TY - THES A1 - Bader, Teresa Anna T1 - Funktionelle Analysen virulenzrelevanter und essentieller Gene in Candida albicans T1 - Functional analysis of virulence related and essential genes in Candida albicans N2 - Die Bedeutung von Mykosen hat wegen der wachsenden Zahl immunsupprimierter Patienten in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. Diese erkranken häufig an oberflächlichen sowie lebensbedrohlichen systemischen Infektionen mit dem opportunistisch humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, da der Keim, der oftmals als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten im Gastrointestinaltrakt gesunder Menschen vorkommt, vom geschwächten Immunsystem nicht mehr in Schach gehalten werden kann. In dieser Arbeit sollten bestimmte Gene von C. albicans, die in anderen Organismen als essentiell für deren Lebensfähigkeit bzw. Virulenz beschrieben wurden, als potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antimykotika charakterisiert werden. Das CMP1-Gen kodiert für die katalytische Untereinheit der konservierten Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und in anderen Organismen verschiedene physiologische Prozesse reguliert und essentiell für die Virulenz des pathogenen Hefepilzes Cryptococcus neoformans ist. Um die Bedeutung von Calcineurin für das Überleben und die Virulenz von C. albicans zu untersuchen, wurden homozygote cmp1 knock-out-Mutanten sowohl in einem auxotrophen C. albicans-Laborstamm als auch, mit Hilfe eines neuen dominanten Selektionsmarkers, in einem prototrophen Wildstamm hergestellt. Die Mutanten erwiesen sich als hypersensitiv gegenüber Natrium, Calcium, Mangan und Lithium sowie gegenüber alkalischem pH-Wert. Darüber hinaus konnten die mutierten Zellen Membranstreß, der durch SDS- oder Fluconazol-Zugabe verursacht wurde, nicht tolerieren und waren unter diesen Bedingungen stark in ihrem Wachstum gehemmt. Andere wichtige Virulenzeigenschaften wie die Toleranz gegenüber Wirts-Körpertemperatur und die Fähigkeit zur Hyphenbildung zeigten sich durch die CMP1-Deletion in vitro nicht beeinträchtigt. Dennoch machte die Anwendung eines murinen Modells einer systemischen Candidose in vivo deutlich, daß die Mutanten sehr stark in ihrer Virulenz attenuiert waren. Der Virulenzdefekt war vermutlich zumindest zum Teil dadurch bedingt, daß die Calcineurin-defizienten Zellen im Gegensatz zum Wildtyp in humanem Serum nicht wachsen konnten und deshalb möglicherweise schlechter über die Blutbahn disseminieren konnten. Außer Calcineurin wurden in Kooperation mit einem Industriepartner drei weitere Gene, YML127, YPR143, und YML93, die in S. cerevisiae als essentiell beschrieben wurden und die keine signifikanten Homologien zu Vertebraten-Genen aufwiesen, in der C. albicans-Genomsequenz identifiziert und auf ihre Eignung als potentielle Targets hin untersucht. Die Funktion dieser Gene war zu Beginn dieser Arbeit unbekannt; vor kurzem wurde jedoch gezeigt, daß sie in S. cerevisiae eine Rolle beim Chromatin-Remodeling bzw. bei der rRNA-Prozessierung haben. Nachdem sich alle Gene auch in C. albicans als essentiell herausgestellt hatten, wurden konditional letale Mutanten hergestellt, in denen die Gene durch induzierbare Deletion mit Hilfe der site-spezifischen Rekombinase FLP aus dem Genom entfernt wurden. Dadurch wurde eine Population von Nullmutanten erhalten, in denen der terminale Phänotyp der Gendeletion analysiert werden konnte. Die funktionelle Analyse des YML127 (RSC9) Gens wies darauf hin, daß es in C. albicans eine ähnliche Funktion hat wie in der Bäckerhefe, in der das Rsc9-Protein ein Bestandteil des RSC-Protein-Komplexes ist, der die Struktur des Chromatins in Abhängigkeit von Zellzyklus und Umweltbedingungen umorganisiert und damit die Aktivität von Genen steuert. Mit Hilfe eines HA-Epitop markierten YML127-Gens konnte das Genprodukt im Zellkern von C. albicans lokalisiert werden. Die C. albicans yml127-Nullmutanten produzierten verlängerte, mehrfach knospende Zellen, was einen Verlust der Koordination zwischen Mitose und Zytokinese vermuten ließ. Die beiden Gene YPR143 und YML93 (UTP14) scheinen wie ihre homologen Vertreter in S. cerevisiae an der Prozessierung der ribosomalen RNA beteiligt zu sein. Heterozygote Mutanten wiesen eine Haploinsuffizienz auf, die sich in einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Hemmstoffen der rRNA-Synthese und der Ribosomenaktivität zeigte, und in den induzierten Nullmutanten akkumulierten Vorstufen der reifen rRNAs. In beiden Fällen führte die Gendeletion zu Anomalien im Zellzyklus; die ypr143-Mutanten wiesen eine vergrößerte unförmige Zellmorphologie auf, und die yml93-Mutanten bildeten große, rundliche Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben nicht nur wichtige Einblicke in die Funktion der untersuchten Gene in essentiellen zellulären Prozessen, sondern zeigen auch deren Bedeutung für die Virulenz