TY - JOUR A1 - Biscotti, Maria Assunta A1 - Gerdol, Marco A1 - Canapa, Adriana A1 - Forconi, Mariko A1 - Olmo, Ettore A1 - Pallavicini, Alberto A1 - Barucca, Marco A1 - Schartl, Manfred T1 - The Lungfish Transcriptome: A Glimpse into Molecular Evolution Events at the Transition from Water to Land JF - Scientific Reports N2 - Lungfish and coelacanths are the only living sarcopterygian fish. The phylogenetic relationship of lungfish to the last common ancestor of tetrapods and their close morphological similarity to their fossil ancestors make this species uniquely interesting. However their genome size, the largest among vertebrates, is hampering the generation of a whole genome sequence. To provide a partial solution to the problem, a high-coverage lungfish reference transcriptome was generated and assembled. The present findings indicate that lungfish, not coelacanths, are the closest relatives to land-adapted vertebrates. Whereas protein-coding genes evolve at a very slow rate, possibly reflecting a “living fossil” status, transposable elements appear to be active and show high diversity, suggesting a role for them in the remarkable expansion of the lungfish genome. Analyses of single genes and gene families documented changes connected to the water to land transition and demonstrated the value of the lungfish reference transcriptome for comparative studies of vertebrate evolution. KW - lungfish KW - transcriptome KW - genome KW - sarcopterygian fish Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167753 VL - 6 IS - 21571 ER - TY - THES A1 - Eck, Saskia T1 - The impact of thermogenetic depolarizations of specific clock neurons on Drosophila melanogaster's circadian clock T1 - Der Einfluss thermogenetischer Depolarisationen spezifischer Uhrneurone auf Drosophila melanogasters circadiane Uhr N2 - The rotation of the earth around its own axis determines periodically changing environmental conditions, like alterations in light and temperature. For the purpose of adapting all organisms’ behavior, physiology and metabolism to recurring changes, endogenous clocks have evolved, which allow the organisms to anticipate environmental changes. In chronobiology, the scientific field dealing with the investigation of the underlying mechanisms of the endogenous clock, the fruit fly Drosophila melanogaster serves as a beneficial model organism. The fruit fly’s circadian clock exhibits a rather simple anatomical organization, but nevertheless constitutes homologies to the mammalian system. Thus also in this PhD-thesis the fruit fly was used to decipher general features of the circadian clock’s interneuronal communication. Drosophila melanogaster’s circadian clock consists of about 150 clock neurons, which are located in the central nervous system of the fly. These clock neurons can be subdivided regarding to their anatomical position in the brain into the dorsal neurons (DN1s, DN2s, DN3s), as well as into the lateral neurons (LPNs, LNds, s-LNvs, l-LNvs). Functionally these clock neuron clusters can be classified as Morning- and Evening oscillators (M- and E- oscillators), driving different parts of the fly’s locomotor activity in light-dark conditions (LD). The Morning-oscillators are represented by the s-LNvs and are known to be the main pacemakers, driving the pace of the clock in constant conditions (constant darkness; DD). The group of Evening-oscillators consists of the LNds, the DN1s and the 5th s-LNv and is important for the proper timing of the evening activity in LD. All of these clock neurons are not functionally independent, but form complex neuronal connections, which are highly plastic in their response to different environmental stimuli (Zeitgebers), like light or temperature. Even though a lot is known about the function and the importance of some clock neuron clusters, the exact interplay between the neurons is not fully known yet. To investigate the mechanisms, which are involved in communication processes among different clock neurons, we depolarized specific clock cells in a temporally and cell-type restricted manner using dTrpA1, a thermosensitive cation channel, which allows the depolarization of neurons by application of temperature pulses (TP) above 29°C to the intact and freely moving fly. Using different clock specific GAL4-driver lines and applying TPs at different time points within the circadian cycle in DD enabled us with the help of phase shift experiments to draw conclusions on the properties of the endogenous clock. The obtained phase shifts in locomotor behavior elicited by specific clock neuronal activation were plotted as phase response curves (PRCs). The depolarization of all clock neurons shifted the phase of activity the strongest, especially in the delay zone of the PRC. The exclusive depolarization of the M oscillators together with the l-LNvs (PDF+ neurons: s-LNvs & l-LNvs) caused shifts in the delay and in the advance zone as well, however the advances were severely enhanced in their temporal occurrence ranging into the subjective day. We concluded that light might have inhibitory effects on the PDF+ cells in that particular part of the PRC, as typical light PRCs do not exhibit that kind of distinctive advances. By completely excluding light in the PRC-experiments of this PhD-thesis, this photic inhibitory input to the PDF+ neurons is missing, probably causing the broadened advance zone. These findings suggest the existence of an inhibitory light-input pathway to the PDF+ cells from the photoreceptive organs (Hofbauer-Buchner eyelet, photoreceptor cells of compound eyes, ocelli) or from other clock neurons, which might inhibit phase advances during the subjective day. To get an impression of the molecular state of the clock in the delay and advance zone, staining experiments against Period (PER), one of the most important core clock components, and against the neuropeptide Pigment Dispersing Factor (PDF) were performed. The cycling of PER levels mirrored the behavioral phase shifts in experimental flies, whereas the controls were widely unaffected. As just those neurons, which had been depolarized, exhibited immediate shifted PER oscillations, this effect has to be rapidly regulated in a cell-autonomous manner. However, the molecular link between clock neuron depolarization and shifts in the molecular clock’s cycling is still missing. This issue was addressed by CREB (cAMP responsive element binding protein) quantification in the large ventrolateral neurons (l-LNvs), as these neurons responded unexpectedly and strongest to the artificial depolarization exhibiting a huge increase in PER levels. It had been previously suggested that CREB is involved in circadian rhythms by binding to regulatory sequences of the period gene (Belvin et al., 1999), thus activating its transcription. We were able to show, that CREB levels in the l-LNvs are under circadian regulation, as they exhibit higher CREB levels at the end of the subjective night relative to the end of the subjective day. That effect was further reinforced by artificial depolarization, independently of the time point of depolarization. Furthermore the data indicate that rises in CREB levels are coinciding with the time point of increases of PER levels in the l-LNvs, suggesting CREB being the molecular link between the neuronal electrical state