TY - THES A1 - Läsker, Katharina T1 - The influence of the short-chain fatty acid butyrate on "Signal transducer and activator of transcription 3" (STAT3) and selected inflammatory genes in the colon carcinoma cell line CACO-2 cultured in 2D and 3D T1 - Der Einfluss der kurzkettigen Fettsäure Butyrat auf "Signal Übermittler und Aktivator der Transkription 3" (STAT3) und ausgewählte an der Entzündung beteiligte Gene in der Dickdarmkrebszelllinie CACO-2 im 2D- und 3D Modell N2 - A disturbance in the symbiotic mutualism between the intestinal microbiome and the human host’s organism (syn. dysbiosis) accompanies the development of a variety of inflammatory and metabolic diseases that comprise the Metabolic Syndrome, chronic inflammatory gut diseases like Crohn’s disease, Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and cardiovascular diseases, among others. The changed uptake and effectiveness of short chain fatty acids (SCFAs) as well as an increase of the intestinal permeability are common, interdependent disease elements in this regard. Short chain fatty acids are end-products of intestinal bacterial fermentation and affect the mucosal barrier integrity via numerous molecular mechanisms. There is evidence to suggest, that SCFAs have a modulating influence on Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in intestinal epithelial cells. STAT3 is a central gene-transcription factor in signaling pathways of proliferation and inflammation. It can be activated by growth factors and other intercellular signaling molecules like the cytokine Oncostatin M (OSM). The mode of STAT3’s activation exhibits, finally, a decisive influence on the immunological balance at the intestinal mucosa. Therefore, the posttranslational modification of STAT3 under the influence of SCFAs is likely to be a very important factor within the development and -progression of dysbiosis-associated diseases. In this study, a clear positive in vitro-effect of the short chain fatty acid butyrate on the posttranslational serine727-phosphorylation of STAT3 and its total protein amount in the human adenocarcinoma cell line CACO2 is verified. Moreover, an increased gene expression of the OSM-receptor subunit OSMRβ can be observed after butyrate incubation. Histone deacetylase inhibition is shown to have a predominant role in these effects. Furthermore, a subsequent p38 MAPK-activation by Butyrate is found to be a key molecular mechanism regarding the STAT3-phosphorylation at serine727-residues. To consider the portion of butyrate receptor signaling in this context in future assays, a CACO-2 cell 3D-culture model is introduced in which an improvement of the GPR109A-receptor expression in CACO-2 cells is accomplished. N2 - Eine Störung der symbiotischen Wechselbeziehung zwischen dem Darmmikrobiom und dem Wirtsorganismus (syn. Dysbiose) begleitet die Entwicklung vieler verschiedener entzündlicher und metabolischer Erkrankungen. Zu ihnen zählen unter anderem das Metabolische Syndrom, chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie M. Crohn, die Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) und kardiovaskuläre Erkrankungen. Eine veränderte Aufnahme und Wirkung von kurzkettigen Fettsäuren (Short-chain fatty acids = SCFAs) und eine Schwächung der Darmbarriere bedingen sich in diesem Zusammenhang gegenseitig. Kurzkettige Fettsäuren sind Endprodukte des bakteriellen Stoffwechsels und beeinflussen die Integrität der Darmbarriere über eine Vielzahl molekularer Mechanismen. Es gibt Hinweise darauf, dass kurzkettige Fettsäuren einen modulierenden Einfluss auf „Signal transducer and activator of transcription 3“ (STAT3) in intestinalen epithelialen Zellen ausüben. STAT3 ist hier ein zentraler Gentranskriptionsfaktor in proliferations- und entzündungsregulierenden Zellsignalwegen. Er kann durch Wachstumsfaktoren und andere interzelluläre Botenstoffe, wie beispielsweise das Zytokin Oncostatin M (OSM), aktiviert werden. Die Art der Aktivierung von STAT3 wirkt sich nicht zuletzt entscheidend auf die immunologische Balance an der Darmbarriere aus. Die Modifikation von STAT3 durch kurzkettige Fettsäuren ist aufgrund dessen mit hoher Wahrscheinlichkeit ein sehr wichtiger Faktor im Hinblick auf Entstehung und Progression der im Zusammenhang mit einer Dysbiose stehenden Erkrankungen. In dieser Arbeit kann eine klare Steigerung der posttranslationalen Phosphorylierung von STAT3 an den Serin-Molekülendungen der Position 727 sowie eine Steigerung der Gesamtproteinmenge von STAT3 in der humanen Karzinomzellline CACO2 in vitro durch Butyrat-Inkubation gezeigt werden. Weiterhin wird unter Butyrat-Einfluss auch die Genexpression der OSM-Rezeptor-Untereinheit OSMRβ gesteigert. Diese Effekte können größtenteils auf den Mechanismus der Histondeacetylase-Hemmung durch Butyrat zurückgeführt werden. Die in der Folge erhöhte P38 MAPK-Phosphorylierung durch Butyrat ist in Bezug auf die Serin727-Phosphorylierung an STAT3 entscheidend beteiligt. Um in künftigen Assays auch den möglichen Einfluss der Butyrat-Rezeptor-Wirkung in diesem Zusammenhang besser zu erfassen, wird ein 3D-Zellkultur Ansatz getestet und in diesem eine verbesserte Expression des Butyrat-Rezeptors GPR109A in CACO-2-Zellen erreicht. KW - Butyrate KW - Signaltransduktion KW - Darmepithel KW - Cytokine KW - MAP-Kinase KW - butyrate KW - signal transduction KW - p38 MAPK KW - STAT3 KW - intestinal barrier KW - 3 dimensional cell culture model KW - CACO-2 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300389 ER - TY - THES A1 - König, Anika T1 - The role of the transcriptional regulators NFATc1 and Blimp-1 in follicular T-cells T1 - Die Rolle der Transkriptionsregulatoren NFATc1 und Blimp-1 in follikulären T-Zellen N2 - The defense against invading pathogens is, amongst other things, mediated via the action of antibodies. Class-switched antibodies and antibodies of high affinity are produced by plasma cells descending from germinal center B (GCB) cells. GCB cells develop in the germinal center (GC), a specialized microstructure found in the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. GCB-cell maturation and proliferation are supported by follicular T- helper (Tfh) cells. On the other hand, follicular regulatory T (Tfr) cells control this process in quantity and quality preventing, for instance, the formation of autoantibodies directed against endogenous structures. The development of GCB, Tfh and Tfr cells essentially