TY  - THES
A1  - Sippel, Martin
T1  - Computational Structure-based Design Approaches: Targeting HIV-1 Integrase and the Macrophage Infectivity Potentiator of Legionella pneumophila
T1  - Computergestütztes strukturbasiertes Design bei HIV-1 Integrase und dem Macrophage Infectivity Potentiator (MIP) von Legionella pneumophila
N2  - Die vorliegende Arbeit thematisiert das computergestützte strukturbasierte Design auf dem Gebiet der HIV-1-Integrase und des Macrophage Infectivity Potentiator (MIP) von Legionella pneumophila. Die durchgeführten Studien geben wertvolle Aufschlüsse über den Wirk-mechanismus einer bekannten Integrase-Inhibitorenklasse and zeigt darüber hinaus einen neuartigen Ansatz zur Integrase-Inhibition auf. Im Falle des MIP-Enzyms konnten zwei niedermolekulare Inhibitoren ermittelt werden. Die Integrase-Studien ergaben wertvolle Informationen im Hinblick auf das Design neuer Inhibitoren. Docking-Experimente konnten die Hypothese weiter untermauern, nach der die Klasse der Diketosäure-Inhibitoren nicht als freie Liganden, sondern als Metallion-Komplexe an das aktive Zentrum der Integrase binden. Die Ergebnisse dieser Studie helfen dabei, das Verständnis über den Wirkmechanismus dieser wichtigen Klasse von Integrase-Inhibitoren weiter zu vertiefen. Um der Entwicklung von Integrase-Inhibitoren einen neuen Impuls zu geben, wurde eine neue Strategie zur Inhibition dargelegt: Anstatt an das aktive Zentrum soll eine neue Inhibitor-Klasse an das Dimerisierungs-Interface eines Integrase-Monomers binden, die katalytisch notwendige Dimerisierung verhindern und somit die enzymatische Aktivität stören. Das Hauptproblem hierbei bestand in den fehlenden Strukturdaten des freien Monomers. Hierzu wurden Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt, um nähere strukturelle Informationen zu erhalten. Momentaufnahmen unterschiedlicher Konformationen dienten als Input-Strukturen für eine Docking-Studie mit dem peptidischen Inhibitor YFLLKL, um dessen Bindemodus aufzuklären. Hierbei zeigte sich, dass dieser Ligand an eine Interface-Konformation bindet, die durch eine Y-förmige Bindestelle charakterisiert ist. Im nächsten Schritt sollte diese Protein-Konformation mit kleinen, nicht-peptidischen Molekülen adressiert werden. Die erste Strategie bestand darin, ein Pharmakophor-Modell zu erstellen, das zur Suche nach Molekülen mit einer guten Komplementarität zur Y-förmigen Bindetasche geeignet ist. Das folgende virtuelle Screening ergab zehn Verbindungen, die eine gute Komplementarität und günstige hydrophobe Wechselwirkungen aufwiesen. Leider zeigte keine der Verbindungen eine reproduzierbare Aktivität im Integrase-Assay. Hierbei verbleiben jedoch gewisse Zweifel, da in dem Assay die Zugabe von BSA vorgeschrieben war, das möglicherweise die hydrophoben Inhibitor-Kandidaten gebunden hat. Die erwähnte erste Strategie wurde überdacht: In einem zweiten Ansatz galt die Hauptaufmerksamkeit der Absättigung von wasserstoffbrückenbildenden Resten. Diese waren zuvor von den eher hydrophoben Verbindungen nicht optimal abgesättigt worden. Zwei Pharmakophor-Modelle wurden erstellt und in einem virtuellen Screening eingesetzt: Docking-Studien der Hits zeigten jedoch, dass nach wie vor viele wasserstoffbrückenbildende Reste des Proteins nicht vom Liganden abgesättigt wurden. Nach abschließender eingehender Betrachtung der Bindemoden der verbliebenen Moleküle aus dem virtuellen Screening konnten nur acht für weitere Testungen ausgewählt werden (Ergebnisse der experimentellen Testung durch Kooperationspartner stehen noch aus). Diese geringe „Ausbeute“ an geeigneten Verbindungen für das Integrase-Dimerisierungsinterface zeigt, wie schwer dieses Target zu adressieren ist: Das Interface weist eine schnell wechselnde Abfolge von basischen, sauren und hydrophoben Resten auf. Im Gegensatz zu anderen Protein-Protein-Interfaces zeigt das Integrase-Interface keine „aufgeräumte“ Bindetasche mit klar voneinander getrennten hydrophoben und hydrophilen Bereichen. Für das zweite Enzym, MIP, konnten mit Hilfe des strukturbasierten Designs zwei niedermolekulare Inhibitoren gefunden werden. Beide Verbindungen führten zu einer deutlichen Abnahme der katalytischen Aktivität. Soweit bekannt, sind bisher keinerlei niedermolekulare MIP-Inhibitoren veröffentlicht. Der Vergleich von MIP mit der humanen PPIase FKBP12 zeigte eine größtenteils ähnliche Tasche, die jedoch einen entscheidenden Unterschied aufweist, nämlich in der Orientierung des Restes Tyr109. Die detaillierte Betrachtung der Strukturdaten beider Enzyme konnte schließlich eine Erklärung liefern, warum ein ketoacyl-substituiertes Pipecolinderivat nicht an MIP bindet, ein sulfonsubstituiertes Pipecolinderivat hingegen das Enzym inhibiert. Die Erkenntnisse über das Inhibitoren-Design für Legionella-MIP können auch auf andere Organismen (z.B. Trypanosomen) übertragen werden, bei denen ebenfalls (homologes) MIP ein Pathogenitätsfaktor ist.
