TY - THES A1 - Leyh, Tanja T1 - GDF-15-Spiegel bei Patienten mit HER2/neu positivem Mammakarzinom im frühen Stadium: eine klinische Pilotstudie T1 - GDF-15 level in patients with early her2-positive breast cancer: a clinical pilot study N2 - GDF-15 wird seit wenigen Jahren als prognostischer und prädiktiver Marker in der Tumortherapie diskutiert. Diese Pilotstudie sollte erstmals GDF-15 bei Patienten mit HER2/neu positivem Mammakarzinom im frühen Stadium im klinischen Verlauf untersuchen. Dazu wurden 22 Patienten rekrutiert und die GDF-15-Spiegel mittels ELISA vor und während einer Antikörpertherapie bestimmt. Um GDF-15 als prädiktiven Marker zu testen, wurde nach neoadjuvanter Therapie und anschließender Operation der Regressionsgrad nach Sinn bewertet. In der untersuchten Kohorte wurde ein medianer GDF 15-Spiegel von 0,33 ng/ml ermittelt. Im Therapieverlauf kam es zu keiner signifikanten Veränderung des Spiegels. Höhere GDF-15-Spiegel konnten allerdings bei größeren Tumoren und bei einem höheren BMI analysiert werden. Ebenfalls konnten wir zeigen, dass der GDF-15-Spiegel signifikant mit dem Alter steigt. Nicht signifikant, aber von Bedeutung ist der Zusammenhang zwischen GDF-15 und dem Regressionsgrad nach Sinn. Die untersuchten Patienten wiesen tendenziell höhere GDF-15-Werte bei niedrigem Regressionsgrad auf. Ein schlechteres Ansprechen auf eine Antikörpertherapie bei höheren GDF 15-Spiegeln ist somit anzunehmen. N2 - GDF-15 as a prognostic and predictive marker in tumortherapy is actively discussed. In this pilot study we analysed the GDF-15 levels before an while antibody-therapy in patients with early her2-positiv breast cancer and correlated those with clinical variables. Overall we found relatively low GDF-15 levels. The correlation of GDF-15 with the sinn regression was not significant but showed a tendency. This indicates a worse response rate to a antibody-therapy for patients with higher GDF-15 serum levels. KW - GDF KW - Mammakarzinom KW - Antikörpertherapie KW - Brustkrebs KW - GDF-15 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241887 ER - TY - THES A1 - Junker, Markus T1 - Development and characterization of monoclonal antibodies to GDF-15 for potential use in cancer therapy T1 - Die Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen GDF-15 zur potenziellen Anwendung in der Krebstherapie N2 - Background GDF-15 is a divergent member of the TGF-superfamily, which was first described as macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1), revealing an immune modulatory function. GDF-15 is a soluble protein which is, under physiological conditions, highly expressed in the placenta and found in elevated levels in blood sera of pregnant women. Apart from the placenta, GDF-15 is expressed in healthy tissue, albeit to a lower extent and overexpressed in many solid tumors. A variety of different functions are attributed to GDF-15 in healthy as well as diseased humans. On the one hand, GDF-15 is required for successful pregnancy and low GDF-15 serum levels during pregnancy correlate with fetal abortion. On the other hand, overexpression of GDF-15, which can be observed in several malignancies is correlated with a poor prognosis. Furthermore, tumor derived GDF-15 leads to cancer associated anorexia-cachexia syndrome in mice. The aim of my PhD thesis was to further investigate the role of GDF-15 as an immune modulatory factor in cancer, in particular, by inhibiting the target molecule in vitro and in vivo. Therefore, the main focus was placed on the generation and characterization of monoclonal GDF-15 specific blocking antibodies, which were tested in vitro and in vivo, which represents a substantial part of my work. Results Here, GDF-15 was shown to be highly expressed in human gynecological cancer and brain tumors. We could then demonstrate that GDF-15 modulates effector immune cells in vitro. GDF-15 mediated a slight downregulation of the activating NKG2D receptor on NK and CD8+ T cells, which is crucial for proper anti-tumoral immune responses. Furthermore, we could demonstrate that GDF-15 reduces the adhesion of CD4+ and CD8+ T cells on endothelial cells in vitro. A negatively affected trans-endothelial migration of leukocytes into inflamed tissue could explain the low T cell infiltration in GDF-15 expressing tumors, which were observed in vivo, where mice bearing (shRNA mediated) GDF-15 deficient glioma cells revealed enhanced immune cell infiltrates in the tumor microenvironment, compared