TY - THES A1 - Winkelmann, Julia T1 - Molekulare Charakterisierung Saposin-ähnlicher Proteine von Entamoeba histolytica SCHAUDINN T1 - Molecular characterization of saposin-like proteins of Entamoeba histolytica SCHAUDINN N2 - Saposin-ähnliche Proteine (SAPLIPs) sind membraninteragierende Proteine, die sich durch die konservierte Position von drei Disulfidbrücken, einer typischen alpha-helikalen Proteinfaltung und der Fähigkeit mit Lipiden zu interagieren, auszeichnen. Ihre zellulären Funktionen sind äußerst vielfältig. Bis zum Beginn des Genomsequenzierungsprojektes waren die Amoebapores die einzigen bekannten und charakterisierten SAPLIPs von Entamoeba histolytica, dem Erreger der humanen Amöbenruhr. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Aktivität stellen sie für diesen parasitischen Einzeller, der sich von phagozytierten Bakterien ernährt, wichtige Effektormoleküle dar. Sie können aber auch cytolytisch auf Wirtszellen wirken und werden deshalb als bedeutender Pathogenitätsfaktor angesehen. Die theoretische computergestützte Datenbankanalyse nach Abschluss der Genomsequenzierung ergab, dass es 16 weitere Gene kodierend für SAPLIPs zusätzlich zu den drei Amoebapore-Genen gibt. Die Sequenzen der neuen SAPLIPs sind abgesehen von dem Cysteinmotiv divers und auch die Größe der Proteine ist sehr unterschiedlich (77 - 1009 Aminosäuren). Alle besitzen sie jedoch eine einzige, C-terminal gelegene SAPLIP Domäne. Außer der SAPLIP-Domäne konnten keine weiteren bekannten funktionellen oder strukturellen Domänen in den relevanten Datenbanken identifiziert werden, die auf mögliche Funktionen hätten hinweisen können. Alle SAPLIP-Gene werden gleichzeitig in axenisch kultivierten Trophozoiten transkribiert wie durch reverse Transkriptions-PCR gezeigt wurde. Die vergleichende transkriptionelle Analyse im Mikroarray ergab, dass nach Kontakt mit menschlichen Kolonzellen keine Hochregulierung dieser Gene mit Ausnahme des Amoebapore A Gens stattfindet. Für die parallele Klonierung der verschiedenen SAPLIP-Domänen wurde ein ”Expressionsscreening” in E.coli mit dem grün fluoreszierenden Protein als Reporterprotein etabliert, das die erfolgreiche Klonierung und Expression eines Fragments aufgrund der Fluoreszenz der Bakterienkolonie bereits auf der Ebene der Transformation anzeigt. Die rekombinant exprimierte und bis zur Homogenität gereinigte SAPLIP-Domäne von SAPLIP 12 wies Amoebapore-ähnliche Aktivitäten auf. Unter Verwendung von Liposomen konnte porenbildende Aktivität nachgewiesen werden, wobei diese Aktivität stark an einen sauren pH-Wert gebunden ist. Die SAPLIP-Domäne 12 ist aber auch antibakteriell und dieses sogar mit vergleichbarer Selektivität wie Amoebapore A, nämlich Zelllyse von gram-positiven B. megaterium war nachweisbar, jedoch nicht von gram-negativen E. coli. Strukturell unterscheiden sich die SAPLIP-Domäne 12 und Amoebapore A bezüglich der Exposition positiver Ladungsansammlungen auf der Proteinoberfläche und des Fehlens des für den Mechanismus der Amoebapores essentiellen Histidinrestes an entsprechender Position in der Sequenz. Darüber hinaus übt die SAPLIP-Domäne 12 eine im Vergleich zum Amoebapore A geringere spezifische Aktivität aus. Diese Eigenschaften weisen darauf hin, dass es sich um einen anderen Wirkungsmechanismus handeln könnte. Für die SAPLIP-Domäne 12 wäre eine über die positiven Ladungen der Proteinoberfläche vermittelte Interaktion mit den negativ geladenen Phospholipidköpfen von Membranen denkbar, die bei Erreichen einer bestimmten Konzentration in einer Störung der Lipidordnung und letztendlich in der Auflösung der Membranstruktur resultieren könnte. SAPLIP 3 ähnelt den Amoebapores in der Größe und molekularen Architektur und kann somit als funktionelle Einheit angesehen werden, es unterscheidet sich aber durch eine hohe negative Nettoladung von den Amoebapores. Außerdem ist das rekombinante SAPLIP 3 nicht antibakteriell und die Membraninteraktionen dieses SAPLIPs unterscheiden sich grundlegend von denjenigen, die für die Amoebapores beschrieben sind. SAPLIP 3 zerstört nicht einfach die Liposomenstruktur wie von den porenbildenden Amoebapores bekannt, sondern es vermittelt die Fusion von multilamellaren Liposomen unter Freisetzung des Liposomeninhalts. Diese Aktivität ist abhängig von der Anwesenheit anionischer Lipide und von einem sauren pH-Wert. Die Fähigkeit zur Vesikelfusion sowie die Verteilung der negativen Ladungen von SAPLIP 3 auf der Proteinoberfläche ähneln Merkmalen des humanen Saposin C. Neben der Funktion als Cofaktor von Exohydrolasen, die im Sphingolipid Katabolismus involviert sind, wird angenommen, dass die Fähigkeit von Saposin C, Vesikel zu fusionieren, wichtig für die Reorganisation der humanen lysosomalen Kompartimente ist. Die Saposin C-ähnlichen Charakteristika von SAPLIP 3 geben Grund zu der Annahme, dass es bereits in einem so basalen Organismus wie der Amöbe ein Protein mit Saposin-ähnlichen membranfusionierenden Aktivitäten gibt und dass dieses SAPLIP entsprechende Funktionen während endo- und exozytotischer Transportprozesse in der Amöbe übernehmen könnte. N2 - Saposin-like proteins (SAPLIPs) are membrane-interacting proteins that are characterized by the conserved position of three disulphide bonds, a typical alpha-helical fold and the ability to interact with lipids. Their cellular functions are extremely diverse. Until the beginning of the genome-sequencing project, the amoebapores were the only known and characterized SAPLIPs of Entamoeba histolytica, which is the causative agent of human amoebiasis. Due to their antimicrobial activity, these proteins are important effector molecules of this unicellular parasite, which feeds on phagocytozed bacteria. However, they also exert cytolytic activity against host cells and therefore, they are considered to be a major pathogenicity factor of the amoeba. The theoretical computer-based data base analysis after the completion of genome sequencing revealed 16 genes coding for SAPLIPs in addition to the three amoebapore genes. The sequences of the novel SAPLIPs are diverse apart from the cysteine motif and furthermore, the sizes of the proteins are highly different (77 – 1009 amino acid residues). They all contain a single, C-terminally located SAPLIP domain. Beside the SAPLIP domain, no other functional or structural domains were identified in the relevant databases that would have pointed to possible functions. All SAPLIP-genes are transcribed in axenically cultured trophozoites at the same time as shown by reverse transcription PCR. The comparative transcriptional analysis using