TY - THES A1 - Vogg, Nora Johanna T1 - Mass spectrometry-based quantification of steroids for the diagnostic workup of adrenal tumors T1 - Massenspektrometrische Quantifizierung von Steroiden zur Diagnostik von Nebennierentumoren N2 - Tumors of the adrenal gland belong to the most frequent neoplasms in humans with a prevalence of 3–10 % in adults. The aim of the diagnostic workup is the identification of potentially hormone-secreting and / or malignant tumors, because most of these tumors will require surgical resection. Malignant adrenocortical carcinomas (ACC) are very rare and associated with a poor prognosis in advanced stages, therefore, an early and accurate diagnosis is crucial. Within this thesis, two liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) methods for the quantification of steroids in different biomaterials were developed to improve the diagnostic workup of adrenal tumors. First, an LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of cortisol and dexamethasone in serum samples after dexamethasone suppression test (DST) was developed, validated, and applied to 400 clinical samples. Newly established method-specific threshold concentrations for cortisol and dexamethasone increased DST specificity from 67.5 % to 92.4 % while preserving 100 % sensitivity. Second, an LC-MS/MS method for the quantification of eleven urinary steroids was developed and validated to improve the differentiation between ACC and adrenocortical adenomas (ACA). A decision tree requiring only two steroids was trained for classification and tested based on 24 h urine samples from 268 patients with adrenal tumor. Malignancy was excluded with a negative predictive value of 100 % in an independent validation cohort of 84 samples of 24-h urine. A newly proposed simplified diagnostic workflow with urinary steroid profiling as first tier test could obviate additional adrenal-specific imaging in 42 of 64 patients with ACA. The new DST method is already in clinical use at the University Hospital Würzburg, whereas the classification model based on urinary steroid profiling will require prospective validation in a larger cohort. N2 - Nebennierentumoren gehören zu den häufigsten Neoplasmen beim Menschen und treten mit einer Prävalenz von 3–10 % bei Erwachsenen über 50 Jahren auf. Häufig wird die Raumforderung zufällig im Rahmen einer bildgebenden Untersuchung erkannt. Die meisten dieser sogenannten Inzidentalome sind gutartige und hormoninaktive Nebennierenrindenadenome (ACA), die keine therapeutische Intervention erfordern. Das Ziel der Nebennierentumor-Diagnostik ist die Abklärung potentieller Hormonaktivität und Malignität, denn diese Tumoren müssen zum Großteil operativ entfernt werden. Hormonaktive Tumoren können benigne oder maligne sein und sind durch die autonome Sekretion von Steroidhormonen charakterisiert. Maligne Nebennierenrindenkarzinome (ACC) sind sehr selten, aber aggressiv und mit einer schlechten Prognose im fortgeschrittenen Tumorstadium assoziiert. Da die therapeutischen Möglichkeiten für das ACC limitiert sind, ist eine schnelle und sichere Diagnostik erforderlich. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden zur Quantifizierung von Steroiden in Biomaterialien entwickelt, um damit die Diagnostik von Nebennierentumoren zu verbessern. Der 1 mg-Dexamethason-Hemmtest (DST) ist ein häufig durchgeführter Screening-Test zur Untersuchung auf autonome Cortisolsekretion. Dabei wird die Supprimierbarkeit der Cortisolsekretion durch die orale Einnahme von Dexamethason überprüft. Eine LC-MS/MS Methode zur simultanen Quantifizierung von Cortisol und Dexamethason im Serum wurde entwickelt, validiert und zur Messung von 400 DST-Patientenproben genutzt. Durch methodenspezifische Schwellenwertkonzentrationen für Cortisol und Dexamethason konnte die klinische Testspezifität von 67.5 % auf 92.4 % bei unveränderter Sensitivität von 100.0 % erhöht werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Verbesserung der Unterscheidung von ACC und ACA. Dafür wurde eine LC-MS/MS Methode zur Quantifizierung von elf Steroiden im Urin