TY - THES A1 - Elsner, Clara Dorothea T1 - Ultrastructural analysis of biogenesis and release of endothelial extracellular vesicles T1 - Ultrastrukturelle Analyse der Biogenese und Freisetzung von endothelialen extrazellulären Vesikeln N2 - Extracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release in Myocardial Endothelial (MyEnd) and Aortic Endothelial (AoEnd) cells cultured under serum starvation and inflammatory stimulation with TNF-α. Detailed morphological analyses were conducted applying and comparing different high- resolution light and electron microscopic methods. In this study, we could depict all steps of MV biogenesis named in literature. However, during the study of exosome biogenesis, we discovered a yet undescribed process: Instead of a direct fusion with the plasma membrane, multivesicular bodies were incorporated into a new distinct cellular compartment bound by fenestrated endothelium first. This may present a novel step in exosome biogenesis and warrants further study. Regarding the conditions of cell cultivation, we observed that the commonly used serum starvation causes MyEnd cells, but not AoEnd cells, to enter apoptosis after 48 hours. When preparing functional EV studies, we therefore recommend assessing the morphological condition of the serum-starved cells at different cultivation points first. When evaluating MV production, a statistical analysis showed that the more time AoEnd cells spent in cultivation under serum starvation, the higher the percentage of MV producing cells. However, additional TNF-α stimulation induced a significantly higher MV production than serum starvation alone. Lastly, our results show that TNF-α stimulation of AoEnd cells in vitro leads to the upregulation of CD44, an adhesion molecule critical in the early stages of atherosclerosis. CD44 was then depicted on the surface of generated MVs and exosomes. We conclude that under inflammatory conditions, EVs can mediate the transfer of CD44 from endothelial cells to target cells. This could be a novel mechanism by which MVs contribute to the development and progression of atherosclerotic disease and should be clarified by further studies. N2 - Extrazelluläre Vesikel (EV), darunter Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körperchen, werden von fast allen Zellen des Körpers freigesetzt, transportieren zellspezifische Informationen und sind von großer Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation. Sie spielen eine zentrale Rolle in verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Vorgängen, wie etwa der Atherosklerose. Während die zellulären Mechanismen hinter der Entstehung und Komposition der EV bereits intensiv erforscht wurden, ist noch wenig über die zugrundeliegenden morphologischen Prozesse bekannt. Diese Arbeit präsentiert eine detaillierte ultrastrukturelle Analyse der Bildung und Freisetzung von EV in myokardialen (MyEnd) und aortalen Endothelzellen (AoEnd), die unter Serumentzug sowie inflammatorischer Stimulation mit TNF-α kultiviert wurden. Dazu wendeten wir verschiedene hochauflösende licht- und elektronenmikroskopische Techniken an. Wir konnten alle in der Literatur beschriebenen Schritte der MV-Biogenese darstellen. Bei der Untersuchung der exosomalen Biogenese entdeckten wir jedoch einen bisher unbekannten Prozess: Anstelle einer direkten Fusion der multivesikulären Körperchen mit der Plasmamembran, wurden diese zunächst in ein neues, von fenestriertem Endothel begrenztes, zelluläres Kompartiment integriert. Ferner stellten wir fest, dass der häufig durchgeführte Serumentzug während der Kultivierung bei MyEnd- – allerdings nicht AoEnd- – Zellen nach 48 Stunden zur Apoptose führte. Daher empfehlen wir, bei funktionellen Studien von EV zunächst eine morphologische Untersuchung der unter Serumentzug kultivierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen. Eine statistische Analyse der MV-Produktion zeigte, dass die Zellen umso mehr MV produzierten, je länger sie sich unter Serumentzug befanden. Jedoch induzierte eine zusätzliche Stimulation mit TNF-α eine signifikant höhere MV-Produktion als der alleinige Serumentzug. Wir konnten zeigen, dass eine TNF-α Stimulation von AoEnd Zellen in vitro zu einer vermehrten Expression von CD44 führte – einem vor allem in der Frühphase der Atherosklerose bedeutendem Adhäsionsmolekül. CD44 konnte ebenso auf der Oberfläche von produzierten MV und Exosomen nachgewiesen werden. Wir schließen daraus, dass MV unter inflammatorischen Bedingungen den Transfer von CD44 von Endothelzellen zu Zielzellen vermitteln und so zur Entstehung und Progression von Atherosklerose