TY  - JOUR
A1  - Schäfer, Simon
A1  - Weibel, Stephanie
A1  - Donat, Ulrike
A1  - Zhang, Qian
A1  - Aguilar, Richard J.
A1  - Chen, Nanhai G.
A1  - Szalay, Aladar A.
T1  - Vaccinia virus-mediated intra-tumoral expression of matrix metalloproteinase 9 enhances oncolysis of PC-3 xenograft tumors
N2  - Background: Oncolytic viruses, including vaccinia virus (VACV), are a promising alternative to classical mono-cancer treatment methods such as surgery, chemo- or radiotherapy. However, combined therapeutic modalities may be more effective than mono-therapies. In this study, we enhanced the effectiveness of oncolytic virotherapy by matrix metalloproteinase (MMP-9)-mediated degradation of proteins of the tumoral extracellular matrix (ECM), leading to increased viral distribution within the tumors. Methods: For this study, the oncolytic vaccinia virus GLV-1h255, containing the mmp-9 gene, was constructed and used to treat PC-3 tumor-bearing mice, achieving an intra-tumoral over-expression of MMP-9. The intra-tumoral MMP-9 content was quantified by immunohistochemistry in tumor sections. Therapeutic efficacy of GLV-1h255 was evaluated by monitoring tumor growth kinetics and intra-tumoral virus titers. Microenvironmental changes mediated by the intra-tumoral MMP-9 over-expression were investigated by microscopic quantification of the collagen IV content, the blood vessel density (BVD) and the analysis of lymph node metastasis formation. Results: GLV-1h255-treatment of PC-3 tumors led to a significant over-expression of intra-tumoral MMP-9, accompanied by a marked decrease in collagen IV content in infected tumor areas, when compared to GLV-1h68-infected tumor areas. This led to considerably elevated virus titers in GLV-1h255 infected tumors, and to enhanced tumor regression. The analysis of the BVD, as well as the lumbar and renal lymph node volumes, revealed lower BVD and significantly smaller lymph nodes in both GLV-1h68- and GLV-1h255- injected mice compared to those injected with PBS, indicating that MMP-9 over-expression does not alter the metastasis-reducing effect of oncolytic VACV. Conclusions: Taken together, these results indicate that a GLV-1h255-mediated intra-tumoral over-expression of MMP-9 leads to a degradation of collagen IV, facilitating intra-tumoral viral dissemination, and resulting in accelerated tumor regression. We propose that approaches which enhance the oncolytic effect by increasing the intra-tumoral viral load, may be an effective way to improve therapeutic outcome.
KW  - Biochemie
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78220
ER  - 
TY  - THES
A1  - Linder, Bastian
T1  - Systemischer Spleißfaktormangel im Zebrafisch Danio rerio – Etablierung und Charakterisierung eines Tiermodells für Retinitis pigmentosa
T1  - Systemic splicing factor deficiency causes tissue-specific defects: a zebrafish model for retinitis pigmentosa
N2  - Retinitis pigmentosa (RP) ist eine vererbte Form der Erblindung, die durch eine progressive Degeneration von Photorezeptorzellen in der Retina verursacht wird. Neben „klassischen“ RP-Krankheitsgenen, die direkt oder indirekt mit dem Sehprozess und der Aufrechterhaltung der Photorezeptoren in Verbindung stehen, können auch Mutationen in Genen für konstitutive Spleißfaktoren zur Photorezeptordegeneration führen. RP kann daher als Paradebeispiel einer Erkrankung mit paradoxer Gewebespezifität angesehen werden: Defekte in essentiellen und ubiquitär exprimierten Genen führen zu einem Phänotyp, der nur wenige Zelltypen betrifft. Um Einblicke in diesen außergewöhnlichen Pathomechanismus zu erhalten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Tiermodell für Spleißfaktor-vermittelte RP im Zebrafisch Danio rerio etabliert. Zunächst wurde gezeigt, dass eine RP verursachende Punktmutation des Spleißfaktors Prpf31 auch in dessen Zebrafisch-Homolog zu einem Verlust der physiologischen Aktivität führt. Als Modell für die Prpf31-Mangelsituation diente dann die durch ein Antisense-Morpholino induzierte partielle Reduktion der Prpf31-Expression in Zebrafischlarven. Konsistent mit einem RP-Phänotyp zeigte sich in diesen Larven eine starke Beeinträchtigung des Sehvermögens. Sie wurde – ebenfalls analog zu RP – durch defekte Photorezeptoren verursacht, die bei ansonsten normal entwickelter Retina eine deutlich veränderte Morphologie aufwiesen. Daraufhin konnten in einer genomweiten Transkriptomanalyse der Augen von Prpf31-defizienten Larven erstmals in vivo photorezeptorspezifische Gene identifiziert werden, deren Expression durch den Mangel an Prpf31 beeinträchtigt war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob es neben den bereits bekannten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren gibt, deren Defekt die Degeneration von Photorezeptoren auslösen kann. Dazu wurde in Zebrafischlarven ein Mangel an Prpf4 erzeugt, einem Spleißfaktor, der bislang nicht mit RP in Verbindung gebracht worden war. Der Phänotyp dieser Fische war nicht von dem des Prpf31 RP-Modells zu unterscheiden. Dies lieferte einen Hinweis darauf, dass auch Defekte in Prpf4 in der Lage sein könnten, RP auszulösen. Tatsächlich konnte durch genetisches Screening ein RP-Patient mit einer Punktmutation in Prpf4 identifiziert werden (Kollaboration mit Hanno Bolz, Universität Köln). Die biochemische Analyse dieser Mutation zeigte, dass sie zu einem Defekt der Integration von Prpf4 in spleißosomale Untereinheiten und zu dessen Funktionsverlust in vivo führt. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Tiermodell konnte zum ersten Mal in vivo ein von Spleißfaktor-Mutationen verursachter Pathomechanismus von Retinitis pigmentosa nachvollzogen werden. Die vom Prpf31-Mangel betroffenen Photorezeptortranskripte stellen vielversprechende Kandidaten für die Vermittlung der Gewebespezifität dar und unterstützen die Hypothese, dass ihre ineffiziente Prozessierung den RP-Phänotyp auslöst. Die Entdeckung eines weiteren Spleißfaktors, dessen Defizienz ebenfalls zu defekten Photorezeptoren führt, zeigt, dass offenbar der Funktionsverlust des Spleißosoms generell in der Lage ist, die Degeneration dieser Zellen zu verursachen. Dies ist nicht zuletzt auch von klinischer Relevanz, da vermutet werden kann, dass sich unter den vielen bisher nicht identifizierten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren befinden.
N2  - Retinitis pigmentosa (RP) is a hereditary eye disease marked by the progressive degeneration of photoreceptor cells in the retina. Typical RP disease gene products are involved in visual function or photoreceptor maintenance. However, also mutations in constitutive splicing factors have been shown to cause this type of photoreceptor degeneration. In humans, almost all transcripts need to be processed by the spliceosome and hence its constitutive components are considered to be essential in all cells of the body. RP therefore serves as a paradigm for diseases with a tissue specificity paradox: Defects in essential and ubiquitously expressed genes lead to a phenotype that affects only a small subset of cells or tissues. To gain insight into this unusual etiology, an animal model for splicing factor-linked RP was established in the zebrafish Danio rerio. First, it was shown that an RP-causing missense mutation in the splicing factor Prpf31 leads to a loss of its physiological activity not only in humans, but likewise in zebrafish. The resulting splicing factor deficiency was then modeled in zebrafish embryos by the injection of an antisense morpholino that blocked Prpf31 translation. Consistent with an RP-like phenotype, partial silencing of Prpf31 led to a marked reduction in visual function. This was – again similar to what is observed in RP – caused by severe photoreceptor defects, as these cells presented a highly aberrant morphology in an otherwise normal retina. Consequently, a genome-wide transcriptome analysis of these animals for the first time resulted in the identification of photoreceptor-specific transcripts which show altered expression in vivo due to Prpf31 deficiency. The second part of this work followed the hypothesis that mutations in other splicing factors may likewise elicit photoreceptor degeneration. Therefore, the splicing factor Prpf4, which was not linked to RP prior to this work, was silenced in zebrafish embryos by the injection of an antisense morpholino. The phenotype of these fish was indistinguishable from the Prpf31 RP-model. Defects in Prpf4 might hence be able to cause the degeneration of photoreceptors. Consistent with this, an RP patient with a missense mutation of Prpf4 was identified (in collaboration with Hanno Bolz, University of Cologne). The biochemical analysis of this mutation revealed that it leads to a defect in the integration of Prpf4 into spliceosomal subunits and to its loss of function in vivo. The animal model established in this work for the first time allowed studying the etiology of splicing factor-linked RP in photoreceptors in vivo. The photoreceptor transcripts affected by Prpf31 deficiency are promising candidates for mediating the tissue-specificity of the disease and support the hypothesis that their inefficient processing triggers the RP-phenotype. The identification of another splicing factor, whose deficiency leads to defective photoreceptors, shows that a loss of spliceosomal function in general is able to cause the degeneration of these cells. This is also of clinical relevance, as it shows that the large list of unknown RP disease genes might include even more splicing factors.
