TY - THES A1 - Fusi, Lorenza T1 - Crosstalk between the MEK5/ERK5 and PKB/FoxO pathways: underlying mechanism and its relevance for vasoprotection and tumorigenesis T1 - Interaktion zwischen dem MEK5/ERK5-Signalweg und der PKB/FoxO Signalkaskade: zugrunde liegender Mechanismus und seine Relevanz für Gefäßerhalt und Tumorgenese N2 - Forkhead box O transcription factors are a family of proteins involved in cellular processes downstream of the Insulin-PI3K-PKB pathway. In response to extra- or intracellular stresses, for example starvation or oxidative stress, FoxOs are required to direct cell cycle progression and apoptosis. In endothelial cells, they induce apoptosis, and their deregulation is linked to diseases involving the insulin pathway, such as diabetes. FoxOs also exhibit a complex role in tumour transformation: here their main function is to suppress tumorigenesis. In both physiological and cancer contexts, FoxO activation leads to the transcription of some general targets, such as p27kip1 or IGFBP1. The FoxOs can also induce tissue-specific genes, as ANGPT2 and BIM in the endothelium. In endothelial cells, another pathway with a pivotal function is the MEK5/ERK5 MAPK signalling way. Its activation promotes cell survival and proliferation in stressful conditions, e.g., when blood vessels are exposed to the shear forces exerted by the blood stream. Furthermore, recent data described ERK5 as a kinase directing tumour resistance upon therapy-induced stress. Comparing their reported roles in various tumours and in the endothelium, FoxO proteins and the MEK5/ERK5 MAPK cascade appear to exert opposite functions. First non-published data confirmed the hypothesis that FoxO factors are subject to a negative modulation by the MEK5/ERK5 pathway. Hence, one goal of this PhD project was to further characterise this crosstalk at molecular level. The major mechanism of FoxO regulation is the balance among several post translational modifications, such as phosphorylation, acetylation, and ubiquitination. Most importantly, the PKB dependent phosphorylation of FoxOs negatively controls their activity, and it is critical for their subcellular localization. Therefore, the regulation of FoxO localization as mechanism of ERK5 dependent suppression was studied, but the results presented in this thesis argue against this hypothesis. However, additional experiments are required to explore the impact of ERK5 activity on FoxO post-translational modifications. FoxO activity can also be modulated by the interaction with other proteins, which in turn could explain general- and tissue-specific gene expression. Thus, another objective of this work was to investigate FoxO3-interactome in endothelial cells and the impact of MEK5/ERK5 activation on it. As published in (Fusi et al. 2022) and presented here, this analysis unveiled TRRAP as new FoxO bound protein in several cell types. Moreover, the interaction did not rely on the capacity of the FoxOs to bind their consensus DNA sequences at the promoter of target genes. Functional data demonstrated that TRRAP is required for FoxO-dependent gene transcription in endothelial and osteosarcoma cells. In addition, TRRAP expression in the endothelium is important for FoxO induced apoptosis. In summary, the interaction between FoxO factors and TRRAP revealed a new regulatory mechanism of FoxO-dependent gene transcription. It remains to be analysed whether the MEK5/ERK5 cascade may exert its suppressive effect on FoxO activity by interfering with their binding to TRRAP and whether such a mechanism may be relevant for tumorigenesis. N2 - Forkhead-Box-O-Proteine sind eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die an verschiedenen zellulären Prozessen stromabwärts des Insulin-PI3K-PKB-Signalwegs beteiligt sind. Als Reaktion auf extra- oder intrazelluläre Stressfaktoren, wie Wachstumsfaktorentzug oder oxidativen Stress, werden die FoxOs benötigt, um Zellzyklusprogression und Apoptose zu regulieren. In Endothelzellen induzieren sie Apoptose und ihre Fehlregulation ist mit Krankheiten, bei denen der Insulinsignalweg involviert ist, wie etwa Diabetes mellitus, verbunden. FoxOs spielen auch eine komplexe Rolle bei der Tumortransformation: Hier besteht ihre Hauptfunktion darin, die Tumorentstehung zu unterdrücken. Sowohl im physiologischen als auch im Kontext von Krebs führt die FoxO-Aktivierung zur Transkription verschiedener allgemeiner Zielgene, wie p27kip1, BIM oder IGFBP1. Die FoxOs können aber auch gewebespezifische Gene, wie zum Beispiel ANGPT2 im Endothel, induzieren. Ein weiterer Signalweg mit wichtiger Funktion in Endothelzellen ist der MEK5/ERK5-MAPK Signalweg. Seine Aktivierung fördert das Überleben und Wachstum von Zellen unter Stressbedingungen, wie z. B. wenn Blutgefäße durch den Blutstrom Schubspannungskräften ausgesetzt sind. Darüber hinaus zeigen neuere Daten, dass ERK5 auch an der Tumorresistenzentwicklung unter therapieinduziertem Stress beteiligt ist. Ein Vergleich