TY - THES A1 - Agerer, Franziska T1 - Integrin-vermittelte Invasion von Staphylococcus aureus in Säugerzellen T1 - Integrin mediated internalisation of Staphylococcus aureus in human cells N2 - Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern. N2 - The gram-positive bacterium S. aureus is part of the normal skin and mucosal flora of humans, but it can also give rise to a wide spectrum of infectious diseases. Virulence-associated features of this pathogen include surface structures that interact with extracellular matrix (ECM) proteins of eukaryotic organisms. These adhesins have been collectively termed MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Fibronectin (Fn) binding to bacterial FnBPs functions as a molecular bridge linking the pathogen to the principal cellular Fn receptor, the integrin 51. In addition to allowing adherence of the bacteria to the host cell surface, the clustering of integrins also leads to the internalization of the microorganisms. How the integrin engagement by the fibronectin-coated bacteria is transduced into the cell and how this signal initiates bacterial engulfment is poorly characterized. Therefore, the major aim of this work was to identify host components that regulate integrin-dependent internalization of pathogenic S. aureus. As a first step, a novel and elegant microscopic method for the evaluation of bacterial invasiveness into eukaryotic cells was developed. The protocol is based on differential fluorescent staining of extracellular and intracellular bacteria and allows quantification of bacterial invasiveness using a fluorescence microscope. The most important advance of this method is the fact, that the bacteria are covalently labeled and therefore, robust and invariant staining of the total bacterial population is achieved. In addition, the protocol does not rely on bacteria-specific antibodies making this the method of choice in case specific antisera against the pathogen are not available. Functional analysis of signaling pathways involved in the uptake process revealed an important role for protein tyrosine kinases (PTKs) during integrin-mediated internalisation of S. aureus. The important function of Src PTKs was further corroborated by the dramatic decrease of S. aureus uptake by Src/Yes/Fyn-deficient cells compared to Src-expressing cells. Biochemically, a significant activation of Src PTKs was observed in human epithelial cells in response to infection with S. aureus, whereas there was no activation after an infection with the non-pathogenic S. carnosus. Integrin-initiated focal contacts (FC) are enriched in specific marker proteins such as vinculin, paxillin, tensin, actinin, or zyxin as well as signaling enzymes including the focal adhesion kinase (FAK) or Src PTKs. In contrast to S. carnosus, contact of S. aureus with the eukaryotic host cell membrane resulted in strong recruitment of FC marker proteins to the site of adherent bacteria. To investigate the role of FAK for the internalization of S. aureus, dominantnegative FAK-mutants and FAK-deficient mouse cells were infected with the pathogen. In all cases, a major reduction in the number of internalized S. aureus was observed. Taken together these results demonstrated an essential role of FAK for the integrin-mediated uptake of S. aureus and suggested that an active FAK/Src complex regulates bacterial internalization via integrins. In a further approach, effectors of the FAK/Src complex and potential regulators of actin cytoskeleton dynamics during internalization of S. aureus were investigated. Biochemical analysis of infected cells revealed the actin-binding protein cortactin as a major tyrosine phosphorylated protein in response to pathogenic staphylococci. Furthermore, cortactin was recruited to the vicinity of cell-bound S. aureus, but not to S. carnosus. Various dominant-negative cortactin mutants that were either compromised in their association with the Arp2/3 complex or dynamin-2, or that lacked critical tyrosine phosphorylation sites in the C-terminal domain interfered with the uptake of S. aureus. As both FAK and cortactin are substrates of active Src kinases and both are responsive to integrin stimulation, it was hypothesized that there is a functional link between FAK, Src, and cortactin. Though the recruitment of cortacin to the vicinity of cell-bound S. aureus was not influenced by the presence of FAK, the phosphorylation status of cortactin after infection with S. aureus or after integrin stimulation by a fibronectin matrix was dependent on both FAK and Src. Together, these results reveal a novel FAK/Src-cortactin signalling axis regulating integrin internalisation. The detailed examination of the FnBP-triggered, integrin-mediated bacterial uptake offers new insight into the pathogenicity strategies of S. aureus and might open up novel avenues for therapeutic intervention. In addition, this work furthers our understanding of the molecular processes regulating the internalisation of integrins. KW - Staphylococcus aureus KW - Integrine KW - Infektion KW - Signaltransduktion KW - Invasion KW - S.aureus KW - Integrine KW - Signaltransduktion KW - invasion KW - S.aureus KW - integrin KW - signal transduction Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14557 ER - TY - THES A1 - Baig, Ayesha Anjum T1 - Studies on platelet interactions with the coagulation system and on modulators of platelet (hem)ITAM signaling in genetically modified mice T1 - Studien zur Thrombozyteninteraktion mit der Gerinnungskaskade und Modulation des (hem)ITAM Signalwegs in genetisch veränderaten Mäusen N2 - Activated platelets and coagulation jointly contribute to physiological hemostasis. However, pathological conditions can also trigger unwanted platelet activation and initiation of coagulation resulting in thrombosis and precipitation of ischemic damage of vital organs such as the heart or brain. The specific contribution of procoagulant platelets, positioned at the interface of the processes of platelet activation and coagulation, in ischemic stroke had remained uninvestigated. The first section of the thesis addresses this aspect through experiments conducted in novel megakaryocyte- and platelet-specific TMEM16F conditional KO mice (cKO). cKO platelets phenocopied defects in platelets from Scott Syndrome patients and had severely impaired procoagulant characteristics. This led to decelerated platelet-driven thrombin generation and delayed fibrin formation. cKO mice displayed prolonged bleeding times and impaired arterial thrombosis. However, infarct volumes in cKO mice were comparable to wildtype (WT) mice in an experimental model of ischemic stroke. Therefore, while TMEM16F-regulated platelet procoagulant activity is critical for hemostasis and thrombosis, it is dispensable for cerebral thrombo-inflammation in mice. The second section describes the generation and initial characterization of a novel knockin mouse strain that expresses human coagulation factor XII (FXII) instead of endogenous murine FXII. These knockin mice had normal occlusion times in an experimental model of arterial thrombosis demonstrating that human FXII is functional in mice. Therefore, these mice constitute a valuable tool for testing novel pharmacological agents against human FXII – an attractive potential target for antithrombotic therapy. Glycoprotein (GP)VI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2)-mediated (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) signaling represent a major pathway for platelet activation. The last section of the thesis provides experimental evidence for redundant functions between the two members of the Grb2 family of adapter proteins - Grb2 and Gads that lie downstream of GPVI and CLEC-2 stimulation. In vitro and in vivo studies in mice deficient in both Grb2 and Gads (DKO) revealed that DKO platelets had defects in (hem)ITAM-stimulation-specific activation, aggregation and signal transduction that were more severe than the defects observed in single Grb2 KO or Gads KO mice. Furthermore, the specific role of these adapters downstream of (hem)ITAM signaling was essential for maintenance of hemostasis but dispensable for the known CLEC-2 dependent regulation of blood-lymphatic vessel separation. N2 - Aktivierte Thrombozyten und die Gerinnungskaskade bilden gemeinsam die Grundlage der physiologischen Hämostase. Daneben können jedoch auch pathologische Bedingungen Thrombozytenaktivierung herbeiführen und die Gerinnungskaskade auslösen und somit zum Gefäßverschluss führen, was häufig ischämische Schäden lebenswichtiger Organe wie beispielsweise des Herzens oder des Gehirns verursachen kann. Prokoagulante Thrombozy-ten befinden sich an der Schnittstelle zwischen Thrombozytenaktivierung und der Gerin-nungskaskade, ihre Funktion bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls wurde jedoch bisher nicht im Detail untersucht. Der erste Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Fragestellung durch die Analyse von neu generierten konditionalen, Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Tmem16f Knockout Mäusen. TMEM16F-defiziente Thrombozy-ten wiesen ähnliche Defekte wie die Thrombozyten von Scott-Syndrom-Patienten sowie stark beeinträchtigte prokoagulante Eigenschaften auf. Diese Defekte gingen mit signifikant verlangsamter thrombozytenabhängiger Thrombingenerierung und verzögerter Fibrinbildung einher. TMEM16F-Defizienz führte zu verlängerter Blutungszeit und beeinträchtigte in einem experimentellen Modell die Bildung arterieller Thromben. TMEM16F-defiziente Mäuse wiesen jedoch im Vergleich zu wildtypischen Mäusen keinerlei Unterschiede im experimentellen ischämischen Schlaganfall auf. TMEM16F-gesteuerte prokoagulante Thrombozytenfunktion ist demnach kritisch für Hämostase und Thrombose, während sie eine untergeordnete Rolle in zerebraler Thrombo-Inflammation spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Generierung und Erstbeschreibung einer neuen Mauslinie, welche den humanen Hageman-Faktor (FXII) anstelle des endogenen murinen FXII exprimiert. In den resultierenden Knock-in Mäusen war die Bildung okklusiver arterieller Thromben nach chemisch induzierter Gefäßverletzung nicht beeinträchtigt, was zeigt, dass der humane FXII im Maussystem voll funktionstüchtig ist. Somit können diese Mäuse in der Zukunft als ein wertvolles Werkzeug zum Testen neuer pharmakologischer Ansätze zur Herabsetzung der FXII-Aktivität eingesetzt werden, welche einen vielver-sprechenden Targets neuartiger antithrombotischer Behandlungsansätze darstellt. Die thrombozytären Rezeptoren Glykoprotein (GP)VI und C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) lösen (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelte Signalwege aus, welche eine eine Schlüsselrolle in der Thrombozytenaktivierung spielen. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit liefert experimentelle Hinweise für überlappende Funkti-onen der Adapterproteine Grb2 und Gads in der (hem)ITAM-anhängigen Signalkaskade. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass Grb2/Gads-doppeldefiziente Thrombozyten (hem)ITAM-spezifische Defekte in der Aktivierung, Aggregation und Signaltransduktion aufweisen, die im Vergleich zu einzeldefizienten Thrombozyten deutlich ausgeprägter sind und somit eine redundante Rolle der Adapterproteine offenbaren. Während Grb2 und Gads gemeinsam an der Aufrechterhaltung physiologischer Hämostase beteiligt sind, tragen sie nicht entscheidend zur bekannten CLEC-2-abhängigen Regulation der Trennung von Blut- und Lymphgefäßen bei. KW - Blutgerinnung KW - Thrombozyt KW - Signaltransduktion KW - Maus KW - Thrombosis KW - Thrombo-inflammation KW - TMEM16F KW - (hem)ITAM signaling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164888 ER - TY - THES A1 - Baljuls, Angela T1 - Differences and Similarities in the Regulation of RAF Isoforms: Identification of Novel A-RAF Phosphorylation Sites T1 - Unterschiede und Ähnlichkeiten in der Regulierung der RAF Isoformen : Identifizierung der neuen A-RAF Phosphorylierungsstellen N2 - In mammals, the RAF family of serine/threonine kinases consists of three members, A-, B- and C-RAF. Activation of RAF kinases involves a complex series of phosphorylations. Although the most prominent phosphorylation sites of B- and C-RAF are well characterized, little is known about regulatory phosphorylation of A-RAF. Using mass spectrometry, we identified here a number of novel in vivo phosphorylation sites in A-RAF. The physiological role and the function of these sites were investigated subsequently by amino acid exchange at the relevant positions. In particular, we found that S432 participates in MEK binding and is indispensable for A-RAF signaling. On the other hand, phosphorylation within the activation segment does not contribute to epidermal growth factor-mediated activation. Regarding regulation of A-RAF activity by 14-3-3 proteins, we show that A-RAF activity is regulated differentially by its C-terminal and internal 14-3-3 binding domain. Furthermore, by use of SPR technique, we found that 14-3-3 proteins associate with RAF in an isoform-specific manner. Of importance, we identified a novel regulatory domain in A-RAF (referred to as IH-segment) positioned between amino acids 248 and 267, which contains seven putative phosphorylation sites. Three of these sites, serines 257, 262 and 264, regulate A-RAF activation in a stimulatory manner. The spatial model of the A-RAF fragment including residues between S246 and E277 revealed a “switch of charge” at the molecular surface of the IH-region upon phosphorylation, suggesting a mechanism in which the high accumulation of negative charges may lead to an electrostatic destabilization of protein/membrane interaction resulting in depletion of A-RAF from the plasma membrane. Activation of B- and C-RAF is regulated by phosphorylation at conserved residues within the negative-charge regulatory region (N-region). Identification of phosphopeptides covering the sequence of the N-region led to the conclusion that, similar to B- and C-RAF, kinase activity of A-RAF is regulated by phosphorylation of the N-region. Abrogation of A-RAF activity by S299A substitution and elevated activity of the A-RAF-Y301D-Y302D mutant confirmed this conclusion. In addition, we studied the role of the non-conserved residues within the N-region in the activation process of RAF kinases. The non-conserved amino acids in positions –3 and +1 relative to the highly conserved S299 in A-RAF and S338 in C-RAF have so far not been considered as regulatory residues. Here, we demonstrate that Y296R substitution in A-RAF led to a constitutively active kinase. In contrast, G300S substitution (mimicking B- and C-RAF) acts in an inhibitory manner. These data were confirmed by analogous