N2  - In this thesis, computational structure-based design approaches were employed to target the HIV-1 integrase and the macrophage infectivity potentiator (MIP) of Legionella pneumophila. The thesis yields valuable information about the mechanism of action of a known class of integrase inhibitors and a novel approach towards enzyme inhibition, which still is mainly unaddressed in current integrase research. For the MIP enzyme, two small-molecule MIP inhibitors were discovered. The computational studies of HIV-1 integrase have provided valuable information for IN inhibitor design. Docking experiments supported the hypothesis that the well-known diketo acid inhibitors enter the IN active site not as free ligands, but rather as metal complexes. These results help to reveal the mechanism of action of this important class of IN inhibitors.To give an impulse for the development of a novel class of inhibitors, a new strategy towards IN inhibition was introduced: An alternative binding site, the dimerization interface of an IN catalytic core domain monomer, was explored for inhibitor design. The lack of structural data of the free monomer was overcome by extensive MD studies. Snapshots derived from the MD simulation were used as protein input structures in a docking study with the inhibitory peptide YFLLKL to reveal its potential binding mode. The docking procedure showed that the peptidic ligand binds to a dimerization interface conformation which shows a Y-shaped binding site.. The next step was to address this protein conformation with small, non-peptidic molecules. The first strategy towards finding small-molecule interface binders was to create a pharmacophore model with hydrophobic features and shape constraints, aiming to find molecules with a good complementarity to the Y-shaped dimerization interface. Virtual screening yielded a total of 10 compounds, which all displayed good shape complementarity and favorable hydrophobic interactions. Unfortunately, none of the compounds showed a reproducible inhibitory activity in biological assays. Some doubts remain about the validity of the assay results: The use of BSA was critical, since it is not unlikely that BSA “intercepted” the hydrophobic candidate compounds. The first strategy towards finding small-molecule dimerization inhibitors was reconsidered: In the second approach, the satisfaction of hydrogen bonding residues at the dimerization interface, was of major interest. Two pharmacophore models were employed, which retrieved several hundred hit molecules. However, docking of these molecules showed that still many hydrogen bonding groups of the protein remained unaddressed by the ligands. Eventually, after visual inspection, only eight molecules were selected as candidate compounds for further testing (results pending). This small “yield” underlines the difficulties in finding interface binders: The IN dimerization interface is a peculiar target with frequently alternating basic, acidic, and hydrophobic residues. It is not a well-ordered binding site with continuous hydrophobic areas and distinct hydrogen bond donors / acceptors. Other protein-protein interfaces show such well-ordered binding sites. Accordingly, the peculiarity of the IN dimerization interface, in addition to the delicate task of disrupting protein-protein interactions at all, makes the development of IN dimerization inhibitors very challenging. For MIP, the studies revealed two experimentally validated MIP inhibitors, which significantly reduce MIP enzymatic activity. To our knowledge, no small-molecule MIP inhibitor has been reported in the literature so far. A detailed analysis of the available structural data of MIP and a comparison to the human PPIase counterpart, FKBP12, pointed out a conformational diversity among the MIP structures and a crucial difference between the two PPIases, which could be traced to mainly one residue (Tyr109). The detailed comparison of FKBP12 and MIP complex structures made it possible to give an explanation, why a ketoacyl-substituted pipecoline derivative most probably does not bind to MIP, but a sulfone-substituted pipecoline derivative does bind to MIP. Knowledge of Legionella MIP inhibitors could be transferred also to other organisms (e.g. trypanosoms), where homologous MIP proteins are also pathological factors.
