TY  - THES
A1  - Bandleon, Sandra
T1  - Der Einfluss von FKBP52 auf die Funktion von TRPC3 Kanälen im Herzen
T1  - Role of FKBP52 in the regulation of TRPC3 channels in the heart
N2  - Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) Kanäle sind Ionenkanäle in der Plasmamembran und erlauben einen nicht selektiven Ca2+-Einstrom in die Zelle. Durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GqPCRs) wird dieser Ca2+-Einstrom erhöht, wodurch über Calmodulin, die Phosphatase Calcineurin aktiviert wird. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) wird durch Calcineurin dephosphoryliert und wandert in den Nucleus, wo er mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert und Hypertrophie-induzierende Gene aktiviert. TRPC3 ist hierbei eine der relevantesten Isoformen für die Entwicklung einer Myokardhypertrophie, wie sie im Rahmen zahlreicher kardiovaskulärer Erkrankungen zu finden ist. Eine kardiale Hypertrophie ist an der Pathogenese der Herzinsuffizienz beteiligt und stellt somit einen wichtigen Risikofaktor für den plötzlichen Herztod dar. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung die Regulation von TRPC3 Kanälen und deren Einfluss auf hypertrophe Prozesse genauer zu untersuchen. 
In Vorversuchen wurde FK506 bindendes Protein 52 (FKBP52) als neuer Interaktionspartner von TRPC3 im Herzen gefunden. Die dabei gefundene FKBP52-Bindestelle von TRPC3 lag erstaunlicherweise außerhalb der zu erwartenden Bindestelle mit den vermeintlichen FKBP Bindemotiven. 
FKBP52 ist ein Immunophilin, das als cis/trans Isomerase fungiert und dadurch an der Regulation von verschiedenen Ionenkanälen beteiligt ist, darunter auch TRPC-Kanäle. Es zeigte sich, dass alle Domänen von FKBP52, bis auf die TPR3-Domäne und der C Terminus, in der Lage waren, mit TRPC3 zu interagieren. Aufgrund der Funktion der FKBPs und der Tatsache, dass TRPC3 eine Rolle in der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie spielt, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob FKBP52 die Aktivität und die nachgeschalteten hypertrophen Signalwege von TRPC3 beeinflusst. 
Die Downregulation von FKBP52 führte zu einer verstärkten TRPC3-abhängigen hypertrophen Antwort in neonatalen Rattenkardiomyozyten (engl. neonatal rat cardiomyocytes, NRCs). Der gleiche Effekt war sowohl in NRCs und in adulten Rattenkardiomyozyten (engl. adult rat cardiomyocytes, ARCs) zu sehen, wenn Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase) defiziente Mutanten von FKBP52 überexprimiert wurde. Verkürzte FKBP52 Mutanten erhöhten ebenfalls die TRPC3-abhängige Aktivität von Calcineurin, was durch eine verstärkte Translokation von NFAT in den Nucleus von NRCs zu sehen war. Außerdem konnte in NRCs und in menschlichen embryonalen Nierenzellen (engl. human embryonic kidney cells, HEK 293 Zellen), die die PPIase defizienten Mutanten exprimierten, ein erhöhter Ca2+-Einstrom in die Zelle beobachtet werden. Das gleiche war nach Downregulation von FKBP52 in HEK 293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren (T3.9 Zellen), zu sehen. Eine funktionelle Interaktion von FKBP52 und TRPC3 konnte auch in elektrophysiologischen Messungen bestätigt werden. Nach der Interaktion von TRPC3 mit den FKBP52 Mutanten zeigte sich eine erhöhte TRPC3-Aktivität. 
Die Daten zeigen somit, dass TRPC3-Kanäle durch FKBP52 reguliert werden und diese Regulation abhängig von der PPIase Funktion ist. Eine Interaktion von TRPC3 mit vollfunktionsfähigem FKBP52 könnte vor einer Ca2+-Überlastung und einer damit einhergehenden pathologischen Hypertrophie des Herzens schützen.