mutations in C-RAF. Based on the three-dimensional structure of the catalytic domain of B-RAF, a tight interaction between the N-region residue S339 and the catalytic domain residue R398 was identified in C-RAF and proposed to inhibit the kinase activity of RAF proteins. Furthermore, Y296 in A-RAF favors a spatial orientation of the N-region segment, which enables a tighter contact to the catalytic domain, whereas a glutamine residue at this position in C-RAF abrogates this interaction. Considering this observation, we suggest that Y296, which is unique for A-RAF, is a major determinant of the low activating potency of this RAF isoform. Finally, the residues R359 in A-RAF and R398 in C-RAF, which interact with the N-region, are also involved in binding of phosphatidic acid. Substitution of this conserved arginine by alanine resulted in accumulation of hyper-phosphorylated form of RAF, suggesting that this residue play a crucial role in phosphorylation-mediated feedback regulation of A- and C-RAF. Collectively, we provide here for the first time a detailed analysis of in vivo A-RAF phosphorylation status and demonstrate that regulation of A-RAF by phosphorylation exhibits unique features compared with B- and C-RAF. N2 - Die Protein-Familie der Serin/Threonin-spezifischen RAF-Kinasen umfasst in Säugetieren drei Mitglieder, A-, B- und C-RAF. Bei der Aktivierung dieser Kinasen spielen Phosphorylierungs-ereignisse eine entscheidende Rolle. Im Gegensatz zu B- und C-RAF, deren Phosphorylierungsstellen ausgiebig charakterisiert sind, blieb die Phosphorylierung von A-RAF weitgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden unter Verwendung der massenspektrometrischen Analyse zahlreiche neue in vivo A-RAF-Phosphorylierungsstellen identifiziert. Die physiologische Relevanz und die Funktion dieser Stellen wurden anschließend durch Aminosäurenaustausch an den relevanten Positionen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass S432 in der A-RAF-Bindung zu MEK involviert und für die Signalweiterleitung unverzichtbar ist. Hingegen ist die EGF-bedingte A-RAF-Aktivierung nicht von der Phosphorylierung innerhalb des Aktivierungssegments abhängig. Hinsichtlich der Regulation von A-RAF-Aktivierung durch 14-3-3-Proteine, wurde hier gezeigt, dass die katalytische Aktivität von A-RAF durch die C-terminale und die interne 14-3-3-Bindungsdomänen unterschiedlich reguliert wird. Weiterhin wurde mittels SPR-Verfahren festgestellt, dass die Interaktion von 14-3-3-Proteinen mit RAF-Kinasen einen isoformspezifischen Charakter trägt. Von entscheidender Bedeutung war die Entdeckung einer neuen regulatorischen Domäne (hier als IH-Segment bezeichnet), die in der A-RAF-Sequenz die Aminosäuren 248 bis 267 umfasst und sieben A-RAF-spezifische Phosphorylierungsstellen enthält. Drei dieser Stellen, S257, S262 und S264, erwiesen sich als positive Regulatoren der A-RAF-Aktivierung. Das räumliche Modell dieses A-RAF-Fragments deckte eine „Ladungsumkehr“ an der molekularen Oberfläche der IH-Region infolge der Phosphorylierung auf. Dieser Befund begründete den Vorschlag eines Regulations-mechanismus, in dem die starke Akkumulierung der negativen Ladungen zu einer elektrostatischen Destabilisierung der Protein-Membran-Interaktion führt, was die Verdrängung der A-RAF-Kinase von der Plasma-Membran zur Folge haben könnte. Die Aktivierung von B- und C-RAF wird durch Phosphorylierung der sogenannten „negativ geladenen“ Region (N-Region) reguliert. Die Identifizierung mehrerer Phosphopeptide aus der N-Region von A-RAF veranlasste die Schlussfolgerung, dass die A-RAF-Aktivität ebenfalls durch die Phosphorylierung innerhalb dieser Region gesteuert werden könnte. In der Tat, die Aufhebung der A-RAF-Aktivität durch die S299A-Substitution und die erhöhte Aktivität der A-RAF-Y301D-Y302D-Mutante bestätigen diese Aussage. Darüberhinaus wurde die Rolle der nichtkonservierten Aminosäuren an den Positionen –3 und +1 relativ zum S299 in A-RAF und S338 in C-RAF im Aktivierungsprozess der RAF-Kinasen untersucht, nachdem diese ursprünglich nicht als regulatorische Stellen erkannt wurden. Es wird hier demonstriert, dass Y296R-Substitution der A-RAF-Kinase eine konstitutive Aktivität verleiht. Hingegen wirkte die G300S-Substitution, die von B- und C-RAF abgeleitet wurde, inhibitorisch. Diese Befunde wurden durch die analogen Mutationen in C-RAF bestätigt. Basierend auf der dreidimensionalen Struktur der katalytischen Domäne von B-RAF wurde eine Interaktion zwischen der N-Region und der katalytischen Domäne in A- und C-RAF festgestellt, die zu einer Inhibierung der Aktivität führen soll. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass die räumliche Ausrichtung von Y296 in der N-Region von A-RAF einen engen Kontakt mit der katalytischen Domäne ermöglicht; dagegen hebt Glutamin in dieser Position die Interaktion auf. In Anbetracht dieser Befunde wurde vorschlagen, dass das A-RAF-spezifische Y296 das niedrige Aktivierungs-potential dieser RAF-Isoform determiniert. In diesem Zusammenhang wurde auch gefunden, dass die Aminosäuren R359 in A-RAF und R398 in C-RAF eine duale Funktion besitzen, indem sie sowohl mit der N-Region als auch mit Lipiden in Wechselwirkung treten können. Substitution dieser konservierten Arginine durch Alanin führte zur Akkumulierung der hyperphosphorylierten Formen der RAF-Kinasen, was die Schlussfolgerung erlaubt, dass diese Reste eine wichtige Rolle in der ERK-vermittelten Feedback-Regulation von A- und C-RAF spielen. Insgesamt wird hier zum ersten Mal eine detaillierte Analyse der in vivo A-RAF-Phosphorylierung geliefert und gezeigt, dass die phosphorylierungsvermittelte Regulation von A-RAF einzigartige Merkmale innerhalb der Familie von RAF-Kinasen aufweist. KW - Raf KW - Phosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - RAF kinases KW - phosphorylation KW - signal trunsduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36135 ER - TY - THES A1 - Bausenwein, Burkhard T1 - Funktionelle Charakterisierung von Daughter of Sevenless T1 - Functional characterisation of Daughter of Sevenless N2 - Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse. N2 - One mechanism used by receptor tyrosine kinases to relay a signal to different downstream effector molecules is to use adaptor proteins that provide docking sites for a variety of proteins. The daughter of sevenless (dos) gene was isolated in a genetic screen for components acting downstream of the Sevenless (Sev) receptor tyrosine kinase. Dos contains a N-terminally located PH domain and several tyrosine residues within consensus binding sites for a number of SH2 domain containing proteins. The structural features of Dos and experiments demonstrating tyrosine phosphorylation of Dos upon Sev activation suggested that Dos belongs to the family of multisite adaptor proteins that include the Insulin Receptor Substrate (IRS) proteins, Gab1, and Gab2. In this work, a monoclonal mouse anti-Dos antibody was generated. The epitope of this antibody lies within the C-terminal 416 amino acids of the Dos Protein. Western Blot analyses of the Dos protein revealed a molecular mass of 115 kD. The staining of eye imaginal discs from wildtype third instar larvae with the monoclonal antibody showed that the Dos protein is expressed in cells in and posterior to the morphogenetic furrow. In this cells Dos localizes to the apical region. For the molecular characterisation