KW  - RNS-Spleißen
KW  - Spleißen
KW  - Spleißosom
KW  - Retinopathia pigmentosa
KW  - Tiermodell
KW  - Zebrabärbling
KW  - RNA Spleißen
KW  - Zebrafisch
KW  - Tiermodell
KW  - Retinitis pigmentosa
KW  - Biochemie
KW  - pre-mRNA splicing
KW  - zebrafish
KW  - animal model
KW  - Retinitis pigmentosa
KW  - biochemistry
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69965
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kober, Franz-Xaver Wilhelm
T1  - Molecular insights into the protein disulfide isomerase family
T1  - Molekulare Mechanismen der Protein Disulfid Isomerase Familie
N2  - Upon synthesis, nascent polypeptide chains are subject to major rearrangements of their side chains to obtain an energetically more favorable conformation in a process called folding. About one third of all cellular proteins pass through the secretory pathway and undergo oxidative folding in the endoplasmic reticulum (ER). During oxidative folding, the conformational rearrangements are accompanied by the formation of disulfide bonds – covalent bonds between cysteine side chains that form upon oxidation. Protein disulfide isomerase (PDI) assists in the folding of substrates by catalyzing the oxidation of pairs of cysteine residues and the isomerization of disulfide bonds as well as by acting as chaperones. In addition to PDI itself, a family of related ER-resident proteins has formed. All PDI family members share the thioredoxin fold in at least one of their domains and exhibit a subset of the PDI activities. Despite many studies, the role of most PDI family members remains unclear. The project presented in this thesis was aimed to establish tools for the biochemical characterization of single members of the PDI family and their role in the folding process. A combination of fluorescence based assays was developed to selectively study single functions of PDI family members and relate their properties of either catalysis of oxidation or catalysis of isomerization or chaperone activity to the rest of the protein family. A binding assay using isothermal titration calorimetry (ITC) was established to complement the activity assays. Using ITC we could show for the first time that members of the PDI family can distinguish between folded and unfolded proteins selectively binding the latter. The unique information provided by this method also revealed a two-site binding of unfolded proteins by PDI itself. In addition to the functional characterization, experiments were conducted to further investigate the oligomeric state of PDI. We could show that the equilibrium between structurally different states of PDI is heavily influenced by the redox state of the protein and its environment. This new data could help to further our understanding of the interplay between oxidases like PDI and their regenerative enzymes like Ero1, which may be governed by structural changes in response to the change in redox status. Another structural approach was the screening of all investigated PDI family members for suitable crystallization conditions. As a result of this screening we could obtain protein crystals of human ERp27 and were able to solve the structure of this protein with X-ray crystallography. The structure gives insight into the mechanisms of substrate binding domains within the PDI family and helps to understand the interaction of ERp27 with the redox active ERp57. In collaboration with the group of Heike Hermanns we could further show the physiological importance of this interaction under oxidative stress. In conclusion, the project presented in this thesis provides novel tools for an extensive analysis of the activities of single PDI family members as well as a useful set of methods to characterize novel oxidoreductases and chaperones. The initial results obtained with the our novel methods are very promising. At the same time, the structural approach of this project could successfully solve the structure of a PDI family member and give information about the interplay within the PDI family.