N2  - Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) channels are ion channels in the plasma membrane which allow a non-selective Ca2+ influx into the cell. Stimulation of Gq-protein-coupled receptors (GqPCRs) increases the Ca2+ influx and activates the phosphatase calcineurin via calmodulin. Afterwards the transcription factor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) is dephosphorylated by calcineurin and translocates to the nucleus, where it interacts with other transcription factors and activates hypertrophy-associated genes. TRPC3 is one of the most relevant isoforms of TRPC channels in the maladaptive hypertrophic program during chronic cardiac diseases. Hypertrophy can lead to the development of heart failure and is therefore an important risk factor for cardiac death. For this reason it is important to understand the regulation of TRPC3 channels in the heart and the influence of TRPC3 in hypertrophy. 
Preliminary experiments revealed FK506 binding protein 52 (FKBP52) as a novel interaction partner of TRPC3 in the heart. Surprisingly, the FKBP52 binding domain of TRPC3 was beyond the expected binding domain with the putative FKBP binding motifs. FKBP52 is an immunophilin which functions as cis/trans isomerase and is involved in the regulation of various ion channels, including TRPC channels. We demonstrated that all domains of FKBP52, except the TPR3 domain and the C-terminal region, interact with TRPC3. Due to the function of FKBPs and the fact that TRPC3 is important in development of cardiac hypertrophy, the aim of this work was to examine whether FKBP52 influences the activity and downstream hypertrophic signalling pathways of TRPC3.
Downregulation of FKBP52 promoted an enhanced TRPC3-dependent hypertrophic response in neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The same effect could be seen by overexpression of peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (PPIase) mutants of FKBP52 in NRCs and adult rat cardiomyocytes (ARCs). Additionally, the PPIase-deficient FKBP52 mutants increased the TRPC3-dependent activity of calcineurin, which was observed by enhanced translocation of NFAT into the nucleus of NRCs. We detected that the expression of the PPIase-deficient FKBP52 mutants in NRCs and human embryonic kidney cells (HEK 293 cells) increased the Ca2+ influx to the cells. A similar effect could be seen after downregulation of FKBP52 in HEK 293 cells overexpressing TRPC3 (T3.9 cells). A functional interaction of FKBP52 and TRPC3 was also confirmed in electrophysiological measurements. The interaction of TRPC3 with the FKBP52 mutants promoted an increased TRPC3 activity. 
The data demonstrate that TRPC3 channels are regulated by FKBP52 and that this regulation depends on the PPIase function. An interaction of TRPC3 with functional FKBP52 could protect against Ca2+ overload and Ca2+-associated pathological hypertrophy of the heart.
KW  - Hypertrophie
KW  - Calciumkanal
KW  - TRPC3
KW  - FKBP52
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210083
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dankworth, Beatrice
T1  - Charakterisierung der dynamischen Interaktion des Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptors mit den Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6)-Kanälen und Generierung von β-Zell-spezifischen GC-A-knock-out-Mäusen sowie die Analyse der Bedeutung von ANP für die Insulin-Homöostase unter pathophysiologischen Bedingungen
T1  - Characterisation of the dynamic interaction between the Guanylyl Cyclase-A receptor and TRPC3/C6 channels and the generation of β-cell-specific GC-A-knock-out-mice as well as the analysis of the importance of ANP for the insulin homeostasis under pathophysiological conditions
N2  - Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellulären Produktion von cGMP über den membranständigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert außerdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkanälen Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass ANP über GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabhängige Weise stimuliert. Um eine mögliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunpräzipitation mit einem anti-Flag-Antikörper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabhängig von ANP mit GC-A ko-immunpräzipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Domäne fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer Überproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antikörper die Koimmunpräzipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schließlich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgeführt, um die lokale Nähe von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine mögliche ANP-induzierte Konformationsänderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen führte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabhängig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP führte dagegen zu keiner Veränderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der für den neuen cGMP-unabhängigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A für die Insulinausschüttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans’schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP für die systemische Glukose-Homöostase zu ergründen, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans’schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht möglich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressionsänderung von GC-A in anderen Geweben führte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO Mäuse blieb unauffällig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP für die Insulinausschüttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere für 12 Wochen einer fettreichen Ernährung (60% Fett) ausgesetzt um einen Prädiabetes auszulösen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgeführt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der Nüchternglukosewert in den weiblichen KO-Mäusen leicht erhöht ist. Daher wurden die oGTT‘s in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle Mäuse eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60% erhöht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und für immunhistologische Zwecke präpariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergrößerte durchschnittliche Inselfläche und eine erhöhte durchschnittliche β-Zellfläche der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen führt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Prädiabetes beiträgt. Eine mögliche verstärkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschließen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell könnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems für die Insulinausschüttung näher ergründen und dadurch eventuell neue Therapieansätze für Diabetes mellitus Typ 2 bringen.
