TY - THES A1 - Däullary, Thomas T1 - Establishment of an infection model of the human intestinal epithelium to study host and pathogen determinants during the \(Salmonella\) Typhimurium infection process T1 - Etablierung eines Infektionsmodells des menschlichen Darmepithels zur Untersuchung von Wirts- und Erregerdeterminanten während des \(Salmonella\) Typhimurium-Infektionsprozesses N2 - According to the WHO, foodborne derived enteric infections are a global disease burden and often manifest in diseases that can potentially reach life threatening levels, especially in developing countries. These diseases are caused by a variety of enteric pathogens and affect the gastrointestinal tract, from the gastric to the intestinal to the rectal tissue. Although the complex mucosal structure of these organs is usually well prepared to defend the body against harmful agents, specialised pathogens such as Salmonella enterica can overcome the intestinal defence mechanism. After ingestion, Salmonella are capable of colonising the gut and establishing their proliferative niche, thereby leading to inflammatory processes and tissue damage of the host epithelium. In order to understand these processes, the scientific community in the last decades mostly used cell line based in vitro approaches or in vivo animal studies. Although these approaches provide fundamental insights into the interactions between bacteria and host cells, they have limited applicability to human pathology. Therefore, tissue engineered primary based approaches are important for modern infection research. They exhibit the human complexity better than traditional cell lines and can mimic human-obligate processes in contrast to animal studies. Therefore, in this study a tissue engineered human primary model of the small intestinal epithelium was established for the application of enteric infection research with the exemplary pathogen Salmonella Typhimurium. To this purpose, adult stem cell derived intestinal organoids were used as a primary human cell source to generate monolayers on biological or synthetic scaffolds in a Transwell®-like setting. These tissue models of the intestinal epithelium were examined for their comparability to the native tissue in terms of morphology, morphometry and barrier function. Further, the gene expression profiles of organotypical mucins, tight junction-associated proteins and claudins were investigated. Overall, the biological scaffold-based tissue models showed higher similarity to the native tissue - among others in morphometry and polarisation. Therefore, these models were further characterised on cellular and structural level. Ultrastructural analysis demonstrated the establishment of characteristic microvilli and tight-junction connections between individual epithelial cells. Furthermore, the expression pattern of typical intestinal epithelial protein was addressed and showed in vivo-like localisation. Interested in the cell type composition, single cell transcriptomic profiling revealed distinct cell types including proliferative cells and stem cells, progenitors, cellular entities of the absorptive lineage, Enterocytes and Microfold-like cells. Cells of the secretory lineage were also annotated, but without distinct canonical gene expression patterns. With the organotypical polarisation, protein expression, structural features and the heterogeneous cell composition including the rare Microfold-like cells, the biological scaffold-based tissue model of the intestinal epithelium demonstrates key requisites needed for infection studies with Salmonella. In a second part of this study, a suitable infection protocol of the epithelial tissue model with Salmonella Typhimurium was established, followed by the examination of key features of the infection process. Salmonella adhered to the epithelial microvilli and induced typical membrane ruffling during invasion; interestingly the individual steps of invasion could be observed. After invasion, time course analysis showed that Salmonella resided and proliferated intracellularly, while simultaneously migrating from the apical to the basolateral side of the infected cell. Furthermore, the bacterial morphology changed to a filamentous phenotype; especially when the models have been analysed at late time points after infection. The epithelial cells on the other side released the cytokines Interleukin 8 and Tumour Necrosis Factor α upon bacterial infection in a time-dependent manner. Taken together, Salmonella infection of the intestinal epithelial tissue model recapitulates important steps of the infection process as described in