entwickelt und validiert. Über die Messung von 24 h Sammelurinproben von 268 Nebennierenrindentumor-Patienten wurde ein Klassifikationsmodell, das auf nur zwei Steroiden basiert, trainiert und getestet. Sowohl die analytische Methode als auch das Klassifikationsmodell wurden hinsichtlich Robustheit und Zeiteffizienz optimiert, um sich möglichst gut in die klinische Routine implementieren zu lassen. Außerdem lag der Fokus auf einer einfachen, nachvollziehbaren und direkten Datenauswertung und -interpretation. Als ein Hauptergebnis konnte Malignität in einer unabhängigen Validierungskohorte von 84 Patienten mit einem negativen prädiktiven Wert von 100 % ausgeschlossen werden. Nach einem vereinfachten diagnostischen Schema mit der Urin-Steroid-Analytik als erstem Screening-Test könnte bei 42 von 64 Patienten mit ACA auf eine zusätzliche nebennierenspezifische Bildgebung verzichtet werden. Des Weiteren wurden erstmals Spontanurinproben als Surrogatmatrix für 24 h Sammelurin in der Validierungskohorte getestet. Dabei unterschied sich der positive prädiktive Wert der Spontanurine mit 86.7 % kaum von den 87.5 % der 24-h Sammelurine, während auch mit Spontanurin ein negativer prädiktiver Wert von 100 % erzielt werden konnte, was einen wichtigen Schritt in die Richtung einer vereinfachten Probensammlung darstellt. Sowohl die simultane Quantifizierung von Cortisol und Dexamethason als auch die 24-h Urin-Steroid-Methode haben ihre Eignung für die klinische Routineanwendung bewiesen. Der Transfer der Urinmethode auf den deutlich einfacheren Spontanurin erfordert jedoch eine prospektive Validierung in einer größeren Patientenkohorte. Die neue DST-Methode wurde bereits im September 2021 in die klinische Routine am Universitätsklinikum Würzburg eingeführt. KW - Nebennierentumor KW - HPLC-MS KW - Steroide KW - adrenal incidentaloma KW - adrenocortical carcinoma KW - adrenocortical adenoma KW - dexamethasone suppression test Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293438 N1 - A revised version of this manuscript has been published in Clinica Chimica Acta 2023 ER - TY - THES A1 - Sbiera, Iuliu T1 - Possible role of epithelial to mesenchymal transition and its associated FGF/FGFR pathway in adrenocortical carcinoma T1 - Mögliche Rolle des epithelial-mesenchymalen Transition und des damit verbundenen FGF/FGFR-Signalwegs beim Nebennierenrindenkarzinom N2 - Recent studies have hinted to an involvement of epithelial to mesenchymal transition, a mechanism often associated with metastasis in epithelial cancers, in adrenocortical carcinoma. In addition, the knowledge about the FGF/FGFR pathway in pathogenesis of the adrenal gland, a pathway often associated with the epithelial to mesenchymal transition, is sparse and fragmented. We assessed, in a large number of normal, benign and malignant adrenocortical tissues (a total of 181 different samples), the expression of canonical and novel epithelial and mesenchymal markers and compared it with their expression in typical epithelial and mesenchymal tissues. In addition, we also quantified the expression of most members of the FGF/FGFR pathway in adrenocortical tissues and compared it against well-studied epithelial and mesenchymal tissues as well as between malignant and not malignant adrenocortical tissues, in order to assess the possible connection to epithelial to mesenchymal transition and find possible drug targets. Surprisingly, both normal and neoplastic adrenocortical tissues lacked expression of epithelial markers (e.g. E-Cadhering or EpCAM) but strongly expressed mesenchymal markers (e.g. N-Cadherin or SLUG), suggesting a higher similarity of adrenocortical tissues to mesenchymal compared to epithelial tissues, reminiscent of the adrenocortical origin from the intermediate mesoderm. Despite their ubiquitous expression in all adrenocortical tissues, mesenchymal markers had a variable expression in adrenocortical carcinoma, associating either directly or inversely with different clinical markers of tumor aggressiveness. Lymph node infiltration was associated with high expression of SLUG (p = 