and the molecular clock. Taking together, the results indicate that a temporal depolarization using dTrpA1 is able to significantly phase shift the clock on the behavioral and protein level. An artificial depolarization at the beginning of the subjective night caused phase delays, whereas a depolarization at the end of the subjective night resulted in advances. The activation of all clock neurons caused a PRC that roughly resembled a light-PRC. However, the depolarization of the PDF+ neurons led to a PRC exhibiting a shape that did not resemble that of a light-mediated PRC, indicating the complex processing ability of excitatory and inhibitory input by the circadian clock. Even though this experimental approach is highly artificial, just the exclusion of light-inputs enabled us to draw novel conclusions on the network communication and its light input pathways. N2 - Die Rotation der Erde um ihre eigene Achse hat periodisch verändernde Umweltbedingungen, wie beispielsweise Veränderungen in den Lichtverhältnissen und der Temperatur, zur Folge. Um das Verhalten, die Physiologie und den Metabolismus eines Organismus an stets wiederkehrende Veränderungen anzupassen, haben sich endogene/circadiane Uhren entwickelt, die es dem Organismus erlauben diese Umweltbedingungen zu antizipieren. In der Chronobiologie, einem wissenschaftlichen Fachbereich, der sich mit der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der Inneren Uhr befasst, dient die Taufliege Drosophila melanogaster als nützlicher Modellorganismus. Die Innere Uhr der Taufliege ist anatomisch eher einfach organisiert, weist trotz alledem jedoch Homologien zum Säugersystem auf. Auch im Rahmen dieser Doktorarbeit diente die Taufliege daher dazu grundlegende Netzwerkeigenschaften der circadianen Uhr zu untersuchen. Die Innere Uhr von Drosophila melanogaster besteht aus ungefähr 150 Uhrneuronen, die sich im zentralen Nervensystem der Fliege befinden. Diese Uhrneurone können, bezüglich ihrer anatomischen Position im Gehirn in die Gruppe der dorsalen Neurone (DN1, DN2, DN3), sowie in die der lateralen Neurone untergliedert werden (LPN, LNd, s-LNv, l-LNv). Funktionell werden diese Uhrneuronengruppen als Morgen- und Abendoszillatoren (M- und E-Oszillatoren) klassifiziert, da sie für unterschiedliche Verhaltensanteile in der Laufaktivität der Fliege unter Licht-Dunkel-Verhältnissen (LD) verantwortlich sind. Die s-LNv stellen dabei die Morgenoszillatoren (M-Oszillatoren) dar und werden als Hauptschrittmacher betrachtet, da sie die Geschwindigkeit der Uhr unter konstanten Bedingungen (Dauerdunkel; DD) bestimmen. Die Gruppe der Abendoszillatoren (EOszillatoren) besteht aus den LNd, einigen DN1 und der fünften s-LNv (5th s-LNv) und ist für die richtige Terminierung der Abendaktivität in LD zuständig. All diese Uhrneurone sind funktionell nicht unabhängig voneinander, sondern bilden komplexe neuronale Verschaltungen untereinander aus, die durch einen hohen Grad an Plastizität bezüglich ihrer Reaktion auf unterschiedliche Umweltparameter (Zeitgeber), wie Licht oder Temperatur, gekennzeichnet sind. Obwohl bereits vieles hinsichtlich der Funktion und der Bedeutung einiger Gruppen von Uhrneuronen bekannt ist, ist das genaue Zusammenspiel unter ihnen immer noch recht unklar. Um die Mechanismen, die in den Kommunikationsprozessen zwischen verschiedenen Uhrneuronen involviert sind, zu untersuchen, machten wir Gebrauch von dTrpA1, einem thermosensitiven Kationenkanal, der es durch die Applizierung von Temperaturpulsen (TP) über 29°C ermöglicht, Neuronen in der intakten und sich frei bewegenden Fliege zeitlich begrenzt und zellspezifisch zu depolarisieren. Mithilfe verschiedener Uhr-spezifischer GAL4-Treiberlinien und der Verabreichung von TP zu verschiedenen Zeitpunkten des circadianen Zyklus in DD, war es uns möglich Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Inneren Uhr anhand von Phasen-Verschiebungsexperimenten zu ziehen. Die hervorgerufenen Phasenverschiebungen im Laufverhalten, die durch die Aktivierung spezieller Uhrneuronen hervorgerufen wurden, wurden dabei als Phasen Responz Kurve (engl. phase response curve; PRC) dargestellt. Die Depolarisierung aller Uhrneurone verschob die Phase der Aktivität am stärksten, insbesondere in der Phasen-Verzögerungszone der PRC. Wurden ausschließlich die M-Oszillatoren zusammen mit den l-LNv (PDF+ Neurone: s-LNv & l-LNv) depolarisiert, wurden ebenso Phasenverschiebungen nach vorne, wie auch nach hinten hervorgerufen, jedoch reichten die Verschiebungen nach vorne deutlich in den subjektiven Tag hinein. Daraus schlussfolgerten wir, dass Licht inhibitorischen Einfluss in diesem Bereich der PRC haben muss, da typische Licht-PRCs nicht derart ausgeprägte Vorverschiebungen aufweisen. Aufgrund des vollständigen Lichtausschlusses in den PRC-Versuchen dieser Doktorarbeit fehlt jedoch dieser Licht-vermittelte inhibitorische Einfluss zu den PDF+ Neuronen und führt daher zur zeitlich stark ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone. Diese Ergebnisse lassen daher vermuten, dass ein inhibitorisch wirkender Licht-vermittelter Eingang zu den PDF+ Neuronen von den photorezeptiven Organen (Hofbauer-Buchner Äuglein, Photorezeptoren der Komplexaugen, Ocellen) oder von anderen Uhrneuronen existieren muss, der die Phasen-Vorverschiebungen während des subjektiven Tages unterdrückt. Um Kenntnis über den molekularen Status der Uhr in der Verzögerungs- und Phasen-Vorverschiebungszone zu erlangen, wurden Färbungen gegen das Protein Period (PER), eines der zentralen Bestandteile der Inneren Uhr und gegen das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF) angefertigt. Der zeitliche Verlauf im Auf- und Abbau des PER Proteins spiegelte die Phasenverschiebungen im Verhalten der Experimentalfliegen wider, wohingegen die Kontrollen weitestgehend unauffällig blieben. Zudem waren nur diejenigen Neurone von einer unmittelbaren Verschiebung der PER Protein Oszillation betroffen, die depolarisiert wurden, was auf einen schnellen Zell-autonomen Prozess schließen lässt. Die molekulare Verknüpfung, die zwischen der Depolarisation der Uhrneuronen und der Verschiebung der molekularen Uhr-Oszillation fungiert, ist immer noch unbekannt. Diesem Thema wurde nachgegangen, indem CREB (engl. cAMP responsive element binding protein) in den großen ventrolateralen Neuronen (l-LNv) quantifiziert wurde, da diese Neuronen unerwarteterweise und am wirksamsten auf die artifizielle Depolarisation mit einer starken PER-Akkumulation reagiert haben. In vorherigen Arbeiten wurde bereits angenommen, dass CREB in die circadiane Rhythmik involviert sei, indem es an Regulationssequenzen des period Gens bindet (Belvin et al., 1999) und somit dessen Transkription aktiviert. Wir konnten zeigen, dass die Menge an CREB Protein in den l-LNv circadian reguliert wird, da diese am Ende der subjektiven Nacht im Vergleich zum Ende des subjektiven Tages deutlich erhöht ist. Dieser Effekt konnte durch die artifizielle Depolarisation, aber unabhängig von deren Zeitpunkt, weiter verstärkt werden. Zudem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Akkumulation des CREB Proteins mit dem Zeitpunkt des Anstiegs des PER Proteins in den l-LNv koinzidiert. Das lässt die Vermutung zu, dass CREB als molekulare Verbindung zwischen dem elektrischen neuronalen Status und der molekularen Uhr