beitragen können. KW - Vesikel KW - Exosom KW - Endothelzelle KW - Zellkommunikation KW - Atherosklerose KW - Extracellular Vesicles KW - Microvesicles KW - Exosomes KW - Cell-cell communication KW - Electron microscopy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288526 ER - TY - JOUR A1 - Scheer, Ulrich T1 - The ultrastructure of the nuclear envelope of amphibian ooctyes: IV. On the chemical nature of the nuclear pore complex material N2 - In order to investigate the chemical composition of the nuclear pore complexes isolated nuclei from mature Xenopus laevis oocytes were manually fractioned into nucleo· plasmic aggregates and the nuclear envelopes. The whole isolation procedure takes no more than 60- 90 sec, and the pore complexes of the isolated envelopes are well preserved as demonstrated by electron microscopy. Minor nucleoplasmic and cytoplasmic contaminations associated with the isolated nuclear envelopes were determined with electron microscopic morphometry and were found to be quantitatively negligible as far as their mass and nucleic acid content is concerned. The RNA content of the fractions was determined by direct phosphorus analysis after differential alkaline hydrolysis. Approximately 9% of the total nuclear RNA of the mature Xenopus egg was found to be attached to the nuclear envelope. The nonmembranous elements of one pore complex contain 0.41 X 10- 16 g RNA. This value agrees well with the content estimated from morphometric data. The RNA package density in the pore complexes (270 X 10- 15 g/fJ-3) is compared with the nucleolar, nucleoplasmic and cytoplasmic RNA concentration and is discussed in context with the importance of the pore complexes for the nucleo-cytoplasmic transport of RNA-containing macromolecules. Additionally, the results of the chemical analyses as well as of the 3H-actinomycin D autoradiography and of the nucleoprotein staining method of Bernhard (1969) speak against the occurence of considerable amounts of DNA in the nuclear pore complex structures. KW - Nuclear envelope KW - Amphibian oocytes KW - Nuclear pore complex KW - Chemical nature KW - Electron microscopy Y1 - 1972 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39500 ER - TY - THES A1 - Ströhle, Serge - Peer T1 - Kultivierung von humanem Speicheldrüsengewebe in einer dreidimensionalen Polyurethanmatrix T1 - Cultivation of human salivary gland tissue in a three-dimensional Polyurethane Matrix N2 - Bei Tumoren von Kopf und Hals kann primär oder adjuvant durch Bestrahlung therapiert werden. Die Folgen dieser Behandlung können Xerostomie, Karies, Infektionen, Dysphagie oder Mundgeruch sein. Diese Nebenwirkungen vermindern die Lebensqualität des Patienten. Unterschiedliche Behandlungsansätze haben aufgrund von therapiebedingten Einschränkungen nicht den Weg in den klinischen Alltag gefunden. Eine Alternative zu den vorhandenen Behandlungsansätzen kann das Tissue Engineering sein. Das Ziel einer Normalisierung der Speichelproduktion nach Behandlung soll durch eine implantierbare, künstliche Speicheldrüse erreicht werden. Kann humanes natives Speicheldrüsengewebe der Parotis auf gradientenfreiem dreidimensional aufgebauten Polyurethan wachsen und seine Funktionalität beibehalten? Humane Parotiszellen wurden von 20 Patienten im Alter von 42 - 90 Jahren durch Operation entnommenen und in Polystyrol-Zellkulturflaschen mit dem Nährmedium BEGM herangezüchtet. Es erfolgte eine 2D-Zellverteilung der reinen Parotiskultur. Zur Kontrolle der Vitalität zwischen den Passagen wurde eine Trypan-Blau Färbung verwendet. Als Trägermaterial der Zellen wurde eine biokompatible, abbaubare Matrix aus ε-Polycaprolacton verarbeitet. Die Übertragung der humanen Parotiszellen wurde mit einer Kleberproteinlösung, bestehend aus den Hauptbestandteilen Aprotinin, Fibrinogen und der Thrombinlösung durchgeführt. 7,14 und 21 Tage nach Aufbringung wurde der Überstand der zeitgleich entnommenen Konstrukte zur Überprüfung des α-Amylase konserviert. Zusätzlich wurden an den 3 Untersuchungstagen Konstrukte für die Anfertigung von histologischen Schnitten, quantitativer PCR, indirekter Immunfluoreszenz und zur Elektronenmikroskopie entnommen. Zur Überprüfung der Funktionalität der angezüchteten Speicheldrüsenzellen wurde das Enzym α-Amylase und das Wasserkanalprotein Aquaporin 5 herangezogen. Bei der Kultivierung der humanen Speicheldrüsenzellen konnte durch den Vitalitätstest Trypan-Blau Färbung in Kombination mit einer Neubauerzählkammer eine konstant hohe Anzahl an vitalen Zellen bis zur 4. Passage nachgewiesen werden. Durch die Lebend/Tot Färbung auf FDA/EB Basis der Konstrukte