the literature, and hence demonstrates a valid in vitro platform for the investigation of the Salmonella infection process in the human context. During the infection process, intracellular Salmonella populations varied in their bacterial number, which could be attributed to increased intracellular proliferation and demonstrated thereby a heterogeneous behaviour of Salmonella in individual cells. Furthermore, by the application of single cell transcriptomic profiling, the upregulation of Olfactomedin-4 (OLFM4) gene expression was detected; OLFM4 is a protein involved in various functions including cell immunity as well as proliferating signalling pathways and is often used as intestinal stem cell marker. This OLFM4 upregulation was time-dependent, restricted to Salmonella infected cells and seemed to increase with bacterial mass. Investigating the OLFM4 regulatory mechanism, nuclear factor κB induced upregulation could be excluded, whereas inhibition of the Notch signalling led to a decrease of OLFM4 gene and protein expression. Furthermore, Notch inhibition resulted in decreased filamentous Salmonella formation. Taken together, by the use of the introduced primary epithelial tissue model, a heterogeneous intracellular bacterial behaviour was observed and a so far overlooked host cell response – the expression of OLFM4 by individual infected cells – could be identified; although Salmonella Typhimurium is one of the best-studied enteric pathogenic bacteria. This proves the applicability of the introduced tissue model in enteric infection research as well as the importance of new approaches in order to decipher host-pathogen interactions with higher relevance to the host. N2 - Nach Angaben der WHO stellen lebensmittelbedingte Darminfektionen eine globale Krankheitslast dar und äußern sich häufig in Krankheiten, die potenziell lebensbedrohliche Ausmaße annehmen können, insbesondere in Entwicklungsländern. Diese Krankheiten werden durch eine Vielzahl von enterischen Erregern verursacht und betreffen den Magen-Darm-Trakt, vom Magen über den Darm bis zum Enddarm. Obwohl die komplexe Schleimhautstruktur dieser Organe in der Regel gut darauf vorbereitet ist, den Körper vor schädlichen Reagenzien zu schützen, können spezialisierte Erreger wie Salmonella enterica den Abwehrmechanismus des Darms überwinden. Nach der Nahrungsaufnahme sind Salmonellen in der Lage, den Darm zu kolonisieren und ihre proliferative Nische zu etablieren, was letztlich zu entzündlichen Prozessen und Gewebeschäden des Wirtsepithels führt. Um diese Prozesse zu verstehen, hat die Wissenschaft in den letzten Jahrzehnten hauptsächlich auf Krebslinien basierende in vitro-Ansätze oder in vivo-Tierstudien verwendet. Obwohl diese Ansätze grundlegende Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirtszellen lieferten, sind sie nur begrenzt auf die Pathologie des Menschen übertragbar. Daher sind Tissue engineering und primärzellbasierte Ansätze für die moderne Infektionsforschung wichtig. Sie spiegeln die menschliche Komplexität besser wider als Ansätze mit Krebszellen und können im Gegensatz zu Tierversuchen human-obligate Prozesse nachbilden. Daher wurde in dieser Studie ein tissue engineered humanes Primärmodell des Dünndarmepithels für die Anwendung in der enterischen Infektionsforschung am Beispiel des Erregers Salmonella Typhimurium etabliert. Zu diesem Zweck wurden aus adulten Stammzellen gewonnene Darmorganoide als primäre humane Zellquelle verwendet, um 2D-Monolayer auf biologischen oder synthetischen Trägestrukturen in einer Transwell®-ähnlichen Umgebung zu erzeugen. Die so erzeugten Gewebemodelle des Darmepithels wurden auf ihre Vergleichbarkeit mit dem nativen Gewebe in Bezug auf Morphologie, Morphometrie und Barrierefunktion untersucht. Weiterhin wurde die Genexpression von organtypischen Muzinen, Tight Junction-assoziierten Proteinen und Claudinen sowie das Expressionsmuster der Tight Junction-Proteine untersucht. Insgesamt wiesen die auf biologischen Matrizes basierenden Gewebemodelle eine größere Ähnlichkeit mit dem nativen Gewebe auf - unter anderem in Bezug auf Morphometrie und Polarisation -, weshalb diese Modelle auf zellulärer und struktureller Ebene tiefgehender charakterisiert wurden. Die ultrastrukturelle Analyse zeigte die Ausbildung charakteristischer Mikrovilli und Tight-Junction-Verbindungen zwischen einzelnen Epithelzellen. Darüber hinaus wurden die Expressionsmuster typischer Darmepithelproteine untersucht, die eine in vivo ähnliche Lokalisation aufwiesen. Im Hinblick auf die Zelltypenzusammensetzung ergab die Analyse des Transkriptoms auf Einzel-Zell-Ebene definierte