depends on the migration into the GC, which is mediated via the expression of the chemokine receptor CXCR5. One transcription factor highly expressed in follicular T cells, comprising Tfh and Tfr cells, is NFATc1. Tfr cells additionally express the transcriptional repressor Blimp-1, which is not expressed in Tfh cells. We found that NFATc1 is transactivating Cxcr5 via response elements in the promoter and enhancer in vitro. Blimp-1 binds to the same elements, transactivating Cxcr5 expression in cooperation with NFATc1, whilst mediating Cxcr5- repression on its own. In Tfr cells Blimp-1 suppresses CXCR5 expression in the absence of NFATc1. Blimp-1 itself is necessary to restrict Tfr-cell frequencies and to mediate Tfr- cell function as in mice with Blimp-1-ablated Tregs high frequencies of Tfr cells do not reduce GCB- or Tfh cell frequencies. NFATc1 and Blimp-1 double deficient Tfr cells show additional loss of function, which becomes visible in clearly expanded antibody titers. To evaluate the function of NFATc1 in Tfr cells, we not only deleted it, but also overexpressed a constitutive active form of NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatory T cells (Tregs). The latter is leading to an upregulation of CXCR5 per cell, without changing Tfh or Tfr-cell frequencies. However, the high density of surface CXCR5 enhances the migration of Tfr cells deep into the GC, which results in a tighter control of the antigen- specific humoral immune response. Additionally, caNFATc1/aA increases the expression of genes coding for Tfr effector molecules like Il1rn, Il10, Tigit and Ctla4. Interestingly, this part of the transcriptional change is dependent on the presence of Blimp-1. Furthermore, Blimp-1 regulates the expression of multiple chemokine receptor genes on the background of caNFATc1/aA. In contrast, when caNFATc1/aA is overexpressed in all T cells, the frequencies of Tfh- and GCB cells are dominantly reduced. This effect seems to stem from the conventional T- cell (Tcon) side, most probably originating from increased secretion of interleukin-2 (IL- 2) via the caNFATc1/aA overexpressing Tcons. IL-2 is known to hinder the germinal center reaction (GCR) and it might in its abundance not be neutralizable by Tfr cells. Taken together, NFATc1 and Blimp-1 cooperate to control the migration of Tfr cells into the GC. Tfr cells in the GC depend on NFATc1 and Blimp-1 to perform their proper function. Overexpression of caNFATc1 in Tregs strengthens Tfr function in a Blimp-1-dependent manner, whilst overexpression of caNFATc1 in all T cells dominantly diminishes the GCR. N2 - Die Abwehr von Krankheitserregern durch das Immunsystem wird unter anderem (u.a.) durch die Wirkung von Antikörpern vermittelt. Antikörper, welche einen Klassenwechsel und eine hohe Affinität aufweisen, werden von Plasmazellen gebildet, welche sich von Keimzentrums-B (GCB) -Zellen ableiten. GCB-Zellen evolvieren innerhalb des Keimzentrums (GC), einer Mikrostruktur, welche sich innerhalb des B-Zellfollikels sekundärer lymphoider Organe bildet. Die GCB-Zell-Reifung und -Proliferation wird durch follikuläre T-Helfer (Tfh) -Zellen unterstützt und durch follikuläre regulatorische T (Tfr) -Zellen kontrolliert, wodurch u.a. die Bildung von Autoantikörpern, welche körpereigene Strukturen angreifen, unterbunden wird. Die Entwicklung von GCB-, Tfh- und Tfr-Zellen ist in entscheidender Weise abhängig von der Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 und der damit verbundenen Migration in das GC. NFATc1 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher in follikulären T-Zellen, bestehend aus Tfh- und Tfr-Zellen, stark exprimiert wird. Im Gegensatz zu Tfh-Zellen exprimieren Tfr-Zellen zusätzlich den Transkriptionsrepressor Blimp-1. Wir haben herausgefunden, dass NFATc1 die Expression von Cxcr5 über die Bindung an Elemente innerhalb des Cxcr5-Promotors und -Enhancers in vitro transakiviert. Blimp-1 bindet an selbige Elemente und transaktiviert in Kooperation mit NFATc1 die Cxcr5-Expression, während es die Cxcr5- Expression alleine hemmt. In Tfr-Zellen supprimiert Blimp-1 die CXCR5-Expression in Abwesenheit von NFATc1. Blimp-1 beschränkt darüber hinaus das Vorkommen von Tfr-Zellen und spielt eine Rolle in der Effektorfunktion von Tfr-Zellen. Dies wird deutlich da das verstärkte Tfr-Zell-Vorkommen in Mäusen mit Blimp-1 defizienten Tregs nicht zu einer Reduktion der GCB-oder Tfh-Zellen führt. Der Verlust der Effektorfunktion akkumuliert in NFATc1 und Blimp-1 doppel-defizienten Tfr-Zellen, was sich in einem deutlichen Anstieg der Antikörpertiter im Serum immunisierter Tiere zeigt. Zur Überprüfung der Funktion von NFATc1 in Tfr-Zellen untersuchten wir sowohl dessen Deletion, als auch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatorischen T-Zellen (Tregs). Letztere steigert die CXCR5- Expression pro Zelle ohne das Vorkommen von Tfh- oder Tfr-Zellen zu verändern. Jedoch führte die erhöhte Oberflächenexpression von CXCR5 zu einer verstärkten Migration der Tfr-Zellen in das GC, was in einer verstärkten Kontrolle der antigenspezifischen Antikörpertiter resultierte. Darüber hinaus erhöht caNFATc1/aA in Abhängigkeit von Blimp-1, die Expression der Gene Il1rn, Il10, Tigit und Ctla4, welche mit der Effektorfunktion von Tfr-Zellen assoziiert werden. Blimp-1 wirkt auf dem Hintergrund der Überexpression von NFATc1 vor allem regulierend auf die Expression von Chemokinrezeptorgenen. Im Gegensatz zur Überexpression von caNFATc1/aA in Tregs allein, führt selbige Veränderung in allen T-Zellen zu einer deutlichen Reduktion des Vorkommens von Tfh- und GCB-Zellen nach Immunisierung. Dieser Effekt scheint durch konventionelle T-Zellen (Tcons) vermittelt zu sein und entsteht vermutlich durch eine erhöhte Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) durch die caNFATc1/aA überexprimierenden Tcons. Dieses IL-2 scheint in seiner Menge nicht durch die vorliegenden Tfr-Zellen neutralisierbar zu sein und die Keimzentrumsreaktion (GCR) zu hemmen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NFATc1 und Blimp-1 kooperieren, um die Migration von Tfr-Zellen in das GC zu kontrollieren. Tfr-Zellen im GC sind in der Erfüllung ihrer ordnungsgemäßen Funktion abhängig von NFATc1 und Blimp-1. Die Überexpression von caNFATc1 in Tregs stärkt die Funktion von Tfr-Zellen in einer Blimp-1-abhängigen Weise, während die Überexpression von caNFATc1 in allen T-Zellen die GCR extrem minimiert. KW - Signaltransduktion KW - NFATc1 KW - follikuläre regulatorische T-Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Blimp-1 KW - CXCR5 KW - germinal center KW - follicular regulatory T cell KW - Keimzentrumsreaktion KW - Zellmigration KW - Immunisierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209727 ER - TY - THES A1 - Joshi, Hemant Kumar T1 - Function of IRAK2 in macrophages and HECTD1 in B cells T1 - Funktion von IRAK2 in makrophagen und HECTD1 in B zellen N2 - The Immune system exerts its response against invading pathogens via a cumulative, sequential cooperation of immune cells coordinated by their secreted products. Immune cells, such as macrophages and dendritic cells (DCs), express toll-like receptors (TLRs) to sense the presence of pathogens through pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The interaction of PAMPs with TLRs elicits a cytosolic signaling cascade that enhances the expression of genes to stimulate inflammation. Interleukin 1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2) is a component of the TLR signaling pathway. IRAK2 transduces the TLR signal via a direct interaction with TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) and subsequent enhancement of its ubiquitination. During my PhD thesis, I determined that a 55-amino acid long stretch at the C-terminal end of IRAK2 is important for TLR signaling. Overexpression of C-terminal truncated IRAK2 (IRAK2Δ55) in the murine macrophage cell line RAW 264.7 led to impaired CD40 expression after TLR4 stimulation by Lipopolysaccharide (LPS). I observed attenuated competency of IRAK2Δ55 in restoring a full TLR signaling response i.e. IL-6 secretion, NO production and CD40 expression in IRAK2-deficient RAW cells generated via CRISPR-Cas9 approach. Additionally, diminished TLR4 induced activation of nuclear factor κB (NF-κB) and extracellular signal related kinase (ERK) was observed with IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells as compared to cell reconstituted with wildtype IRAK2. IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells also exhibited reduced TLR4-induced cell death and phosphorylation of receptor interacting protein kinase 3 (RIP3). Co-immunoprecipitation experiments in HEK 293T cells showed that IRAK2Δ55 was still able to bind to TRAF6 alike IRAK2 but failed to induce ubiquitination of TRAF6. In conclusion, the results suggest that the IRAK2 TRAF6 interaction is not sufficient to sustain full TLR signaling. An C-terminus-dependent unknown molecular mechanism is also involved. Through my PhD work, I also analyzed a B cell lineage-specific HECTD1 knock-out mice. HECTD1 is an E3 ubiquitin ligase for various substrate proteins, such as heat shock protein 90 (HSP90), adenomatous polyposis coli and phosphatidylinositol phosphate kinase type 1 γ. Hsp90 regulates a variety of signaling molecules in NF-κB activation pathways which are essential for an optimal B cell response. HECTD1-deficient pro-B cells developed normally into mature B cells. However, TLR4 stimulated HECTD1-deficient B cells displayed reduced immunoglobulin (Ig) production in in vitro cultures. In addition, mice with HECTD1-deficient B cells showed a diminished Ig response after nitrophenylacetyl-keyhole limpet hemocyanin immunization. Thus, HECTD1 is necessary for efficient Ig secretion. N2 - Auf das Eindringen von Pathogenen in den Körper antwortet das Immunsystem mit einer kumulativen, sequenziellen und wechselseitigen Zusammenarbeit zwischen Immunzellen, ihren Oberflächenrezeptoren sowie den von ihnen sezernierten Mediatoren. Immunzellen, wie Makrophagen und dendritische Zellen (DZ), sind dabei in der Lage mittels Toll-like Rezeptoren (TLRs) das Vorhandensein von Pathogenen über Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) zu detektieren. Die Bindung von PAMPs an TLRs führt über intrazelluläre Signalkaskaden zu einer verstärkten Expression pro-inflammatorischer Gene und damit zur Initiierung einer Immunreaktion. Die Interleukin 1 Rezeptor-assoziierte Kinase 2 (IRAK2) ist einer Komponente der TLR Signalkaskade. IRAK2 bindet direkt an den TNF-Rezeptor-assozierten Faktor 6 (TRAF6), welcher daraufhin verstärkt ubiquitiniert wird. In meiner Promotionsarbeit habe ich einen 55 Aminosäure langen Abschnitt im C-Terminus von IRAK2 identifiziert, der für die Signalleitung von TLRs essentiell ist. Die Überexpression von mutierten IRAK2, dem dieser C-terminale Bereich fehlt (IRAK2∆55), in der murinen Macrophagen Zelllinie RAW 264.7 führte zu einer verminderten Expression von CD40 nach Stimulation des TLR4 durch Lipopolysaccharid (LPS). Wurden IRAK2-defiziente RAW Zellen mit dem mutierten IRAK2∆55 Gen rekonstituiert, zeigten diese Zellen verglichen mit Zellen, die mit dem wildtypischen Gen rekonstituiert wurden, eine verminderte Aktivierung des nuclear factor κB (NF-κB) und der extracellular signal related kinase (ERK) nach Stimulation des TLR4. Ebenso waren die Expression von CD40, die Sekretion von IL-6 und NO gestört. In IRAK2-defizienten und IRAK2∆55 RAW Zellen war eine Reduktion des durch TLR4 induzierten Zelltodes sowie der TLR4-induzierten Phosphorylierung der Rezeptor-interagierenden Proteinkinase 3 (RIP3) zu beobachten. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit HEK 293T Zellen zeigten, dass IRAK2∆55 genauso wie intaktes IRAK2 zwar in der Lage ist, TRAF6 zu binden, aber nicht dessen Ubiquitinylierung zu induzieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Interaktion von IRAK2 mit TRAF6 für ein optimales TLR-Signal nicht ausreichend ist und deshalb ein bisher unbekannter Mechanismus an der Signalweiterleitung beteiligt sein muss. Dieser Mechanismus ist vom C-terminalen Ende von IRAK2 abhängig. In einem zweiten Teil meiner Doktorarbeit analysierte ich B-Zellen von Mäusen, in denen HECTD1-spezifisch in der B-Zellentwicklungslinie deletiert wurde. HECTD1 ist eine E3 Ubiquitin-Ligase für zahlreiche Substratproteine, wie bspw. dem Hitzeschock-Protein (heat-shock-protein, HSP90), dem adenomatösen Polyposis coli Protein oder der Phosphatidylinositol Phosphatkinase Typ 1 γ. HSP90 reguliert eine Vielzahl an Signalmolekülen im NF-κB Signalweg, die für eine optimale B-Zell-Antwort wesentlich sind. HECTD1-defiziente pro-B-Zellen entwickelten sich normal zu reifen B-Zellen. Die Stimulation des TLR4 auf HECTD1-defizienten B-Zellen führte in vitro zu einer im Vergleich zu wildtypischen B-Zellen reduzierten Immunglobulin-Sekretion. Eine