dienen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die zeitlich begrenzte Depolarisation mithilfe von dTrpA1 signifikante Phasenverschiebungen im Verhalten wie auch auf der Proteinebene hervorrufen kann. Eine artifizielle Depolarisation zu Beginn der subjektiven Nacht verursacht Phasenverschiebungen nach hinten, wohingegen eine Depolarisation zum Ende der subjektiven Nacht Phasenverschiebungen nach vorne zur Folge hat. Die Aktivierung aller Uhrneurone brachte eine PRC hervor, die weitestgehend einer Licht-PRC gleicht. Die Depolarisierung der PDF+ Zellen hingegen ergab eine PRC, die sich insbesondere bezüglich der ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone von einer Licht-vermittelten PRC unterscheidet. Die Innere Uhr scheint somit die Fähigkeit zu besitzen, exzitatorische und inhibitorische Eingänge in komplexer Art und Weise zu verarbeiten. Obwohl der in dieser Doktorarbeit gewählte experimentelle Ansatz hochgradig artifiziell ist, war es uns gerade durch den Ausschluss von Licht möglich, neue Schlussfolgerungen bezüglich der Kommunikation innerhalb des Netzwerks und dessen Lichtinformations-Eingänge zu ziehen. KW - Chronobiologie KW - Circadian clock KW - Tagesrhythmus KW - Taufliege Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137118 ER - TY - THES A1 - Kupper, Maria T1 - The immune transcriptome and proteome of the ant Camponotus floridanus and vertical transmission of its bacterial endosymbiont Blochmannia floridanus T1 - Das Immuntranskriptom und -proteom der Ameise Camponotus floridanus und die vertikale Transmission ihres Endosymbionten Blochmannia floridanus N2 - The evolutionary success of insects is believed to be at least partially facilitated by symbioses between insects and prokaryotes. Bacterial endosymbionts confer various fitness advantages to their hosts, for example by providing nutrients lacking from the insects’ diet thereby enabling the inhabitation of new ecological niches. The Florida carpenter ant Camponotus floridanus harbours endosymbiotic bacteria of the genus Blochmannia. These primary endosymbionts mainly reside in the cytoplasm of bacteriocytes, specialised cells interspersed into the midgut tissue, but they were also found in oocytes which allows their vertical transmission. The social lifestyle of C. floridanus may facilitate the rapid spread of infections amongst genetically closely related animals living in huge colonies. Therefore, the ants require an immune system to efficiently combat infections while maintaining a “chronic” infection with their endosymbionts. In order to investigate the immune repertoire of the ants, the Illumina sequencing method was used. The previously published genome sequence of C. floridanus was functionally re-annotated and 0.53% of C. floridanus proteins were assigned to the gene ontology (GO) term subcategory “immune system process”. Based on homology analyses, genes encoding 510 proteins with possible immune function were identified. These genes are involved in microbial recognition and immune signalling pathways but also in cellular defence mechanisms, such as phagocytosis and melanisation. The components of the major signalling pathways appear to be highly conserved and the analysis revealed an overall broad immune repertoire of the ants though the number of identified genes encoding pattern recognition receptors (PRRs) and antimicrobial peptides (AMPs) is comparatively low. Besides three genes coding for homologs of thioester-containing proteins (TEPs), which have been shown to act as opsonins promoting phagocytosis in other insects, six genes encoding the AMPs defesin-1 and defensin-2, hymenoptaecin, two tachystatin-like peptides and one crustin-like peptide are present in the ant genome. Although the low number of known AMPs in comparison to 13 AMPs in the honey bee Apis mellifera and 46 AMPs in the wasp Nasonia vitripennis may indicate a less potent immune system, measures summarised as external or social immunity may enhance the immune repertoire of C. floridanus, as it was discussed for other social insects. Also, the hymenoptaecin multipeptide precursor protein may be processed to yield seven possibly bioactive peptides. In this work, two hymenoptaecin derived peptides were heterologously expressed and purified. The preliminary antimicrobial activity assays indicate varying bacteriostatic effects of different hymenoptaecin derived peptides against Escherichia coli D31 and Staphylococcus aureus which suggests a functional amplification of the immune response further increasing the antimicrobial potency of the ants. Furthermore, 257 genes were differentially expressed upon immune challenge of C. floridanus and most of the immune genes showing differential expression are involved in recognition of microbes or encode immune effectors rather than signalling components. Additionally, genes coding for proteins involved in storage and metabolism were downregulated upon immune challenge suggesting a trade-off between two energy-intensive processes in order to enhance effectiveness of the immune response. The analysis of gene expression via qRT-PCR was used for validation of the transcriptome data and revealed stage-specific immune gene regulation. Though the same tendencies of regulation were observed in larvae and adults, expression of several immune-related genes was generally more strongly induced in larvae. Immune gene expression levels depending on the developmental stage of C. floridanus are in agreement with observations in other insects and might suggest that animals from different stages revert to individual combinations of external and internal immunity upon infection. The haemolymph proteome of immune-challenged ants further established the immune-relevance of several proteins involved in classical immune signalling pathways, e.g. PRRs, extracellularly active proteases of the Toll signalling pathway and effector molecules such as AMPs, lysozymes and TEPs. Additionally, non-canonical proteins with putative immune function were enriched in immune-challenged haemolymph, e.g. Vitellogenins, NPC2-like proteins and Hemocytin. As known from previous studies, septic wounding also leads to the upregulation of genes involved in stress responses. In the haemolymph, proteins implicated in protein stabilisation and in the protection against oxidative stress and insecticides were enriched upon immune challenge. In order to identify additional putative immune effectors, haemolymph peptide samples from immune-challenged larvae and adults were analysed. The analysis in this work focussed on the identification of putative peptides produced via the secretory pathway as previously described for neuropeptides of C. floridanus. 