TY - THES A1 - Zimmermann [née Papp], Lena T1 - Platelets as modulators of blood-brain barrier disruption and inflammation in the pathophysiology of ischemic stroke T1 - Thrombozyten als Modulatoren der Blut-Hirn-Schrankenstörung und Inflammation in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls N2 - Ischemia-reperfusion injury (I/R injury) is a common complication in ischemic stroke (IS) treatment, which is characterized by a paradoxical perpetuation of tissue damage despite the successful re-establishment of vascular perfusion. This phenomenon is known to be facilitated by the detrimental interplay of platelets and inflammatory cells at the vascular interface. However, the spatio-temporal and molecular mechanisms underlying these cellular interactions and their contribution to infarct progression are still incompletely understood. Therefore, this study intended to clarify the temporal mechanisms of infarct growth after cerebral vessel recanalization. The data presented here could show that infarct progression is driven by early blood-brain-barrier perturbation and is independent of secondary thrombus formation. Since previous studies unravelled the secretion of platelet granules as a molecular mechanism of how platelets contribute to I/R injury, special emphasis was placed on the role of platelet granule secretion in the process of barrier dysfunction. By combining an in vitro approach with a murine IS model, it could be shown that platelet α-granules exerted endothelial-damaging properties, whereas their absence (NBEAL2-deficiency) translated into improved microvascular integrity. Hence, targeting platelet α-granules might serve as a novel treatment option to reduce vascular integrity loss and diminish infarct growth despite recanalization. Recent evidence revealed that pathomechanisms underlying I/R injury are already instrumental during large vessel occlusion. This indicates that penumbral tissue loss under occlusion and I/R injury during reperfusion share an intertwined relationship. In accordance with this notion, human observational data disclosed the presence of a neutrophil dominated immune response and local platelet activation and secretion, by the detection of the main components of platelet α-granules, within the secluded vasculature of IS patients. These initial observations of immune cells and platelets could be further expanded within this thesis by flow cytometric analysis of local ischemic blood samples. Phenotyping of immune cells disclosed a yet unknown shift in the lymphocyte population towards CD4+ T cells and additionally corroborated the concept of an immediate intravascular immune response that is dominated by granulocytes. Furthermore, this thesis provides first-time evidence for the increased appearance of platelet-leukocyte-aggregates within the secluded human vasculature. Thus, interfering with immune cells and/or platelets already under occlusion might serve as a potential strategy to diminish infarct expansion and ameliorate clinical outcome after IS. N2 - Eine häufig auftretende Komplikation in der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls ist der Ischämie/Reperfusion Schaden (I/R Schaden), welcher trotz der erfolgreichen Wiederherstellung der zerebralen Durchblutung durch ein paradoxes Fortschreiten des entstandenen Gewebeschadens charakterisiert ist. Dieses Phänomen wird durch das schädigende Zusammenspiel von Thrombozyten und inflammatorischen Zellen am vaskulären Endothel verursacht. Allerdings sind die räumlich-temporalen und molekularen Mechanismen dieser zellulären Interaktionen und deren Beteiligung am Infarktwachstum noch nicht vollständig verstanden. Daraus folgend, beabsichtigte diese Arbeit eben diese temporalen Mechanismen des fortschreitenden Infarktwachstums nach der zerebralen Gefäßwiedereröffnung aufzuklären. Die hier vorgestellten Daten implizieren, dass das anhaltende Fortschreiten des Gewebeschadens durch die Schädigung der Bluthirnschranke verursacht wird und somit unabhängig vom Auftreten sekundär gebildeter Thromben ist. In vorangegangenen Studien konnte die Freisetzung von thrombozytären Granula als molekularer Mechanismus, mit welchem Thrombozyten zum I/R Schaden beitragen, aufgedeckt werden. Basierend auf diesen Studien wurde in dieser Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die Sekretion thrombozytärer Granula im Zusammenhang mit der Beeinträchtigung