über die Untersuchungszeit von 14 Tagen konnte keine Vermehrung von avitalen Zellen mikroskopisch festgestellt werden. Die statistische Auswertung mittels Boxplots des ELISA berechnete für den ersten Untersuchungstag einen Median auf niedrigem Niveau von 4,4 U/l und sank im weiteren Zeitverlauf am Untersuchungstag 21 auf die niedrigsten Median von 2,2 U/l ab. α-Amylase konnte an allen 3 Tagen mittels quantitativer PCR und indirekter Immunfluoreszenz belegt werden. Aquaporin 5 als Funktionsnachweis war in der vorliegenden Studie nicht signifikant durch quantitative PCR beweisbar. Die Rasterelektronenmikroskopie bildete adhärente Zellen in kugeliger Form aus den besiedelten Matrices nach 7 Tagen Kultivierung ab. Durch die Transmissionselektronenmikroskopie konnten Zellen, die Zellfortsätze ausgebildet hatten nach 14 Tagen beobachtet werden. Der Versuch, histologische Schnitte auf Grundlage der Paraffineinbettung oder Kryo-Konservierung zu erzeugen, musste frustran abgeschlossen werden. Eine Kultivierung von Speicheldrüsenzellen auf einer Matrix aus ε-Polycaprolacton ohne Gradienten ist eingeschränkt umsetzbar. Die Studie konnte zeigen, dass das Wachstum der Zellen auf konstant niedrigem Niveau über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen lag. Der Funktionsnachweis von α-Amylase auf absinkendem niedrigem Niveau sowie fehlender Bestätigung von Aquaporin 5 kann als stationäre Phase des Wachstums interpretiert werden. Zur Verbesserung der Zellentwicklung sollte die besiedelte Matrix zu einem 3D-Zellwachstum anregen. Bei sequenziell entstehender Polarität der Zellen käme es zu einer Verbesserung der Vitalität sowie der vermehrten Ausbildung von α-Amylase und Aquaporin 5. Dies könnte in einer Kombination der Zellkultur aus Parotiszellen mit Kokulturen aus humanen Myoepithelzellen und Parenchymzellen erreicht werden. Sehr gute Ergebnisse des Zellwachstums und der Zellfunktion konnten aktuell in anderen Studien auf der Trägersubstanz Matrigel oder durch Rebesiedelung von dezellularisierten Organen beobachtet werden. N2 - In the case of tumours of the head and neck, the tumour can be treated primarily or adjuvantly by radiation. The consequences of this treatment can be xerostomia, caries, infections, dysphagia or bad breath. These side effects reduce the patient's quality of life. Different treatment approaches have not found their way into the clinical routine due to therapy related limitations. Tissue engineering can be an alternative to the existing treatment approaches. The goal of normalising saliva production after treatment is to be achieved by means of an implantable, artificial salivary gland. Can human native salivary gland tissue of the parotid gland grow on gradient-free three-dimensional polyurethane and retain its functionality? Human parotid gland cells were taken from 20 patients aged 42 - 90 years by surgery and cultivated in polystyrene cell culture bottles with the culture medium BEGM. A 2D cell distribution of the pure parotid culture was performed. A trypan-blue staining was used to control the vitality between the passages. A biocompatible, degradable matrix of ε-polycaprolactone was used as carrier material for the cells. The transfer of human parotid cells was performed with a glue protein solution consisting of the main components aprotinin, fibrinogen and the thrombin solution. 7, 14 and 21 days after application, the supernatant of the constructs taken at the same time was preserved for the examination of α amylase. In addition, constructs for the preparation of histological sections, quantitative PCR, indirect immunofluorescence and electron microscopy were taken during the 3 days of examination. The enzyme α-amylase and the water channel protein aquaporin 5 were added to test the functionality of the cultivated salivary gland cells. During the cultivation of human salivary gland cells, the vitality test Trypan blue staining in combination with a Neubauer counting chamber showed a constantly high number of vital cells up to the 4th passage. The live/dead staining on FDA/EB basis of the constructs over the examination period of 14 days did not show any proliferation of avital cells. The statistical evaluation by means of ELISA box plots calculated a median at a low level of 4.4 U/l for the first day of the examination and dropped to the lowest median of 2.2 U/l on examination day 21. α-amylase was detected on all 3 days by quantitative PCR and indirect immunofluorescence. Aquaporin 5 as a functional test was not significantly detectable by quantitative PCR in this study. The scanning electron microscopy imaged