reduzierte Immunglobulin-Antwort konnte auch in B-Zell-spezifischen hectd1-/- Mäusen beobachtet werden, wenn diese zuvor mit Schlitzschnecken-Hämocyanin (Keyhole Limpet Hemocyanin, NP-KLH) immunisiert wurden. Die reduzierte Produktion von Antikörpern durch HECTD1-defiziente B-Zellen zeigt, dass dieses Protein für diese zentrale Aufgabe von B-Zellen notwendig ist. KW - Toll-like-Rezeptoren KW - IRAK2 KW - HECTD1 KW - Signaltransduktion KW - TLR signaling Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150846 ER - TY - THES A1 - Weber, Judith T1 - Immunhistochemische Analysen zur Expression von cellular FLICE (FADD-like-IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein (cFLIP) in epithelialen und melanozytären Tumoren der Haut T1 - Immunohistochemical analysis of cellular FLICE (FADD-like-IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein (cFLIP) in melanocytic and epithelial skin lesions N2 - Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Apoptose stellt einen zentralen Baustein in der Pathogenese von Tumorerkrankungen dar. cFLIP inhibiert rezeptornah die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose und spielt somit eine bedeutende Rolle als Regulator der Apoptose. Eine verstärkte Expression von cFLIP kann folglich hinweisend auf eine Fehlregulation der Apoptose bei der Entstehung und Progression von Tumoren sein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von cFLIP in kutanen epithelialen und melanozytären Tumoren mit formalinfixierten und paraffinierten Gewebeproben untersucht. Bei der zunächst durchgeführten Charakterisierung der käuflich erhältlichen monoklonalen cFLIP-Antikörper mittels cFLIP-überexprimierenden HaCaT-Keratinozyten wurde überraschenderweise die fehlende Spezifität eines Antikörpers (KlonEPR8438(2)) nachgewiesen, was zur Folge hatte, dass der Hersteller die Produktion nach Mitteilung der Befunde eingestellt hat. Daher wurden die weiteren Untersuchungen unter Verwendung des Antikörper-Klons G11, der sowohl im Western Blot als auch immunhistochemisch die beiden cFLIP-Splicevarianten cFLIPL und cFLIPS spezifisch nachweist, durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass cFLIP in epithelialen Hauttumoren in erheblichem Maß exprimiert wird. In jeweils 40% der untersuchten aktinischen Keratosen und Morbi Bowen konnte cFLIP nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu zeigte sich in den fortgeschrittenen Formen epithelialer Hauttumoren eine deutlich höhere Expressionsrate. Eine Expression wiesen zudem 100% der untersuchten Keratoakanthome und 95% der Plattenepithelkarzinome (mit überwiegend gutem Differenzierungsgrad) auf. Dementsprechend war es nicht verwunderlich, dass alle untersuchten Metastasen von Plattenepithelkarzinomen cFLIP überexprimierten. Die Analyse melanozytärer Läsionen ergab, dass cFLIP in melanozytären Nävi wie auch superfiziell spreitenden Melanomen, Lentigo-maligna-Melanomen und akral lentiginösen Melanomen nur in einer sehr geringen Anzahl der untersuchten Präparate überexprimiert wurde. Erstaunlicherweise konnte jedoch in 65% der nodulären Melanome sowie in 60% der Melanommetastasen cFLIP nachgewiesen werden. Bezüglich der Expression von cFLIP im Primärtumor sowie der Metastase desselben Patienten konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die frühe Hemmung des extrinsischen Apoptoseweges durch das antiapoptotische Protein cFLIP an der Entstehung, dem Wachstum und möglicherweise der Metastasierung epithelialer Hauttumore beteiligt sein dürfte. Die auffallend hohe Expressionsrate im nodulären Melanom sowie den untersuchten Melanommetastasen könnte einen zukünftigen therapeutischen Angriffspunkt darstellen. N2 - It is already known, that cFLIP is an effective inhibitor of death receptor-mediated apoptosis. Due to its ability to block one of the most proximal steps of the extrinsic apoptotic cascade, every kind of dysregulation concerning cFLIP may have serious consequences for tissue homeostasis. Therefore, it is possible that cFLIP-mediated prevention of death receptor-mediated apoptosis represents one critical step during the development of malignancy. In the present study, the expression of cFLIP was examined by immunohistochemistry in a panel of 110 epithelial and 140 melanocytic skin lesions. Therefore, we used the purchased monoclonal mouse antibody clone G11 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg). cFLIP expression was undetectable in all analyzed basal cell carcinomas, whereas both actinic keratosis and Bowen’s disease (8/20 (40%)) were positive for cFLIP. Consistent to previous data, all 20 (100 %) keratoacanthomas were positive for cFLIP, too. Furthermore, almost all (19/20 (95%)) squamous cell carcinomas were positive for cFLIP as well as 10/10 (100 %) metastases of squamous cell carcinomas. Melanocytic nevi expressed cFLIP (7/20 (35 %)). In Melanoma, cFLIP expression was different in melanoma subtypes and type of tissue. While only 15% of superficial spreading melanomas and 10 % of lentigo-maligna melanomas were positive, 25% of acral lentiginous melanomas were positive for cFLIP expression. The majority (13/20 (64 %)) of nodular melanomas and of melanoma metastases (12/20 (60 %)) were positive for cFLIP. Additionally, we examined cFLIP expression in ten primary melanomas as well as one of their regional lymph node/skin metastases. Due to the small sample size and the heterogeneity of analyzed primary melanomas/metastases a connection between expression of cFLIP in primary tumors and metastases could neither be proved nor denied and needs to be elucidated in more detail. In conclusion, our study confirms that cFLIP expression is selectively detected in different melanocytic and epithelial skin lesions. In respect to the high proportion of melanoma metastase and metastases of squamous cell carcinomas, our findings demonstrate that cFLIP may be implicated in tumor development and progression and therefore could serve as a biomarker or as a target for future therapies. KW - Melanom KW - Plattenepithelcarcinom KW - Apoptose KW - Signaltransduktion KW - Immunhistochemie KW - cFLIP KW - Apoptoseresistenz KW - extrinsischer Signalweg Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209918 ER - TY - THES A1 - Hübner, Lisa-Christina T1 - Bedeutung von neuroendokrinen Zellen für die Signalübertragung an sensorischen Nervenfasern in den Atemwegen T1 - Importance of neuroendocrine cells in the respiratory tracts of mice