Zelltypen. Dies waren Zellen mit proliferativem Profil, Stammzellen und Vorläuferzellen, und Zellen der absorptiven Linie, Enterozyten und Microfold-Zellen. Zellen der sekretorischen Linie wurden ebenfalls annotiert, jedoch ohne eindeutige kanonische Genexpression. Mit der organotypischen Polarisierung, der Proteinexpression, den strukturellen Merkmalen und der heterogenen Zellzusammensetzung, einschließlich der seltenen Microfold-Zellen, weist das auf einer biologischen Matrix basierende Gewebemodell des Darmepithels die wichtigsten Voraussetzungen für Infektionsstudien mit Salmonellen auf. Im zweiten Teil dieser Studie wurde ein geeignetes Infektionsprotokoll für das Epithelgewebemodell mit Salmonella Typhimurium erstellt, gefolgt von der Untersuchung der wichtigsten Merkmale des Infektionsprozesses. Salmonella hafteten an den epithelialen Mikrovilli und verursachten während der Invasion das typische Membran-Kräuseln; interessanterweise konnten die Schritte der Invasion einzeln beobachtet werden. Nach der Invasion zeigte die Zeitverlaufsanalyse der Infektion, dass die Salmonellen intrazellulär lokalisierten und replizierten, während sie gleichzeitig von der apikalen zur basolateralen Seite der infizierten Zelle migrierten. Darüber hinaus veränderte sich die Morphologie der Bakterien in der Spätphase der Infektion zu einem filamentösen Phänotyp. Die Epithelzellen auf der anderen Seite setzten nach der bakteriellen Infektion zeitabhängig die Zytokine Interleukin 8 und Tumor-Nekrose-Faktor-α frei. Insgesamt rekapituliert die Salmonelleninfektion des intestinalen Epithelgewebemodells wichtige Schritte des Infektionsprozesses, wie sie in der Literatur beschrieben sind und stellt somit eine valide in vitro Plattform für die Untersuchung des Salmonelleninfektionsprozesses in einem menschlichen Kontext dar. Interessanterweise variierten die intrazellulären Salmonellenpopulationen während des Infektionsprozesses in ihrer Bakterienzahl, was auf eine erhöhte intrazelluläre Proliferation zurückgeführt werden konnte und somit ein heterogenes Verhalten der Salmonellen in einzelnen Zellen demonstriert. Darüber hinaus wurde durch die Anwendung von Einzel-Zell-Transkriptom-Analysen die Hochregulierung der Genexpression von Olfactomedin-4 (OLFM4) nachgewiesen; OLFM4 ist ein Protein mit verschiedenen Funktionen, darunter Prozesse der Zellimmunität sowie proliferierende Signalwege, und es wird häufig als Darmstammzellmarker verwendet. Diese OLFM4-Hochregulierung war zeitabhängig, auf mit Salmonella infizierten Zellen beschränkt und schien mit der intrazellulären Bakterienmasse zuzunehmen. Bei der Untersuchung der OLFM4-Regulationsmechanismen konnte eine nuclear factor κB-induzierte Hochregulierung ausgeschlossen werden, während die Hemmung der Notch-Signalübertragung zu einem Rückgang der OLFM4-Gen- und Proteinexpression führte. Darüber hinaus führte die Hemmung von Notch zu einer verminderten Bildung von filamentösen Salmonella. Insgesamt konnte durch die Verwendung des hier eingeführten primären Epithelgewebemodells ein heterogenes intrazelluläres bakterielles Verhalten beobachtet und eine bisher übersehene Wirtszellantwort - die Expression von OLFM4 durch einzelne infizierte Zellen - bei einem der am besten untersuchten enterischen Pathogene identifiziert werden. Dies beweist die Anwendbarkeit des vorgestellten Gewebemodells in der enterischen Infektionsforschung sowie die Bedeutung neuer Ansätze zur Entschlüsselung von Wirt-Pathogen-Interaktionen mit höherer Relevanz für den Wirt. KW - Salmonella typhimurium KW - Tissue Engineering KW - Darmepithel KW - Infektion KW - Infektionsmodell KW - menschliches Darmepithel KW - Infektionsprozess KW - Gewebemodell KW - Wirt-Erreger Interaktion KW - infectionmodel KW - human intestinal epithelium KW - infectionprocess KW - Host-pathogen interaction KW - tissue model Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311548 ER - TY - THES A1 - Götz, Andreas T1 - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus T1 - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism N2 - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus. N2 - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells. KW - Escherichia coli KW - Intrazellulärraum KW - Salmonella typhimurium KW - Vermehrung KW - Kohlenstoffstoffwechsel KW - Salmonella KW - Salmonella enterica KW - Salmonella typhimurium KW - Salmonellose KW - Escherichia coli KW - Shigella KW - Infektion KW - Bakterielle Infektion KW - sifA KW - enteroinvasive KW - CaCo-2 cell KW - 13C-isotopologue profiling KW - microinjection Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292 ER -