der bekannten Rolle beider Signalwege im Endothel und bei der Tumorgenese, impliziert eine mutmaßlich gegensätzliche Funktion von FoxO Proteinen und der MEK5/ERK5-MAPK Kaskade. Erste unveröffentlichte Daten stützen die Hypothese, dass FoxO Faktoren einer Negativregulation durch MEK5/ERK5 unterliegen. Ein Ziel dieses Promotionsprojekts, war es daher diesen Zusammenhang auf molekularer Ebene näher zu charakterisieren. Die FoxO-Regulierung ist primär das Zusammenspiel mehrerer posttranslationaler Modifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung und Ubiquitinierung. Der wichtigste Regulationsmechanismus ist dabei die inhibitorische Phosphorylierung durch die Kinase PKB, welche die transkriptionelle FoxO-Aktivität hemmt und deren subzelluläre Lokalisierung ins Zytoplama fördert. Daher wurde zunächst der Einfluss von ERK5 auf die FoxO-Lokalisierung untersucht. Die Daten dieser Arbeit sprechen gegen einen Einfluss von der ERK5 Aktivität auf FoxO Lokalisation, doch sind zusätzliche Experimente erforderlich, um dessen Wirkung auf das Muster der posttranslationalen Modifikation der FoxOs zu klären. FoxO-Aktivität kann auch durch die Interaktion mit anderen Proteinen moduliert werden, die wiederum auch die allgemeine und gewebespezifische Genexpression steuern könnten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es daher, das FoxO3-Interaktom in Endothelzellen und den Einfluss forcierter MEK5/ERK5-Aktivierung darauf zu untersuchen. Wie in (Fusi et al. 2022) gezeigt und hier vorgestellt, führte diese Analyse zur Identifikation von TRRAP als neuem generellen FoxO Bindepartner. Die zelltypunabhängige Interaktion beider Proteine beruhte dabei nicht auf der Fähigkeit der FoxOs direkt an ihre Konsensus-DNA-Sequenzen in den Promotoren ihrer Zielgene zu binden. Funktionelle Daten zeigten nachfolgend, dass TRRAP entscheidend zur FoxO abhängigen Gentranskription in Endothel- und Osteosarkomzellen beiträgt. Darüber hinaus ist TRRAP im Endothel für die effiziente Apoptoseinduktion durch FoxOs wichtig. Zusammenfassend offenbarte die Interaktion zwischen FoxO-Faktoren und TRRAP einen neuen Regulationsmechanismus der FoxO-abhängigen Gentranskription. Es bleibt zu prüfen, ob die MEK5/ERK5 Kaskade FoxOs dadurch hemmt, dass sie die Bindungsfähigkeit von FoxO an TRRAP stört, und ob die beobachtete FoxO-TRRAP Interaktion auch im Kontext der Tumorgenese von Bedeutung ist. KW - Endothel KW - MAP-Kinase KW - Apoptosis KW - FoxO transcription factors KW - MEK5/ERK5 cascade KW - TRRAP KW - Crosstalk KW - Forkhead-Box-Proteine KW - Endothelium KW - Forkhead Transcription Factors Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296769 ER - TY - THES A1 - Chen, Wenchun T1 - Studies on the role of calcium channels and the kinase domain of transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) in platelet function T1 - Studien über die Rolle von Calcium Kanälen und der Kinase Dömane von transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) für die Thrombozytenfunktion N2 - Platelet activation and aggregation are essential processes for the sealing of injured vessel walls and preventing blood loss. Under pathological conditions, however, platelet aggregation can lead to uncontrolled thrombus formation, resulting in irreversible vessel occlusion. Therefore, precise regulation of platelet activation is required to ensure efficient platelet plug formation and wound sealing but also to prevent uncontrolled thrombus formation. Rapid elevations in the intracellular levels of cations are a core signaling event during platelet activation. In this thesis, the roles of Ca2+ and Mg2+ channels in the regulation of platelet function were investigated. Orai1, the major store-operated calcium (SOC) channel in platelets, is not only vital for diverse signaling pathways, but may also regulate receptor-operated calcium entry (ROCE). The coupling between the Orai1 signalosome and canonical transient receptor potential channel (TRPC) isoforms has been suggested as an essential step in the activation of store-operated calcium entry (SOCE) and ROCE in human platelets. However, the functional significance of the biochemical interaction between Orai and TRPC isoforms still remains to be answered. In the first part of this thesis, the functional crosstalk between Orai1 and TRPC6 was addressed. Orai1-mediated SOCE was found to enhance the activity of phospholipases (PL) C and D, to increase diacylglycerol (DAG) production and finally to regulate TRPC6-mediated ROCE via DAG, indicating that the regulation of TRPC6 channel activity seems to be independent of the physical interaction with Orai1. Furthermore, Orai1 and TRPC6 double deficiency led to a reduced Ca2+ store content and basal cytoplasmic Ca2+ concentrations, but surprisingly also enhanced ATP secretion, which may enhance Ca2+ influx via P2X1 and compensate for the severe Ca2+ deficits seen in double mutant platelets. In addition, Orai1 and TRPC6 were not essential for G protein-coupled receptor (GPCR)-mediated platelet activation, aggregation and thrombus formation. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) contains a cytosolic serine/threonine protein kinase. To date, a few in vitro substrates of the TRPM7 kinase have been identified, however, the physiological role of the kinase remains unknown. In the second part of this thesis, mice with a point mutation which blocks the catalytic activity of the TRPM7 kinase (Trpm7KI) were used to study the role of the TRPM7 kinase in platelet function. In Trpm7KI platelets phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) metabolism and Ca2+ mobilization were severely impaired upon glycoprotein (GP) VI activation, indicating that the TRPM7 kinase regulates PLC function. This signaling defect in Trpm7KI platelets resulted in impaired aggregate formation under flow and protected animals from arterial thrombosis and ischemic brain infarction. Altogether, these results highlight the kinase domain of TRPM7 as a pivotal signaling moiety implicated in the pathogenesis of thrombosis and cerebrovascular events. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sind zwei elementare Prozesse für das Abdichten verletzter Gefäßwände und damit zur Verhinderung von exzessivem Blutverlust. Unter pathologischen Bedingungen kann die Thrombozytenaggregation jedoch zur unkontrollierten Thrombusbildung und folglich zum irreversiblen Gefäßverschluss führen. Daher ist eine präzise Regulation der Thrombozytenaktivierung wichtig, um effizient Gefäßverletzungen zu schließen aber gleichzeitig eine unkontrollierte Thrombusbildung zu verhindern. Schnelle Veränderungen der zytoplasmatischen Konztentration von Kationen stellen ein Kernelement der Signaltransduktion während der Plättchenaktivierung dar. In dieser Arbeit wurden die Rolle von Ca2+ und Mg2+ Kanälen in der Regulation der Thrombozytenfunktion untersucht. Orai1, der bedeutendste store-operated calcium (SOC) Kanal in Thrombozyten, ist nicht nur entscheidend für verschiedene Signalwege, sondern reguliert möglicherweise auch receptor-operated calcium entry (ROCE). Die Kopplung zwischen dem Orai1-Signalkomplex und canonical transient receptor potential channel (TRPC) Isoformen wurde als entscheidender Schritt in der Aktivierung in der Aktivierung von store-operated calcium entry (SOCE) und ROCE in humanen Thrombozyten vermutet. Die Frage nach der funktionellen Relevanz der Interaktion zwischen Orai und TRPC Isoformen blieb jedoch unbeantwortet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der funktionelle Crosstalk zwischen Orai1 und TRPC6 adressiert. Hierbei zeigte sich, das Orai1-vermittelter SOCE die Aktivität der Phosholipasen (PL) C und D steigert, die Diacylglycerol (DAG) Produktion verstärkt und schließlich TRPC6-vermittelten ROCE via DAG reguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulation der TRPC6 Kanalaktivität unabhängig von einer direkten Interaktion mit Orai1 zu sein scheint. Darüber hinaus führte die Doppeldefizienz von Orai1 und TRPC6 zu verringerten Ca2+ Konzentrationen in intrazellulären Ca2+-Speichern und im Zytoplasma der Thrombozyten. Überraschenderweise war auch die ATP-Sekretion erhöht, was eventuell den Ca2+-Einstrom durch P2X1 verstärkt und möglicherweise das starke Ca2+-Defizit in den doppeldefizienten Thrombozyten kompensiert. Außerdem wurde gezeigt, dass Orai1 und TRPC6 nicht für die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sowie für die Thrombusbildung mittlels G protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) benötigt werden. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) enthält eine zytosolische Serin/Threonin-Kinase Domain. Bislang wurden zwar wenige in vitro Substrate der TRPM7 Kinase identifiziert, jedoch ist die physiologische Rolle dieser Kinase immer noch unbekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer Punktmutation, welche die katalytische Aktivität der TRPM7 Kinase blockiert (Trpm7KI) eingesetzt um die Rolle der TRPM7 Kinase für die Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In Trpm7KI Thrombozyten war der Metabolismus von phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und die Ca2+-Mobilisierung nach Aktivierung des Rezeptors Glykoprotein (GP) VI schwer beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der TRPM7 Kinase die Funktion der PLC reguliert. Aus diesem Signaltransduktionsdefekt in Trpm7KI Thrombozyten resultierte eine verringerte Aggregatbildung unter Flussbedingungen und ein Schutz der Tiere vor arteriellen Thrombosen und ischämischem Schlaganfall. Zusammenfassend heben diese Ergebnisse die Kinasedomäne von TRPM7 als einen ausschlaggebenden Bestandteil in Signalkaskaden hervor und implizieren eine Rolle dieser Domäne in der Pathogenese von ischämischen Kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Calciumkanal KW - Protein TRPC6 KW - Platelet KW - Orai1 KW - Crosstalk KW - TRPM7 kinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103719 ER -