of the homozygous lethal dosR31 allele, genomic sequence analysis were performed and the sequences compared to the dos cDNA sequence. The established amino acid sequence of the DosR31 protein showed six amino acid substitutions that potentially influence the tertiary structure of the protein. In addition, a stop codon in position 463 of the amino acid sequence was found. These results confirm that dosR31 is a loss-of-function allele which does not provide normal Dos function. To study the functional requirements of the potential SH2 domain binding sites for the Dos function in receptor tyrosine kinase mediated signaling processes, mutated dos transgenes were expressed in flies. The putative binding sites for the SH2 domains of the SH2/SH3 adaptor protein Shc, PhospholipaseC-g (PLCg), the regulatory subunit of Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3kinase) and the Corkscrew (Csw) tyrosine phosphatase were mutated by changing the invariant tyrosine within the consensus sites into phenylalanine. Ectopic expression of the mutated constructs lacking the binding sites for the Shc, PLCg, and PI3kinase SH2 domains can substitute the loss of endogenous Dos function during development. In contrast, tyrosine 801, corresponding to a Corkscrew (Csw) SH2 domain binding site, is essential for Dos function. Ectopic expression of transgenes upon heat shock induction may lead to phenotypic effects not caused by the transgene. To circumvent this problem, the endogenous dos enhancer/promotor element was cloned to study the function of the mutated transgenes expressed in a wildtype pattern. The cloned genE-dos minigene was able to fully substitute the loss of endogenous Dos function in dosR31 and dosP115 animals and shows wildtype like expression in eye imaginal discs. To study the role of the mutated SH2 domain binding sites for Dos function in eye development, a new in vivo test system based on the Flp/FRT flipase recombinase system was established. This clonal assay system allows the expression of the mutated transgenes under the control of the dos enhancer/promotor in clones of cells lacking endogenous Dos function. Expression of mutated transgenes in clones of cells lacking endogenous Dos function provided evidence that tyrosine residue Y801 that has been shown to bind a Csw SH2 domain is critical for Dos function. The tyrosine residues within the potential SH2 domain binding sites for Shc, PLCg and PI3kinase do not play an essential role for the Dos function during eye development. The established clonal test system is of general use for assaying the in vivo function of putative protein-protein interaction regions within the Dos protein for eye development irrespective of their requirement in other developmental processes. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Daughter of Sevenless KW - Multi-Adaptor-Protein KW - PH-Domäne KW - SH2-Domänen Bindungsstelle KW - Rezeptor-Tyrosin-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Daughter of Sevenless KW - multi-adaptor-protein KW - PH-domain KW - SH2-domain binding site KW - receptor tyrosin kinase KW - signal transduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-814 ER - TY - THES A1 - Benesic, Andreas T1 - Wirkung nanomolarer Konzentrationen des Mykotoxins Ochratoxin A auf Calciumhomöostase, Wachstumsverhalten und hormonelle Signaltransduktion menschlicher proximaler Tubuluszellen T1 - Effect of nanomolar Concentrations of the Mycotoxin Ochratoxin A on Calciumhoneostasis, Proliferation and hormonal Signaltransduction in human proximal tubular cells N2 - Hintergrund: Der weitverbreitete und karzinogene Pilzmetabolit Ochratoxin A (OTA) beeinflußt die Funktion und das Wachstumsverhalten renaler Zellen. In höheren Konzentrationen reduziert OTA auch die Integrität der Zellen. Untersucht wurde die mögliche Beteiligung von Änderungen der zellulären Calciumhomöostase an den Wirkungen von OTA in nanomolaren Konzentrationen. Methoden: Immortalisierte menschliche Nierenepithelzellen (IHKE) wurden verwendet, um die Effekte von OTA auf die zytosolische Calciumhomöostase ([Ca2+]i), Zellwachstum und und -integrität zu untersuchen. 1 nmol/l OTA potenzierte Ca2+-abhängig die EGF- und Ang II-induzierte Zellproliferation. Ca2+-unahängige Zelluntergänge und Reduktion der Zellzahl konnte nur nach 24-stündiger Inkubation mit einer Schwellenkonzentration von >10 nmol/l beobachtet werden. Innerhalb von Sekunden wurden durch OTA reversible und konzentrationsabhänige [Ca2+]i-Oszillationen mit einer Schwellenkonzentration von 0.1 nmol/l hervorgerufen. Die Oszillationen wurden durch Reduktion des extrazellulären Ca2+, den Ca2+-Kanalblocker SK&F 96365 und durch Hemmung der der Phospholipase C verhindert. Der durch OTA hervorgerufene Ca2+-Einstrom war auch nach Entleerung von Ca2+-Speichern durch Schwellenkonzentration das ebenfalls die Oszollationen hemmte, noch vorhanden. Zusätzlich steigerte OTA den Füllungszustand von Thapsigargin-empfindlichen Ca2+-Speichern und stimulierte die Aktivität der Thapsigargin-empfindlichen Ca2+-ATPase. Eine 10-minütige Inkubation mit OTA erhöhte den zellulären cAMP-Gehalt dosisabhängig. Der Proteinkinase A Inhibitor H-89 unterdrückte die OTA-induzierten Ca2+- Oszillationen. 1 nM OTA potenzierte die Effekte von Angiotensin II und EGF auf [Ca2+]i. Schlußfolgerungen: (i) OTA beeinträchtigt in niedrig-nanomolaren Konzentrationen, die im Rahmen der natürlichen Exposition auftreten können, reversibel die Ca2+-Homöostase in menschlichen proximalen Tubuluszellen. (ii) OTA verursacht dosis-abhängige [Ca2+]i-Oszillationen die auf OTA-induzierten Ca2+-Einstrom und Thapsigargin-sensitive Ca2+-Speicher angewiesen sind. (iii) Ferner interagieren niedrig-nanomoler Konzentrationen von OTA mit hormonellen Ca2+-Signalen, was z.B. zu einem veränderten zellulären Proliferationsverhalten führt. (iv) Die Verminderung der Zellintegrität durch höhere OTA-Konzentrationen hängt nicht von Veränderungen der Ca2+-Homöostase ab. (v) Die durch OTA hervogerufene renale Dysfunktion scheint, zumindest teilweise, auf Wechselwirkungen mit zellulären Signaltransduktionsmechanismen zu beruhen und nicht auf Zellzerstörung. N2 - The ubiquitous nephrotoxic and carcinogenic fungal metabolite ochratoxin A (OTA) interacts with renal cell function and growth. At higher concentrations OTA also reduces cell integrity. The possible contribution of changes in cellular Ca2+-homeostasis to the effects of OTA at nanomolar concentrations was investigated. Immortalized human kidney epithelial (IHKE) cells were used to investigate the effects of OTA on cytosolic calcium homeostasis ([Ca2+]i), cell growth and cell viability. 1 nmol/l OTA potentiated EGF- and Ang II-induced cell proliferation in a Ca2+-dependent manner. A Ca2+-independent decrease in cell viability and cell number could be observed only after 24 h-exposure with threshold concentrations > 10 nmol/l. Within seconds OTA evoked reversible and concentration-dependent [Ca2+]i oscillations with a threshold concentration of 0.1 nM. The oscillations were abolished by removal of extracellular Ca2+, by the Ca2+-channel blocker SK&F 96365 and by inhibition of phospholipase C. OTA-induced activation of Ca2+-influx was still present after store depletion with thapsigargin, which blunted the oscillations. In addition, OTA increased the filling state of thapsigargin-sensitive Ca2+-stores and stimulated the thapsigargin-sensitive Ca2+-ATPase activity. 