which connect to sensory nervous fibers N2 - Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, neuroendokrine Zellen in den Atemwegen bei Mäusen zu untersuchen, welche Kontakt zu sensorischen Nervenfasern ausbilden. In vorangegangenen Versuchen konnte bereits die Menge des ausgeschütteten CGRPs nach Stimulation mit Bitterstoffen bestimmt werden. Die Methode zur Messung der Freisetzung von CGRP aus verschiedenen Organen wurde von Prof. Reeh und seiner Arbeitsgruppe etabliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, woher das ausgeschüttete CGRP kommt und ob die Stimulation von Bürstenzellen mit Bitterstoffen zur Ausschüttung von CGRP aus den neuroendokrinen Zellen führt. Anhand der elektronenmikroskopischen Auswertung und der dreidimensionalen Rekonstruktion konnte gezeigt werden, dass es Kontakt zwischen den neuroendokrinen Zellen im Epithel der Trachea und sensorischen Nervenfasern gibt. Die immunhistochemischen Versuche zeigten, dass es nach Stimulation mit Denatonium höchstwahrscheinlich zur Ausschüttung von CGRP durch die intraepithelialen Fasern gekommen ist. Diese Annahme spiegelt sich in der veränderten Morphologie sowie der geringeren Quantität der intraepithelialen Fasern nach Stimulation mit Denatonium deutlich wider. Dass es weder bei der Anzahl der neuroendokrinen Zellen, noch bei der Erscheinung und Anzahl der extraepithelialen Fasern nach Denatoniumstimulation zu einer Veränderung gekommen ist, unterstützt diese Annahme ebenfalls. Im Hinblick auf die durchgeführten Versuche mit den TRPM5-gendefizienten Mäusen zeigte sich, dass die Stimulation mit Denatonium keine Auswirkungen auf die Anzahl der neuroendokrinen Zellen hatte. Dieses Ergebnis unterstützt die Erkenntnisse der vorangegangenen Untersuchungen, welche gezeigt haben, dass das CGRP nicht von den neuroendokrinen Zellen ausgeschüttet wurde. Des Weiteren lässt das Ergebnis darauf schließen, dass die Ausschüttung von CGRP nicht abhängig von der Anwesenheit von Bürstenzellen ist. Insgesamt zeigen die Untersuchungen, dass es nach Stimulation mit Bittersubstanzen zu einer CGRP-Ausschüttung durch die intraepithelialen Fasern gekommen ist. Interessant wäre es weiterhin zu klären, welche Effekte diese Ausschüttung bewirkt und welche Bedeutung der Freisetzung von Substanz P in diesem Zusammenhang zukommt. N2 - This thesis focused on the objective to investigate the neuroendocrine cells in the respiratory tracts of mice which connect to sensory nervous fibers. In the preceding trials it was possible to determine the amount of the released CGRP after the stimulation with bitter substances. The method of measuring the release of CGRP from a variety of organs was established by Prof. Reeh and his working group. The aim of this work was to investigate where the released CGRP originates from and if the stimulation of brush cells with bitter substances leads to the release of CGRP in the neuroendocrine cells. Based on the electron-microscopic analysis and the three dimensional reconstruction, a correlation between the neuroendocrine cells in the epithelium of mice trachea and the sensory nervous fibers was observed. The immunhistochemical examinations displayed that the stimulation with Denatonium most probably leads to the release of CGRP through intraepithelial fibers. This presumption is reflected in the changed morphology as well as the lower quantity of intraepithelial fibers after the stimulation with Denatonium. Furthermore, the presumption is supported by the fact that neither the number of neuroendocrine cells, nor the appearance and number of extraepithelial fibers led to a change after denationium stimulation. With regards to the executed trials with TRPM5 gene-deficient mice it was observed that the stimulation with Denatonium does not impact the number of neuroendocrine cells. This again supports the finding of the previous trials which showed that CGRP was not released by neuroendocrine cells. Moreover, it can be concluded from this result that the release of CGRP is independent from the existence of brush cells. Overall the trials showed that the release of CGRP through intraepithelial fibers was triggered by the stimulation with bitter substances. Based on these results it would be interesting to investigate the effects of the release and to understand the role of substance P in this correlation. KW - Luftröhre KW - Luftröhrenschleimhaut KW - Signaltransduktion KW - Neuroendokrine Zellen KW - Signalübertragung KW - Trachea KW - neuroendocrine cells KW - signal transmission Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207517 ER - TY - THES A1 - Heitmann, Johanna Friederike T1 - Signaltransduktionsweg nach rtPA-Behandlung im peripheren Nerven zur Barrierenöffnung für hydrophile Analgetika in der Regionalanästhesie T1 - Signaling pathway of rtPA for drug delivery of hydrophilic analgesics to the peripheral nerve for nociception-specific regional analgesia N2 - Zur Durchführung peripherer Nervenblockaden werden im klinischen Alltag nichtselektive Lokalanästhetika verwendet, die neben sensorischen auch motorische Nervenfasern blockieren. Diese Arbeit untersucht und beschreibt Grundlagen für die Verwendung selektiv wirksamer Co-Analgetika. Ziel dieser Arbeit war in diesem Kontext die Analyse der intrazellulären Signalwege, welche nach Applikation von rtPA am peripheren Nerven zur Öffnung der perineuralen Barriere und so zu einer opiat- vermittelten Analgesie führen. Gemäß unserer Hypothese bindet rtPA an den LRP-1- Rezeptor und löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus: Erk wird phosphoryliert und inhibiert über bislang unklare Mechanismen die Claudin-1-Transkription. Claudin-1 wird weniger in die Zellmembran eingebaut und/oder verlässt durch Endozytose/ Internalisierung die Zellmembran, was zur Öffnung der perineuralen Barriere führt und den Durchtritt selektiv wirksamer Analgetika erlaubt. In der späteren Phase steht die Analyse der Wiederherstellung der Barrierefunktion der Zellmembran im Vordergrund. Die ist von zentraler Bedeutung um eine Schädigung des Nervens durch das Umgebungsmilieu zu verhindern. Vermutlich wird die Wiederherstellung der Barrierefunktion über den Wnt-Signalweg gesteuert. Die Akkumulation von b-Catenin und Cdx2 führt zu einem erneuten Anstieg der Claudin-1-Transkription. Der Claudin-1- Gehalt steigt in Western Blot-Untersuchungen jedoch bereits zu einem früheren Zeitpunkt in der Zellmembran wieder an. Dies legt nahe, dass