567 regulated peptides derived from 39 proteins were identified in the larval haemolymph, whereas 342 regulated peptides derived from 13 proteins were found in the adult haemolymph. Most of the peptides are derived from hymenoptaecin or from putative uncharacterised proteins. One haemolymph peptide of immune-challenged larvae comprises the complete amino acid sequence of a predicted peptide derived from a Vitellogenin. Though the identified peptide lacks similarities to any known immune-related peptide, it is a suitable candidate for further functional analysis. To establish a stable infection with the endosymbionts, the bacteria have to be transmitted to the next generation of the ants. The vertical transmission of B. floridanus is guaranteed by bacterial infestation of oocytes. This work presents the first comprehensive and detailed description of the localisation of the bacterial endosymbionts in C. floridanus ovaries during oogenesis. Whereas the most apical part of the germarium, which contains the germ-line stem cells, is not infected by the bacteria, small somatic cells in the outer layers of each ovariole were found to be infected in the lower germarium. Only with the beginning of cystocyte differentiation, endosymbionts are exclusively transported from follicle cells into the growing oocytes, while nurse cells were never infected with B. floridanus. This infestation of the oocytes by bacteria very likely involves exocytosis-endocytosis processes between follicle cells and the oocytes. A previous study suggested a down-modulation of the immune response in the midgut tissue which may promote endosymbiont tolerance. Therefore, the expression of several potentially relevant immune genes was analysed in the ovarial tissue by qRT-PCR. The relatively low expression of genes involved in Toll and IMD signalling, and the high expression of genes encoding negative immune regulators, such as PGRP-LB, PGRP-SC2, and tollip, strongly suggest that a down-modulation of the immune response may also facilitate endosymbiont tolerance in the ovaries and thereby contribute to their vertical transmission. Overall, the present thesis improves the knowledge about the immune repertoire of C. floridanus and provides new candidates for further functional analyses. Moreover, the involvement of the host immune system in maintaining a “chronic” infection with symbiotic bacteria was confirmed and extended to the ovaries. N2 - Der evolutionäre Erfolg von Insekten wird zumindest teilweise Symbiosen zwischen Insekten und Prokaryonten zugeschrieben. Dabei übertragen bakterielle Symbionten verschiedenste Fitnessvorteile an ihre Wirte. Beispielsweise ermöglicht die Bereitstellung von Nährstoffen, welche in der Nahrung des Insekts fehlen, die Erschließung neuer ökologischer Nischen. Die Florida Rossameise Camponotus floridanus trägt endosymbiontische Bakterien der Gattung Blochmannia. Diese primären Endosymbionten kommen hauptsächlich im Zytoplasma von spezialisierten Zellen des Mitteldarms, den sogenannten Bakteriozyten, vor. Blochmannien wurden aber auch in Oozyten und Eiern gefunden, was ihre vertikale Übertragung an Individuen der nächsten Generation ermöglicht. Als soziale Insekten leben C. floridanus in großen Kolonien von nah verwandten Individuen. Ihre Lebensweise begünstigt möglicherweise die schnelle Ausbreitung von Infektionen, weshalb erwartet werden müsste, dass die Ameisen ein effizientes Immunsystem besitzen. Gleichzeitig muss jedoch die „chronische“ Infektion mit den bakteriellen Symbionten aufrechterhalten werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Immunrepertoire der Ameisen mittels Illumina Sequenzierung charakterisiert. Zunächst wurde das vor kurzem publizierte Genom von C. floridanus funktionell re-annotiert. Dabei wurden 0.53% der annotierten Proteine der GO-Unterkategorie “Prozesse des Immunsystems” zugeordnet. Basierend auf Homologieanalysen wurden Gene identifiziert, die für 510 Immunproteine kodieren. Die Genprodukte spielen eine Rolle bei der Erkennung von Mikroben und in den Signalwegen des Immunsystems, sind jedoch auch an Prozessen der zellulären Immunantwort, wie beispielsweise Phagozytose und Melanisierung, beteiligt. Dabei sind Komponenten der Hauptsignalwege hoch konserviert. Obwohl die Anzahl der identifizierten Proteine, die Fremdorganismen erkennen (PRRs), und die Anzahl an antimikrobiellen Peptiden (AMPs) vergleichsweise gering ist, verfügt C. floridanus insgesamt über ein umfangreiches Immunrepertoire. Neben drei Genen, die für Thioester-enthaltende Proteine (TEPs) kodieren und wie in anderen Insekten möglicherweise eine Rolle als Opsonine bei der Phagozytose spielen, wurden sechs AMP-Gene identifiziert. Diese kodieren für Defesin-1 und Defensin-2, Hymenoptaecin, zwei Tachystatin-ähnliche und ein Crustin-ähnliches Peptid. Die geringe Anzahl an bekannten AMPs im Vergleich zur Honigbiene Apis mellifera (13 AMPs) und Wespe Nasonia vitripennis (46 AMPs) könnte ein möglicherweise geringeres Potential des Immunsystems anzeigen. Allerdings könnten zusätzliche Maßnahmen, die unter dem Begriff „Soziale Immunität“ zusammengefasst werden, das Immunrepertoire von C. floridanus ergänzen, wie es schon für andere Insekten diskutiert wurde. Zudem könnten durch proteolytische Prozessierung des Hymenoptaecin Multipeptid Präkursormoleküls sieben mögliche antimikrobielle Peptide freigesetzt werden. Für die vorliegende Arbeit wurden zwei verschiedene dieser Hymenoptaecin Peptide heterolog exprimiert und aufgereinigt. Die vorläufige funktionelle Charakterisierung der Peptide zeigt, dass diese Peptide möglicherweise bakteriostatische Wirkung mit einem unterschiedlichen Wirkspektrum gegen Escherichia coli D31 und Staphylococcus aureus entfalten. Dies erlaubt die Annahme, dass die Expression des Hymenoptaecins zu einer funktionellen Amplifikation der Immunantwort führt und das Immunrepertoire der Ameisen erweitert. Nach Injektion von bakteriellem Material in die Ameisen wurde die Expression von 257 Genen reguliert. Viele dieser Gene kodieren für Proteine zur Erkennung von Pathogenen oder kodieren für Effektoren des Immunsystems. Komponenten der Signalwege zeigten dagegen kaum Veränderungen in ihrer Expression auf. Außerdem zeigten Gene, die für Speicherproteine oder Proteine des Metabolismus kodieren, generell eine geringere Expression nach Stimulierung des Immunsystems auf. Dies lässt einen Ausgleich zwischen zwei energieintensiven Prozessen vermuten, um eine effektive Immunantwort zu ermöglichen. Darüber hinaus zeigt die Validierung der Expressionsdaten mittels qRT-PCR eine Abhängigkeit der Expression mehrerer Gene vom Entwicklungsstadium der Ameisen auf. Generell wurden die gleichen Tendenzen in der Regulation der Expression dieser Gene nach Immunstimulierung beobachtet. Allerdings wurde die Expression mehrerer immunrelevanter Gene in Larven weit stärker induziert als in Adulten. Wie es auch schon für andere Insekten gezeigt wurde, scheinen C. floridanus Larven und Arbeiterinnen auf individuelle Kombinationen externer und interner Immunfaktoren zurückzugreifen. Die vorher beschriebenen Transkriptomdaten wurden durch die Charakterisierung des Hämolymph-Proteoms von C. floridanus nach Immunstimulation ergänzt, wodurch die Immunrelevanz vieler Faktoren auch auf Proteinebene bestätigt werden konnte. Beispielsweise wurden zahlreiche PRRs und extrazellulär aktive Proteasen des Toll-Signalwegs, aber auch Immuneffektoren wie AMPs, Lysozyme und TEPs in der Hämolymphe identifiziert. Zusätzlich führte die Immunstimulation in Larven und Adulten zur Anreicherung nicht-kanonischer Proteine mit möglicher Immunfunktion, beispielsweise Vitellogenine, NPC2-ähnliche Proteine und Hemocytin. Aus einer früheren Arbeit ist bekannt, dass septische Verwundungen zusätzlich die transkriptionelle Aktivierung von Genen der Stressantwort hervorrufen können. So wurden auch in der Hämolymphe Proteine entdeckt, die eine Rolle bei der Stabilisierung von Proteinen, und dem Schutz