TY  - THES
A1  - Bourdet, Patric
T1  - Entwicklung einer auf Antikörpern basierten Therapie von chirurgischen Infektionen verursacht durch methicillinresistente und -sensible Staphylococcus aureus (MRSA und MSSA)
T1  - Development of an antibody based therapy of surgical infections caused by methicillinresistant and -sensitive Staphylococcus aureus (MRSA and MSSA)
N2  - Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Diese grampositiven Bakterien verursachen neben harmlosen oberflächlichen Hautinfektionen auch lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika wird zukünftig wahrscheinlich nicht ausreichen, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. Ziel dieser Arbeit war es, zunächst zwei Proteine IsaA und IsaB herzustellen, um diese Proteine für Immunisierungsstudien zu nutzen. Zunächst wurde das gereinigte IsaA-Protein verwendet, um ein Kaninchen zu immunisieren. Mit den daraus gewonnenen Antikörpern wurden dann erste Tierversuche begonnen, um die Bedingungen für den therapeutischen Einatz von gegen IsaA-gerichteten Antikörpern zu ermitteln und die Wirksamkeit einer Antikörper-Behandlung zu evaluieren. Für die Herstellung der gewünschten Proteine wurden die Gensequenzen zunächst aus verschiedenen S. aureus-Stämmen mittels PCR amplifiziert und in den kommerziellen Expressionsvektor pQE30 kloniert. Die amplifizierte Gensequenz stammt aus den klinischen Stämmen 418 (IsaA) bzw. 134 (IsaB). Nach der Klonierung wurden geeignete Expressions- und Reinigungsstrategien entwickelt. Dabei wurden folgende Bedingungen als optimal für Wachstum und Überexpression herausgearbeitet: IsaA: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 3 h Wachstum bei 37°C. IsaB: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 4 h Wachstum bei 37°C. Es stellte sich auch heraus, dass IsaA zunächst in nur unzureichender Quantität vorhanden bzw. exprimiert worden war. Die Vermutung, dass IsaA überwiegend im Pellet in sogenannten Einschlusskörpern (inclusion bodies) eingeschlossen war, erklärte dieses Phänomen. Das Protein konnte erfolgreich aus dem Pellet isoliert werden. Die Produktion und Aufreinigung beider Proteine IsaA und IsaB unter optimierten Bedingungen ergab, dass beide Proteine nun in ausreichender Menge und Konzentration für die folgende Immunisierung und die weiteren Arbeiten vorlagen. Aus Kaninchen, die mit IsaA immunisiert wurden, konnten polyklonale Antikörper gewonnen werden, die die Grundlage für einen ersten Tierversuch mit 24 Ratten bildeten. Hierbei zeigte sich, dass die Tiere, die mit 1.000.000.000 Bakterien infiziert worden waren deutlich stärkere Infektionszeichen aufwiesen als diejenigen, die mit 100.000.000 Bakterien infiziert worden waren. Weiterhin wurde deutlich, dass die Tiere, die Serum (mit Antikörper gegen IsaA) erhalten hatten, gegenüber den Vergleichstieren mit Placebo einen deutlichen Vorteil hinsichtlich Infektionszeichen und Immunantwort hatten. Somit belegen die tierexperimentiellen Ergebnisse in dieser Arbeit erstmalig den therapeutischen Nutzen von Antikörpern gegen IsaA. IsaA ist demnach ein geeignetes Target für eine Immuntherapie gegen S. aureus.
N2  - Staphylococcus aureus is one of the most common pathogens of nosocomial infections. These grampositive bacteria not only cause harmless superficial skin infections but also life threatening systemic infections. A huge problem in therapy of S. aureus infections is the increasing rate of multiresistance. The development of new antibiotics will probably not be sufficient in the future because new resistance in bacteria is to expect. Therefore there is urgent need for alternative therapies fighting multiresistant bacteria such as S. aureus. One approach is immunotherapy, e.g. by production of monoclonal antibodies against adequate targets of S. aureus. The purpose of this paper was to produce two proteins, IsaA and IsaB, to use these for immunisation studies. First purified IsaA was used to immunise a rabbit. The extracted antibodies were used for early animal experiments to evaluate conditions for the therapeutic use and efficiency of antibodies against IsaA. For production of the wanted proteins gene sequences from various S. aureus strains were amplified by PCR and cloned into pQE30, a commercial expression vector. The amplified gene sequences come from strain 418 (IsaA) and strain 134 (IsaB). After cloning appropriate conditions for expression and purifiing were elaborated: IsaA: induction of overexpression with 100 µM IPTG, 3 h growth at 37°C. IsaB: induction of overexpression with 100 µM IPTG, 4 h growth at 37°C. First IsaA emerged to be present respectively expressed of low quantity only. The presumption that IsaA was predominantly enclosed in so called inclusion bodies explained this phenomenon. The protein could successfully isolated from the pellet. Production and purification of both proteins IsaA and IsaB under optimised conditions led to sufficient quantitiy and concentration for the immunisation following and further research. From a rabbit, immunised with IsaA, polyclonal antibodies were obtained and provided a basis for the first animal experiment with 24 rats. It showed that animals infected with 1.000.000.000 bacteria had considerably more signs of infection than those infected with 100.000.000 bacteria. It could also be shown that animals treated with serum (with antibodies against IsaA) had clear advantage regarding signs of infections and immune response compared to those animals treated with placebo. These results of the animal experiment document the therapeutic benefit of antibodies against IsaA for the first time. Therefore IsaA is an adequate target for immunotherapy against S. aureus.