0.04), and at the same time low expression of N-cadherin (p = 0.001), and the same pattern was observed for venous infiltration of tumoral tissue, Weiss score of tumor malignancy or Ki67 proliferation marker. In malignant compared to benign adrenal tumors, we found significant differences in the expression of 16 out of the 94 studied FGF receptor pathway related genes. Genes involved in tissue differentiation and metastatic spread through epithelial to mesenchymal transition were most strongly altered. The therapeutically targetable FGF receptors 1 and 4 were upregulated 4.6- and 6-fold, respectively, in malignant compared to benign adrenocortical tumors, which was confirmed by using two different quantification methods in both frozen and paraffin embedded tissue material. High expression of FGFR1 and 4 was significantly associated with worse patient prognosis (High FGFR1 expression was associated with a shorter overall patient survival of 84 vs 148 months (HR=1.8, 95% CI: 1.01-3.25) as well as a shorter resection free survival of 25 vs 75 months ((HR=2.93, 95% CI: 1.25-6.84), while high FGFR4 was associated with a much shorter overall survival of 50 vs 155 months (HR=2.44, 95% CI: 1.41-4.22). In conclusion, epithelial to mesenchymal transition does not seem to play a role in adrenocortical carcinoma tumor progression, and the FGF/FGFR pathway, even if it is probably not related to EMT, is nonetheless associated with tumor aggressiveness. Furthermore, quantification of FGF receptors may enable a stratification of adrenocortical carcinoma for the use of FGFR inhibitors in future clinical trials. N2 - Jüngste Studien weisen auf eine Beteiligung der epithelial-mesenchymalen Transition, ein Mechanismus der oft mit Metastasen bei Epithelkarzinomen assoziiert ist, beim Nebennierenrindenkarzinom hin. Darüber hinaus gibt es kaum Kenntnisse über die Rolle des FGF/FGFR-Signalweges in der Pathogenese der Nebenniere, ein Signalweg, der oft mit der epithelial-mesenchymalen Transition in Verbindung gebracht wird. Wir haben hier an einer großen Anzahl von normalen, gutartigen und bösartigen Nebennierenrindengewebeproben (insgesamt 181 Proben) die Expression von kanonischen und anderen epithelialen und mesenchymalen Markern untersucht und mit ihrer Expression in typischen epithelialen und mesenchymalen Geweben verglichen. Darüber hinaus, haben wir auch die Expression der meisten Mitglieder des FGF/FGFR-Signalwegs in Nebennierenrindengeweben quantifiziert und mit gut definierten epithelialen und mesenchymalen Geweben verglichen sowie zwischen bösartigen und nicht bösartigen Nebennierenrindengeweben, um die mögliche Verbindung zu epithelialer-mesenchymaler Transition zu finden und mögliche therapeutische Ziele zu identifizieren. Überraschenderweise konnte weder in normalem noch in neoplastischem Nebennierenrindengewebe die Expression von epithelialen Markern (z. B. E-Cadherin oder EpCAM) nachgewiesen werden. In beiden Geweben wurde aber eine starke Expression mesenchymaler Marker (z. B. N-Cadherin oder SLUG) gefunden, was auf eine größere Ähnlichkeit von Nebennierenrindengeweben zu mesenchymalen im Vergleich zu epithelialen Geweben hindeutet. Dies könnte mit der Entwicklung des Nebennierenrinden-gewebes aus dem intermediären Mesoderm erklärt werden. Trotz ihrer ubiquitären Expression in allen Nebennierenrindengeweben, hatten mesenchymale Marker eine variable Expression in Nebennierenrindenkarzinomen, die entweder direkt oder indirekt mit verschiedenen klinischen Markern der Tumoraggressivität assoziiert waren. Die Lymphknoteninfiltration war mit einer hohen Expression von SLUG (p = 0,04) und einer niedrigen Expression von N-Cadherin (p = 0,001) verbunden. Das gleiche Muster wurde für die venöse Infiltration von Tumorgewebe, dem Weiss-Score oder dem Ki67-Proliferationsmarker beobachtet. Signifikante Unterschiede in der Expression von 16 der 94 untersuchten Gene, die mit dem FGF-Rezeptorsignalweg in Verbindung stehen, wurden beim Vergleich von bösartigen und gutartigen Nebennierentumoren gefunden. Gene, die an der Gewebedifferenzierung und Metastasierung