gegen oxidativen Stress und Insektizide spielen. Zur Identifizierung weiterer möglicher Peptideffektoren wurden Hämolymphpeptid-Proben von immunstimulierten Larven und Adulten analysiert. Der Fokus der Analyse lag dabei auf der Identifizierung von Peptiden, die auf dem sekretorischen Weg gebildet werden, wie es zuvor für Neuropeptide von C. floridanus beschrieben worden war. 567 differentiell regulierte Peptide, die von 39 Proteinen abstammen, wurden in Larvenhämolymphe identifiziert, wohingegen in der Hämolymphe von Adulttieren 342 derartige Peptide, die 13 Proteinen zugeordnet werden können, gefunden wurden. Die meisten dieser Peptide können Hymenoptaecin oder bisher noch nicht charakterisierte Proteinen zugeordnet werden. Jedoch wurde ein Peptid in larvaler Hämolymphe identifiziert, dessen Aminosäuresequenz vollständig mit der Sequenz eines vorhergesagten, von Vitellogenin stammenden Peptids übereinstimmt. Weil dieses Peptid keine Ähnlichkeiten zu anderen bereits charakterisierten antimikrobiellen Peptiden aufweist, stellt es einen geeigneten Kandidaten für weitere funktionelle Analysen dar. Die bakterielle Infektion von Oozyten ermöglicht die transovariale Übertragung von B. floridanus und ermöglicht damit die Etablierung einer stabilen Infektion in der nächsten Wirtsgeneration. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die erste umfassende und detaillierte Beschreibung der Lokalisation bakterieller Endosymbionten in Ovarien von C. floridanus. Im apikalen Germarium, in welchem sich die Keimbahn-Stammzellen befinden, liegt noch keine bakterielle Infektion des Gewebes vor. In späteren Segmenten des Germariums jedoch können Blochmannien das erste Mal in kleinen somatischen Zellen der äußeren Schicht jeder Ovariole detektiert werden. Mit beginnender Zystozytendifferenzierung werden die Endosymbionten von Follikelzellen ausschließlich in die heranwachsenden Oozyten transportiert, wobei sehr wahrscheinlich Exozytose-Endozytose-Prozesse involviert sind. Nährzellen zeigen zu keinem Zeitpunkt während der Oogenese eine bakterielle Infektion auf. Da in einer früheren Studie vorgeschlagen wurde, dass eine signifikant reduzierte Anregung der Immunantwort im Mitteldarmgewebe zur Toleranz der Endosymbionten beitragen könnte, wurde auch die Expression ausgewählter Immungene in den Ovarien durch qRT-PCR untersucht. Die relativ geringe Expression von Genen des Toll- und des IMD-Signalwegs und die zusätzlich vergleichsweise starke Genexpression negativer Regulatoren des Immunsystems, wie PGRP-LB, PGRP-SC2 und tollip, sind Indikatoren einer reduzierten Immunantwort in den Ovarien von C. floridanus. Wie schon für den Mitteldarm der Tiere vorgeschlagen, könnte dies möglicherweise sowohl zur Toleranz von Blochmannia als auch zur vertikalen Übertragung der Endosymbionten beitragen. Die vorliegende Doktorarbeit erweitert das Wissen über das Immunrepertoire von C. floridanus und es konnten vielversprechende Kandidaten für weitere funktionelle Analysen von möglichen Immunfaktoren identifiziert werden. Darüber hinaus konnten weitere Hinweise auf die Bedeutung von Immunfaktoren der Ameisen bei der Toleranz gegenüber den symbiontischen Bakterien gefunden und auf die Ovarien der Tiere ausgeweitet werden. KW - Camponotus floridanus KW - Oogenese KW - Symbiose KW - endosymbiosis KW - Blochmannia floridanus KW - ant oogenesis KW - immune genes KW - antimicrobial peptides KW - Endosymbiosen KW - Ameisenoogenese KW - Immungene KW - Antimikrobielle Peptide Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142534 ER - TY - JOUR A1 - Künstner, Axel A1 - Hoffmann, Margarete A1 - Fraser, Bonnie A. A1 - Kottler, Verena A. A1 - Sharma, Eshita A1 - Weigel, Detlef A1 - Dreyer, Christine T1 - The Genome of the Trinidadian Guppy, Poecilia reticulata, and Variation in the Guanapo Population JF - PLoS ONE N2 - For over a century, the live bearing guppy, Poecilia reticulata, has been used to study sexual selection as well as local adaptation. Natural guppy populations differ in many traits that are of intuitively adaptive significance such as ornamentation, age at maturity, brood size and body shape. Water depth, light supply, food resources and predation regime shape these traits, and barrier waterfalls often separate contrasting environments in the same river. We have assembled and annotated the genome of an inbred single female from a high-predation site in the Guanapo drainage. The final assembly comprises 731.6 Mb with a scaffold N50 of 5.3 MB. Scaffolds were mapped to linkage groups, placing 95% of the genome assembly on the 22 autosomes and the X-chromosome. To investigate genetic variation in the population used for the genome assembly, we sequenced 10 wild caught male individuals. The identified 5 million SNPs correspond to an average nucleotide diversity (π) of 0.0025. The genome assembly and SNP map provide a rich resource for investigating adaptation to different predation regimes. In addition, comparisons with the genomes of other Poeciliid species, which differ greatly in mechanisms of sex determination and maternal resource allocation, as well as comparisons to other teleost genera can begin to reveal how live bearing evolved in teleost fish. KW - Trinidadian guppy KW - Poecilia reticulata KW - genetics Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166755 VL - 11 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Scharaw, Sandra A1 - Iskar, Murat A1 - Ori, Alessandro A1 - Boncompain, Gaelle A1 - Laketa, Vibor A1 - Poser, Ina A1 - Lundberg, Emma A1 - Perez, Franck A1 - Beck, Martin A1 - Bork, Peer A1 - Pepperkok, Rainer T1 - The endosomal transcriptional regulator RNF11 integrates degradation and transport of EGFR JF - Journal of Cell Biology N2 - Stimulation of cells with epidermal growth factor (EGF) induces internalization and partial degradation of the EGF receptor (EGFR) by the endo-lysosomal pathway. For continuous cell functioning, EGFR plasma membrane levels are maintained by transporting newly synthesized EGFRs to the cell surface. The regulation of this process is largely unknown. In this study, we find that EGF stimulation specifically increases the transport efficiency of newly synthesized EGFRs from the endoplasmic reticulum to the plasma membrane. This coincides with an up-regulation of the inner coat protein complex II (COP II) components SEC23B, SEC24B, and SEC24D, which we show to be specifically required for EGFR transport. Up-regulation of these COP II components requires the transcriptional regulator RNF11, which localizes to early endosomes and appears additionally in the cell nucleus upon continuous EGF stimulation. Collectively, our work identifies a new regulatory mechanism that integrates the degradation and transport of EGFR in order to maintain its physiological levels at the plasma membrane. KW - Epidermal growth-factor KW - finger protein 11 KW - receptor tyrosine kinases KW - early secretory pathway KW - breast-cancer KW - brefeldin-a KW - E3 ligase KW - trafficking KW - export KW - endoplasmic-reticulum Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186731 VL - 215 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Kunz, Meik A1 - Liang, Chunguang A1 - Nilla, Santosh A1 - Cecil, Alexander A1 - Dandekar, Thomas T1 - The drug-minded protein interaction database (DrumPID) for efficient target analysis