with the GDF-15 expressing control group. Those animals further exhibited a decreased tumor growth and prolonged survival. GDF-15 is a soluble protein, secreted by more than 50 % of solid tumors and associated with grade of malignancy. Therefore a neutralizing monoclonal antibody to GDF-15 was assumed to be an auspicious therapeutically anti-cancer tool. Such an antibody was thus generated in GDF-15 knock out mice against human GFD-15. Amongst many clones, the GDF-15 antibody clone B1-23 was found to be applicable in Western Blot as well as in ELISA techniques, detecting a three-dimensional epitope of the mature GDF-15 dimer with high affinity and specificity. To enable the humanization for a later administration in humans, the variable regions of antibody B1-23 were identified by a special PCR method using degenerate primers and cloned into a sequencing vector. The sequence obtained thereby enabled the generation of chimeric and humanized B1-23 variants. After further comprehensive characterization, the original mouse antibody B1-23 as well as the chimeric antibody (ChimB1-23) and the humanized B1-23 antibody (H1L5) were applied in a melanoma xenograft study in vivo. None of the antibodies could significantly inhibit tumor growth. .However of utmost importance, body weight loss mediated by tumor derived GDF-15 could be significantly prevented upon administration of all three GDF-15 specific antibodies, which confirmed the antagonizing functionality of the immunoglobulin. Conclusion GDF-15 is a promising cancer target, involved in tumor progression and cancer related cachexia. A monoclonal GDF-15 antibody was generated, which served on one hand as a tool for molecular biological applications (Western Blot, ELISA, etc.) and on the other hand was applied as an antagonizing antibody in vitro and in vivo. Even though tumor growth inhibition by GDF-15 depletion in T cell deficient athymic mice failed using B1-23, the same antibody and derivates thereof (chimeric and humanized) impressively prevented tumor associated cachexia in UACC-257 melanoma bearing nude mice. The missing anti-tumor effect in our own melanoma model in nude mice can only partially be explained by the missing secondary immunity, in particular cytotoxic T cells, in the athymic animals, since in a similar melanoma model, performed by an external company, a tumor reduction in immunocompromised animals was observed, when B1-23 was administered. These findings support the idea that T cells are substantial for an effective tumor immunity and are in line with the results of the syngeneic, T cell comprising, mouse glioma model, where silencing of tumor expressed GDF-15 led to an enhanced intratumoral T cell infiltration and a prolonged survival. Taken together our data allow for the conclusion that tumor associated cachexia can be combatted with the GDF-15 antibody B1-23. Further, B1-23 might elicit direct anti-tumor effects in immune competent models, which contain T cells, rather than in an athymic, T cell deficient nude mouse model. N2 - Hintergrund GDF-15 ist ein divergentes Mitglied der TGF-Superfamilie, welches zuerst als „macrophage inhibitory cytokine-1“ (MIC-1) mit immunmodulatorischen Eigenschaften beschrieben wurde. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich in der Plazenta exprimiert wird und welches im Serum von Schwangeren in erhöhten Konzentrationen nachgewiesen werden kann. Mit Ausnahme der Plazenta wird GDF-15 in verschiedenen gesunden Geweben gefunden, hier jedoch in deutlich niedrigeren Konzentrationen, und ist in vielen soliden Tumoren überexprimiert. GDF-15 werden sowohl bei gesunden, als auch bei kranken Menschen, unterschiedlichste Funktionen zugeschrieben. Zum einen ist GDF-15 für eine erfolgreiche Schwangerschaft notwendig. Niedrige GDF-15 Spiegel im Serum während der Schwangerschaft korrelieren mit dem Verlust des Fötus. Zum anderen korreliert die Überexpression von GDF-15, welche bei unterschiedlichen Malignitäten beobachtet werden kann, mit einer schlechten Prognose. Darüber hinaus verursacht das von Tumorzellen sezernierte GDF-15 das sogenannte „Anorexie-Kachexie Syndrom“ in Mäusen. Das Ziel meiner Arbeit war es, die immunmodulatorische Funktion von GDF-15 im Tumorkontext zu untersuchen, insbesondere durch eine Hemmung des Zielmoleküls in vitro und in vivo. Aus diesem Grund wurde der Schwerpunkt auf die Generierung und Charakterisierung monoklonaler, GDF-15 spezifischer, blockierender Antikörper gelegt. Diese wurden sowohl in vitro als auch in vivo getestet, was einen großen Teil dieser Arbeit darstellt. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass GDF-15 in humanen gynäkologischen Tumoren wie auch in Hirntumoren überexprimiert ist. Weiterhin ließ sich zeigen, dass GDF-15 Effektorzellen des Immunsystems in vitro moduliert. Dabei verursacht GDF-15 eine moderate Herunterregulation des aktivierenden Killing Rezeptors NKG2D auf NK und CD8+ T Zellen, welcher eine hohe Bedeutung für eine effektive anti-tumorale Immunantwort hat. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass GDF-15 die Adhäsion von CD4+ und CD8+ T Zellen auf Endothelzellen in vitro herabsetzt. Eine daraus resultierende Reduktion der trans-endothelialen Migration von Leukozyten in entzündetes Gewebe erklärt möglicherweise die niedrige T Zell Infiltration in GDF-15 exprimierenden Tumoren, welche in vivo beobachtet werden konnten. Mäuse, denen (auf shRNA basierende) GDF-15-defiziente Gliomzellen appliziert wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche GDF-15-exprimierenden Gliomzellen erhalten hatte, ein verlängertes Überleben, vermindertes Tumorwachstum und eine erhöhte Immunzellinfiltration in das Tumormikromillieu. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das von mehr als 50 % aller soliden Tumore sezerniert wird und mit dem Grad der Malignität korreliert. Daher wurde postuliert, dass ein neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen GDF-15 eine effektive neue Antikrebstherapie ermöglichen sollte. Solch ein Antikörper wurde entsprechend in GDF-15-defizienten Mäusen generiert. Unter verschiedenen Klonen wurde der Antikörper Klon B1-23 identifiziert, welcher sowohl im Western Blot als auch im ELISA anwendbar ist. Dieser Klon detektiert ein drei-dimensionales Epitop des maturen GDF-15 Dimers mit hoher Affinität und Spezifität. Um den Antikörper für eine spätere Anwendung im Menschen humanisieren zu können, wurden die variablen Regionen des Klons B1-23 durch eine spezielle PCR Methode unter Verwendung degenerierter Primer und nachfolgender Klonierung in einen Sequenzierungsvektor identifiziert. Die hierdurch gewonnenen Sequenzen ermöglichten die Generierung von chimären und humanisierten Varianten von B1-23. Nach anschließender intensiver Charakterisierung konnte sowohl der ursprüngliche Maus-Antikörper B1-23 als auch der chimäre B1-23 Antikörper (ChimB1-23) und der humanisierte B1-23 Antikörper (H1L5) in einer Melanom Xenograft Studie in vivo getestet werden. Zwar ließ sich mit keinem der Antikörper eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums beobachten. Als herausragendes Ergebnis zeigte sich allerdings, dass der durch GDF-15 induzierte Gewichtsverlust signifikant durch die Verabreichung der GDF-15 spezifischen Antikörper verhindert werden konnte, was die antagonisierende Funktionalität des entwickelten Immunglobulins bestätigte. Schlussfolgerung GDF-15 ist ein vielversprechendes Zielmolekül bei Krebserkrankungen, welches bei der Tumorprogression und Tumor-assoziierter Kachexie beteiligt ist. Es konnte ein monoklonaler Anti-GDF-15 Antikörper generiert werden, welcher zum einen molekularbiologisch zum Einsatz kam (z.B. Western Blot, ELISA, etc.) und zum anderen als antagonisierender Antikörper sowohl in vitro als auch in vivo Anwendung fand. Auch wenn B1-23 scheinbar keine Tumorwachstumshemmung durch die Depletion von GDF-15 in T Zell defizienten athymischen Mäusen zeigte, konnte derselbe Antikörper wie auch die abgeleiteten Varianten (chimärisiert und humanisiert) eindrücklich die Tumor assoziierte Kachexie im UACC-257 Melanom Modell verhindern. Der ausgebliebene antitumorale Effekt in unserem Melanom Modell in Nacktmäusen lässt sich nur zum Teil durch eine fehlende sekundäre Immunkomponente, insbesondere das Fehlen zytotoxischer T Zellen, erklären, da es in einem ähnlichen Xenograft Melanom Modell, welches in Auftragsforschung (CRO) durchgeführt wurde, zu einer Reduktion des Tumorwachstums durch die Applikation von B1-23 kam. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass T Zellen unerlässlich für eine effektive antitumorale Antwort sind, eine Annahme, die durch die Ergebnisse des syngenen Gliom Maus-Modells unterstützt wird, in welchem es durch das Ausschalten von Tumor produziertem GDF-15 zu einer erhöhten intratumoralen T Zell Infiltration und einem längeren Überleben kam. Zusammengenommen erlauben uns diese Daten den Schluss, dass eine tumorbedingte Kachexie durch den GDF-15-Antikörper B1-23 bekämpft werden kann. Allerdings sind direkte B1-23 vermittelte antitumorale Effekte eher in immunkompetenten Modellen mit T Zellen als in einem athymischen, T Zell defizienten Nacktmaus-Modell zu erwarten. KW - Growth-differentiation Factor 15 KW - GDF-15 KW - Monoklonaler Antikörper KW - Krebs KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132424 ER - TY - THES A1 - Dombrowski, Yvonne T1 - Charakterisierung von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom T1 - Characterization of GDF-15 as immune modulator in ovarian cancer N2 - GDF-15 ist ein atypisches Mitglied der TGF-b-Superfamilie. Unter physiologischen Bedingungen kommt es nur in der Plazenta in größeren Mengen vor, während es in zahlreichen Tumoren überexprimiert gefunden wurde. Die genaue Funktion von GDF-15 im Tumorkontext ist nicht genau geklärt. Aufgrund der häufigen und hohen Expression in Tumoren scheint GDF-15 eine wesentliche Funktion im Tumorprogress auszuüben. Das Ovarialkarzinom (OvCA) nimmt die Stellung als tödlichste gynäkologische Erkrankung ein. Da der Tumor meist erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert wird, sind bis heute die Heilungschancen schlecht. Häufig kommt es zum Rezidiv nach zunächst erfolgreicher Chemotherapie und mit 30% ist die 5-Jahres-Überlebenschance gering. Für die chemoresistenten Fälle gibt es bis zum heutigen Zeitpunkt keine effektive Therapie. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, neue innovative Therapiestrategien zu entwickeln. Günstige immunologische Parameter korrelieren mit der Überlebensdauer von OvCA-Patientinnen, was die Immuntherapie beim OvCA in den Fokus der experimentellen klinischen Therapie rückt. Doch um neue immuntherapeutische Strategien entwickeln zu können, müssen zunächst immunologisch relevante Angriffspunkte identifiziert werden. Das in vielen Tumoren exprimierte GDF-15 ist mit einem der stärksten immunsuppressiven Faktoren verwandt, was die Vermutung nahe legt, dass auch GDF-15 eine immunologisch relevante Funktion im Tumorkontext ausüben könnte. Daher wurden die Expression und die mögliche Funktion von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom untersucht. Expressionsanalysen von OvCA-Gewebe und primären OvCA-Zellen zeigten, dass GDF-15 das am stärksten überexprimierte Gen der untersuchten TGF-b-Familienmitglieder im OvCA ist. Auch als sezerniertes Protein wird GDF-15 in vivo und in vitro im OvCA detektiert, was auf eine funktionale Rolle von GDF-15 im OvCA hindeutet. Normalerweise eliminiert das Immunsystem entartete körpereigene Zellen. Manchmal gelingt es Tumorzellen jedoch, sich dieser Immunüberwachung zu entziehen und dem Immunsystem zu „entwischen“. Inwieweit GDF-15 bei der Koordination des „immune escape“ des OvCA eine Rolle spielt, sollte im Fokus dieser Arbeit stehen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf der Wirkung von GDF-15 auf NK-Zellen, da diese als frühe Effektoren und wichtige Mediatoren zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem nicht nur eine Schlüsselrolle bei der immunologische Überwachung spielen, sondern sich dadurch auch als ideale Werkzeuge für die Tumorimmuntherapie auszeichnen. Exogenes GDF-15 hemmt in vitro die Lyseaktivität von NK-Zellen gegenüber OvCA-Zellen. Endogene GDF-15-Defizienz der OvCA-Zellen sensitiviert diese für NK-Zell-Lyse und endogene GDF-15-Überexpression mindert die NK-Lyseaktivität. Die Hemmung der NK-Lyseaktivität kann durch verschiedene synergistisch wirkende Mechanismen erfolgen: durch Rezeptormodulation, durch direkte Modulation des Lysemechanismus und durch Apoptoseregulation. Wie TGF-b1 reguliert GDF-15 die Expression des aktivierenden NK-Rezeptors NKG2D von der Zelloberfläche herunter und induziert zusätzlich die Expression des inhibierenden Rezeptors CD305 und die des mit NKG2A- und NKG2C-assoziierten Rezeptors CD94. Daneben greift GDF-15 direkt in den Lysemechanismus der NK-Zellen ein, indem es die Granzym B-Expression beeinflusst. Darüber hinaus sensitiviert GDF-15 Immunzellen für die Apoptose durch die Induktion von Fas/CD95. Signaltransduktionsanalysen zeigen, dass GDF-15 in Immunzellen die SMAD-Proteine zeitverzögert zu TGF-b aktiviert, was auf eine indirekte Wirkung schließen lässt. Zusätzlich kann GDF-15 auch die die p38/MAPK in Immunzellen aktivieren. Die Genregulation von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen ist sehr verschieden. Beide Zytokine regulieren überwiegend Gene aus gleichen Funktionalitätsclustern, allerdings sind die einzelnen von