TY  - THES
A1  - Hofstetter, Christine
T1  - Inhibition of H3K27me-Specific Demethylase Activity During Murine ES cell Differentiation Induces DNA Damage Response
T1  - Inhibierung der H3K27me-Spezifischen Demethylase Aktivität in Murin Differenzierenden ES Zellen Induziert die DNA Schadensantwort
N2  - Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms.
During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation.
KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation.
In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells.
N2  - Stammzellen sind definiert durch ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und dem Potential in multiple Zellinien zu differenzieren. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) können sich fortlaufend erneuern und besitzen zudem das Potential, in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm) zu differenzieren. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaften sind ES Zellen seit Jahrzehnten im Focus der Wissenschaft. Wenn ES Zellen differenzieren, sind sie in der Lage, sphäroid-förmige Aggregate zu bilden, welche als embryoide Körperchen (EBs) bezeichnet werden. In EBs finden sich Zellen aller 3 Keimblätter und daher dienen sie als in vitro Modell für frühe embryonale Entwicklung.
Während der ES Zell Differenzierung verändert die De-repression oder Repression von Genen die Struktur des Chromatins. ES Zellen besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die mit der Regulation des Chromatins assoziiert sind, einschließlich post-translationale Modifikationen an Histonen. Post-translationale Histon- methylierung gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Modifikationen und spielen z.B. ein wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Bis zur Entdeckung der ersten Histon-Demethylase KDM1A im Jahre 2004 glaubte man, dass Modifikationen an Histonen irreversible sind. Bislang wurden jedoch eine Vielzahl an Histon-Demethylasen identifiziert, welche mit der Genregulation, sowie der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzelle in Verbindung gebracht werden konnten.
KDM6A und KDM6B sind H3K27me3/2-spezifische Histon-Demethylasen, welche bei der posterioren Entwicklung durch Regulation der Hox Gene eine wichtige Rolle spielen. Bislang ist über die molekulare Funktion von KDM6A und KDM6B in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen wenig bekannt. Um die KDM6A und KDM6B Demethylase Aktivität in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen außer Kraft zu setzten kam ein spezifischer Inhibitor (GSK-J4) zum Einsatz. Die Behandlung mit GSK-J4 zeigte keine Auswirkungen auf die Viabilität oder Proliferation von nicht differenzierten ES Zellen. Jedoch war die Differenzierung von
ES Zellen in Gegenwart von GSK-J4 inhibiert und zeigte einen erhöhten G1-Phase Arrest sowie eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen. Eine globale Transkriptionsanalyse in frühen differenzierenden ES Zellen, in Gegenwart von GSK- J4 zeigte, dass lediglich eine relativ geringe Zahl von Genen differenziell reguliert war. Dabei waren mehr Gene hochreguliert als herunterreguliert. Viele der hochregulierten Gene konnten mit der DNA Schadensantwort in Verbindung gebracht werden. In Übereinstimmung damit konnte in Gegenwart von GSK-J4 in differenzierenden ES Zellen DNA Schaden nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation von H3K27me3 oder KDM6B mit γH2AX markierten Foci, welche DNA Schaden markieren, konnte nicht nachgewiesen werden. Nichts desto trotz zeigten GSK-J4 behandelte, differenzierende Eed KO ES Zellen, welche keine H3K27me3 Modifikation besitzen, eine abgemilderte DNA Schadensantwort. In Anwesenheit von GSK-J4 konnte während der hämatopoetischen Differenzierung eine reduzierte Kolonie-Bildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass in Anwesenheit von GSK-J4 ebenfalls auch die hämatopoetische Differenzierung inhibiert wird.
Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass die enzymatische Aktivität von KDM6A und KDM6B für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands nicht essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die enzymatische Aktivität von beiden Proteinen unabdingbar für die ES Zell sowie die hämatopoetische Differenzierung. Die enzymatische Inhibierung von KDM6A und KDM6B führt während der Differenzierung zu einem erhöhten DNA Schaden, wodurch die DNA Schadensantwort aktiviert wird. Somit sind KDM6A und KDM6B mit DNA Schaden und der DNA Schadensantwort assoziiert.