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Integrasen
KW  - HIV
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Molekulardesign
KW  - Legionärskrankheit
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Molecular modelling
KW  - HIV
KW  - Legionnaires' Disease
KW  - drug design
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51247
ER  - 
TY  - THES
A1  - Albert-Weißenberger, Christiane
T1  - Regulation of the Flagellar Biogenesis in Legionella pneumophila
T1  - Die Regulation der Flagellenbiogenese in Legionella pneumophila
N2  - The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.
N2  - Das pathogene Bakterium Legionella pneumophila repliziert sich in der Natur intrazellulär in Protozoen. Beim Menschen kann das Bakterium eine schwere Pneumonie, die sogenannte Legionärskrankheit auslösen. Hierbei vermehren sich die Bakterien in Alveolarmakrophagen der Lunge. Der Lebenszyklus von L. pneumophila Bakterien ist gekennzeichnet durch zwei Phase: replikative Bakterien sind avirulent; im Gegensatz dazu sind transmissive Bakterien virulent und flagelliert. Hauptziel dieser Arbeit war es die Beteiligung der regulatorischen Proteins FleQ, FleR, and RpoN an der Flagellengenregulation zu ermitteln. Mutanten für die Gene welche für FleQ, FleR oder RpoN codieren exprimieren in der transmissiven Phase im Genesatz zum Wildtyp nur wenig Flagellin und sind nicht flagelliert. Nachgewiesen wurde dies durch eine phänotypische Analyse, Western blot und Ektronenmikroskopie. Studien des Transkripoms dieser Mutanten zeigten, daß FleQ die Expression zahlreicher Flagellenbiosynthesegenen kontrolliert. Gemeinsam mit RpoN kontrolliert FleQ die Transkription von 14 der 31 Klasse II Flagellengene, welche für Basalkörper, Haken und regulatorische Proteine codieren. Überraschenderweise sind 7 der 15 späten Flagellengenen (Klasse III und IV) abhängig von FleQ, aber unabhängig von RpoN exprimiert. Daher und entgegen der allgemeinen Auffassung dass sogenannte ‚enhancer binding' Proteine wie FleQ zur Transkriptionsinitiation immer mit RpoN interagieren, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass FleQ von L. pneumophila Genexpression sowohl RpoN-abhängig, als auch RpoN-unabhängig reguliert. Ebenso anders als zuvor vorgeschlagen, verdeutlichen Studien des Transkriptoms einer fleR Mutante, dass FleR nicht die Expression der Klasse III Flagellengene induziert. Statt dessen reguliert FleR gemeinsam mit RpoN zahlreiche Gene der Proteinbiosynthese und des Metabolismus. Basierend auf diesen experimentellen Ergebnissen sind in unserem modifizierten Modell für die transkriptionelle Regulation der L. pneumophila Flagellengene die Flagellengene der Klasse II von FleQ und RpoN kontrolliert, während die Flagellengene der Klasse III und IV in einer fleQ-abhängigen aber rpoN-unabhängigen Weise kontrolliert sind. Obwohl alle L. pneumophila Stämme den zweiphasigen Lebenszyklus aufweisen haben sich unterschiedliche Pathotypen evolviert. Das ist auch in den Genomen sichtbar, die z. B. genomische Inseln enthalten. Die genomische Insel Trb-1 von L. pneumophila Corby trägt alle Gene eines Typ-IV Konjugationssystem, ein ntegrase-Gen und einen putative oriT-Bereich. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es also zu untersuchen, inwieweit Trb-1 an konjugativem DNA-Transfer beteiligt ist. Mit Hilfe von Konjugationsexperimenten, zeigten wir, dass der oriT-Bereich von Trb-1 funktional ist und zur Konjugation zwischen verschiedenen L. pneumophila Stämmen beiträgt. Dies ist der erste oriT Bereich von L. pneumophila, dessen Funktionalität nachgewiesen wurde. Damit bekräftigen unsere Ergebnisse, dass Konjugation eine treibende Kraft für die Evolution neuer Pathotypen in L. pneumophila ist.