weitere von der Transkription unabhängige Mechanismen zur Wiederherstellung der Barrierefunktion beitragen. Eine mögliche Alternative zu rtPA stellt katalytisch inaktives rtPAi dar, welches in Untersuchungen ähnliche Ergebnisse wie rtPA zeigte. Dabei könnte die Verwendung von rtPAi anstatt rtPA pathophysiologisch denkbare Komplikationen wie beispielsweise Blutungen verhindern. In Versuchen anderer Mitglieder der Arbeitsgruppe wurde die Öffnung der perineuralen Barriere mittels immunhistochemischer und funktioneller Untersuchungen bestätigt. Auch konnten keine akute Neurotoxizität oder Blutungsgefahr beobachtet werden. Somit stellt rtPA in Kombination mit Opioiden eine mögliche Alternative zur Verbesserung der postoperativen Analgesie dar, die jedoch weiterer Untersuchungen hinsichtlich von Nutzen, Risiken und Nebenwirkungen bedarf. N2 - Regional postoperative pain treatment with non-selective local anesthetics does not only block nociception but also the motoric function of the nerve. This thesis describes and examines principles for the utilization of selective co-analgesics. Aim of this study was to analyze the intracellular signaling-pathways after application of rtPA to the peripheral nerve. The application leads to an opening of the blood-nerve-barrier and to an opioid-mediated analgesia. We postulate that rtPA binds to the LRP-1-receptor and leads via phosphorylation of Erk to a downregulation of Claudin-1-transcription. The mechanism of downregulation is unknown. Claudin-1 is less incorporated into the cell membrane and/or it is removed by endocytosis. This leads to an opening of the blood- nerve-barrier and hydrophilic analgesics like opioids can reach the nerve. After the opening of the barrier we analyzed the mechanisms which lead to a restitution of the barrier-function. This step is important to assure that the nerve is protected from the environment. Our theory is that the Wnt-signaling-pathway is responsible for reestablishing the barrier. An accumulation of b-Catenin and Cdx2 leads to a resumption of Claudin-1-transcription. However Western Blot investigations showed an earlier rise of Claudin-1 in the cell-membrane. This indicates that there are other, from transcription independent mechanisms, that lead to restitution of the barrier-function. Catalytic inactive rtPAi is a promising alternative to rtPA as it shows similar effects without possible side effects like bleedings. Immunohistochemistry and behavioral tests performed by other members of the group confirmed the opening of the blood-nerve-barrier after application of rtPA. No acute neurotoxicity or bleedings have been observed. Therefore, we postulate that rtPA in combination with opioids is an interesting new alternative to mediate postoperative analgesia. However, we still need further investigations to learn more about the benefit, risks and side effects of rtPA application to the peripheral nerve. KW - Schmerz KW - Therapie KW - Analgesie KW - Signaltransduktion KW - Nerven KW - Blut-Nerven-Barriere KW - Co-Analgetika KW - rtPA Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205177 ER - TY - THES A1 - Kreckel, Jennifer T1 - Das Adapterprotein TRAF2 und seine Bedeutung für die Todesrezeptor-vermittelte Signaltransduktion T1 - The adaptor protein TRAF2 and its meaning for the death receptor induced signal transduction N2 - Während die Rolle des tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in der Signaltransduktion der TRAF-interagierenden Rezeptoren der TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) bereits in der Vergangenheit umfassend erforscht wurde, ist die Rolle und Funktion dieses Adapterproteins für die Signalgebung der Todesrezeptoren nicht vollständig aufgeklärt. Die unklare Funktion der Really Interesting New Gene (RING) E3 Ligase Domäne in TRAF2 und die Abhängigkeit von Caspasen für die Aktivierung des klassischen nuclear factor κB (NFκB)-Signalweges führten in dieser Arbeit zur Herstellung von CRISPR/Cas9 knockout (KO) Zellen, bei denen TRAF2 in der Kolorektalkarzinomzelllinie HCT116 als auch in den Fibrosarkomzellen HT1080 ausgeschaltet wurde. Diese Zellen wurden zuvor so modifiziert, dass die Apoptose „downstream“ der Caspase-8-Aktivierung nicht weiter induzierbar war. HCT116-Zellen exprimierten hierzu ein mutiertes Allel der Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) und HT1080-Bcl2-TNFR2 Zellen das anti-apoptotische Protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2). Im Fokus dieser Arbeit waren die Todesrezeptoren TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 und Cluster of Differentiation(CD)95. In den TRAF2-KO Zelllinien war der alternative NFκB Signalweg konstitutiv aktiv und der TNFR1-induzierte klassische NFκB-Signalweg inhibiert. Die proinflammatorische Signalgebung in Form der Interleukin (IL)8 Produktion war in den CD95-artigen Todesrezeptoren signifikant, aber nicht vollständig, reduziert und erfolgte Caspase-8-Aktivität unabhängig. Der Effekt der TRAF2-Deletion konnte durch eine Rekonstitution von TRAF2, jedoch nicht durch eine Überexpression von TRAF1 wiederhergestellt werden. Des Weiteren führte die TRAF2-Defizienz zu einer verstärkten Procaspase-8- Prozessierung nach Aktivierung von Todesrezeptoren, die überraschenderweise mit einer Reduktion der Caspase-8-Aktivität einherging. Die Prozessierung der Procaspase-8, jedoch nicht die Aktivierung des klassischen NFκB-Signalweges wurde vermutlich durch eine verringerte Rekrutierung von cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP)1 an den TNFR1 erreicht. Die Expression der anti-apoptotischen Proteine FADD-like ICE (FLICE) Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) und cIAP1 wurde nicht von der TRAF2-Depletion beeinflusst. Somit konnte in dieser Arbeit ein nicht-obligatorischer Effekt von TRAF2 auf die Regulation der proinflammatorischen Todesrezeptor-vermittelten Signaltransduktion nachgewiesen werden, die durch TRAF1 nicht ersetzt werden kann. Des Weiteren wurde eine bisher nicht beschriebene, stabilisierende Wirkung von TRAF2 auf die Capsase-8-Aktivität gezeigt. N2 - The role of tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in signaltransduction of TRAF-interacting receptors of the TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) is well-studied during the last decades. The role and the function of this adapter protein for the signaling of death receptors, however, still remains largely unclear. Ambiguous