adherent cells in spherical form from the colonised matrices after 7 days of cultivation. Using transmission electron microscopy, cells that had formed cell extensions could be observed after 14 days. The attempt to produce histological sections based on paraffin embedding or cryopreservation had to be frustrated. Cultivation of salivary gland cells on a matrix of ε-polycaprolactone without gradients is of limited use. The study was able to show that the growth of the cells was at a constantly low level over the 21-day period of the study. The proof of function of α-amylase at a decreasing low level and the lack of confirmation of aquaporin 5 can be interpreted as a stationary phase of growth. To improve cell development, the colonised matrix should stimulate 3D cell growth. If the cells were to develop a sequential polarity, there would be an improvement in vitality as well as increased formation of α-amylase and aquaporin 5. This could be achieved by a combination of cell culture from parotid cells with cocultures of human myoepithelial cells and parenchymal cells. Very good results of cell growth and cell function could be observed in other studies on the carrier substance Matrigel or by re-colonisation of decellularised organs. KW - Ohrspeicheldrüse KW - Tissue Engineering KW - Polyurethane KW - Trägersubstanz KW - Zellkultur KW - Ohrspeicheldrüse KW - Elektronenmikroskopie KW - Biomarker KW - Real time quantitative PCR KW - Electron microscopy KW - Cell culture KW - Parotid glands KW - Biochemical markers KW - Quantitative Real-Time PCR Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216887 ER - TY - JOUR A1 - Franke, Werner W. A1 - Kartenbeck, Jürgen A1 - Krien, S. A1 - VanderWoude, W. J. A1 - Scheer, Ulrich A1 - Morré, D. J. T1 - Inter- and intracisternal elements of the Golgi apparatus: A system of membrane-to-membrane cross-links N2 - Electron opaque cross-bridge structures span the inter- and intracisternal spaces and provide membrane-to-membrane connections between adjacent cisternae of dictyosomes of pollen tubes of Clivia and Lilium. Additionally, the classic intercisternal rods, characteristic of intercisternal regions near the maturing face of dictyosomes, are connected with the adjacent membranes through similar cross-bridge elements. We suggest that these structural links are responsible for maintaining the flattened appearance of the central parts of Golgi apparatus cisternae as well as for the coherence of cisternae within the stack. Observations on other plant (e.g. microsporocytes of Canna) and animal cells (e.g. rodent liver and hepatoma cells, newt spermatocytes) show that such an array of membrane cross-links is a universal feature of Golgi apparatus architecture. The cross-bridges appear as part of the complex "zone of exclusion" which surrounds dictyosomes, entire Golgi apparatus and Golgi apparatus equivalents in a variety of cell types. KW - Golgi apparatus KW - Membranes KW - Cross-bridges KW - Electron microscopy Y1 - 1972 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39514 ER - TY - JOUR A1 - Scheer, Ulrich T1 - A novel type of chromatin organization in lampbrush chromosomes of Pleurodeles waltlii: visualization of clusters of tandemly repeated, very short transcriptional units N2 - A novel chromatin configuration is described in lampbrush chromosomes of Pleurodeles waltlii oocytes which is different from transcriptionally inactive chromatin as weil as from the various forms of transcribed chromatin hitherto described. This novel type of chromatin is not arranged in Christmas tree-Iike configurations of densely packed lateral ribonucleoprotein (RNP) fibriIs but is characterized by a periodic alternating pattern of thick and thin regions which occur in clusters 01 some 10,000 repeats. Each thickened unit with an average length of 45 nm contains two c10sely spaced particles, the putative RNA polymerases, and each thickened unit is separated from the next one by a beaded chromatin spacer with a length of about 80 nm. This chromatin spacer contains on average two particles of approximately 14 nm in diameter, assumed to be nucleosomes. The thickened regions are interpreted to represent short transcriptional units containing approximately 130 base pairs of DNA which are separated from each other by nontranscribed spacers of 240-400 base pairs of DNA. The possibility is discussed that these transcriptional units represent 5S rRNA or tRNA genes. KW - Lampbrush chromosomes KW - Amphibian oocytes KW - Transcription units KW - Electron microscopy Y1 - 1982 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-41087 ER -