durch epithelial-mesenchymale Transition beteiligt sind, waren dabei am stärksten verändert. Die therapeutisch relevante FGF-Rezeptoren 1 und 4 waren bei malignen im Vergleich zu gutartigen Nebennierenrindentumoren 4,6- bzw. 6,0-fach hochreguliert. Dies wurde durch Verwendung zweier unabhängiger Quantifizierungsmethoden sowohl in gefrorenem als auch in paraffineingebettetem Gewebematerial bestätigt. Eine hohe Expression von FGFR1 und 4 war signifikant mit einer schlechteren Prognose verbunden. Eine hohe FGFR1-Expression war mit einem kürzeren Gesamtüberleben der Patienten von 84 vs. 148 Monaten (HR = 1,8; 95%CI: 1,01-3,25) sowie einem kürzeren resektions-freien Überleben von 25 vs. 75 Monaten (HR = 2,93; 95%CI: 1,25-6,84) verbunden, während eine höhere FGFR4-Expression mit einem viel kürzeren Gesamtüberleben von 50 vs. 155 Monaten assoziiert war (HR = 2,44; 95%CI: 1,41-4.22)). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Mechanismus der epithelial-mesenchymalen Transition keine Rolle bei der Tumorprogression des Nebennierenrindenkarzinoms zu spielen schein. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass der FGF/FGFR-Signalweg, auch wenn er wahrscheinlich nicht mit der EMT zusammenhängt, mit der Aggressivität der Tumoren assoziiert. Die Untersuchung der Expression der FGF-Rezeptoren könnte für die Stratifizierung des Nebennierenrindenkarzinoms, zwecks Verwendung von FGFR-Inhibitoren in zukünftigen klinischen Studien, benutzt werden. KW - Nebennierenrindenkrebs KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - adrenocortical carcinoma KW - epithelial to mesenchymal transition KW - fibroblast growth factors Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-277454 ER - TY - THES A1 - Liang, Raimunde T1 - Identification of new drug targets in adrenocortical carcinoma through targeted mRNA analysis T1 - Identifikation neuer Drug Targets im Nebennierenrindenkarzinom durch gezielte mRNA-Analyse N2 - Adrenocortical carcinomas (ACC) are aggressive tumors associated with a heterogeneous but generally poor prognosis and limited treatment options for advanced stages. Despite promising molecular insights and improved understanding of ACC biology, efficient targeted therapies have not been identified yet. Thus, this study aims to identify potential new drug targets for a future personalized therapeutic approach. RNA was isolated from 104 formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples from ACC patients, 40 of those 104 cases proved to be suitable for further mRNA analyses according to the quality check of the extracted RNA. Gene expression of 84 known cancer drug targets was evaluated by quantitative real-time PCR using 5 normal adrenal glands as reference. Protein expression was investigated for selected candidate drug targets by immunohistochemistry in 104 ACC samples, 11 adenomas and 6 normal adrenal glands. Efficacy of an available inhibitor of the most promising candidate was tested by functional in vitro experiments in two ACC cell lines (NCI-H295R and MUC1) alone or in combination with other drugs. Most frequently overexpressed genes were TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 and PLK1. Nuclear immunostaining of CDK1, CDK4 and PLK1 significantly correlated with the respective mRNA expression. CDK4 was chosen as the most promising candidate for functional validation as it is actionable by FDA-approved CDK4/6 inhibitors. ACC samples with copy number gains at CDK4 locus presented significantly higher CDK4 expression levels. The CDK4/6 inhibitor palbociclib showed a concentration- and time- dependent reduction of cell viability in vitro, which was more pronounced in NCI-H295R than in MUC1 cells. This was in line with higher CDK4 expression at western blot analysis in NCI-H295R cells. Furthermore, palbociclib was applied in combination with dual IGFR/IR inhibitor linsitinib showing a synergistic effect on reducing cell viability. In conclusion, this proof-of-principle study confirmed RNA profiling to be useful to discover potential drug targets. Detected drug targets are suitable to