microarrays revealed that after six hours of contact with human cells and their phagocytosis none of these genes, with the exception of the amoebapore A gene, was upregulated. In order to clone the different fragments in parallel, an expression screening in E. coli with the green fluorescent protein as reporter protein was established, which indicates the successful cloning and expression of a fragment by the fluorescence of the bacterial colony already at the level of transformation. The SAPLIP domain 12, which has been recombinantly expressed and purified to homogeneity, exerts amoebapore-like activities. Using liposomes, pore-forming activity was detected, which is strongly dependent on acidic pH. Furthermore, the SAPLIP domain 12 is antibacterial even with similar selectivity as amoebapore A in that cell lysis of gram-positive B. megaterium was detectable but not of gram-negative E. coli. Structurally, the SAPLIP domain 12 differs from the amoebapores by exposing patches of positive charges on the protein surface und by lacking a histidine residue at a corresponding position in its sequence, which has been shown to be essential for the mechanism of amoebapore A. Moreover, the SAPLIP domain 12 displays a lower specific activity. These features indicate that this SAPLIP domain may act by means of another mechanism. It may interact with the negatively charged phospholipid head groups of membranes by its positively charged protein surface and after reaching a certain threshold concentration, possibly resulting in a disturbance of the lipid order and finally in the disintegration of the membrane structure. SAPLIP 3 resembles the amoebapores in size and molecular architecture and could therefore be considered as a functional unit, but it differs from the amoebapores by a highly negative net charge. Besides, the recombinant protein is not antibacterial and the membrane interactions of this SAPLIP are completely different from those described for the amoebapores. SAPLIP 3 does not simply destroy the liposome structure as known from the pore-forming amoebapores but induces leaky fusion of multilamellar liposomes. This activity is dependent on the presence of negatively charged lipids and on acidic pH. The capability of vesicle fusion as well as the negative charge distribution of SAPLIP 3 resembles features of the human saposin C. Beside its function as a cofactor of exohydrolases, which are involved in the sphingolipid catabolism, saposin C is considered to be involved in the reorganization of human lysosomal compartments due to its fusogenic activity. The saposin C-like characteristics of SAPLIP 3 suggest that a protein with saposin-like membrane fusogenic activity already exists in such a basal organism like an amoeba and that this SAPLIP fulfils corresponding functions during endo- and exocytotic transport processes in the amoeba. KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapor-Proteine KW - Molekularbiologie KW - Saposin-ähnliche Proteine KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapores KW - Membraninteraktionen KW - Saposin-like proteins KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapores KW - membrane interactions Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15927 ER - TY - THES A1 - Bauer, Wolfgang T1 - Klonierung und Charakterisierung der humanen Puromycin-sensitiven Aminopeptidase T1 - Cloning and characterization of the human Puromycin-sensitive aminopeptidase N2 - Auf der Suche nach neuen Vitamin D-responsiven Genen wurde die Methodik des Differential Display verwendet. Die eingesetzten Oligonukleotid-Primer waren homolog zur 24-Hydroxylase, einem für den Vitamin D-Stoffwechsel wichtigen Enzym, das von Vitamin D selbst reguliert wird. Mit diesem Ansatz sollten neue Mitglieder aus der Familie der P450-Enzyme gefunden werden. Mehrere differentiell exprimierte DNA-Fragmente wurden in der Folge isoliert und aufgearbeitet, die Sequenzierung eines 550 bp großen Fragments ergab beim Datenbankabgleich keine signifikanten Homologien und ließ daher auf ein noch unbekanntes Gen schließen. Die Klonierung und weitere Charakterisierung dieses Gens wies letztlich in eine nicht erwartete Richtung. Mit der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase war ein Gen aus der Familie der Metallopeptidasen gefunden worden, eine Exopeptidase mit einem Zink-Ion im katalytischen Zentrum. Proteinchemisch schon vor einigen Jahren isoliert, war über die PSA (Puromycin-sensitive Aminopeptidase) bekannt, daß sie N-terminale Aminosäuren hydrolysiert mit einer Spezifität für basisch / neutrales und hydrophobes Substrat und überwiegend im Cytoplasma lokalisiert ist. Namengebend ist die starke Hemmbarkeit der Enzymaktivität durch Puromycin. Vorstehendes summiert die wichtigsten biochemischen Eigenschaften des Enzyms, aus molekularbiologischer Sicht war zum Zeitpunkt der Aufnahme der Arbeiten jedoch noch wenig über die PSA bekannt. Dies hat sich in letzter Zeit geändert, während der Sequenzierarbeiten im Rahmen dieser Arbeit konnte eine schweizer Arbeitsgruppe die Klonierung und Sequenz-Charakterisierung der murinen und später humanen cDNA des Gens veröffentlichen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeitsgruppe wie auch den im Zuge der vorliegenden Dissertation erarbeiteten Resultaten konnte das molekularbiologische Wissen um die PSA erheblich erweitert werden. So liegt mittlerweile die komplette Nukleotid- und Aminosäurensequenz des Gens vor, das Auffinden des Zink-Bindungsmotives HEXXH(X)18E erlaubte die Einordnung des Enzyms in die Familie M1 der Metallopeptidasen, weiterhin konnte das Gen auf dem Chromosom 17q21 lokalisiert werden. Weitere Daten zur Gewebe- und Zellinienexpression sind nun ebenfalls vorhanden, interessant hierbei neben der erwartet starken Expression im Gehirn das deutliche Vorhandensein in Hoden und Nebennierenrinde. Auch in Bezug auf die Regulation der PSA wurden neue Ergebnisse erzielt, wichtigstes Resultat im Rahmen dieser Arbeit ist hier, daß sich die früher festgestellte Vitamin D –Responsivität nicht bestätigen ließ. Für die Zukunft von außerordentlichem Interesse dürfte das kürzlich gelungene Erstellen PSA-defizienter Mäuse sein, das nun erste Beobachtungen von Auswirkungen der Gen-Deletion am lebenden Organismus erlaubt. Trotz alledem sind in Bezug auf die physiologische Rolle der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase weiterhin viele Fragen ungeklärt. Wie hoffentlich in dieser Dissertation herausgearbeitet, ergeben sich dabei interessante Perspektiven für die mögliche Funktion des Enzyms im Organismus. N2 - Searching for new vitamin D responsive genes we employed the differential display-technique. Oligonucleotide-primers used were homologous to the 24-hydroxylase, an enzyme important in vitamin D metabolism and itself regulated by vitamin D. With the above we were hoping to isolate new members of the p450 enzyme family. Several DNA fragments showed differential expression and were subsequently isolated and analysed. Comparing the sequence of one 550 bp fragment with published Genbank sequences resulted in no significant homologies indicating the possibility of an unknown gene. Cloning and characterization of this gene did lead in an unexpected direction. We had found the Puromycin-sensitive aminopeptidase, a member of the family of metallopeptidases and an exopeptidase with a zinc-ion in the catalytical centre. The protein chemistry of this enzyme had been known for several years. The PSA (Puromycin-sensitive aminopeptidase) was known to hydrolyse N-terminal amino acids with specificity for alkaline/neutral as well as hydrophobic substrate. Localized predominantly in the cytoplasm the activity of the enzyme is inhibited by Puromycin. The above summarizes the protein chemistry of the PSA, however, little was known in the beginning about the molecular biology of the gene. This has changed as of late, a Swiss team has recently published the cloning and sequencing of the murine and later the human gene. These published results and data gathered within the scope of this thesis helped to widen our knowledge of the molecular biology of the PSA. The DNA- as well as the amino acid sequence of the gene is now established, since the protein contains the zinc-binding motif HEXXH(X)18E it could be identified as a member of family M1 of metallopeptidases. Furthermore its chromosomal localization could be identified at 17q21. There are also more data about expression in tissues as well as cell lines with the most interesting being the strong expression in testes and adrenal cortex. Regarding the regulation of the gene more results were gathered, the previously found regulation by vitamin D could not be confirmed. The construction of PSA-deficient mice, which has been accomplished recently, promises insight into the consequences of gene-deletion in the living organism. However, in terms of the physiologic role of the Puromycin-sensitive Aminopeptidase, many interesting questions remain unanswered. KW - Molekularbiologie KW - Klonierung KW - Aminopeptidase KW - Puromycin KW - molecular biology KW - cloning KW - aminopeptidase KW - Puromycin Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11135 ER - TY - THES A1 - Lalic-Mülthaler, Mio T1 - Molekularbiologischer Nachweis und Immunologie des P60-Proteins, sowie In-vitro-Transkription PrfA-abhängiger bzw. -unabhängiger Gene von Listeria monocytogenes T1 - Molecular biologycal detection and immunology of the P60-protein and in vitro-transcription of PrfA-dependent and -independent genes of Listeria monocytogenes N2 - Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43). N2 - Listeria monocytogenes, a Gram positive, optionally intracellular bacterium is capable of causing heavy infections of the central nervous system in immunocompromised humans. Due to its ubiquitous occurrence, as well as its high resistance to preservation methods there is a great interest in its rapid identification and differentiation towards the apathogenen species of Listeria. Due to the preserved and variable domains P60 as an essential housekeeping gene represents a promising target in order to establish ge-nus- and species-specific detection systems. An immunogenic map of the P60 of L. innocua and L. monocytogenes was generated by EPITOP-SPOT-mapping. Furthermore CD4-T-cells specific for P60 were hereby characterized and for one of them the epitope was exactly determined. Transfer experiments with these T-cells and booster infections with L. monocytogenes and/or L. innocua showed that L. innocua alone is not capable of establishing an immune protection against L. monocytogenes, while in vitro and in vivo it was sufficient to maintain an existing immunity through stimulating memory T-cells by cross-reactive epitopes. In vitro-transcription from Phly, PplcA and PactA occurs strictly PrfA-dependent while that of Piap, PprfA1/2 and, unexpectedly, also from Pmpl is PrfA-independent. It requires – except with PprfA - high concentrations of ATP but not GTP. In order to ensure an efficient tran-scription, the first three initiating nucleotides have to be available in higher concentration. RNAP separated over a heparin column after preparation from L. monocytogenes either exposed to heat shock treatment at 48°C (RNAP48), shifted to MEM (RNAPMEM), or cultured directly in BHI (RNAPBHI) showed different activity profiles with the promoters mentioned above. Therefore actA and hly may require an alternative sigma factor (not Sigma-43) for their optimal transcription. KW - Listeria monocytogenes KW - Immunreaktion KW - Molekularbiologie KW - Listeria monocytogenes KW - innocua KW - P60 KW - PrfA KW - Listeria monocytogenes KW - innocua KW - P60 KW - PrfA Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8760 ER - TY - THES A1 - Huber, Saskia T1 - Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugehörigen Proteinfamilie T1 - Characterization of SAP47 in Drosophila melanogaster and its protein familiy N2 - In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugehörige Proteinfamilie charakterisiert. N2 - A synapse associated protein, SAP47, and its protein family is characterized. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Drosophila KW - Synapse KW - SAP47 KW - BSD KW - Drosophila KW - synapse KW - SAP47 KW - BSD Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777 ER - TY - THES A1 - Wagner, Nicole T1 - Charakterisierung der Kernmembranproteine Lamin-B-Rezeptor und Bocksbeutel von Drosophila melanogaster T1 - Characterization of nuclear membrane proteins Lamin B Receptor and Bocksbeutel of Drosophila melanogaster N2 - Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Domänen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF). N2 - Functional characterization of novel inner membrane proteins of Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Receptor (dLBR), a novel integral membrane protein of the inner nuclear membrane; Bocksbeutel alpha and Bocksbeutel beta, LEM-domain proteins and their putative interacting partner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF). KW - Taufliege KW - Kernhülle KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Kernhülle