bzw. für das Überleben des humanpathogenen Hefepilzes C. albicans. Die entsprechenden Genprodukte sollten sich deshalb prinzipiell als Angriffspunkte für die Entwicklung neuer antimykotischer Medikamente eignen. N2 - The importance of fungal infections has steadily increased during the past decades due to the growing number of immunocompromised patients. These patients often suffer from superficial as well as life-threatening systemic infections with the opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans, which is a harmless commensal on mucosal surfaces in many healthy people but cannot be controlled any more by a weakened immune system. On the other hand, virulence traits of the fungus also contribute to its pathogenicity, because they enable adaptation to different host niches. The success of medical treatment is limited by the emergence of resistance and by toxic side effects of antifungal drugs. Therefore, there is an urgent need to develop novel antimycotic agents. In this work selected C. albicans genes, which were known to be essential for viability or virulence in other organisms, were characterized as potential targets for the development of new antifungal drugs. The CMP1 gene encodes the catalytic subunit of the conserved calcium/calmodulin-dependent phosphatase calcineurin, which regulates a variety of physiological processes in the model yeast Saccharomyces cerevisiae and other organisms and is essential for virulence of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans. To investigate the importance of calcineurin for survival and virulence of C. albicans, homozygous cmp1 knock-out mutants were constructed in an auxotrophic C. albicans laboratory strain as well as, using a new dominant selection marker, in a prototrophic wild-type strain. The mutants showed hypersensitivity to increased concentrations of ions and to alkaline pH. In addition, the mutated cells could not tolerate membrane stress resulting from SDS or fluconazole treatment and their growth was strongly inhibited under these conditions. Other characteristics that are important for virulence, like tolerance to the host body temperature and the ability to switch to a hyphal growth form, were not affected by the CMP1 deletion. Nevertheless, the mutants were avirulent in a murine model of systemic candidiasis. The virulence defect could be explained at least in part by the fact that, in contrast to the wild-type, the cmp1 mutants were unable to grow in human serum and therefore might have a reduced capacity to disseminate via the bloodstream. In addition to CMP1, three other genes, YML127, YPR143, and YML93, were selected in cooperation with an industrial partner from the available C. albicans genome sequence and evaluated as potential targets. These genes had been reported to be essential in S. cervisiae and they did not exhibit significant homology to mammalian genes. At the beginning of the present work the function of the three genes was unknown, but recently it was demonstrated that their counterparts in S. cerevisiae have roles in chromatin remodeling or rRNA processing. It was demonstrated that all three genes are also essential in C. albicans. Therefore, conditional lethal mutants were constructed in which the genes could be excised from the genome by inducible deletion using the site-specific FLP recombinase. In this way, populations of null mutants were obtained in which the terminal phenotype of the gene deletion could be analyzed. The functional analysis of the YML127 (RSC9) gene showed that it has a similar function in C. albicans as in S. cerevisiae, where the Rsc9 protein is a component of the RSC complex that remodels the structure of chromatin in a cell cycle dependent manner and in response to environmental conditions and thereby controls gene activity. Using an HA-epitope-tagged YML127 gene the Yml127 protein could be localized in the nucleus in C. albicans. The C. albicans yml127 null mutants produced elongated, multi-budded cells, pointing to a loss of coordination of mitosis and cytokinesis. The genes YPR143 and YML93 (UTP15) seem to be involved in the processing of the ribosomal RNA, like their counterparts in S. cerevisiae. Heterozygous mutants exhibited a haploinsufficient phenotype, which was evident from their hypersusceptibility to inhibitors of rRNA synthesis and ribosome activity, and the induced null mutants accumulated precursors of the mature rRNAs. In both cases the gene deletion resulted in cell cycle defects; the ypr143 null mutants produced enlarged, misshapen cells, and the yml93 mutants formed large, round cells. The results of this work not only provide valuable clues about the function of the investigated genes in essential cellular processes, but also demonstrate their importance for virulence and viability of the human pathogenic fungus C. albicans. In principle, the corresponding