10 min incubation with OTA increased cellular cAMP content in a dose-dependent manner. The protein kinase A inhibitor H-89 suppressed OTA-induced Ca2+-oscillations. 1 nM OTA potentiated the effects of angiotensin II and EGF on [Ca2+]i. Conclusions: (i) OTA impairs Ca2+-homeostasis in human renal epithelial cells in a reversible manner at low nanomolar concentrations, which occur during dietary exposure. (ii) OTA causes dose-dependent [Ca2+]i oscillations which are dependent on OTA-induced Ca2+-influx and thapsigargin-sensitive Ca2+-stores. (iii) Furthermore, low nanomolar OTA interferes with hormonal Ca2+ signaling leading, for example, to altered cell proliferation. (iv) Reduction of cell integrity at higher concentrations does not depend on changes of Ca2+-homeostasis. (v) OTA-induced renal dysfunction at low nanomolar concentrations seems to result, at least in part, from the interaction with cellular signaling mechanisms and not from cell destruction. KW - Ochratoxin A KW - Calciumoszillationen KW - Angiotensin II KW - Signaltransduktion KW - Proliferation KW - Ochratoxin A KW - Calciumoscillations KW - Angiotensin II KW - Signaltransduction KW - Proliferation Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6599 ER - TY - THES A1 - Bischof, Astrid T1 - Mechanismen der TZR-abhängigen und -unabhängigen Aktivierung primärer T-Zellen der Ratte durch CD 28 T1 - Mechanisms of T cell receptor dependent and independent activation of primary rat T cells via CD28 N2 - Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abhängig über den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt über kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molekülen ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivität einiger monoklonaler Antikörper (mAb) spezifisch für CD28 der Ratte, die alle ruhenden primären Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen können, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterstützt CD28 als kostimulatorisches Molekül nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenständiges Signalmolekül, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 könnte für die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verhältnis der Stärke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt. N2 - Resting T cells need two signals to become fully activated: one delivered via the T cell receptor (TCR) and a second one provided by costimulatory receptors. Among the known costimulatory molecules CD28 is the most potent one. In the rat system some CD28-specific monoclonal antibodies (mAb) trigger all primary rat T cells to proliferate and produce cytokines without TCR engagement. The signalling pathways elicited by one of these mitogenic CD28-specific mAb were analyzed and compared to the signals given in classical costimulation with TCR contribution. The results suggest that direct CD28 stimulation does not mimic TCR signals but elicits distinct, CD28-specific signals. Thus, CD28 as a costimulatory molecule not only supports TCR mediated signalling but functions as a generator of mitogenic signals. This could be relevant to the type of immune reaction triggered since the relative contribution of TCR and CD28 signals to T cell activation has been shown to influence the functional differentiation of T cells towards the Th1 or Th2 subset. KW - Antigen CD28 KW - T-Lymphozyt KW - Aktivierung KW - Signaltransduktion KW - T-Zellaktivierung KW - Kostimulation KW - T-Zellrezeptor (TZR) KW - CD28 KW - Proliferation KW - Kinasen KW - Signalkaskaden KW - JNK KW - ZAP-70 KW - Ratte KW - T cell activation KW - costimulation KW - T cell receptor (TCR) KW - CD28 KW - proliferation KW - kinases KW - signalling cascades KW - JNK KW - ZAP-70 KW - rat Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-875 ER - TY - THES A1 - Burkard, Natalie T1 - Signalübertragungswege und Präventionsmöglichkeiten der kardialen Hypertrophie : conditional overexpression of neuronal nitric oxide synthase is cardioprotective in ischemia-reperfusion T1 - Konditionale Überexpression der neuronalen NO-Synthase wirkt kardioprotektiv bei Ischämie-Reperfusion N2 - Zusammenfassung: Wie früher schon gezeigt, wird der L-Typ Ca2+-Kanal durch eine induzierbare, myokardspezifische Überexpression der neuronalen Stickstoffmonoxidsynthase (nNOS) inhibiert. Gleichzeitig bewirkt diese Überexpression eine verminderte kardiale Kontraktilität1 (Burkard N. et al. (2007). Circ Res 100, 32-44). nNOS interagiert mit vielen verschiedenen Kompartimenten und Kanälen innerhalb der Zelle. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine nNOS Überexpression nach Ischämie-Reperfusion kardioprotektiv wirkt. Dieses wird durch eine Inhibition der Mitochondrienfunktion und durch eine Verminderung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ermöglicht. In einer früheren Arbeit wurde der Effekt der induzierbaren und myokardspezifischen Überexpression von nNOS unter physiologischen Bedingungen am transgenen Tiermodell untersucht. Diese Arbeit beschäftigt sich nun mit der Überexpression von nNOS unter pathophysiologischen (Ischämie-Reperfusion) Bedingungen. Ein Ischämie-Reperfusions-Schaden bewirkt bei Wildtyp-Mäusen, sowie bei transgener nNOS Überexpression eine Anreicherung von nNOS in den Mitochondrien. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Mausmyokard haben gezeigt, dass bei Überexpression nNOS zusätzlich in den Mitochondrien lokalisiert ist. Diese Translokation von nNOS in die Mitochondrien ist abhängig von HSP90. Ischämie- Reperfusionsexperimente an isolierten Mäuseherzen zeigten einen kardioprotektiven Effekt der nNOS Überexpression (30min post ischemia, LVDP 27.0±2.5mmHg vs. 45.2±1.9mmHg, n=12, p<0.05). Dieser positive Effekt konnte bei der Bestimmung der Infarktgröße bestätigt werden. nNOS überexprimierende Mäuse hatten eine kleinere Infarktgröße nach Ischämie-Reperfusion (36.6±8.4 relative % vs. 61.1±2.9 relative %, n=8, p<0.05). Die Überexpression von nNOS bewirkte ebenfalls einen signifikanten Anstieg des mitochondrialen Nitrit-Levels, begleitet von einer Verminderung der Cytochrom C Oxidase Aktivität (72.0±8.9units/ml in nNOS overexpressing mice vs. 113.2±17.1units/ml in non-induced mice, n=12, p<0.01), was zu einer Hemmung der Mitochondrienfunktion führt. Dementsprechend war der Sauerstoffverbrauch (gemessen an isolierten Herzmuskelstreifen) schon unter basalen Bedingungen beinNOS Überexpression vermindert (0.016±0.0015 vs. 0.024±0.006ml[O2] x mm-3 x min-1, n=13, p<0.05). Außerdem war die ROS Konzentration in Herzen von nNOS überexprimierenden Mäusen signifikant vermindert (6.14±0.685 vs. 14.53±1.7μM, n=8, p<0.01). Die Zugabe von verschiedenen Inhibitoren, Western Blot- und Aktivitätsuntersuchungen zeigten schließlich, dass diese niedrigere ROS Konzentration durch eine verminderte Xanthin Oxidoreduktase Aktivität hervorgerufen wurde. Zusammenfassend hat diese Arbeit gezeigt, dass eine induzierbare und myokardspezifische Überexpression von nNOS unter pathophysiologischen Bedingungen (Ischämie-Reperfusion) kardioprotektiv wirkt. Zusätzlich zu der Verminderung des myokardialen Ca2+-Überschusses nach Reperfusion könnte dieser protektive Effekt durch eine Hemmung der Mitochondrienfunktion bedingt sein, schließlich wird der Sauerstoffverbrauch schon unter basalen Bedingungen reduziert N2 - Summary: I previously demonstrated that conditional