KW - innere Kernmembran KW - LEM Domäne KW - nuclear envelope KW - INM KW - LEM domain Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7245 ER - TY - THES A1 - Langer, Katharina T1 - K+-Homöostase und kaliumabhängige Xylogenese in Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx T1 - K+ homeostasis and potassium dependent xylogenesis in Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx. N2 - Mit molekularbiologischen und biophysikalischen Analysen sowie immunologischen Nachweisen wurden Grundlagen des kaliumabhängigen Holzwachstums erforscht. Aus Holz-Kambium-Bast-Gewebe wurden mit PTK2 (Populus tremula K+ channel 2), KPT1 (K+ channel Populus tremula 1) und PtKUP1 (Populus tremula K+ uptake transporter 1) drei Volllängen putativer Kaliumtransporter isoliert. PTK2 ließ sich anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT2/3-Unterfamilie und KPT1 dem KAT1-Subtyp der Shaker-Familie zuordnen, während sich PtKUP1 in die Familie der KT/KUP/HAK-Transporter einreihte. Ein direkter Zusammenhang zwischen Kaliumtransport und holzbildenden Zellen konnte durch Verringerung der Gefäßweiten und signifikante Schrumpfung der Streckungszone nach lokal begrenzter Applikation des Kaliumkanalblockers TEA+ sowie durch Kaliumlimitierende Bedingungen hergestellt werden. Die Transkripte von PTK2 und PTORK (Populus tremula outward rectifying K+ channel) wurden in den Leitgeweben des Stammes, dort besonders im Phloem und in Schließzellen lokalisiert. KPT1 wurde fast ausschließlich in den Schließzellen nachgewiesen. Die mRNA von PtKUP1 war ubiquitär in geringen Mengen vorhanden. Funktionell wurde PTK2 als schwach spannungsabhängiger, K+-selektiver, nicht-gleichrichtender Kaliumkanal charakterisiert. Wie AKT2/3-ähnliche Kaliumkanäle, wurde PTK2 durch Protonen und spannungsabhängig durch Calcium geblockt. KPT1 und PtKUP1 komplementierten einen Bakterienstamm in seiner Kalium-Aufnahmedefizienz und repräsentieren demnach Kalium-Aufnahmesysteme. In Protoplasten einer Pappel-Suspensionskultur konnte ein auswärtsgleichrichtender, kalium- und spannungsabhängiger, K+-Kanal nachgewiesen werden. Dieser Auswärtsgleichrichter zeigte langsame, sigmoidale Aktivierungskinetiken, ähnlich den Kaliumströmen PTORK-exprimierender Oocyten. Des Weiteren wurde in der Suspensionskultur ein einwärtsgleichrichtender, spannungsabhängiger K+-selektiver Kanal detektiert, der, wie PTK2 in Xenopus-Oocyten, spannungsabhängig durch Calcium geblockt wurde. Nach Zugabe extrazellulären Cäsiums kam der Einwärtsstrom vollständig zum Erliegen. Für alle drei Kaliumkanäle der Pappel sowie den Kalium-Carrier wurden die Promotorregionen isoliert. Sie enthielten Motive für licht- und temperaturabhängige Transkription, gewebespezifische Expression im Leitgewebe, in Schließzellen und in Wurzeln, sowie hormonabhängige Transkription. Die Genaktivitäten von PTORK und PTK2 wurden nach Transformation von A. thaliana mit geeigneten Promotor-GUS-Konstrukten im Phloem und Xylemparenchym von Blattstielen nachgewiesen. Erstmals für Pflanzen wurden mit PTORK und PTK2 Kaliumkanal-Proteine immunologisch durch Antikörper in Phloem- und Strahlzellen während des aktiven Holzwachstums lokalisiert. Während PTK2 gleichmäßig in den Strahlzellen verteilt war, wurde im gleichen Zelltyp für PTORK eine polare Anordnung zu den angrenzenden Gefäßen hin beobachtet. Um die verschiedenen Kaliumtransporter mit der kambialen Aktivität und dem Holzwachstum zu verknüpfen, wurden die Expressionsprofile mit jahreszeitlichen Änderungen der Kaliumgehalte im Stamm verglichen. Die Transkriptanalyse von PTORK, PTK2, KPT1 und PtKUP1 über den Zeitraum eines Jahres in Stamm- und Blattknospen zeigte eine transkriptionelle Korrelation von PTORK und PTK2 mit der saisonal begrenzten Holzbildung. Ihre hohen Transkriptmengen im Herbst lassen, zusammen mit ihrer Lokalisation im Leitgewebe und ihren funktionellen Eigenschaften, auf eine Beteiligung der beiden Kaliumkanäle an Speicherungsvorgängen in die lebenden Mark- und Baststrahlen im Herbst schließen. Im Frühjahr dagegen, wenn sich die Kaliumströme umkehren, um „sink“-Gewebe mit Kalium zu versorgen, wird das Kalium vermutlich hauptsächlich über PTK2, der dann maximal exprimiert wird, aus den Strahlen und Gefäßen zu den Meristemen in Stamm und Knospen transportiert. Die hauptsächlich in Schließzellen lokalisiert KPT1 wurde zur Knospenöffnung transient induziert. Damit könnte gesichert werden, dass ausreichend osmotisch aktives Kalium für Zellexpansion und Stomaöffnung in die Schließzellen gelangt. PtKUP1 war in allen Geweben während des gesamten Jahres niedrig exprimiert und sichert daher vermutlich eine Kaliumversorgung auch unter limitierenden Bedingungen. Zur Vermehrung und Schaffung neuen Pflanzenmaterials wurde eine sterile Agarkultur aus P. tremula x P. tremuloides sowie eine Pappel-Suspensionskultur aus oberirdischem, sich teilendem Sprossgewebe etabliert. Die Expressionsanalyse der Zellkultur deutete auf eine Ausstattung an Kaliumkanälen wie in Wurzelhaaren hin, mit hohen Transkriptzahlen für PTORK, geringer Expression von PTK2 und geringsten PtKUP1-Transkripten. N2 - The current work focussed on the elucidation of the molecular basis for K+-dependent wood formation. Using molecular techniques in combination with biophysical and immu-nological approaches the results can be summarised as follows: The cDNA’s of three putative potassium transporter, PTK2 (Populus tremula K+ channel 2), KPT1 (K+ channel Populus tremula 1) and PtKUP1 (Populus tremula K+ uptake trans-porter 1), were isolated from wood-cambium-phloem tissue. Based on the deduced amino acid sequences, PTK2 was assigned to the AKT2/3-subfamily and KPT1 to the KAT1-suptype of Shaker channels, while PtKUP1 was grouped into the family of the KT/KUP/HAK-transporters. The contribution of potassium channels for wood formation was shown by local application of the K+ channel blocker TEA+ as well as under limiting K+ conditions. Both treatments resulted in a decrease of vessel lumen area, a significant reduction of the zone of expanding xylem cells and a premature initiation of secondary cell wall synthesis. The transcripts of PTK2 and PTORK (Populus tremula outward rectifying K+ channel), were mainly localised in the phloem of the vascular tissue and in guard cells while KPT1 was restricted to guard cells. In contrast, the mRNA of PtKUP1 was ubiqui-tously present at low levels. PTK2 was functionally characterised as a weakly voltage-dependent, K+-selective channel mediating potassium currents into and out of the cell. Reminiscent to AKT2/3-like channels, PTK2 was sensitive to