E3 ligase function of their TRAF2-Really Interesting New Gene (RING) domain and the dependency from caspase-8 for classical nuclear factor κB (NFκB) activation resulted in this work in the generation of TRAF2-Knockout (KO) CRISPR/Cas9 cells both in the colorectal carcinoma cell line HCT116 and in the fibrosarcoma cell line HT1080. These cell lines were previously modified to gain apoptosis-resistance downstream the activation of caspase-8. Therefore, HCT116 cells expressed a mutated allele of the phosphoinositide-3-kinase (PI3K) and HT1080-TNFR2 cells expressed the anti-apoptotic protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2). Focus of this study was the death receptors TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 and Cluster of Differentiation (CD)95. TRAF2-KO cells displayed a constitutive active alternative NFκB pathway and inhibition of the TNFR1-induced classical NFκB pathway. The stimulation of proinflammatory signaling in the form of upregulation of interleukin (IL)8 production was reduced partially but significantly in CD95-type death receptors and in a caspase-8-activity independent way. The reconstitution of TRAF2 but not an overexpression of TRAF1 was able to reverse the effects of TRAF2 deficiency. Additionally, the TRAF2-depletion increased DR-induced procaspase-8-processing, surprisingly resulting in the downregulation of caspase-8-activity. Processing of procaspase-8, but not the activation of the classical NFκB-pathway were presumably achieved by an inhibition of the recruitment of cellular inhibitor of apoptosis protein 1 (cIAP1) to the TNFR1. Expression of the anti-apoptotic proteins FLICE Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) and cIAP1 were unaffected by TRAF2-depletion. Taken together, this work was able to show a non-obligate effect of TRAF2 in the regulation of DR-induced proinflammatory signaling, which was not restorable by TRAF1. Furthermore, we saw a stabilizing effect of TRAF2 on caspase-8 activity, which was not described previously. KW - Adapterproteine KW - TRAF KW - Signaltransduktion KW - TRAF2 KW - Todesrezeptor Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200384 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Nadine T1 - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen T1 - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates N2 - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht. Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht. Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat. Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren. Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen. Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein. N2 - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species. In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera. To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate. Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions. To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops. Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms. KW - Dattelpalme KW - Gerste KW - Elektrophysiologie KW - Hitzestress KW - Schließzelle KW - Anionenkanal KW - Zuckertransporter KW - SLAC1 KW - SUT1 KW - Signaltransduktion KW - ZmSUT1 KW - Phoenix dactylifera KW - Hordeum vulgare KW - Zea mays Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491 ER - TY - THES A1 - Kaltdorf, Martin Ernst T1 - Analyse von regulatorischen Netzwerken bei Zelldifferenzierung und in der Infektionsbiologie T1 - Analysis of Regulatory Networks during Cell Differentiation and in Infection Biology N2 - Das zentrale Paradigma der Systembiologie zielt auf ein möglichst umfassendes Ver-ständnis der komplexen Zusammenhänge biologischer Systeme. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden folgen diesem Grundsatz. Am Beispiel von drei auf Basis von Datenbanken und aktueller Literatur rekonstruier-ten Netzwerkmodellen konnte in der hier vorliegenden Arbeit die Gültigkeit analyti-scher und prädiktiver Algorithmen nachgewiesen werden, die in Form der Analy-sesoftware Jimena angewandt wurden. Die daraus resultierenden Ergebnisse sowohl für die Berechnung von stabilen Systemzuständen, der dynamischen Simulation, als auch der Identifikation zentraler Kontrollknoten konnten experimentell validiert wer-den. Die Ergebnisse wurden in einem iterativen Prozess verwendet werden um das entsprechende Netzwerkmodell zu optimieren. Beim Vergleich des Verhaltens des semiquantitativ ausgewerteten regulatorischen Netzwerks zur Kontrolle der Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Chondrozyten (Knorpelbildung), Osteoblasten (Knochenbildung) und Adipozyten (Fett-zellbildung) konnten 12 wichtige Faktoren (darunter: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) mit Hilfe der Berechnung der Bedeutung (Kontrollzentralität der Netzwerkknoten identifi-ziert werden). Der Abgleich des simulierten Verhaltens dieses Netzwerkes ergab eine Übereinstimmung mit experimentellen Daten von 47,2%, bei einem widersprüchlichen Verhalten von ca. 25%, dass unter anderem durch die temporäre Natur experimentel-ler Messungen im Vergleich zu den terminalen Bedingungen des Berechnung der stabilen Systemzustände erklärt werden kann. Bei der Analyse des Netzwerkmodells der menschlichen Immunantwort auf eine Infek-tion durch A. fumigatus konnten vier Hauptregulatoren identifiziert werden (A. fumi-gatus, Blutplättchen, hier Platelets genannt, und TNF), die im Zusammenspiel mit wei-teren Faktoren mit hohen Zentralitätswerten (CCL5, IL1, IL6, Dectin-1, TLR2 und TLR4) fähig sind das gesamte Netzwerkverhalten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Aktivitätsverhalten von IL6 in Reaktion auf A. fumigatus und die regulato-rische Wirkung von Blutplättchen mit den entsprechenden experimentellen Resultaten deckt. Die Simulation, sowie die Berechnung der stabilen Systemzustände der Immunantwort von A. thaliana auf eine Infektion durch Pseudomonas syringae konnte zeigen, dass die in silico Ergebnisse mit den experimentellen Ergebnissen übereinstimmen. Zusätzlich konnten mit Hilfe der Analyse der Zentralitätswerte des Netzwerkmodells fünf Master-regulatoren identifiziert werden: TGA Transkriptionsfaktor, Jasmonsäure, Ent-Kaurenoate-Oxidase, Ent-kaurene-Synthase und Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase. Während die ersteren beiden bereits lange als wichtige Regulatoren für die Gib-berellin-Synthese bekannt sind, ist