and drug development JF - Database N2 - The drug-minded protein interaction database (DrumPID) has been designed to provide fast, tailored information on drugs and their protein networks including indications, protein targets and side-targets. Starting queries include compound, target and protein interactions and organism-specific protein families. Furthermore, drug name, chemical structures and their SMILES notation, affected proteins (potential drug targets), organisms as well as diseases can be queried including various combinations and refinement of searches. Drugs and protein interactions are analyzed in detail with reference to protein structures and catalytic domains, related compound structures as well as potential targets in other organisms. DrumPID considers drug functionality, compound similarity, target structure, interactome analysis and organismic range for a compound, useful for drug development, predicting drug side-effects and structure–activity relationships. KW - drug-minded protein KW - database Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147369 VL - 2016 ER - TY - THES A1 - Ruf, Franziska T1 - The circadian regulation of eclosion in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Die zeitliche Steuerung des Adultschlupfes in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Eclosion is the emergence of an adult insect from the pupal case at the end of development. In the fruit fly Drosophila melanogaster, eclosion is a circadian clock-gated event and is regulated by various peptides. When studied on the population level, eclosion reveals a clear rhythmicity with a peak at the beginning of the light-phase that persists also under constant conditions. It is a long standing hypothesis that eclosion gating to the morning hours with more humid conditions is an adaption to reduce water loss and increase the survival. Eclosion behavior, including the motor pattern required for the fly to hatch out of the puparium, is orchestrated by a well-characterized cascade of peptides. The main components are ecdysis-triggering hormone (ETH), eclosion hormone (EH) and crustacean cardioactive peptide (CCAP). The molt is initiated by a peak level and pupal ecdysis by a subsequent decline of the ecdysteroid ecdysone. Ecdysteroids are produced by the prothoracic gland (PG), an endocrine tissue that contains a peripheral clock and degenerates shortly after eclosion. Production and release of ecdysteroids are regulated by the prothoracicotropic hormone (PTTH). Although many aspects of the circadian clock and the peptidergic control of the eclosion behavior are known, it still remains unclear how both systems are interconnected. The aim of this dissertation research was to dissect this connection and evaluate the importance of different Zeitgebers on eclosion rhythmicity under natural conditions. Potential interactions between the central clock and the peptides regulating ecdysis motor behavior were evaluated by analyzing the influence of CCAP on eclosion rhythmicity. Ablation and silencing of CCAP neurons, as well as CCAP null-mutation did not affect eclosion rhythmicity under either light or temperature entrainment nor under natural conditions. To dissect the connection between the central and the peripheral clock, PTTH neurons were ablated. Monitoring eclosion under light and temperature entrainment revealed that eclosion became arrhythmic under constant conditions. However, qPCR expression analysis revealed no evidence for cycling of Ptth mRNA in pharate flies. To test for a connection with pigment-dispersing factor (PDF)-expressing neurons, the PDF receptor (PDFR) and short neuropeptide F receptor (sNPFR) were knocked down in the PTTH neurons. Knockdown of sNPFR, but not PDFR, resulted in arrhythmic eclosion under constant darkness conditions. PCR analysis of the PTTH receptor, Torso, revealed its expression in the PG and the gonads, but not in the brain or eyes, of pharate flies. Knockdown of torso in the PG lead to arrhythmicity under constant conditions, which provides strong evidence for the specific effect of PTTH on the PG. These results suggest connections from the PDF positive lateral neurons to the PTTH neurons via sNPF signaling, and to the PG via PTTH and Torso. This interaction presumably couples the period of the peripheral clock in the PG to that of the central clock in the brain. To identify a starting signal for eclosion and possible further candidates in the regulation of eclosion behavior, chemically defined peptidergic and aminergic neurons were optogenetically activated in pharate pupae via ChR2-XXL. This screen approach revealed two candidates for the regulation of eclosion behavior: Dromyosuppressin (DMS) and myo-inhibitory peptides (MIP). However, ablation of DMS neurons did not affect eclosion rhythmicity or success and the exact function of MIP must be evaluated in future studies. To assess the importance of the clock and of possible Zeitgebers in nature, eclosion of the wildtype Canton S and the clock mutant per01 and the PDF signaling mutants pdf01 and han5304 was monitored under natural conditions. For this purpose, the Würzburg eclosion monitor (WEclMon) was developed, which is a new open monitoring system that allows direct exposure of pupae to the environment. A general decline of rhythmicity under natural conditions compared to laboratory conditions was observed in all tested strains. While the wildtype and the pdf01 and han5304 mutants stayed weakly rhythmic, the per01 mutant flies eclosed mostly arrhythmic. PDF and its receptor (PDFR encoded by han) are required for the synchronization of the clock network and functional loss can obviously be compensated by a persisting synchronization to external Zeitgebers. The loss of the central clock protein PER, however, lead to a non-functional clock and revealed the absolute importance of the clock for eclosion rhythmicity. To quantitatively analyze the effect of the clock and abiotic factors on eclosion rhythmicity, a statistical model was developed in cooperation with Oliver Mitesser and Thomas Hovestadt. The modelling results confirmed the clock as the most important factor for eclosion rhythmicity. Moreover, temperature was found to have the strongest effect on the actual shape of the daily emergence pattern, while light has only minor effects. Relative humidity could be excluded as Zeitgeber for eclosion and therefore was not further analyzed. Taken together, the present dissertation identified the so far unknown connection between the central and peripheral clock regulating eclosion. Furthermore, a new method for the analysis of eclosion rhythms under natural conditions was established and the necessity of a functional clock for rhythmic eclosion even in the presence of multiple Zeitgebers was shown. N2 - Der Schlupf adulter Fliegen aus dem Puparium wird in der Taufliege Drosophila melanogaster zum einen von der inneren Uhr und zum anderen von Peptiden gesteuert. Beobachtet man den Schlupf auf der Populationsebene, lässt sich erkennen, dass die meisten Fliegen zu Beginn der Lichtphase schlüpfen. Diese Rhythmizität im Schlupfverhalten von Fliegenpopulationen hält auch unter konstanten Bedingungen an. Seit langer Zeit wird angenommen, dass der Schlupf am Morgen eine Anpassung an feuchte Bedingungen ist, wodurch der Wasserverlust verringert und die Überlebenswahrscheinlichkeit erhöht werden könnte. Das stereotype motorische Schlupfverhalten, mit dem sich die Fliege aus der Puppenhülle befreit, wird durch das gut untersuchte Zusammenspiel zahlreicher Peptide gesteuert. Die wichtigsten Peptide sind hierbei das ecdysis-triggering hormone (ETH), das Schlupfhormon (EH) und das crustacean cardioactive peptide (CCAP). Wie bei jedem Schlupf wird die Häutung durch eine stark erhöhte Produktion des Ecdysteroids Ecdyson ausgelöst. Der anschließende Abfall der Ecdyson-Titer löst dann den Adultschlupf aus. Ecdysteroide werden in der Prothorakaldrüse (PD) gebildet, die eine periphere Uhr besitzt und kurz nach dem Adultschlupf zurückgebildet wird. Das prothorakotrope Hormon (PTTH) reguliert sowohl die Produktion als auch die Freisetzung der Ecdysteroide aus der PD. Obwohl bereits viel über den Aufbau und die Funktionsweise der inneren Uhr und der Kontrolle des Adultschlupfes durch Peptide bekannt ist, weiß man bisher nicht, wie beide Systeme miteinander interagieren. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, einerseits diese Verbindung zu untersuchen und andererseits die Gewichtung verschiedener Zeitgeber für den Adultschlupf unter natürlichen Bedingungen zu bewerten. Um eine mögliche Verbindung zwischen der zentralen Uhr und den Peptiden, die das motorische Verhalten während des Schlupfes steuern, zu untersuchen, wurde der Einfluss von CCAP auf die Schlupfrhythmik betrachtet. Hierzu wurden die CCAP-exprimierenden Neurone genetisch ablatiert oder elektrisch stillgelegt, sowie zusätzlich eine CCAP-defiziente Mutante getestet. Weder unter künstlichen Licht- oder Temperaturzyklen, noch unter natürlichen Bedingungen wurden Effekte auf den Schlupfrhythmus bei veränderter CCAP Verfügbarkeit beobachtet. Die Verbindung zwischen der zentralen und der peripheren Uhr der PD wurde untersucht, indem die PTTH-exprimierenden Neurone in Fliegen ablatiert wurden. Dies führte sowohl unter konstanten Licht- als auch Temperaturbedingungen zu arrhythmischem Schlupf der Populationen. Die Analyse der Expression von Ptth mRNA mittels qPCR lieferte keine Hinweise auf eine zyklische Regulation des Ptth Transkripts in pharaten Tieren. Um eine Verbindung zu pigment-dispersing factor (PDF)-exprimierenden Uhrneuronen nachzuweisen, wurden die Rezeptoren von PDF (PDFR) und dem short Neuropeptide F (sNPFR) in den PTTH- Neuronen herunterreguliert. Nur der Verlust von sNPFR führte unter konstanten Bedingungen zu arrhythmischem Schlupf. RT-PCR-Analyse der mRNA Expression des Rezeptors von PTTH, Torso, ergab, dass torso mRNA in pharaten Fliegen nur in der PD und in den Gonaden exprimiert wird, nicht jedoch im Gehirn. Das Herrunterregulieren der torso mRNA in der PD führte unter konstanten Bedingungen zu arrhythmischem Schlupf und lieferte deutliche Hinweise zur spezifischen Funktion von PTTH in der PD. Diese Ergebnisse zeigen eine sNPF-vermittelte Verbindung zwischen den PDF-positiven lateralen Neuronen und den PTTH-Neuronen, welche über PTTH und Torso weiter bis in die PD reicht. Durch diese Verbindung wird vermutlich die Periode der peripheren Uhr in der PD an die Periode der zentralen Uhr im Gehirn angepasst. Um ein Startsignal für den Adultschlupf und weitere mögliche Kandidaten, die eine Rolle in der Steuerung des Schlupfes spielen, zu identifizieren, wurden chemisch definierte kleine Gruppen peptiderger und aminerger Neurone optogenetisch durch das Kanalrhodopsin ChR2-XXL aktiviert. In dieser Testreihe wurden Dromyosuppressin (DMS) und myoinhibitorisches Peptid (MIP) als mögliche Kandidaten ermittelt. Eine Ablation der DMS-Neurone hatte jedoch keine Auswirkungen auf Schlupfrhythmik und -erfolg. Die genaue Funktion von MIP sollte in zukünftigen Experimenten untersucht werden. Um die Gewichtung der Uhr und möglicher Zeitgeber für das natürliche Verhalten zu bestimmen, wurde der Schlupf des Wildtyps Canton S, der Uhrmutante per01 sowie der PDF-Signalwegsmutanten pdf01 und han5304 (han codiert für den PDFR) unter natürlichen Bedingungen beobachtet. Hierfür wurde ein neues und offenes Aufzeichnungssystem entwickelt: der Würzburger Schlupfmonitor (WEclMon), der einen direkten Kontakt der Puppen mit den sie umgebenden abiotischen Bedingungen ermöglicht. Im Vergleich zu Laborbedingungen war die Rhythmizität des Schlupfes unter natürlichen Bedingungen in allen getesteten Fliegenlinien weniger ausgeprägt. Während der Wildtyp sowie die pdf01 und han5304 Mutanten weiterhin schwach rhythmisch schlüpften, schlüpfte die per01 Mutante hauptsächlich arrhythmisch. Das Zusammenspiel zwischen PDF und seinem Rezeptor synchronisiert das Uhrnetzwerk, und der Verlust dieser Interaktion kann durch tägliches neues Ausrichten an den Zeitgebern ausgeglichen werden. Der Verlust des Uhrproteins PER unterbindet jedoch die komplette Funktionsfähigkeit der Uhr. Dadurch wird die Notwendigkeit der Uhr für einen rhythmischen Schlupf unterstrichen. Um den Einfluss der Uhr und abiotischer Faktoren auf den Schlupfrhythmus zu untersuchen, wurde im Rahmen einer Kooperation mit Oliver Mitesser und Thomas Hovestadt ein statistisches Modell entwickelt. Die Ergebnisse der Modellierung unterstützen die Hypothese, dass die Uhr der wichtigste Faktor für einen rhythmischen Schlupf auch unter Zeitgeber-Bedingungen ist. Die Umgebungstemperatur übt hingegen den stärksten Einfluss auf die Form des täglichen Schlupfmusters aus, während Licht hier nur einen schwachen Einfluss hat. Es konnte gezeigt werden, dass sich relative Luftfeuchtigkeit nicht als Zeitgeber für den Schlupf eignet, weshalb sie in weiteren Untersuchungen nicht berücksichtigt wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit der vorliegenden Arbeit die Verbindung zwischen der zentralen und peripheren Uhr in der Steuerung des Schlupfes identifiziert werden konnten, die bisher nicht bekannt war. Außerdem wurde eine neue Methode der Untersuchung des Adultschlupfes unter natürlichen Bedingungen etabliert und die Notwendigkeit einer intakten Uhr für einen rhythmischen Adultschlupf selbst in Anwesenheit mehrerer Zeitgeber konnte herausgestellt werden. KW - Taufliege KW - Tagesrhythmus KW - Adultschlupfes Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146265 ER - TY - JOUR A1 - Ankenbrand, Markus J. A1 - Weber, Lorenz A1 - Becker, Dirk A1 - Förster, Frank A1 - Bemm, Felix T1 - TBro: visualization and management of de novo transcriptomes JF - Database N2 - RNA sequencing (RNA-seq) has become a powerful tool to understand molecular mechanisms and/or developmental programs. It provides a fast, reliable and cost-effective method to access sets of expressed elements in a qualitative and quantitative manner. Especially for non-model organisms and in absence of a reference genome, RNA-seq data is used to reconstruct and quantify transcriptomes at the same time. Even SNPs, InDels, and alternative splicing events are predicted directly from the data without having a reference genome at hand. A key challenge, especially for non-computational personnal, is the management of the resulting datasets, consisting of different data types and formats. Here, we present TBro, a flexible de novo transcriptome browser, tackling this challenge. TBro aggregates sequences, their annotation, expression levels as well as differential testing results. It provides an easy-to-use interface