overexpression of the neuronal nitric oxide synthase (nNOS) inhibited L-type Ca2+-channels and decreased myocardial contractility1 (Burkard N. et al. (2007). Circ Res 100, 32-44). However, nNOS has multiple targets within the cardiac myocyte and it is possible that interesting biological functions of this protein remain to be elucidated. In this study, I showed that nNOS overexpression has a cardioprotective effect after ischemia-reperfusion injury by inhibiting mitochondrial function and reducing the generation of reactive oxygen species (ROS). The effect of conditional nNOS overexpression in cardiac myocytes in ischemiareperfusion injury was assessed. Ischemia-reperfusion injury in WT mice resulted in nNOS accumulation in the mitochondria. Similary, transgenic nNOS overexpression caused nNOS abundance in mitochondria. Electron microscopy of mouse myocardium from nNOS overexpressing mice showed that after induction of its expression, nNOS is additionally localised in mitochondria. nNOS translocation into mitochondria was dependent on HSP90. Ischemia-reperfusion experiments in isolated hearts showed a cardioprotective effect of nNOS overexpression (30min post-ischemia, LVDP 27.0±2.5mmHg in non-induced animals vs. 45.2±1.9mmHg in nNOS overexpressing mice, n=12, p<0.05). Consistently with this finding, in vivo the infarct size within the area at risk was significantly decreased in nNOS overexpressing mice compared to non-induced animals (36.6±8.4 relative % vs. 61.1±2.9 relative %, n=12, p<0.05). nNOS overexpression also caused a significant increase in mitochondrial nitrite levels accompanied by a decrease of cytochrome c oxidase activity (72.0±8.9units/ml in nNOS overexpressing mice vs. 113.2±17.1units/ml in non-induced mice, n=12, p<0.01) resulting in an inhibition of mitochondrial function. Accordingly, O2-consumption (MVO2) in isolated heart muscle stripes was decreased in nNOS overexpressing mice, already under resting conditions (0.016±0.0015 vs. 0.024±0.006ml[O2] x mm-3 x min-1, n=13, p<0.05). Additionally, this study showed that the ROS concentration was significantlydecreased in hearts of nNOS overexpressing mice compared to non-induced animals (6.14±0.685 vs. 14.53±1.7μM, n=8, p<0.01). Application of different inhibitors, Western Blot analysis and activity assays showed that the lower ROS concentration in nNOS overexpressing mice was caused by inhibition of the xanthine oxidoreductase (XOR) activity by the increased abundance of nNOS expression. In summary, this study demonstrated that the conditional transgenic overexpression of nNOS resulted in myocardial protection after ischemia-reperfusion injury. Besides reduction of myocardial Ca2+-overload after reperfusion this might be caused by inhibition of mitochondrial function through nNOS, which reduced myocardial oxygen consumption already under baseline conditions (Burkard N. conditionally accepted by KW - Herzhypertrophie KW - Signaltransduktion KW - Prävention KW - kardioprotektiv KW - Ischämie-Reperfusion KW - nNOS KW - cardioprotection KW - ischemia-reperfusion KW - nNOS Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51832 ER - TY - THES A1 - Böhme, Linda T1 - Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis-infected human host cells T1 - Zelluläre Antwort auf doppelsträngige RNA in Chlamydia trachomatis-infizierten humanen Wirtszellen N2 - Chlamydien sind Gram-negative, obligat-intrazelluläre Bakterien, die für ein weites Spektrum an relevanten Krankheiten verantwortlich sind. Auf Grund ihres zweiphasigen Entwicklungszyklusses sind Chlamydien von einer intakten Wirtszelle abhängig, um sich erfolgreich vermehren und im Organismus ausbreiten zu können. Daher haben Chlamydien anspruchsvolle Strategien entwickelt, um das Immunsystem des Wirtes auszuschalten oder den programmierten Zelltod ihrer Wirtszelle zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Infektion mit C. trachomatis einen Einfluss auf die zelluläre Antwort auf dsRNA nehmen kann. Die Synthese von dsRNA ist ein charakteristisches Merkmal der Replikation von Viren, welche sowohl die Apoptose induzieren als auch das Immunsystem aktivieren kann. Um eine chlamydiale und virale Co-Infektion zu simulieren, wurden Chlamydien-infizierte Epithelzellen mit der synthetischen dsRNA Polyinosin-Polycytidinsäure (polyI:C) transfiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die durch dsRNA eingeleitete Apoptose verhindern können. Eine signifikante Reduktion der dsRNA-induzierten Apoptose konnte in infizierten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 in infizierten Zellen unterblieb. Dies war von der frühen bakteriellen Proteinsynthese abhängig und für die dsRNA-vermittelte Apoptose spezifisch, da der durch TNFalpha bewirkte Zelltod nicht auf der Ebene der Caspase-8 verhindert werden konnte. Die Aktivierung von zellulären Faktoren, die bei der Apoptoseinduzierung eine wichtige Rolle spielen, beispielsweise PKR und RNase L, war in infizierten Zellen jedoch unverändert. Stattdessen konnte durch RNA Interferenz-vermittelte Depletion gezeigt werden, dass der zelluläre Caspase-8-Inhibitor cFlip eine entscheidende Rolle bei der chlamydialen Blockierung der dsRNA-vermittelten Apoptose spielt. Mittels Co-Immunopräzipitation konnte ein erster Hinweis darauf gefunden werden, dass C. trachomatis eine Anreicherung von cFlip im dsRNA-induzierten Komplex von Caspase-8 und FADD bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die Immunantwort auf virale Infektionen beeinflussen, welche vor allem die Expression von Interferonen und Interleukinen beinhaltet. Es stellte sich heraus, dass die Aktivierung des Interferon regulatory factor 3 (IRF-3) und des zur Familie von NF-kappaB Trankriptionsfaktoren gehörenden p65, zwei zentralen Regulatoren der Immunantwort auf dsRNA, in infizierten Epithelzellen verändert war. Die Degradation von IkappaB-alpha, des Inhibitors von NF-kappaB, war in infizierten Zellen beschleunigt, begleitet von einer Veränderung der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern. Im Gegensatz dazu wurde die nukleäre Translokation von IRF-3 durch die Infektion signifikant verhindert. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass eine Infektion mit C. trachomatis die zelluläre Antwort auf dsRNA signifikant verändern kann und implizieren einen Einfluss von chlamydialen Infektionen auf den Ausgang von viralen Superinfektionen. N2 - Chlamydia are Gram-negative obligate intracellular bacteria responsible for a wide spectrum of relevant diseases. Due to their biphasic developmental cycle Chlamydia depend on an intact host cell for replication and establishment of an acute infection. Chlamydia have therefore evolved sophisticated strategies to inhibit programmed cell death (PCD) induced by a variety of stimuli and to subvert the host immune system. This work aimed at elucidating whether an infection with C. trachomatis can influence the cellular response to double-stranded RNA (dsRNA). The synthesis of dsRNA is a prominent feature of viral replication inside infected cells that can induce both PCD and the activation of a cellular innate immune response. In order to mimic chlamydial and viral co-infections, Chlamydia-infected cells were transfected with polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C), a synthetic dsRNA. In the first part of this work it was investigated whether C. trachomatis-infected host cells