der endothelialen Barriere gelegt. Durch die Kombination eines in vitro Ansatzes mit einem murinen Model des ischämischen Schlaganfalls konnte gezeigt werden, dass α-Granula endothelialen Schaden verursachen, wohingegen deren Absenz (NBEAL2 Defizienz) zu einer verbesserten mikrovaskulären Integrität führte. Aufgrund dessen könnte das Adressieren der α-Granula als eine neuartige Therapieoption zum Erhalt der vaskulären Integrität und zur Verminderung des Infarktwachstums trotz Rekanalisation genutzt werden. Neuste Erkenntnisse enthüllten, dass die dem I/R Schaden zu Grunde liegenden Pathomechanismen bereits während des Verschlusses eines großen hirnversorgenden Gefäßes zu beobachten sind. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust von penumbralem Gewebe unter Okklusion und I/R Schädigung während der Reperfusion im engen Zusammenhang stehen. Im Einklang hiermit konnten humane Daten eine Neutrophilen-dominierte Immunantwort und lokale Thrombozyten Aktivierung und deren Sekretion, anhand der Detektion der α-Granula Hauptkomponenten, im verschlossenen Gefäßsystem von ischämischen Schlaganfall Patienten nachweisen. Diese anfänglichen Beobachtungen konnten im Rahmen dieser Arbeit anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen von lokal abgenommenen ischämischen Blutproben erweitert werden. Die Phänotypisierung von Immunzellen enthüllte eine bisher unbekannte Verschiebung der Lymphozyten Population hin zu CD4+ T-Zellen und bekräftigte zusätzlich das Konzept einer unmittelbaren intravaskulären Immunantwort, welche durch Granulozyten dominiert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Thesis das erste Mal das erhöhte Auftreten von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten in dem verschlossenen humanen Gefäßsystem nachgewiesen werden. Demzufolge könnte eine Beeinflussung von Immunzellen und/oder Thrombozyten bereits unter Okklusion als potentiell vielversprechende Strategie genutzt werden, um die Ausweitung des Infarktes einzuschränken und klinische Endpunkte nach einem ischämischen Schlaganfall zu verbessern. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Entzündung KW - Thrombo-inflammation KW - Ischemic stroke KW - Platelets KW - Inflamamtion KW - Immune cells KW - Vascular system Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302850 ER - TY - THES A1 - Baig, Ayesha Anjum T1 - Studies on platelet interactions with the coagulation system and on modulators of platelet (hem)ITAM signaling in genetically modified mice T1 - Studien zur Thrombozyteninteraktion mit der Gerinnungskaskade und Modulation des (hem)ITAM Signalwegs in genetisch veränderaten Mäusen N2 - Activated platelets and coagulation jointly contribute to physiological hemostasis. However, pathological conditions can also trigger unwanted platelet activation and initiation of coagulation resulting in thrombosis and precipitation of ischemic damage of vital organs such as the heart or brain. The specific contribution of procoagulant platelets, positioned at the interface of the processes of platelet activation and coagulation, in ischemic stroke had remained uninvestigated. The first section of the thesis addresses this aspect through experiments conducted in novel megakaryocyte- and platelet-specific TMEM16F conditional KO mice (cKO). cKO platelets phenocopied defects in platelets from Scott Syndrome patients and had severely impaired procoagulant characteristics. This led to decelerated platelet-driven thrombin generation and delayed fibrin formation. cKO mice displayed prolonged bleeding times and impaired arterial thrombosis. However, infarct volumes in cKO mice were comparable to wildtype (WT) mice in an experimental model of ischemic stroke. Therefore, while TMEM16F-regulated platelet procoagulant activity is critical for hemostasis and thrombosis, it is dispensable for cerebral thrombo-inflammation in mice. The second section describes the generation and initial characterization of a novel knockin mouse strain that expresses human coagulation factor XII (FXII) instead of endogenous murine FXII. These knockin mice had normal occlusion times in an experimental model of arterial thrombosis demonstrating that human FXII is functional in mice. Therefore, these mice constitute a valuable tool for testing novel pharmacological agents against human FXII – an attractive potential target for antithrombotic therapy. Glycoprotein (GP)VI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2)-mediated (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) signaling represent a major pathway for platelet activation. The last section of the thesis provides experimental evidence for redundant functions between the two members of the Grb2 family of adapter proteins - Grb2 and Gads that lie downstream of GPVI and CLEC-2 stimulation. In vitro and in vivo studies in mice deficient in both Grb2 and Gads (DKO) revealed that DKO platelets had defects in (hem)ITAM-stimulation-specific activation, aggregation and signal transduction that were more severe than the defects observed in single Grb2 KO or Gads KO mice. Furthermore, the specific role of these adapters downstream of (hem)ITAM signaling was essential for maintenance of hemostasis but dispensable for the known CLEC-2 dependent regulation of blood-lymphatic vessel separation. N2 - Aktivierte Thrombozyten und die Gerinnungskaskade bilden gemeinsam die Grundlage der physiologischen Hämostase. Daneben können jedoch auch pathologische Bedingungen Thrombozytenaktivierung herbeiführen und die Gerinnungskaskade auslösen und somit zum Gefäßverschluss führen, was häufig ischämische Schäden lebenswichtiger Organe wie beispielsweise des Herzens oder des Gehirns verursachen kann. Prokoagulante Thrombozy-ten befinden sich an der Schnittstelle zwischen Thrombozytenaktivierung und der Gerin-nungskaskade, ihre Funktion bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls wurde jedoch bisher nicht im Detail untersucht. Der erste Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Fragestellung durch die Analyse von neu generierten konditionalen, Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Tmem16f Knockout Mäusen. TMEM16F-defiziente Thrombozy-ten wiesen ähnliche Defekte wie die Thrombozyten von Scott-Syndrom-Patienten sowie stark beeinträchtigte prokoagulante Eigenschaften auf. Diese Defekte gingen mit signifikant verlangsamter thrombozytenabhängiger Thrombingenerierung und verzögerter Fibrinbildung einher. TMEM16F-Defizienz führte zu verlängerter Blutungszeit und beeinträchtigte in einem experimentellen Modell die Bildung arterieller Thromben. TMEM16F-defiziente Mäuse wiesen jedoch im Vergleich zu wildtypischen Mäusen keinerlei Unterschiede im experimentellen ischämischen Schlaganfall auf. TMEM16F-gesteuerte prokoagulante Thrombozytenfunktion ist demnach kritisch für Hämostase und Thrombose, während sie eine untergeordnete Rolle in zerebraler Thrombo-Inflammation spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Generierung und Erstbeschreibung einer neuen Mauslinie, welche den humanen Hageman-Faktor (FXII) anstelle des endogenen murinen FXII exprimiert. In den resultierenden Knock-in Mäusen war die Bildung okklusiver arterieller Thromben nach chemisch induzierter Gefäßverletzung nicht beeinträchtigt, was zeigt, dass der humane FXII im Maussystem voll funktionstüchtig ist. Somit können diese Mäuse in der Zukunft als ein wertvolles Werkzeug zum Testen neuer pharmakologischer Ansätze zur Herabsetzung der FXII-Aktivität eingesetzt werden, welche einen vielver-sprechenden Targets neuartiger antithrombotischer Behandlungsansätze darstellt. Die thrombozytären Rezeptoren Glykoprotein (GP)VI und C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) lösen (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelte Signalwege aus, welche eine eine Schlüsselrolle in der Thrombozytenaktivierung spielen. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit liefert experimentelle Hinweise für überlappende Funkti-onen der Adapterproteine Grb2 und Gads in der (hem)ITAM-anhängigen Signalkaskade. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass Grb2/Gads-doppeldefiziente Thrombozyten (hem)ITAM-spezifische Defekte in der Aktivierung, Aggregation und Signaltransduktion aufweisen, die im Vergleich zu einzeldefizienten Thrombozyten deutlich ausgeprägter sind und somit eine redundante Rolle der Adapterproteine offenbaren. Während Grb2 und Gads gemeinsam an der Aufrechterhaltung physiologischer Hämostase beteiligt sind, tragen sie nicht entscheidend zur bekannten CLEC-2-abhängigen Regulation der Trennung von Blut- und Lymphgefäßen bei. KW - Blutgerinnung KW - Thrombozyt KW - Signaltransduktion KW - Maus KW - Thrombosis KW - Thrombo-inflammation KW - TMEM16F KW - (hem)ITAM signaling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164888 ER -