extra cellular protons and blocked by calcium in a voltage-dependent manner. KPT1 and PtKUP1 were able to com-plement a potassium uptake deficient strain of E. coli. Therefore KPT1 und PtKUP1 repre-sent potassium uptake transport proteins. Protoplasts from poplar suspension cultures dis-played an outward rectifying, potassium- and voltage-dependent, K+-selective channel. This outward rectifier exhibiting slow sigmoidal activation kinetics, reminiscent of PTORK when heterologously expressed in Xenopus oocytes. In addition, an inward rectify-ing, voltage-dependent, K+-selective channel was detected in suspension cultured cells, showing a voltage-dependent calcium block like PTK2 expressed in Xenopus oocytes. The currents carried by this channel were completely abolished after application of extra cellu-lar caesium. The promotor regions of all three poplar potassium channels and the potas-sium transporter were isolated. Sequence analysis revealed signal motifs for temperature- and light-dependent regulation as well as tissue-specific expression in vascular tissue, guard cells and roots and motifs for hormonal dependent transcription. Transformation of A. thaliana with promotor-GUS-constructs showed that PTORK and PTK2 gene activities were predominantly observed in the phloem and xylem parenchyma of petioles. For the first time in plants the K+ channel proteins PTORK and PTK2 were immunologically local-ised with antibodies in phloem and rays during the active wood forming period. In contrast to PTK2 which was equally distributed within ray cells PTORK was polar arranged to neighbouring vessels. In order to link the different potassium transporters to cambial activ-ity and wood formation expression profiles were compared to seasonal changes of potas-sium content of the stems. The annual expression analysis of PTORK, PTK2, KPT1 und PtKUP1 in stems and buds revealed a correlation of PTORK und PTK2 with seasonally limited wood formation. Their induction in autumn, as well as their localisation in vascular tissues and their functional properties, indicated an involvement of both potassium chan-nels in loading the still living pit and phloem rays in autumn. In contrast in spring, when K+ fluxes reverse from the rays and vessels to the meristematic tissues to ensure cambial activ-ity, this ion is probably transported via PTK2, which is maximal expressed at this time. KPT1, which is mainly localised in guard cells, was induced transiently when buds open and therefore probably ensures that sufficient, osmotic active potassium comes into guard cells for expansion and stomatal opening. Finally, PtKUP1 may represent a gene that is important for potassium nutrition under limiting conditions since transcript levels were low in all tissues throughout the year. A sterile agar culture of P. tremula x P. tremuloides was generated for propagation and a sterile poplar suspension culture was established from over ground dividing stem tissue. The K+-channel expression profile of the cell culture was similar to that described for root hairs showing high transcript levels of PTORK, little ex-pression of PTK2 and minimal amounts of PtKUP1 transcripts. KW - Pappel KW - Kalium KW - Holz KW - Wuchsleistung KW - Molekularbiologie KW - Populus KW - Kaliumtransporter KW - Holzbildung KW - Blattknospen KW - Populus KW - potassium carrier KW - wood formation KW - buds Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7068 ER - TY - THES A1 - Picard-Maureau, Marcus T1 - Molekulare Analyse der Penetration von Foamyviren und Konstruktion und Charakterisierung von Adenovirus-Foamyvirus Hybridvektoren T1 - Molecular analysis of foamy virus penetration and construction and charaterization of adenovirus-foamy virus hybrid vectors N2 - In dieser Arbeit wurde zum einen die Penetration von Foamyviren (FV) unter besonderer Berücksichtung des FV Hüllglykoproteins (Env) untersucht, zum anderen wurden Adenovirus-Foamyvirus (Ad-FV) Hybridvektoren zur Kombination der Vorteile beider Vektorsysteme konstruiert und analysiert. Das Ziel war die Herstellung von Ad-FV Vektoren mit hohen Titern, die stabil in das Genom des Wirts integrieren. Über die Penetration von FV ist bisher wenig bekannt. Umhüllte Viren können entweder durch direkte Fusion der viralen Hülle mit der Zellmembran oder durch rezep-torvermittelte Endocytose, oft mit einem pH-abhängigen Fusionsschritt der viralen Membran mit der Membran intrazellulärer Kompartimente, in Zielzellen gelangen. In dieser Studie wurde die Abhängigkeit der FV Env vermittelten Infektion verschie-dener FV Spezies von lysosomotropen Agenzien mit MuLV oder Prototyp FV (PFV) Pseudotypen analysiert. Ähnlich wie bei Vesikuläres Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) Pseudotypen wurde die FV Env vermittelte Infektion von fast allen Agen-zien, die den endosomalen pH anheben, inhibiert. Allerdings hatte Chloroquin keine inhibitorische Wirkung auf die FV Env vermittelte Infektion im Gegensatz zu der VSV-G katalysierten, was auf einen unter-schiedlichen Penetrationsmechanismus schließen lässt. Eine Analyse der pH-Abhängigkeit der FV Env Fusionsaktivität in einem Zell-Fusionsassay zeigte eine Induktion der Fusionsaktivität mit einer maximalen Stärke bei pH 5,5. Nur bei PFV Env wurde eine basale Fusionsaktivität bei neutralem pH detektiert. Die relativ schnelle Induktion der Fusionsaktivität in saurem Milieu weist auf eine Konformationsänderung des Hüllglykoproteins zur Transformation in einen fusionsaktiven Status hin. Aufgrund dieser Daten kann man von einem endocytotischen, pH-abhängigen Penetrationsmechanismus von FV ausgehen. Zur Kombination der Vorteile von Adenoviren und FV wurde ein Ad-FV Hybridvektorsystem konstruiert um eine effizientes Werkzeug zum stabilen Gentransfer zu schaffen. Das System besteht aus adenoviralen Hochkapazitäts- (HC-Ad) Vektoren auf Adenovirus 5 Basis, die eine selbst-inaktivierende PFV Vektor Kassette unter Kontrolle eines humanen Cytomegalovirus- (hCMV) Promotors oder des reversen Tet Transaktivator Systems (Tet) enthalten. In alle Vektoren ist eine Verstärktes Grün Fluoreszierendes Protein (EGFP) Expressionskassette als Markergen integriert. Es wurden sowohl FV Vektoren, die nach der Primärinfektion über einen intrazellulären Transduktionsmechanismus stabil integrieren, als auch solche, die über einen Se-kundärzyklus mit Hilfe extrazellulärer Partikel stabil transduzieren können, hergestellt. Die Ad-FV Vektoren konnten mit zu herkömmlichen HC-Ad Vektoren vergleich-baren Titern bis zu 1010 iU/ml produziert werden. In Ad-FV infizierten Zellen war die erwartete FV