could resist apoptosis induced by polyI:C. A significant reduction in apoptosis, determined by PARP cleavage and DNA fragmentation, could be observed in infected cells. It could be shown that processing of the initiator caspase-8 was inhibited in infected host cells. This process was dependent on early bacterial protein synthesis and was specific for dsRNA because apoptosis induced by TNFalpha was not blocked at the level of caspase-8. Interestingly, the activation of cellular factors involved in apoptosis induction by dsRNA, most importantly PKR and RNase L, was not abrogated in infected cells. Instead, RNA interference experiments revealed the crucial role of cFlip, a cellular caspase-8 inhibitor, for chlamydial inhibition of dsRNA-induced apoptosis. First data acquired by co-immunoprecipitation experiments pointed to an infection-induced concentration of cFlip in the dsRNA-induced death complex of caspase-8 and FADD. In the second part of this work, the chlamydial influence on the first line of defense against viral infections, involving expression of interferons and interleukins, was examined. Activation of the interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and the NF-kappaB transcription factor family member p65, both central regulators of the innate immune response to dsRNA, was altered in Chlamydia-infected epithelial cells. polyI:C-induced degradation of IkappaB-alpha, the inhibitor of NF-kappaB, was accelerated in infected cells which was accompanied by a change in nuclear translocation of the transcription factor. Translocation of IRF-3, in contrast, was significantly blocked upon infection. Together the data presented here demonstrate that infection with C. trachomatis can drastically alter the cellular response to dsRNA and imply an impact of chlamydial infections on the outcome of viral super-infections. KW - Chlamydia trachomatis KW - Signaltransduktion KW - Immunreaktion KW - Doppelhelix KW - RNS KW - Apoptosis KW - Apoptose KW - doppelsträngige RNA KW - Immunantwort KW - Apoptosis KW - Chlamydia trachomatis KW - double-stranded RNA KW - innate immunity KW - signal transduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46474 ER - TY - THES A1 - Clemen, Holger T1 - Analyse der Expression und möglicher signalinduzierender Eigenschaften des CD1d-Moleküls der Ratte T1 - Analysis of expression and potential signal inducing properties of rat CD1d-molecule N2 - Wie MHC Klasse I und II-Moleküle präsentieren CD1d-Moleküle dem TCR Antigene, allerdings Lipide und Glykolipide und nicht Proteinfragmente. Die Entdeckung der massiven TH1- und TH2-Zytokinproduktion von Typ I-NKT-Zellen nach CD1d-vermittelter Erkennung von α-Galactosylceramid, einem aus dem Meeresschwamm gewonnenen Glykosphingolipid, weckte großes Interesse an ihrem immunregulatorischen Potential und ihrem möglichen Nutzen für neue Immun- und Tumortherapien. Um die Funktion und die Bedeutung von CD1d besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Expressionslevel der lymphatischen Gewebe der Ratte und der Maus untersucht. Hierfür wurden die neu generierten monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 verwendet, die die CD1d-Moleküle von Ratte und Maus binden und so den direkten Vergleich beider Spezies ermöglichen. Sowohl die isolierten Zellen des Thymus und der Milz als auch des Lymphknotens waren in der LEW- und F344-Ratte sowie in der BALB/c-Maus schwach bis stark CD1d positiv. In der LEW-Ratte und in der F344-Ratte wiesen jeweils ca. 18% der Milzzellen eine vergleichsweise erhöhte CD1d-Expression auf. Dabei handelte es sich in erster Linie um Marginalzonen-B-Zellen. Bestimmte Subpopulationen der Dendritischen Zellen und vermutlich Makrophagen stellten die restlichen CD1d stark positiven Populationen dar. Nur ca. 2% der isolierten Zellen der Lymphknoten der LEW-Ratte waren stark CD1d positiv, wohingegen der LEW-Thymus gemäß dem noch geringeren Anteil an APC kaum Zellen mit erhöhter CD1d-Expression enthielt. In der BALB/c-Maus war der Anteil CD1d stark positiver Milzzellen mit 4% deutlich geringer als in der LEW- oder F344-Milz. Abgesehen von MZ-B-Zellen konnten in der Maus kaum Populationen mit starker CD1d-Expression in den verschiedenen Färbungen festgestellt werden. Demnach stellt CD1d sowohl in der Ratte als auch in der Maus einen guten Marker für MZ-B-Zellen dar. Demgegenüber zeigten vereinzelt kleine Populationen der Milz, des Lymphknotens und des Thymus beider Spezies eine verminderte oder gar keine CD1d-Expression. Zur Analyse möglicher signalinduzierender Eigenschaften der verschiedenen Anti- CD1d-Antikörper wurden ihre Effekte auf rCD1d+ Transduktanten und primäre Zellen untersucht. 58/4 konnte im Gegensatz zu 232 spezifisch über Bindung an Ratten- CD1d Zelltod und Aggregatbildung in Tumor-B-Zellen des Menschen und der Maus, aber nicht in Tumor-T-Zellen, induzieren. Der zytoplasmatische Schwanz der CD1d-Moleküle scheint an der Aggregatbildung beteiligt zu sein. Die Bindung von 58/4 oder 232 führte in überlebenden rCD1d+ Raji-Zellen zu einer ähnlich starken Internalisierung der CD1d-Moleküle. Während nach 5-stündiger Inkubation mit 232 und erneuter CD1d-Färbung wieder die vorherige CD1d- Expression festgestellt wurde, konnte nach Inkubation mit 58/4 eine bleibende Herunterregulierung beobachtet werden. Folglich bewirkte 58/4 ein anderes bzw. stärkeres Signal in den Zellen als 232. Diese Beobachtungen stützen die Signaltransduktion als mögliche weitere Funktion der CD1d-Moleküle neben der Antigenpräsentation und definieren die monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 als nützliche Werkzeuge für weitere Studien zur Analyse der molekularen Mechanismen der CD1d-vermittelten Signaltransduktion. Das Verständnis solcher Mechanismen bildet wiederum die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapien z. B. zur Eliminierung CD1d exprimierender Tumore. N2 - CD1d-molecules present in contrast to MHC class I and II-molecules lipid antigens to T-cells. There are some observations showing strong CD1d-mediated effects on immune system, so that there is a growing interest in understanding these mechanisms in order to be able to regulate this influence. The expression of CD1d in rats hasnt been known yet. Since our anti-CD1d-antibodies recognize CD1d-molecules of rats as well as of mice, we could compare these species. Antigen-presenting cells, especially marginal-zone B-cells, showed in both the highest CD1d-expression, so that our anti-CD1d-antibodies can be used for their identification. Only a small part of the cells of thymus, spleen and lymphnodes showed a marginal or no CD1d-expression. The analysis of antibody-inducing effects on CD1d+ cells showed, that some of our antibodies can mediate a CD1d-specific cell-death similar to the well-known MHC II-mediated cell death. Survived cells react with an antibody-dependent rate of aggregation or down-regulation of CD1d indicating our antibodies can become a potential tool for further analysis of CD1d-mediated reactions in order to develop new therapies, for example for elimination of CD1d-expressing tumors. KW - Zelltod KW - Signaltransduktion KW - Immunmodulation KW - CD1d KW - CD1d KW - cell death KW - signal transduction KW - immune modulation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65242 ER - TY - THES A1 - Danzer, Claus-Peter T1 - Generierung von chimären Mäusen mit Mutationen in der