TGF-b1 und GDF-15 regulierten Gene verschieden. Nur drei Gene (CD55, Caspase-8 und Apolipoprotein 6) sind durch GDF-15 und TGF-b1 gleich reguliert. Zusammengefasst zeigt sich eine funktionale Analogie von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen. TGF-b1 scheint eine stärkere Wirkung zu induzieren, dafür zeigt GDF-15 hier ein breiteres Funktionalitätsspektrum. Durch die Charakterisierung der funktionalen Rolle von GDF-15 als Immunmodulator in Tumoren ist hier ein neuer potentieller Angriffspunkt identifiziert worden, welcher Grundlage für neue Tumortherapiestrategien, nicht nur für das OvCA, sondern auch für andere GDF-15-exprimierende Tumore sein kann. N2 - GDF-15 is an atypical member of the TGF-b superfamily. Under physiological conditions it is expressed primarily in the placenta, whereas it is over-expressed in many tumors. So far, the exact function of GDF-15 in tumor context remains unknown. Due to the high and frequent expression in different tumors GDF-15 might play an important role in tumor progression. Ovarian cancer (OvCA) is one of the most deadly gynaecological malignancies. Often OvCA is diagnosed in late stages and therapies frequently fail. Initially, chemotherapy is successful but in many cases tumors re-grow and the 5-year survival rate is less than 30%. Until now, no cure for chemoresistent OvCA exists which demonstrates the need for new experimental strategies. Immunotherapy is one major subject of experimental OvCA therapy, as favorable immunological parameters correlate with the survival of OvCA patients. In order to design new immunotherapeutic strategies against OvCA reliable and immunologically relevant targets have to be identified. GDF-15 is not only highly expressed in different tumors but is also closely related to one of the most immunosuppressive factors known suggesting a potential immunosuppressive role for GDF-15 itself. Thus, in this work GDF-15 expression and potential function as an immune modulator in ovarian cancer is analyzed. Expression analyses of OvCA tissue and primary OvCA cells reveal GDF-15 with the highest over-expression in OvCA of all analyzed TGF-b family members on RNA and protein level in vivo and in vitro. This high expression suggests a functional involvement of GDF-15 in ovarian carcinogenesis. The immune system is able to eliminate altered cells but sometimes tumor cells escape from this immune surveillance. Thus, this work focuses on the contribution of GDF-15 to the immune escape of OvCA. NK cells act as early cytotoxic effectors against tumors and represent important immune mediators with impact on innate and adaptive immunity. In vitro, exogenous GDF-15 inhibits NK cell lysis against OvCA cells. Additionally, GDF-15 deficient OvCA cells are killed more efficiently in NK lysis assays than GDF-15 over-expressing OvCA targets. Inhibition of NK cell lysis can occur by different synergistic mechanisms: receptor modulation, direct inhibition of cytotoxic functions and apoptosis regulation. Like TGF-b GDF-15 down-regulates NKG2D receptor expression and furthermore, induces the expression of the inhibitory receptor CD305 and the NKG2A and NKG2C associated receptor CD94. Additionally, GDF-15 interferes directly with the cytolytic activity of NK cells by reducing granzyme B expression. Moreover, GDF-15 sensitizes immune cells for apoptosis by up-regulation of CD95/Fas. Signal transduction analyses reveal a delay in GDF-15 dependent SMAD signaling in immune cells compared to that of TGF-b suggesting a rather indirect effect of GDF-15. But GDF-15 can additionally activate p38/MAPK in immune cells. GDF-15 and TGF-b dependent gene regulation in NK cells is different although regulated genes cluster in the same functional groups. Only three genes (CD55, caspase-8 and Apolipoprotein 6) are regulated in a similar way. In summary, GDF-15 and TGF-b show similar immune modulating characteristics. TGF-b seems to be more potent mostly achieving a more powerful effect but here, GDF-15 showed a broader mechanistic spectrum. The functional role of GDF-15 as an immune mediator in tumor context reveals an interesting new target for experimental therapy not only for OvCA but for all GDF-15 producing tumors. KW - Immunmodulator KW - Eierstockkrebs KW - Tumorimmunologie KW - Transforming Growth Factor beta KW - GDF-15 KW - Ovarialkarzinom KW - GDF-15 KW - ovarian cancer KW - tumor immunology KW - immune modulator Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48885 ER -