die immunregulatorische Funktion von Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase bisher weitgehend unbekannt. N2 - The central paradigm of systems biology aims at a comprehensive understanding in complex relationships of biological systems. The methods used in this work support this aim. By the example of three network models reconstructed on the basis of databases and current literature, the validity of analytical and predictive algorithms could be demon-strated in this work. As simulation software the framework Jimena was applied. The results for the calculation of stable system states, the dynamic simulation as well as the identification of central control nodes could be validated experimentally. The re-sults were used in an iterative process to further optimize the corresponding network model. Comparing the behavior of the semi-quantitatively evaluated regulatory network to control the differentiation of human mesenchymal stem cells into chondrocytes (carti-lage formation), osteoblasts (bone formation) and adipocytes (fatty cell formation), 12 important factors (including: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) could be identified by the calculation of the control centralities of the network nodes. The comparison of the simulated behavior of these nodes showed an agreement with experimental data of 47.2%. We found a contradictory behavior of approximately 25%. Differing results can be explained due to the temporary nature of experimental measurements compared to the terminal conditions of the calculation the stable system states. Analyzing the network model of the human immune response to A. fumigatus infec-tion, four major regulators could be identified (A. fumigatus, platelets, and TNF), which interact with other factors with high control centrality values (CCL5, IL1, IL6, Dectin1). TLR2 and TLR4) are capable of affecting the overall network behavior. It could be shown that the activity behavior of IL6 in response to the modular activity of the plate-lets as well as A. fumigatus coincides with the corresponding experimental results. The simulation, as well as the calculation of the stable system states of the immune response of A. thaliana to an infection by Pseudomonas syringae, showed that in silico results are in agreement with the experimental results. By analyzing the control cen-trality values of the network model, five main regulators could be: TGA transcription factor, jasmonic acid, ent-kaurene-Oxidase, ent-kaurene synthase and aspartate semi-aldehyde. While the former two have long been recognized as important regulators of gibberel-lin synthesis, the immunoregulatory function of aspartate semialdehyde dehydrogen-ase has been largely unknown. KW - Netzwerksimulation KW - Immunbiologie KW - Zelldifferenzierung KW - Systembiologie KW - Signaltransduktion KW - Mesenchymale Stammzelldifferenzierung KW - Netzwerkrekonstruktion KW - network simulation KW - network reconstruction KW - immunology KW - mesenchymal stem cell differentiation KW - signal transduction Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-198526 ER - TY - THES A1 - Seibold, Marcel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom T1 - Functional characterization of the Ras family small GTP binding protein RAL in multiple myeloma N2 - Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird. N2 - Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasia which is characterized by monoclonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to hematopoetic failure, bone lesions and renal failure. Although continuous development of existing therapeutics and new therapeutic options vastly improved MM patient survival, MM still remains an incurable disease. Oncogenic mutations and the bone marrow microenvironment contribute to a signaling network which sustains MM cell proliferation and survival. Within this network mutations of the RAS oncogene account for up to 50 % of MM patients. Despite its prevalence and importance not only in MM, RAS still remains undruggable. The GTPase-family Member RAL is considered as a RAS effector which might also influence maintainance of tumor cell survival. In several tumor entities RAL is overexpressed in tumor cells and influences proliferation and apoptosis. Therefore, in MM RAL might also be controlled by oncogenic RAS and mediate cell survival of tumor cells. In this work, RAL’s functional role as well as the potential interconnection with oncogenic RAS was investigated. In MM cells RAL is ovexpressed compared to non-malignant MGUS or plasma cells. Knockdown analyses showed that RAL is essential for MM cell survival. These survival effects are transferred independently of MAPK/ERK signaling as shown by Western Blot analysis. However, to some extent RAL influenced MM cell survival dependently of AKT activity. Because RAL knockdown had a significant effect on MM cell survival a pharmacological inhibition was tested using the inhibitor RBC8. In a portion of MM cell lines RBC8 exerts effects on cell survival. But the effects of RBC8 on RAL activation were only visible at higher concentrations as shown by pulldown assays. Thus, subsequent development of potent RAL inhibitors is of major importance for clinical translation. To investigate whether RAL is directly activated by oncogenic RAS, RAL pulldown assays were performed after knockdown of oncogenic RAS. Strikingly, there was no direct connection between the presence of oncogenic RAS and RAL activation. Furthermore, gene expression profiles after RAS or RAL knockdown showed differing expression signatures. Potential effectors of RAL which might also influence MM cell survival were investigated in mass spectrometric analyses where the exocyst complex components EXO84 and SEC5 were identified as RAL interaction partners. Since RAL is of importance for MM cell survival, RAL knockdown was combined with clinically relevant agents. There was an enhanced induction of apoptosis upon combination of PI3K or AKT inhibitors with RAL knockdown. Taken together, the influence of RAL as a crucial mediator of MM cell survival was shown in this work. Therefore, RAL represents a potential therapeutic target which is regulated independently of oncogenic RAS. KW - Kleine GTP-bindende Proteine KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - RAL KW - Multiples Myelom KW - Zellüberleben KW - Knochenmark Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208003 ER -