be investigated by immunohistochemistry in the clinical setting. Moreover, CDK4/6 inhibitors are promising candidates for treatment of a subset of patients with tumors presenting CDK4 copy number gains and/or overexpression, while linsitinib might be an interesting combination partner in patients with both IGF2 and IGF1R overexpression. These results are intended as a basis for a validation study in a prospective cohort, further evaluation in vivo in suitable mouse models or testing in patients with ACC in clinical trials are needed and might improve the future management of patients with ACC in terms of precision medicine. N2 - Nebennierenrindenkarzinome (ACC) sind aggressive Tumore, die mit einer heterogenen, aber insgesamt ungünstigen Prognose sowie limitierten therapeutischen Optionen für fortgeschrittene Stadien assoziiert sind. Trotz hoffnungsvoll stimmenden molekularen Einblicken und verbessertem Verständnis für die Biologie des ACC wurden bisher keine effektiven Targeted Therapies (zielgerichtete Therapien) identifiziert. Daher strebt diese Studie die Identifikation potentieller neuer Drug Targets (Arzneimittelzielpunkte) im Rahmen einer zukünftigen personalisierten Therapie an. RNA wurde von 104 formalinfixierten und paraffineingebetteten Tumorproben von ACC Patienten isoliert, 40 der 104 Fälle zeigten sich nach der Qualitätsprüfung der extrahierten RNA geeignet für weiterführende mRNA-Analysen. Genexpression von 84 bekannten Karzinom-Drug Targets wurden durch quantitative Real-Time PCR unter Nutzung von 5 normalen Nebennieren als Referenz evaluiert. Proteinexpression wurde in selektierten Kandidaten-Drug Targets durch Immunhistochemie in 104 ACC-Proben, 11 Adenomen und 6 normalen Nebennieren untersucht. Das Potential eines verfügbaren Inhibitors gegen das vielversprechendste Kandidatengen wurde in funktionalen in vitro Experimenten mit zwei ACC-Zelllinien (NCI-H295R und MUC1) allein und in Kombination mit einem anderen Medikament getestet. Die am häufigsten überexprimierten Gene stellten TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 und PLK1 dar. Die immunhistologische Kernfärbung für CDK1, CDK4 und PLK1 korrelierten signifikant mit der jeweiligen mRNA-Expression. CDK4 wurde als erfolgversprechendster Kandidat für weitere funktionale Validierung ausgewählt, da es durch FDA-genehmigte CDK4/6-Inhibitoren angreifbar ist. ACC-Proben mit Copy Number Gains des CDK4 Genlocus zeigten signifikant höhere CDK4 Expressionslevel. Der CDK4/6-Inhibitor Palbociclib wies eine zeit- und konzentrationsabhängige Reduktion der Zellviabilität in vitro auf, welche ausgeprägter in NCI-H295R- als in MUC1-Zellen war. Dies war in Einklang mit stärkerer CDK4 Expression in den NCI-H295R-Zellen in der Western Blot Analyse. Weiterhin wurde Palbociclib in Kombination mit dem dualen IGFR/IR-Inhibitor Linsitinib eingesetzt, dies zeigte einen synergistischen Effekt auf die Reduktion der Zellviabilität. Zusammenfassend bestätigte diese Proof-of-Principle den Nutzen von RNA Profiling zur Erfassung potentieller Drug Targets. Die ermittelten Drug Targets sind geeignet für immunhistochemische Untersuchungen im klinischen Setting. Darüber hinaus sind CDK4/6-Inhibitoren vielversprechende Kandidaten für die Behandlung einer Teilgruppe von Patienten mit Tumoren, die CDK4-Copy Number Gains und/oder -Überexpression aufweisen, während Linsitinib ein interessanter Kombinationspartner in Patienten mit sowohl IGF2- wie auch IGF1R-Überexpression darstellen könnte. Diese Resultate sollen als Basis für eine Validationsstudie in einer prospektiven Kohorte dienen, weitere Evaluation in vivo in geeigneten Mausmodellen oder Untersuchung in ACC-Patienten in klinischen Studien sind erforderlich und könnten das zukünftige Management von ACC-Patienten verbessern im Rahmen der Präzisionsmedizin. KW - Adrenokortikales Karzinom KW - CDK4 Inhibitor KW - Präzisionsmedizin KW - gezielte Therapie KW - Palbociclib KW - adrenocortical carcinoma KW - precision medicine KW - CDK4 inhibitor KW - ACC KW - targeted therapy Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235545 ER -