to mine the aggregated data and generate publication-ready visualizations. Additionally, it supports users with an intuitive cart system, that helps collecting and analysing biological meaningful sets of transcripts. TBro’s modular architecture allows easy extension of its functionalities in the future. Especially, the integration of new data types such as proteomic quantifications or array-based gene expression data is straightforward. Thus, TBro is a fully featured yet flexible transcriptome browser that supports approaching complex biological questions and enhances collaboration of numerous researchers. KW - database Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147954 VL - 2016 ER - TY - THES A1 - Jung, Lisa Anna T1 - Targeting MYC Function as a Strategy for Tumor Therapy T1 - Hemmung der MYC-Funktion als Strategie für die zielgerichtete Tumortherapie N2 - A large fraction of human tumors exhibits aberrant expression of the oncoprotein MYC. As a transcription factor regulating various cellular processes, MYC is also crucially involved in normal development. Direct targeting of MYC has been a major challenge for molecular cancer drug discovery. The proof of principle that its inhibition is nevertheless feasible came from in vivo studies using a dominant-negative allele of MYC termed OmoMYC. Systemic expression of OmoMYC triggered long-term tumor regression with mild and fully reversible side effects on normal tissues. In this study, OmoMYC’s mode of action was investigated combining methods of structural biology and functional genomics to elucidate how it is able to preferentially affect oncogenic functions of MYC. The crystal structure of the OmoMYC homodimer, both in the free and the E-box-bound state, was determined, which revealed that OmoMYC forms a stable homodimer, and as such, recognizes DNA via the same base-specific DNA contacts as the MYC/MAX heterodimer. OmoMYC binds DNA with an equally high affinity as MYC/MAX complexes. RNA-sequencing showed that OmoMYC blunts both MYC-dependent transcriptional activation and repression. Genome-wide DNA-binding studies using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing revealed that OmoMYC competes with MYC/MAX complexes on chromatin, thereby reducing their occupancy at consensus DNA binding sites. The most prominent decrease in MYC binding was seen at low-affinity promoters, which were invaded by MYC at oncogenic levels. Strikingly, gene set enrichment analyses using OmoMYC-regulated genes enabled the identification of tumor subgroups with high MYC levels in multiple tumor entities. Together with a targeted shRNA screen, this identified novel targets for the eradication of MYC-driven tumors, such as ATAD3A, BOP1, and ADRM1. In summary, the findings suggest that OmoMYC specifically inhibits tumor cell growth by attenuating the expression of rate-limiting proteins in cellular processes that respond to elevated levels of MYC protein using a DNA-competitive mechanism. This opens up novel strategies to target oncogenic MYC functions for tumor therapy. N2 - Eine Vielzahl humaner Tumore entsteht durch die aberrante Expression des Onkoproteins MYC. Da MYC als Transkriptionsfaktor viele zelluläre Prozesse reguliert, ist er auch maßgeblich an der Entwicklung von normalem Gewebe beteiligt. Die direkte Hemmung von MYC stellt eine große Herausforderung für die Wirkstoffentwicklung dar. Studien mit dem dominant-negativen MYC-Allel namens OmoMYC belegten, dass MYC ein potenzieller Angriffspunkt für die zielgerichtete Tumortherapie ist. Die systemische Expression dieser MYC-Mutante löste eine dauerhafte Tumorregression aus und zeigte milde sowie vollständig reversible Nebenwirkungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus von OmoMYC untersucht, wobei sowohl Methoden der Strukturbiologie als auch der funktionalen Genomik angewendet wurden. Die Kristallstruktur des OmoMYC Proteins wurde im freien und E-Box-gebundenen Zustand bestimmt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass OmoMYC ein stabiles Homodimer bildet. Als solches erkennt es DNA mittels derselben basenspezifischen Interaktionen wie der MYC/MAX-Komplex. Dabei bindet OmoMYC DNA mit einer ähnlichen Affinität wie das MYC/MAX-Heterodimer. Die genomweite Expressionsanalyse mittels RNA-Sequenzierung identifiziert eine Reduktion sowohl der MYC-abhängigen Transkriptionsaktiverung als auch der Transkriptionsrepression durch OmoMYC. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung wird gezeigt, dass OmoMYC mit MYC/MAXKomplexen auf Chromatin konkurriert und so deren Besetzung global an Konsensus-Bindestellen verringert. Die stärkste Reduktion zeigt sich an Promoterregionen mit schwacher Affinität für die MYC-Bindung, welche durch onkogene MYC-Proteinmengen aufgefüllt werden. Gene set enrichment-Analysen unter Berücksichtigung von OmoMYC-regulierten Genen erlaubten die Identifizierung von Tumor-Subgruppen mit hohen MYC-Proteinmengen in zahlreichen Tumorentitäten. Zusammen mit einem fokussierten shRNA-Screen können so neue Zielproteine für die Bekämpfung von MYC-getriebenen Tumoren, wie zum Beispiel ATAD3A, BOP1 und ADRM1, identifiziert werden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass OmoMYC spezifisch das Tumorzellwachstum inhibiert, indem es die Expression von zentralen Proteinen limitiert, welche durch erhöhte MYC-Proteinmengen reguliert werden. Somit können neue Strategien zur Tumortherapie identifiziert werden, die auf onkogene Funktionen von MYC zielen. KW - Myc KW - Kristallstruktur KW - Transkription KW - Bauchspeicheldrüsenkrebs KW - DNS-Bindung KW - OmoMYC KW - promoter invasion Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146993 ER - TY - JOUR A1 - Kaltdorf, Martin A1 - Srivastava, Mugdha A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Liang, Chunguang A1 - Binder, Jasmin A1 - Dietl, Anna-Maria A1 - Meir, Zohar A1 - Haas, Hubertus A1 - Osherov, Nir A1 - Krappmann, Sven A1 - Dandekar, Thomas T1 - Systematic Identification of Anti-Fungal Drug Targets by a Metabolic Network Approach JF - Frontiers in Molecular Bioscience N2 - New antimycotic drugs are challenging to find, as potential target proteins may have close human orthologs. We here focus on identifying metabolic targets that are critical for fungal growth and have minimal similarity to targets among human proteins. We compare and combine here: (I) direct metabolic network modeling using elementary mode analysis and flux estimates approximations using expression data, (II) targeting metabolic genes by transcriptome analysis of condition-specific highly expressed enzymes, and (III) analysis of enzyme structure, enzyme interconnectedness (“hubs”), and identification of pathogen-specific enzymes using orthology relations. We have identified 64 targets including metabolic enzymes involved in vitamin synthesis, lipid, and amino acid biosynthesis including 18 targets validated from the literature, two validated and five currently examined in own genetic experiments, and 38 further promising novel target proteins which are non-orthologous to human proteins, involved in metabolism and are highly ranked drug targets from these pipelines. KW - metabolism KW - targets KW - antimycotics KW - modeling KW - structure KW - interaction KW - fungicide Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147396 VL - 3 ER -