Proteinexpression und ihre Induzierbarkeit bei Ad-FVTet Vektoren nachweisbar. Mit diesen Vektorsystemen infizierte Zellen zeigten eine signifikant höhere persistierende Transgenexpression im Vergleich zu mit HC-Ad oder Kontroll- Ad-FV Vektoren ohne ein funktionales FV pol ORF infizierten Zellen. Eine Southern Blot Analyse von Ad-FVTet infizierten Einzelzellklonen mit persistierender EGFP Expression belegte eine stabile Integration der FV Vektor Kassette. In dieser Arbeit konnten Ad-FV Vektoren mit hohem Titer hergestellt werden, die eine, auch im Vergleich mit bisher publizierten Ad-Retrovirus Systemen, stark erhöhte Effizienz des persistenten Transgentransfers durch stabile Integration zeigten. N2 - In this study, both, the analysis of the penetration mechanism of Foamy Viruses (FV), focusing on the FV envelope glycoprotein (Env), and the construction and analysis of Adenovirus (Ad)-FV hybrid vectors for efficient prolonged transgene expression, was addressed. Little is known about the uptake of foamy viruses, a subfamily of retroviruses, into target cells. In general enveloped viruses use two different entry strategies, an endocytotic entry pathway, mostly involving a pH-dependent fusion process, and a pH-independent fusion process at the cell membrane. In this study, we examined the pH dependence of FV entry by analyzing FV Env mediated infectivity of target cells in the presence of weak bases, vacuolar ATPase inhibitors and carboxylic ionophores using Murine Leukemia Virus (MuLV) or FV vector pseudotypes. Similiar to Vesicular Stomatitis Virus glycoprotein G (VSV-G) mediated uptake, FV Env mediated entry was inhibited by most agents used. However, in contrast to VSV-G pseudotypes, chloroquine failed to reduce the infectivity of FV Env pseudotypes, implying that the pathway is different from that of VSV-G. Various glycoproteins from other FV species showed a similiar inhibition pattern as the prototype FV (PFV). Analysis of the pH-dependence of the FV mediated fusion process in a cell-to-cell fusion assay revealed an induction of syncitia formation by a short exposure to acidic pH, peaking around pH 5.5. The very short time period of exposure to low pH neccessary for the induction of fusion activity implies a conformational change of FV Env at low pH to transform to a fusogenic state. Interestingly, of all FV Env species analyzed only the PFV Env had a significant fusion activity a neutral pH. Taken together, these data suggest a pH-dependent endocytotic pathway of infection of target cells by FV. In this work, an adenoviral/foamyviral (Ad-FV) hybrid vector system was developed to exploit the favourable features of the two parental viral species for efficient and stable gene transfer. The system consists of high capacity (HC-Ad) Adenovirus 5 vectors containing self-inactivating PFV vector cassettes under control of a human cytomegalovirus- (hCMV) promotor or the reverse Tet transactivator system (Tet). The PFV Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) transfer vectors encoded by this vector cassettes could either transduce target cells by an intracellular retrotransposition step or by an additional secondary cycle with extracellular paticles. The Ad-FV vectors could be produced with titers up to 1010 iU/ml, comparable to conventional Ad vectors. We were able to demonstrate the predicted pattern of PFV protein expression in Ad-FV vector infected cells and the induction of PFV protein expression in Ad-FVTet infected cells. Long-term analysis of cells infected by the chimeric vec-tors showed a significantly higher amount of persistent transgene expressing cells when compared to cells infected by a control vector containing a non-functional FV pol ORF or by a conventional HC-Ad vector. Southern blot analysis of persistently transgene expressing cells indicated stable integration of the PFV vector genome in cells infected by Ad-FVTet vectors. In summary, our results demonstrate the production of high titer Ad-FV hybrid vectors mediating, even compared to other published Ad-Retrovirus systems, prolonged transgene expression by stable integration. KW - Spumaviren KW - Penetration KW - Molekularbiologie KW - Adenoviren KW - Vektor KW - Foamyvirus KW - Gentherapie KW - Hybridvektor KW - virale Penetration KW - foamy virus KW - gene therapy KW - hybrid vector KW - viral entry Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5445 ER - TY - THES A1 - Schneeberger, Daniela T1 - Molekulare und funktionelle Analyse der p21-aktivierten Kinase Mbt (mushroom bodies tiny) in der Augen- und Pilzkörperentwicklung von Drosophila melanogaster T1 - Molecular and functional analysis of the p21-aktivated kinase Mbt (mushroom bodies tiny) in eye- and mushroom body development of Drosophila melanogaster N2 - Diese Arbeit beschäftigt sich mit Mbt, einem hochkonservierten Signalmolekül aus der Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK) aus Drosophila, während der Augen- und Pilzkörperentwicklung. Mbt wird aufgrund von Sequenzhomologien der PAK Unterfamilie II (PAK4-6) zugeordnet. PAK4-6 binden präferentiell die aktivierten Rho-GTPasen Cdc42 und schwächer Rac, werden durch diese Bindung jedoch nicht aktiviert, sondern an bestimmte Zellkompartimente rekrutiert. In Struktur- Funktionsanalysen in vitro und in vivo konnte gezeigt werden, dass Mbt ebenfalls fast ausschließlich mit aktiviertem Cdc42 und kaum mit aktiviertem Rac interagiert. Diese Interaktion führt nicht zur Aktivierung von Mbt, sondern eher zu einer Verringerung der Kinaseaktivität. Eine weitere Funktion der Interaktion von Cdc42 und Mbt ist die Rekrutierung von Mbt an die Adhärenzverbindungen (AV) in sich entwickelnden Photorezeptorzellen. Außerdem kann katalytisch inaktives Mbt im Gegensatz zu Cdc42-bindungsdefizientem Mbt partiell die Mbt-Funktion in mbtP1-Fliegen übernehmen. Mbt hat also auch kinaseunabhängige Funktionen. Während der Pilzkörperentwicklung sind sind die Cdc42-Bindungsdomäne und die Kinasedomäne von Mbt ebenfalls essentiell, ob subzelluläre Lokalisation hier eine ähnlich wichtige Rolle spielt, wurde nicht untersucht. Als Mbt-Interaktionspartner wurden in einem Yeast-two-Hybrid Screen drei neuartige Proteine identifiziert. Zwei davon, CG8818 und CG14880, können als Substrat von Mbt fungieren. Allerdings kann nur für CG8818 eine direkte Bindung spezifisch mit aktiviertem Mbt nachgewiesen werden. Die Interaktion mit CG14880 scheint transient zu sein und nur für die Zeit der Phosphorylierungsreaktion anzudauern. Gegen CG8818 wurde ein Antiserum hergestellt, das nach seiner Charakterisierung in biochemischen und