172130 VL - 9 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Cai, Kai A1 - El-Merahbi, Rabih A1 - Loeffler, Mona A1 - Mayer, Alexander E. A1 - Sumara, Grzegorz T1 - Ndrg1 promotes adipocyte differentiation and sustains their function JF - Scientific Reports N2 - Adipocytes play a central role in maintaining metabolic homeostasis in the body. Differentiation of adipocyte precursor cells requires the transcriptional activity of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (Pparγ) and CCAAT/enhancer binding proteins (C/Ebps). Transcriptional activity is regulated by signaling modules activated by a plethora of hormones and nutrients. Mechanistic target of rapamacin complexes (mTORC) 1 and 2 are central for the coordination of hormonal and nutritional inputs in cells and are essential for adipogenesis. Serum glucocorticoid kinase 1 (Sgk1)-dependent phosphorylation of N-Myc downstream-regulated gene 1 (Ndrg1) is a hallmark of mTORC2 activation in cells. Moreover, Pparγ activation promotes Ndrg1 expression. However, the impact of Ndrg1 on adipocyte differentiation and function has not yet been defined. Here, we show that Ndrg1 expression and its Sgk1-dependent phosphorylation are induced during adipogenesis. Consistently, we demonstrate that Ndrg1 promotes adipocyte differentiation and function by inducing Pparγ expression. Additionally, our results indicate that Ndrg1 is required for C/Ebpα phosphorylation. Moreover, we found that Ndrg1 phosphorylation by Sgk1 promotes adipocyte formation. Taken together, we show that induction of Ndrg1 expression by Pparγ and its phosphorylation by Sgk1 kinase are required for the acquisition of adipocyte characteristics by precursor cells. KW - differentiation KW - cell signalling KW - adipocytes KW - Ndrg1 Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170565 VL - 7 IS - 7191 ER -