Signalleitungs-Domäne von CD22 und Untersuchungen zur Funktion von CD22 in Knockout-Mäusen T1 - Generation of Chimaeric mice with mutations in the signaling domain of CD22 and analysis of the function of CD22 in knockout mice N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialinsäure-bindende Immunglobulin-ähnliche Lectine). Mit der äußersten der 7 extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialinsäure interagieren. In der cytoplasmatischen Domäne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungeklärt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerstörte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Domäne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren für CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. Für beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingeführten Mutationen vollständig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chimäre Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank ermöglichte die Verlängerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch öffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Veränderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerstörten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalität des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig für die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialinsäure auf der selben Zelloberfläche (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellulären Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialinsäure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-Mäusen, aber nur ca. 4,5% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- Mäusen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialinsäure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zurückzuführen. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In Übereinstimmung damit führte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abhängiger Demaskierung. 4. FACS-Färbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- Mäusen um ca. 70-80% gegenüber wt-Mäusen verkleinert ist. In Bestätigung früherer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabhängige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- Mäusen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant stärker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- Mäusen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zurückzuführen ist. N2 - Aim of this thesis was to investigate aspects of the function of CD22, a B-cell specific member of the Siglec-family (sialic acid binding immunoglobulin–like lectins). CD22 can specifically bind a2,6-sialic acid with the outermost of its 7 extracellular Ig-domains. There are 6 conserved tyrosine residues in the cytoplasmic domain, 3 of which lie within ITIMs (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs). Following BCR engagement, CD22 becomes tyrosine-phosphorylated. Consecutively, the cytosolic tyrosin-phosphatase SHP-1 binds to the phosphorylated ITIMs, becomes activated and inhibits the BCR-signal. There are also some positive modulators of the BCR-signal which bind to CD22 (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2). The role of these molecules in the context of CD22 remains to be elucidated. 1. One main goal of this work was the generation of two new knockin mouse lines. In the first line (CD22-ITIM-KO), the ITIMs of CD22 were to be destroyed. A second line in which CD22 lacks its cytoplasmic tail was to be generated (CD22-Tailless). Both models were supposed to serve the in vivo investigation of the role of the positive modulators of the BCR-signal and the interrelation of CD22 signaling and ligand binding. Cloning of the targeting vectors pCD22-ITIM-KO and pCD22-tailless was completed. Using control vectors, which were also cloned, screening-PCRs for the identification of homologous recombined ES-cell clones were established. C57BL/6 ES-cells were transfected with the targeting constructs, and homologous recombinants were identified with PCR and Southern blot. The introduced mutations were confirmed by sequencing. Following cre/lox-mediated deletion of the selection cassette, fully characterised CD22-ITIM-KO clones were injected into BALB/c-blastocysts. Five chimaeras were obtained, none of which transmitted the mutations through the germline. No homologous recombinants were obtained upon injection of the C57BL/6 targeting constructs into other, non-isogenic ES-cell lines. Finding of the genomic sequence of murine CD22 in a database made it possible to extend pCD22-ITIM-KO by 4 kb with DNA from a 129/ola mouse strain. The new construct was used to transfect 129/ola ES-cells, which are generally known to be kariotypically more stable than C57BL/6 ES-cells. No homologous recombinants were obtained. The now known sequence of the CD22 gene will make it possible to reconstruct pCD22-ITIM-KO based on 129-DNA or to modify and improve the already existing C57BL/6-constructs. 2. To investigate the consequences of the destroyed ITIMs on tyrosine-phosphorylation and SHP-1 association of CD22 in vitro, a CD22-ITIM-KO expression-vector was constructed and sialyl-transferase/CD22-ITIM-KO double-transfectants of the murine plasmocytoma-line J558L were generated. CD22 tyrosine-phosphorylation after BCR-stimulation was completely abolished in CD22-ITIM-KO transfectants. Accordingly, SHP-1 couldnt associate with CD22-ITIM-KO. The results prove the funcionality of the CD22-ITIM-KO construct with respect to ITIM-phosphorylation and binding of SHP-1. Furthermore the results show that the ITIM-tyrosines are also important for the phosphorylation of the non-ITIM-tyrosines. 3. Interaction of CD22 with its ligand a2,6-sialic acid on the surface of the same cell (in cis) plays an important role in cell-cell-interaction and intracellular signal transduction. In this work B-cells on which the ligand binding site of CD22 is not occupied by endogenous a2,6-sialic acid (demasked CD22) were identified by FACS for the first time. 10,5% of all B220+ spleen cells from wild type mice, in contrast to only 4,5% B220+ spleen cells from CD22-/- mice were able to bind exogenous a2,6-sialic acid. This effect is mainly due to the presence or absence of CD22, respectively. Detailed FACS-analyses revealed that cells with demasked CD22 are enriched in the fraction of the transitional B-cells type 2 (T2 cells) and show signs of activation. Accordingly, in vitro activation of B-cells with LPS or IL4 resulted in CD22-dependent demasking. 4. FACS-analyses showed that the marginal zone (MZ) B-cell compartment in CD22-/- mice is strongly reduced (by about 70-80%). Earlier results showing that the immune response against i.p.-injected TI2-antigens is about 2-fold reduced in CD22-/- mice could be confirmed. However, the response was significantly more impaired (3-4-fold) when the same dose of antigen was applied i.v., a situation where preferentially the MZ B-cells of the spleen come in contact with antigen carried along with the blood flow. The known deficiency in TI2-responses in CD22-/- mice is likely due to non-sufficient MZ B-cell numbers in these animals. KW - B-Lymphozyt KW - Signaltransduktion KW - Knockout KW - Antigen CD22 KW - B-Zellen KW - Signaltransduktion KW - Knockout Mäuse KW - CD22 KW - B-Cells KW - Signaltransduction KW - Knockout Mice KW - CD22 Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4966 ER -