N2  - Umlagerungsprozess nennt man Proteinfaltung. Schätzungsweise ein Drittel aller zellulären Proteine werden über den sekretorischen Transportweg geschleust und durchlaufen die oxidative Proteinfaltung im endoplasmatischen Retikulum (ER). Während der oxidativen Faltung werden zusätzlich zur Umlagerung von Seitenketten auch Disulfidbrücken gebildet. Dies sind kovalente Bindungen zwischen Zystein-Seitenketten durch Oxidation entstehen. Protein Disulfid Isomerase (PDI) unterstützt die Faltung von Proteinen im ER indem es die Oxidation zweier Zystein- Seitenketten katalysiert. Neben der Oxidation katalysiert PDI ebenfalls die Isomerisierung von fehlverknüpften Disulfidbrücken und wirkt als Chaperon der Aggregation entgegen. Im Laufe der Evolution hat sich zusätzlich zu PDI eine Gruppe verwandter ER-lokalisierter Proteine gebildet. Diese Mitglieder der PDI-Familie weisen alle das Thioredoxin-Faltungsmotiv in mindestens einer ihrer Domänen auf und besitzen mindestens eine der drei PDI-Aktivitäten. Trotz eingehender Untersuchung ist die Rolle der meisten dieser PDI Familienmitglieder weiterhin unklar. Im Rahmen des Projekts, welches dieser Dissertation zugrunde liegt, wurden Methoden zur biochemischen Charakterisierung einzelner Mitglieder der PDI-Familie, und deren Rolle im Faltungsprozess, entwickelt. Eine Kombination von Fluoreszenzexperimenten wurde etabliert mit der selektiv einzelne Aktivitäten von Faltungshelfern analysiert und qualitativ in die PDI- Familie eingeordnet werde können. Diese fluoreszenzbasierten Methoden wurden durch isothermale Titrationkalorimetrie (ITC) ergänzt. Mit ITC konnten wir als Erste zeigen, dass PDI- Familienmitglieder gefaltete von ungefalteten Proteinen unterscheiden können und letztere selektiv binden. Die zusätzlichen Informationen, die in einem ITC-Experiment gewonnen wurden, zeigten, dass PDI mit Substraten mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Bindungsstellen interagiert. Neben der funktionellen Analyse der PDI-Familie wurde Experimente durchgeführt um den oligomeren Zustand von PDI näher zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass das Gleichgewicht zwischen strukturell verschiedenen Zuständen entscheidend vom Redox-Status von PDI abhängt. Diese neuen Daten werfen ein neues Licht auf die Interaktion zwischen Oxidasen wie PDI und ihren regenerativen Enzymen wie Ero1. Diese Interaktion könnte sehr wohl durch strukturelle Veränderungen, ausgelöst durch Redox-Reaktionen, reguliert werden. Als weiteren strukturellen Ansatz zur Erforschung der PDI-Familie wurden alle verwendeten Familienmitglieder auf aussichtsreiche Kristallisationsbedingungen hin untersucht. Durch dieses Screening konnte ERp27 kristallisiert und seine Struktur durch Röntgenkristallografie aufgeklärt werden. Die so gewonnene Struktur gibt Aufschluss über die Mechanismen der Substratbindung in der PDI- Familie und hilft ebenfalls dabei, die Interaktion zwischen ERp27 und dem redoxaktiven ERp57 besser zu verstehen. Auf Grund dieser Daten konnten wir gemeinsam mit der Gruppe von Heike Hermanns die physiologische Bedeutung dieser Interaktion bei oxidativem Stress aufzeigen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Projektes neue Werkzeuge zur eingehenden Analyse der PDI-Familie etabliert werden, welche auch zur Charakterisierung neuer Oxidoreduktasen und Chaperone verwendet werden können. Die ersten Ergebnisse die mit Hilfe dieser neuen Methoden gewonnen werden konnten sind vielversprechen. Gleichzeitig konnten wir mit ERp27 die Struktur eines weiteren PDI-Familienmitgliedes lösen und so weitere Einblicke in das komplexe Netzwerk der PDI-Familie gewinnen.
KW  - Biochemie
KW  - Proteinfaltung
KW  - Disulfidbrücken
KW  - Protein Disulfid Isomerase
KW  - Biochemistry
KW  - protein folding
KW  - disulfide bonds
KW  - protein disulfide isomerase
KW  - PDI
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72144
ER  -