histologischen Ansätzen zum Einsatz kommen soll. In einem genetischen Screen wurden Mutationen in canoe als Verstärker und Mutationen in eip75b als Suppressor des mbtP3-Augenphänotyps gefunden. Eip75B ist ein putativer Steroidhormonrezeptor und wird während der Verpuppung exprimiert, also zu dem Zeitpunkt, wenn sich der mbt-Phänotyp ausbildet. Interessanterweise haben Mutationen in eip75b keinen Effekt auf den mbtP3-Pilzkörperphänotyp. Canoe ist wie Mbt an den AV von sich entwickelnden Photorezeptorzellen lokalisiert und spielt ebenfalls während deren Morphogenese eine Rolle. Canoe ist ein aktinbindendes Protein und könnte eine Verbindung von Mbt zum Cytoskelett darstellen, das der dynamischen Regulation bedarf, um morphogenetische Prozesse voranzutreiben. Eine direkte Interaktion kann nicht nachgewiesen werden. Auch während der Pilzkörperentwicklung scheinen Mbt und Canoe im gleichen Signalweg aktiv zu sein. Genetische Interaktion mit mbtP3 während der Augenentwicklung konnte außerdem für Mutationen in slingshot und twinstar gezeigt werden, die beide in die Regulation des Cytoskeletts involviert sind. Das Transmembranprotein Crumbs scheint ebenfalls zusammen mit Mbt in der Photorezeptorzellmorphogenese eine Rolle zu spielen. Außerdem weißen erste Experimente darauf hin, dass Mbt im ERK-MAP Kinase-Signalweg eine Rolle spielt. Durch die Entdeckung der direkten und indirekten Interaktionspartner bietet sich nun die Gelegenheit, die Funktion und Wirkungsweise von Mbt weiter zu entschlüsseln. Damit kann ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung der Rolle von PAK-Proteinen während morphogenetischer Prozesse und der Regulation der Zellzahl in der Entwicklung geleistet werden. N2 - In this work the function of Mbt, a higly conserved signaling molecule of the family of p21-activated kinases (PAK) from Drosophila, has been characterized during eyeand mushroom body development. Based on sequence homology, Mbt was classified as member of the PAK subfamily II (PAK4-6). PAK4-6 interact preferentially with activated Cdc42 and weakly with activated Rac. In contrast to PAK1-3 and DPAK this interaction does not lead to the activation of kinase activity but to the recruitment of PAK4-6 to specific cell compartments. A structure- function analysis in vitro and in vivo demonstrated that Mbt preferentially interacts with activated Cdc42 and weakly with Rac. This interaction does not lead to the activation but to the suppression of Mbt kinase activity. Furthermore, Cdc42 recruits Mbt to adherens junctions (AJ) in developing photoreceptor cells. In contrast to a Cdc42-binding deficient Mbt, a kinase dead Mbt protein can partially substitute for the loss of endogenous Mbt function in mbtP1-mutant flies. Thus, Mbt has kinase independent functions. The kinase domain and the Cdc42-binding domain are also essential for Mbt function during mushroom body development. The subcellular localization of Mbt during mushroom body development was not investigated. Three novel protein were identified as Mbt interacting proteins in a yeast-two-hybrid screen. Two of them, CG8818 and CG14880, are phosphorylation substrates of Mbt. However, only for CG8818 a direct interaction specifically with activated Mbt could be confirmed. The interaction with CG14880 seems to be very transient and to last just for the time of the phosphorylation reaction. For CG8818 an antiserum was generated which awaits its characterization and employment in biochemical and histological approaches. In a screen for modifiers of the mbtP3-eye phenotype mutations in canoe were found to enhance and mutations in eip75b were found to suppress the mbtP3-eye phenotype. eip75b encodes a putative steroid hormone receptor. It is expressed during puparium formation when the mbt-phenotype evolves. Interestingly, mutations in eip75b have no effect on the mbtP3-mushroom body phenotype. Canoe and Mbt colocalize at AJ in developing photoreceptor cells and Canoe, like Mbt, plays a role in photoreceptor cell morphogenesis. Canoe is an actin binding protein and could provide a link between Mbt and the cytoskeleton which needs to be regulated dynamically to drive morphogenetic processes. However, a direct interaction could not be shown. In mushroom body development Canoe and Mbt seem to function in the same developmental pathway. The mbtP3-eye phenotype was also modified by mutations in twinstar and slingshot. These proteins are regulators of actin dynamics and therefore another link to the cytoskeleton. The transmembrane protein Crumbs seems to function together with Mbt during photoreceptor cell morphogenesis as well. Last but not least, preliminary experiments suggest that Mbt is involved in the Erk-MAP Kinase pathway. These indirect and direct interaction partners await to be further characterized. Their identification offer a great opportunity to further gain insight into the processes regulated by Mbt KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Auge KW - Ontogenie KW - Molekularbiologie KW - p21-aktivierte Kinase KW - PAK KW - Augenentwicklung KW - Mbt KW - Pilzkörperentwicklung KW - p21-activated kinase KW - PAK KW - eye development KW - Mbt KW - mushroom body development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4410 ER - TY - THES A1 - Glasenapp, Elisabeth ¬von¬ T1 - Lamin C2 T1 - Lamin C2 N2 - In der Kernlamina von Spermatozyten von Nagetieren sind die Lamin A-Genprodukte, Lamin A und C, durch eine meiosespezifische Splicingvariante ersetzt. Dieses Lamin C2 unterscheidet sich auffallend von den somatischen Varianten in Struktur, Menge und Verhalten. Durch eine ektopische Expression von Lamin C2 als EGFP-Lamin C2-Fusionsprotein in einer somatischen Zellinie zeigte sich, daß eine neuartige Hexapeptidsequenz (GNAEGR) am N-terminalen Ende des Proteins anstelle der C-terminal gelegenen CaaX-Box somatischer Lamine für die Interaktion mit der Kernhülle verantwortlich ist. So ermöglicht eine posttranslationelle Myristylierung des ersten Glycins ein Membrantargeting, bei dem der hydrophobe Myristinsäurerest vergleichbar dem hydrophoben Farnesylrest am Cystein der Caax-Box mit den Fettsäureresten der Kernmembran interagiert. Die Deletion des Hexapeptids im Fusionsprotein EGFP-Lamin C2 und die seine N-terminale Insertion in das Fusionsprotein EGFP-Lamin C - es besitzt keine Caax-Box - bestätigt, daß allein das Hexapeptid das Membrantargeting steuert: Die Deletionsmutante EGFP-Lamin C2 bleibt diffus im Kern verteilt, während sich die Insertionsmutante EGFP-Lamin C im Bereich der Kernperipherie anreichert. Eine weitere Besonderheit stellt die