TY - THES A1 - Jurak Begonja, Antonija T1 - NO/cGMP and ROS Pathways in Regulation of Platelet Function and Megakaryocyte Maturation T1 - NO/cGMP und ROS Singnalwege in Regulation der Plättchen Funktion und Megakaryozyten Entwicklung N2 - Blutplättchen spielen unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Hämostase. So verhindern sie ein andauerndes Bluten von Wunden, indem sie in Blutgefässen zwischen normalen Zellen des Endothels und beschädigten Bereichen unterscheiden und sich dort gezielt anheften können. Das Zusammenspiel der Plättchenagonisten und den dazugehörigen Rezeptoren wird durch intrazelluläre Signalmoleküle kontrolliert, die die Aktivierung der Blutplättchen regulieren. Äusserst wichtige intrazellulare Signalmoleküle stellen dabei die zyklischen Nukleotide cGMP und cAMP dar, die bei der Hemmung der Plättchen beteiligt sind. Die Bildung von cGMP und cAMP in den Blutplättchen wird durch die aus dem Endothel freigesetzten Moleküle NO und Prostacyclin (PGI2) stimuliert, die ihrerseits Blutplättchen hemmen, indem sie Proteinkinase G (PKG) und Proteinkinase A (PKA) aktivieren. Neuerdings wird vorgeschlagen, dass es sich bei ROS („reactive oxygen species“) um einen neuen Modulator bei der Signaltransduktion zwischen verschiedenen Zelltypen handelt. Die hier zusammengefasste Arbeit beschreibt die Rolle der ROS-Produktion bei der Aktivierung von Blutplättchen, die Beziehung zwischen dem NO/cGMP/PKG I Signalweg und der ROS bzw. MAP-Kinase Signaltransduktion, und die Rolle von zyklischen Nukleotiden bei der Entwicklung von Megakaryozyten und Blutplättchen. Werden Blutplättchen durch unterschiedliche Einflüsse aktiviert, so produzieren sie über die Aktivierung von NAD(P)H-Oxidase nur intrazelluläres aber nicht extrazelluläres ROS. Dabei beinflusst das in den Blutplättchen produzierte ROS signifikant die Aktivierung von αIIbβ3 Integrin, nicht jedoch die Sekretion von alpha- bzw. dichten Granula oder die Gestalt der Blutplättchen. Die Thrombin-induzierte Integrin αIIbβ3-Aktivierung ist nach Behandlung der Blutplättchen mit Hemmstoffen der NAD(P)H-Oxidase oder Superoxid-Fängern signifikant reduziert. Diese Inhibitoren reduzieren auch die Aggregation der Blutplättchen bzw. die Thrombusbildung auf Kollagen, wobei diese Effekte unabhängig vom NO/cGMP Signalweg vermittelt werden. Sowohl ADP, das von dichten Granula der Blutplättchen sezerniert wird und zur Aktivierung von P2Y12-Rezeptoren führt, als auch die Freigabe von Thromboxan A2 stellen wichtige, vorgeschaltete Vermittler bei der p38 MAP Kinase-Aktivierung durch Thrombin dar. Jedoch spielt die p38 MAP-Kinase-Aktivierung keine signifikante Rolle bei der Thrombin-induzierten Kalzium-Mobilisierung, P-Selektin Exprimierung, αIIbβ3 Integrin Aktivierung oder Aggregation der Blutplättchen. Abschliessend kann festgestellt werden, dass sich die Aktivierung der PKG insgesamt klar hemmend auf die p38 and ERK MAP-Kinasen in menschlichen Blutplättchen auswirkt. Desweiteren zeigt diese Studie, dass zyklische Nukleotide nicht nur die Blutplättchen hemmen, sondern auch einen Einfluss auf die Entwicklung der Megakaryozyten und Blutplättchen haben, aber auf unterschiedliche Weise. cAMP ist an der Differenzierung von embryonalen hämatopoietischen Zellen zu Megakaryozyten beteiligt, wobei cGMP keine Rolle bei diesem Prozess spielt. Während PKA in embryonalen Zellen schon vertreten ist, steigt beim Reifungsprozess der Megakaryozyten die Expression von Proteinen, die bei der cGMP Signalverbreitung („soluble guanylyl cyclase“, sGC; PKG) mitwirken, stetig an. In der letzten Phase der Reifung von Megakaryozyten, die durch die Freisetzung der Blutplättchen charakterisiert ist, zeigen cGMP und cAMP leicht divergierende Effekte: cGMP verstärkt die Bildung von Blutplättchen, während cAMP dieselbe reduziert. Dies deutet auf einen fein abgestimmten Prozess hin, abhängig von einem Stimulus, der von den benachbarten Zellen des Sinusoid-Endothels stammen könnte. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen zu einen besseren Verständnis der Regulation von Blutplättchen sowie der möglichen molekularen Mechanismen bei, die eine Rolle bei der Reifung von Megakaryozyten im vaskularen Mikroumfeld des Knochenmarks innehaben. N2 - In physiological conditions platelets have a major role in maintaining haemostasis. Platelets prevent bleeding from wounds by distinguishing normal endothelial cells in vasculature from areas with lesions to which they adhere. Interaction of platelet agonists and their receptors is controlled by intracellular signaling molecules that regulate the activation state of platelets. Very important intracellular signaling molecules are cyclic nucleotides (cGMP and cAMP), both involved in inhibition of platelet activation. Formation of cGMP and cAMP in platelets is stimulated by endothelial-derived NO and prostacyclin (PGI2), which then mediate inhibition of platelets by activating protein kinase G (PKG) and protein kinase A (PKA). Recently, it has been suggested that reactive oxygen species (ROS) represent new modulators of cell signaling within different cell types. The work summarized here describes the involvement of platelet ROS production in platelet activation, the relation of NO/cGMP/PKG I pathway to ROS and to mitogen-activated protein kinases (MAP kinase) signaling, and the involvement of cyclic nucleotides in megakaryocyte and platelet development. Platelets activated with different agonists produce intracellular but not extracellular ROS by activation of NAD(P)H oxidase. In addition, ROS produced in platelets significantly affects αIIbβ3 integrin activation but not alpha/dense granule secretion and platelet shape change. Thrombin induced integrin αIIbβ3 activation is significantly decreased after pretreatment of platelets with NAD(P)H oxidase inhibitors and superoxide scavengers. These inhibitors also reduce platelet aggregation and thrombus formation on collagen under high shear and achieve their effects independently of the NO/cGMP pathway. ADP secreted from platelet dense granules with subsequent activation of P2Y12 receptors as well as thromboxane A2 release are found to be important upstream mediators of p38 MAP kinase activation by thrombin. However, p38 MAP kinase activation does not significantly contribute to calcium mobilization, P-selectin expression, αIIbβ3 integrin activation and aggregation of human platelets in response to thrombin. Finally, PKG activation does not stimulate, but rather inhibit, p38 and ERK MAP kinases in human platelets. Further study revealed that cyclic nucleotides not only inhibit platelet activation, but are also involved, albeit differentially, in megakaryocyte and platelet development. cAMP is engaged in haematopoietic stem cell differentiation to megakaryocytes, and cGMP has no impact on this process. While PKA is already present in stem cells, expression of proteins involved in cGMP signaling (soluble guanylyl cyclase, sGC; PKG) increases with maturation of megakaryocytes. In the final step of megakaryocyte maturation that includes release of platelets, cGMP and cAMP have mild but opposing effects: cGMP increases platelet production while cAMP decreases it indicating a finely regulated process that could depend on stimulus coming from adjacent endothelial cells of sinusoids in bone marrow. The results of this thesis contribute to a better understanding of platelet regulation and of the possible molecular mechanisms involved in megakaryocyte maturation in bone marrow vascular microenvironment. KW - Thrombozyt KW - Megakaryozyt KW - Signaltransduktion KW - Stickstoffmonoxid KW - Cyclo-GMP KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Plättchen KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryozyten KW - Platelets KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryocytes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21954 ER - TY - THES A1 - Nikolaev, Viacheslav T1 - Development and application of fluorescent cAMP und cGMP biosensors T1 - Entwicklung und Anwendung fluoreszierender Biosensoren für cAMP und cGMP N2 - The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 μm/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of β1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications. N2 - Die zyklischen Nukleotide cAMP and cGMP sind zwei ubiquitäre Botenstoffe, die verschiedene physiologische Prozesse regulieren, vom Sehen und Gedächtnis bis zu Blutdruck und Thrombusbildung. Sie wirken über cAMP- und cGMP-abhängige Kinasen (PKA und GK), Kanäle und Epac. Obgleich die Funktionen von zyklischen Nukleotiden in klassischen biochemischen Studien gut untersucht sind, ermöglichen diese Methoden nicht, cAMP und cGMP in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu analysieren. In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzresonanzenergietransfer benutzt, um eine Technik für die Visualisierung von cAMP and cGMP in lebenden Zellen und in vitro zu entwickeln. Ligand-induzierte Konformationsänderung in einer einzelnen, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierten Bindungsdomäne diente als Grundlage für Biosensoren, die dynamische, hochsensitive Messungen von cAMP und cGMP ermöglichen. Bei solchen Sensoren wurden die chemischen und Bindungseigenschaften von unmodifizierten Domänen aufrechterhalten, was die cAMP- und cGMP-Messungen im physiologischen Konzentrationsbereich in lebenden Zellen ermöglicht. Für die Entwicklung der cAMP-Sensoren wurden die Domänen von PKA, Epac und von einem cAMP- gesteuerten HCN-Kanal benutzt. cGMP-Sensoren beruhen sich auf den Bindungsdomänen von GK und Phosphodiesterasen (PDEs). Mit Hilfe der auf Epac-basierten Sensoren wurde die cAMP-Dynamik in Neuronen und Makrophagen zeitlich und räumlich aufgelöst. In diesen Zellen diffundiert cAMP mit hoher Geschwindigkeit (~ 40 μm/s) frei durch das ganze Zytosol. Um die Mechanismen der cAMP-Kompartimentierung besser zu verstehen, wurden die kinetischen Eigenschaften der PDE2 in aldosteronproduzierenden Zellen analysiert. PDE2 ist imstande, große Mengen von cAMP äußerst schnell zu hydrolisieren, so dass die Geschwindigkeit der cAMP-Hydrolyse viel höher ist als von cAMP-Synthese, was eine Grundlage der cAMP-Kompartimentierung sein könnte. cAMP-Sensoren wurden auch benutzt, um eine klinisch relevante diagnostische Methode zu entwickeln, die Autoantikörper gegen β1-adrenergen Rezeptoren bei Herzinsuffizienzpatienten zuverlässig nachweist. Diese Methode hat ermöglicht, die Sensitivität der früher entwickelten Techniken zu verbessern. Konformationsänderung in einzelnen Bindungsdomänen von GK und PDE wurde als nächstes benutzt, um ein Reihe neuer fluoreszierender Biosensoren für cGMP zu entwickeln. Diese Sensoren zeigten hohe räumliche und zeitliche Auslösung und wurden zur Analyse schneller Dynamik von cGMP-Synthese und für cGMP-Imaging in Mesangialzellen angewandt. Zusammenfassend wurden hochsensitive Biosensoren für cAMP und cGMP auf Grund einzelner, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierter Bindungs-domäne entwickelt und in verschiedenen biologischen und klinisch relevanten Applikationen eingesetzt. KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Biosensor KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - Fluoreszenz KW - Sensor KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - fluorescence KW - sensor Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15673 ER -