N2  - Atrial natriuretic peptide (ANP) modulates blood pressure and volume by its cGMP generating guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. ANP also stimulates cardiomyocyte growth and angiogenesis. This work concentrates on two separate mechanisms where ANP/GC-A system plays an important role. The first part of this work concerns the dynamic interaction of the transient receptor potential canonical type 3 or type 6 (TRPC3/C6) cation channels with GC-A receptor. Recently, it was indicated that ANP via GC-A stimulates the TRPC-mediated Ca2+ influx in cardiomyocytes in a cGMP-independent manner. To analyze the presumed direct interaction between TRPC3/C6 and GC-A the proteins TRPC3 or C6 and Flag-GC-A were coexpressed in HEK293 cells in presence or absence of ANP. After lysis GC-A was precipitated from the membrane fraction of the cells with anti-Flag-antibodies. TRPC3 and TRPC6 were detected in this fraction. The co-immunoprecipitation was also performed with a modified GC-A receptor lacking the cyclase domain as well as with cardiomyocytes from transgenic mice characterized by cardiomyocyte overexpression of HA-GC-A. In all cases TRPC3/C6 co-immunoprecipitated with GC-A. Finally, FRET-based approaches were used to examine the local distance between GC-A and TRPC3. Coexpression of GC-A-CFP and TRPC3-YFP in HEK293 cells led to a FRET signal which was decreased by ANP (1-100 nM) in a concentration dependent manner. Incubation of the membrane permeable cGMP analog 8-Br-cGMP did not alter the FRET signal. All results confirm the presence of a stable protein interaction between GC-A and TRPC3 or TRPC6. In the second part of this work the role of ANP/GC-A system for (patho)physiologic insulin release in pancreatic β-cells was investigated. It was recently shown that GC-A is expressed in β-cells and that ANP modulates β-cell growth and insulin secretion in isolated pancreatic islets. To analyze the relevance of ANP for the systemic glucose homeostasis a new mouse model was generated characterized by a β-cell-specific GC-A deletion. To prove the conditional GC-A knock out (KO) we used genomic PCR and immunohistochemistral approaches. The specific deletion did alter neither the GC-A expression in other tissues nor blood pressure and heart weight in KO mice. Fasting blood glucose levels were slightly elevated in female KO mice. Therefore all subsequent experiments were evaluated gender-related. Male and female controls and KO mice were fed a high fat diet (60 % fat) for 12 weeks to provoke a prediabetic state and insulin resistance. Oral glucose tolerance tests (oGTT), blood pressure measurements and weight analysis were performed to analyze if the KO affects insulin homeostasis under pathophysiological conditions. All mice developed an insufficient blood glucose regulation which was evident using the oGTT. Blood pressure was increased by 60% both in controls and KO mice. For immunohistochemical studies the pankreata from several animals were dissected and fixed in formalin. The cut organ slices were treated with glucagon and insulin antibodies. All islets were documented and analyzed morphometrically. The mean islet area and the mean β-cell area was significantly increased in KO animals. In summary, the β-cell-specific KO of GC-A led to hypertrophic β-cells under pathophysiological conditions. To uncover the entire role of ANP/GC-A system for the insulin release further studies have to be performed. The new mouse model provides the potential to find new therapeutic strategies for the treatment diabetes mellitus type 2.
KW  - Atriales natriuretisches Hormon
KW  - Insulin
KW  - Guanylyl Cyclase A
KW  - TRPC3
KW  - TRPC6
KW  - ANP
KW  - insulin
KW  - GC-A
KW  - TRPC3
KW  - TRPC6
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78650
ER  -