KW  - MRSA
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Immuntherapie
KW  - Antikörper
KW  - Infektion
KW  - Target
KW  - IsaA
KW  - IsaB
KW  - IsaA
KW  - IsaB
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56199
ER  - 
TY  - THES
A1  - Raspe, Matthias Eduard
T1  - Zelluläre Invasivität und molekulare Marker von kolonisierenden und Infektions-assoziierten Methicillin resistenten Staphylococcus aureus-Isolaten
T1  - Cellular invasiveness and molecular markers of colonizing and infection-associated Methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates
N2  - Hintergrund: Zunehmend wird der Eigenschaft von Staphylococcus aureus als fakultativ intrazellulärem Erreger Bedeutung zugemessen. Ein direkter Nachweis der in vivo Relevanz von fakultativ intrazellulärem S. aureus bleibt allerdings bisher aus. Der Mechanismus zellulärer Invasivität ist bekannt und korreliert mit verschiedenen molekularen Markern (spa-Typ, SCCmec-Typ und pls/Pls). In dieser Studie wurde die Zuverlässigkeit und Ausweitbarkeit dieser Marker getestet. Des Weiteren wurde überprüft, ob sich die zelluläre Invasivität von kolonisierenden und Infektions-assoziierten MRSA-Isolaten unterscheidet und, ob die alleinige Bestimmung molekularer Marker in vitro die Virulenz eines Isolats in vivo abzuschätzen vermag. Methoden:Insgesamt wurden 109 MRSA-Isolate gesammelt, molekular charakterisiert (spa-Typ, BURP-Analyse, SCCmec-Typ, pls, agr-Typ, Hämolyseverhalten) und das Potential zellulärer Invasivität in vitro ermittelt. Die Assoziation eines Isolates mit einer Infektion in vivo wurde nachverfolgt (93 Kolonisierer versus 16 Infektions-assoziierte-Isolate). Zusätzlich wurde eine Referenzgruppe aus 13 S. aureus-Isolaten etabliert, die klinisch mit vergleichsweise invasiven Infektionen assoziiert waren (12 Osteomyelitis-Isolate und 1 Endokarditis-Isolat). Ergebnisse: Die bekannten molekularen Marker zellulärer Invasivität korrelieren zuverlässig in einer Population klinischer MRSA-Isolate und lassen sich auch auf bisher nicht bekannte (spa- und SCCmec-) Typen ausweiten. Das Hämolyseverhalten korrelierte nicht mit der zellulären Invasivität. Der agr-Typ wurde als weiterer molekularer Marker identifiziert. Die zelluläre Invasivität war unabhängig von der Etablierung einer Infektion in vivo (mediane Invasivität der Kolonisierer 100% versus 108% der Infektions-assoziierten Studienisolate und 110% der externen Referenzisolate). Des Weiteren waren die molekularen Marker spa- und agr-Typ nicht in der Lage, die Virulenz eines MRSA-Isolats in vivo abzuschätzen. Diskussion: Die zelluläre Invasivität klinischer MRSA-Isolate korreliert zuverlässig mit molekularen Markern. Allerdings vermögen weder die zelluläre Invasivität, noch mit ihr assoziierte molekulare Marker die Etablierung einer Infektion in vivo vorherzusagen. Beide scheinen also als Surrogat-Parameter zur Abschätzung der klinischen Virulenz eines Isolats ungeeignet. Zur Klärung der Frage, ob molekulare Marker zellulärer Invasivität in anderen Abschnitten der Pathogenese von S. aureus- Infektionen eine Rolle spielen, bedarf es weiterer Studien.
N2  - Background: Fibronectin-binding of S. aureus is reported to correlate with the propensity to cause invasive infections. Cellular invasion of S. aureus is Fn dependent and clusters with molecular markers (spa type, SCCmec, Pls). Here, we tested the hypothesis that cellular invasiveness and corresponding molecular markers predict the propensity to cause infections in a prospective cohort. Methods: 109 clinical MRSA isolates were characterized (agr, spa, BURP, SCCmec, pls) and cellular invasiveness was determined. Association with clinical infection was assessed (93 colonizing vs. 16 infecting isolates). Further 13 S. aureus isolates from patients with severe S. aureus infections served as an external comparison. Results: The agr type was identified as a new marker for invasiveness and known molecular markers were corroborated. Establishment of infection was independent from cellular invasiveness of MRSA (mean colonizing vs. infecting isolates 100% and 89%, respectively; external infecting isolates: 109%). Furthermore agr and spa types were unable to predict clinical behavior. Conclusion: Cellular invasiveness of MRSA isolates clusters reproducibly with molecular markers. However, cellular invasiveness and molecular markers cannot predict establishment of infection. This suggests that both criteria may not be used as surrogate parameters for the virulence potential of human MRSA isolates.
KW  - MRSA
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Invasivität
KW  - spa
KW  - agr
KW  - SCCmec
KW  - pls
KW  - invasiveness
KW  - spa
KW  - agr
KW  - SCCmec
KW  - pls
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69444
ER  -