Verteilung von Lamin C2 innerhalb der Kernhülle dar, denn es verteilt sich nicht gleichmäßig wie alle bisher bekannten Lamine, sondern bildet zahlreiche Aggregate. Nicht nur in der Kernhülle von Spermatozyten, sondern auch als Fusionsprotein in somatischen Zellen exprimiert, zeigt Lamin C2 diese Akkumulationen. Überraschenderweise treten die Synaptonemal-komplexenden nur im Bereich dieser Lamin C2-Aggregate mit der Kernhülle in Kontakt. Es wird daher postuliert, daß die Lamin C2-Aggregate der lokalen Verstärkung der Kernhülle dienen und wichtig für die auf die Prophase beschränkte Anheftung der SC an die Kernhülle sind. Da zudem in einer Kurzzeitkultur von Pachytänspermatozyten, in der die Prophase künstlich beschleunigt wird, gezeigt werden konnte, daß Lamin C2 mit Ende der Prophase I noch vor dem Auflösen der eigentlichen Kernhülle nicht mehr nachweisbar ist, scheint ein Zusammenhang zwischen Lamin C2 in der Kernhülle und der Umorganisation des genetischen Materials zu bestehen. N2 - In the spermatocytes of rodents the lamin A gene products, lamin A and C, are substituted by a meiosis specific splicing variant called lamin C2, which differs significantly in structure, amount and function from somatic lamins. Instead of having a CaaX-Box, which mediates interaction between the somatic lamins and the nuclear membrane, a novel kind of membrane targeting is found in lamin C2. It consists of a hexapeptide sequence (GNAEGR) which substitutes the N-terminus and parts of the a-helical rod domain. Transfection experiments with a EGFP-lamin C2- fusion protein in a somatic cell line showed that without this hexapeptide no membrane targeting of lamin C2 takes place, while an insertion of the hexapeptide enables lamin C to accumulate at the periphery of the nuclear envelope. The first N-terminal glycine of the hexapeptide is posttranslationally modified by a myristic acid residue whose hydrophobic chain interacts with the nuclear membrane similar to the farnesyl residue in somatic lamins. By looking for the localization in the nuclear envelope lamin C2 reveals another surprising behaviour compared to somatic lamins. While other lamins are distributed evenly in the nuclear envelope, lamin C2 is found in several aggregates. Furthermore, the accumulation is not restricted to the nuclear envelope of spermatocytes, but also found in somatic cells when lamin C2 as EGFP-lamin C2 fusion protein is ectopically expressed. Contrary to somatic cells where no effect of ectopically expressed EGFP-lamin C2 on the organization of chromatin can been seen, in spermatocytes the position of SC-ends colocalize with lamin C2 rich areas of the nuclear envelope without exeption. The N-terminal part of somatic lamins that is missing in lamin C2 contains domains which are involved in dimerization and polymerization of A-type and B-type lamins. Therefore a new way of interaction in the nuclear envelope of spermatocytes has to be proposed for lamin C2. Additionally, lamin C2 can only be found in spermatocytes during prophase I. A short-time culture which accelerates the development of pachytene spermatocytes by the phosphatase inhibitor Okadaic acid supports the finding that lamin C2 vanishes before the break down of the nuclear envelope in metaphase I begins. KW - Ratte KW - Spermatozyt KW - Lamine KW - Meiose KW - Kernhülle KW - Molekularbiologie KW - Lamin C2 KW - Pachytänspermatozyten KW - Kernhülle KW - Kernlamina KW - Meiose KW - Synaptonemalkomplex KW - Okadasäure KW - Myristylierung KW - Membran-Adressierungs-Signal KW - Lamin C2 KW - pachytene spermatocytes KW - nuclear envelope KW - nuclear lamina KW - meiosis KW - synaptonemal complex KW - okadaic acid KW - myristoylation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3690 ER - TY - THES A1 - Biela, Alexander T1 - Molekulare und funktionelle Charakterisierung von pflanzlichen Aquaporinen T1 - Molecular and functional characterization of plant aquaporins N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Aquaporine aus Nicotiana tabacum und Samanea saman mit molekularbiologischen Methoden analysiert und durch heterologe Expression in Oozyten von Xenopus laevis funktionell charakterisiert. Das aus Tabak isolierte Aquaporin NtAQP1 wird am höchsten in Wurzeln exprimiert, ist trotz vorhandener Cysteine nicht quecksilbersensitiv und permeabel für Glycerin und Harnstoff. Sowohl eine Ionenleitfähigkeit, als auch eine Regulation auf Proteinebene konnten im Oozytensystem nicht nachgewiesen werden. Die Leguminose Samanea saman bewegt im Tag-/Nachtrhythmus ihre Fiederblätter und -stengel. Dieses wird durch Variieren des Turgors im Flexorgewebe von Pulvini realisiert. Während SsAQP1 in seinen Charakteristika mit NtAQP1 übereinstimmt, ist SsAQP2 quecksilbersensitiv und hoch selektiv für Wasser. Der für SsAQP2 ermittelte Permeabilitätskoeffizient war um den Faktor 10 höher als der von SsAQP1. Northern Experimente zeigten, dass SsAQP2 ausschließlich im Flexorgewebe exprimiert wird. Die Expression ist zum Zeitpunkt der Streckungsbewegung des Pulvinus um 7 Uhr am stärksten. Dagegen wurde SsAQP1 zu allen untersuchten Zeitpunkten nur schwach in Pulvini exprimiert. N2 - Plant aquaporins from Nicotiana tabacum and Samanea saman were analysed with molecular techniques and functionally characterised by heterologous expression in Xenopus laevis oocytes. The tobacco aquaporin NtAQP1 is highly expressed in roots and flowers. Though it possesses several cysteines residues it is not sensitive to mercurials. Additionally NtAQP1 is permeable for glycerol and urea, but not for ions. A regulation on the protein level could not be detected. The leguminose Samanea saman moves its leaflets by bending or stretching of motor organs called pulvini. This turgor related movement is restricted to the flexor and accompanied by a high flow of water. While the characteristics of SsAQP1 resemble those of NtAQP1, SsAQP2 is sensitive to mercurials and highly selective for water. The calculated permeability coefficient of SsAQP2 was ten times higher than that for SsAQP1. Northern experiments revealed a high expression of SsAQP2 exclusively in the flexor tissue, when the pulvinus is stretching in the morning. In contrast, SsAQP1 is poorly expressed in pulvini. KW - Tabak KW - Regenbaum KW - Porin KW - Wassertransport KW - Molekularbiologie KW - Aquaporin KW - NtAQP1 KW - SsAQP1 KW - SsAQP2 KW - Glycerin KW - Quecksilber KW - Oozyten KW - Pulvini KW - aquaporin KW - NtAQP1 KW - SsAQP1 KW - SsAQP2 KW - glycerol KW - mercury KW - oocytes KW - pulvini Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3207 ER -