KW  - Embryonale Stammzelle
KW  - Epigenetic
KW  - Maus
KW  - Histone
KW  - Demethylierung
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Epigenetik
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107023
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seitz, Florian
T1  - Synthesis, enzymatic recognition and antiviral properties of modified purine nucleosides
T1  - Synthese, enzymatische Erkennung und antivirale Eigenschaften modifizierter Purin-Nukleoside
N2  - Beyond the four canonical nucleosides as primary building blocks of RNA, posttranscriptional modifications give rise to the epitranscriptome as a second layer of genetic information. In eukaryotic mRNA, the most abundant posttranscriptional modification is N6-methyladenosine (m6A), which is involved in the regulation of cellular processes. Throughout this thesis, the concept of atomic mutagenesis was employed to gain novel mechanistic insights into the substrate recognition by human m6A reader proteins as well as in the oxidative m6A demethylation by human demethylase enzymes. Non-natural m6A atomic mutants featuring distinct steric and electronic properties were synthesized and incorporated into RNA oligonucleotides. Fluorescence anisotropy measurements using these modified oligonucleotides revealed the impact of the atomic mutagenesis on the molecular recognition by the human m6A readers YTHDF2, YTHDC1 and YTHDC2 and allowed to draw conclusions about structural prerequisites for substrate recognition. Furthermore, substrate recognition and demethylation mechanism of the human m6A demethylase enzymes FTO and ALKBH5 were analyzed by HPLC-MS and PAGE-based assays using the modified oligonucleotides synthesized in this work. 
Modified nucleosides not only expand the genetic alphabet, but are also extensively researched as drug candidates. In this thesis, the antiviral mechanism of the anti-SARS-CoV-2 drug remdesivir was investigated, which causes delayed stalling of the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). Novel remdesivir phosphoramidite building blocks were synthesized and used to construct defined RNA-RdRp complexes for subsequent studies by cryogenic electron microscopy (cryo-EM). It was found that the 1'-cyano substituent causes Rem to act as a steric barrier of RdRp translocation. Since this translocation barrier can eventually be overcome by the polymerase, novel derivatives of Rem with potentially improved antiviral properties were designed.
N2  - Über die vier kanonischen Nukleoside als primäre RNA-Bausteine hinausgehend bauen posttranskriptionelle Modifikationen eine zweite Informationsebene, das Epitranskriptom, auf. Die häufigste posttranskriptionelle Modifikation in eukaryotischer mRNA ist N6-Methyladenosin (m6A), welches in die Regulierung zellulärer Prozesse involviert ist. In dieser Arbeit wurde das Konzept der atomaren Mutagenese genutzt, um neue Einblicke in die Erkennung von m6A durch menschliche m6A-bindende Proteine sowie in die oxidative Demethylierung von m6A durch menschliche Demethylase-Enzyme zu gewinnen. Es wurden nicht natürlich vorkommende m6A Atommutanten mit unterschiedlichen elektronischen und sterischen Eigenschaften synthetisiert und in RNA-Oligonukleotide eingebaut. Durch Fluoreszenzanisotropie-Messungen mit diesen Oligonukleotiden wurde der Einfluss der Atommutagenese auf die molekulare Erkennung durch die menschlichen m6A-bindenden Proteine YTHDF2, YTHDC1 und YTHDC2 untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse ließen Rückschlüsse auf die strukturellen Voraussetzungen für die Erkennung eines Substrates zu. Weiterhin wurden die in dieser Arbeit synthetisierten modifizierten Oligonukleotide zur Untersuchung von Substraterkennung und Demethylierungs-Mechanismus der menschlichen
m6A-Demethylasen FTO und ALKBH5 mittels HPLC-MS- und PAGE-basierter Analysen verwendet. 
Modifizierte Nukleoside dienen nicht nur zur Erweiterung des genetischen Alphabets, sondern werden auch als potentielle Wirkstoff-Kandidaten erforscht. In dieser Arbeit wurde der antivirale Wirkmechanismus des Anti-SARS-CoV-2-Wirkstoffes Remdesivir untersucht, der eine verzögerte Blockade der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) bewirkt. Neuartige Remdesivir Phosphoramidit-Bausteine wurden synthetisiert und genutzt, um RNA-RdRp-Komplexe mit definierter Struktur zu konstruieren, welche anschließend mittels Cryoelektronenmikroskopie (Cryo-EM) untersucht wurden. Es wurde herausgefunden, dass der 1'-Cyano-Substituent dazu führt, dass Rem als sterische Blockade der RdRp-Translokation agiert. Da diese Tranlokationsbarriere von der Polymerase überwunden werden kann, wurden neuartige Rem-Derivate mit potentiell verbesserten antiviralen Eigenschaften entworfen.
KW  - Nucleinsäuren
KW  - Nucleoside
KW  - Demethylierung
KW  - COVID-19
KW  - SARS-CoV-2
KW  - Demethylase
KW  - Epitranskriptom
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313238
ER  -