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Genregulation
KW  - Legionella pneumophila
KW  - gene regulation
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34335
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hacker, Jörg
A1  - Ott, Manfred
A1  - Wintermeyer, Eva
A1  - Ludwig, Birgit
A1  - Fischer, Gunter
T1  - Analysis of virulence factors of Legionella pneumophila.
N2  - Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' disease is a facultative intracellular bacterium, which in the course of human infection multiplies in lung macrophages predominantly manifesting as pneumonia. The natural habitat of Legionella is found in sweet water reservoirs and man-made water systems. Virulent L. pneumophila spontaneously convert to an avirulent status at a high frequency. Genetic approaches have led to the identification of various L. pneumophila genes. The mip (macrophage infectivity potentiator) determinant remains at present the sole established virulence factor. The Mip protein exhibits activity of a peptidyl prolyl cis trans isomerase (PPiase), an enzyme which is able to bind the immunosuppressant FK506 and is involved in protein folding. The recently cloned major outer membrane protein (MOMP) could play a role in the uptake of legionellae by macrophages. Cellular models are useful in studying the intracellular replication of legionellae in eukaryotic cells. Human celllines and protozoan models are appropriate for this purpose. By using U 937 macrophage-like cells and Acanthamoeba castellanii as hosts, we could discriminate virulent and avirulent L. pneumophila variants since only the virulent strain was capable of intracellular growth at 37 oc. By using these systems we further demonstrated that a hemolytic factor cloned and characterized in our laboratory, legiolysin (lly), had no influence on the intracellular growth of L. pneumophila.
KW  - Legionella pneumophila
Y1  - 1993
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70620
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Ott, M.
A1  - Bender, L.
A1  - Lück, P. C.
A1  - Meyer, P.
A1  - Hacker, Jörg
T1  - Distribution of Legionellae in a hospital water system: prevalence of immunologically and genetically related Legionella pneumophila serogroup 6 isolates
N2  - A hospital warm water system was monitored for the prcsence and distribution of lcgionellac. Subtyping of ten scletled Legionella pneumophiltl isolates. originating from four different sites in the system by using serogroup spccific antisera in an indircct immunofluorcscence tcst, rcvcalcd that nine of the tcn isolatcs belonged to scrogroup 6, while the remaining one was serogroup I 0. Two monoclonal antibodics (mAbs) spccific for a subgroup of serogroup 6 strains were further used for characterization. None of the strains reactcd with these mAbs. Genome analysis by elaborating Not I profiles using the pulscd field gel electrophoresis (PFGE) technique revealed that nearly all serogroup 6 isolates dcrived from different sites, including a new building connected hy a ring pipe. wcrc identical according to restriction fragment pattems. The patterns were distinguishable from those of the two L. pnewnophi/a serogroup 6 rcfcrencc strains, and ftom that of thc L. pneumophila scrogroup 10 isolate. These data arguc for a relatively homogeneaus L. pneunwpltila serogroup 6 population in the entire watcr system.
KW  - Infektionsbiologie
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Hospital water system
KW  - Environmental isolate
KW  - Serogroup
KW  - Genomic profile
Y1  - 1992
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59827
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Hacker, Jörg
A1  - Rdest, Ursula
A1  - Wintermeyer, E.
A1  - Ludwig, B.
T1  - Legiolysin, a New Hemolysin from L. pneumophila
N2  - Legionella pneumophila generares exotoxins, cytolysins, proteases oc hemolysins that darnage host cells llke erythrocytes or rissue cu lrure cells. The gene for a new L. pneumophila hemolysin withour a proteolytic activiry was idemified, cloned in E. coli and sequenced. The gene producr was analysed by SDS-Polyacrylamide-gel-electrophoresis.
N2  - Legionella pneum.ophila bildet Exoroxine, Zytolysine, Proteasen oder Hämolysine, die Wirtszellen wie Erythrozyten oder Animalzellen schädigen. Das Gen für ein neues L. pneumophila Hämolysin ohne proteolytische Aktivität wurde identifiziert, in E. coli kloniert und sequenziert. Das Genprodukt wurde durch SDS-Gelelcktropborese analysiert.
KW  - Hämolysin
KW  - Legionella pneumophila
Y1  - 1991
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73070
ER  -