gene products should therefore be suitable targets for the development of novel antifungal drugs. KW - Candida albicans KW - Virulenz KW - Calcineurin KW - Gen KW - Candida albicans KW - Calcineurin KW - RSC Chromatin Remodeling Komplex KW - rRNA Prozessierung KW - Candida albicans KW - calcineurin KW - RSC chromatin remodeling complex KW - rRNA processing Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12894 ER - TY - THES A1 - Bergfeld, Arne T1 - Das pH-regulierte Protein 1 (Pra1) von \(Candida\) \(albicans\) moduliert CD4\(^+\) T-Zell-Antworten der Maus in vitro durch direkte Bindung an die T-Zell-Oberfläche T1 - The pH-regulated protein 1 (Pra1) of \(Candida\) \(albicans\) modulates mouse CD4\(^+\) T cell responses in vitro by directly binding to the T cell surface N2 - Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar. Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann. Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden. Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen. Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit. Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt. Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α. N2 - Infections caused by C. albicans on mucosal surfaces are a common disease in patients suffering from suppression of the T cell immune defense. Blood stream infections by the yeast C. albicans (candedemia) represent still a severe complication in patients in intensive care units with high rates of lethality. The pH-regulated antigen 1 (Pra1) is a protein produced by C. albicans which is present on the surface of the fungi and is secreted into the supernatant of fungal cultures as well. Pra1 can bind to human T cells via the surface protein CD46. It is known, that this protein can also bind to certain immune cells of mice (monocytes and phagocytes). Binding to T cells of mice is not yet known. A characterization of the interaction of Pra1 with immune cells of mice would be valuable, because mice act as a biological model system for the investigation of infections with C. albicans. In this paper, it could be shown that recombinant Pra1 (rPra1) can bind to mouse CD4+ T cells as well. After the finding that rPra1 can bind to CD4+ T cells, different parameters determining this binding have been studied. Zinc was found to be one influencing factor on the binding. Pra1 can bind free zinc ions and by the addition of ZnCl2 while incubating T cells with Pra1 the signal of bound Pra1 to CD4+ T cells could be increased. Aspf2, a protein from Aspergillus fumigatus with high homology to Pra1, was not able to bind to these cells. In in-vivo-experiments with animals infected with C. albicans, no wild-typic secreted Pra1 was found bound to T cells. Supernatant from C. albicans cultures produced, after incubation in vitro, a signal for cell-bound Pra1 on CD4+ T cells. Kinetics of the binding of rPra1 to T cells showed a constant increase of signal over the time of incubation. The off-kinetics revealed a decrease of cell-bound rPra1 over time to the edge of detectability. The receptor of Pra1 on T cells has not been identified yet. The structurally and functionally comparable surface proteins Crry, CD59a and CD55 were tested in knockout mice for each of these proteins and could be excluded as possible receptors. After binding of secreted Pra1 to neutrophilic granulocytes these cells experience a decreased capacity to phagocytose pathogens. The binding of Pra1 to CD4+ T cells leads to a costimulation of T cells, which results in increased cell activation and proliferation. This costimulatory capacity of Pra1 can be augmented by adding 10 μM zinc chloride. During activation of naïve CD4+ T cells Pra1 reduces the secretion of IFN-γ. The reduction of IFN-γ-producing cells is not due to an influence of Pra1 during cell activation of naive CD4+ T cells to Th1 cells and is also not due to induction of apoptosis in IFN-γ-producing Th1 cells. The binding of Pra1 to ex-vivo isolated CD4+ T cells reduces the in vitro secretion of IFN-γ after stimulating these cells via their T cell receptor. Additionally, the secretion of IL-2 and TNF-α was reduced. KW - Candida albicans KW - T-Lymphozyt KW - Interferon KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Interleukin 2 KW - C. albicans KW - CD4+ KW - T-Zelle KW - IFN-g KW - Pra1 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169716 ER - TY - JOUR A1 - Bergfeld, Arne A1 - Dasari, Prasad A1 - Werner, Sandra A1 - Hughes, Timothy R. A1 - Song, Wen-Chao A1 - Hortschansky, Peter A1 - Brakhage, Axel A. A1 - Hünig, Thomas A1 - Zipfel, Peter F. A1 - Beyersdorf, Niklas T1 - Direct binding of the pH-regulated Protein 1 (Pra1) from Candida albicans inhibits cytokine secretion by mouse CD4\(^{+}\) T cells JF - Frontiers in Microbiology N2 - Opportunistic infections with the saprophytic yeast Candida albicans are a major cause of morbidity in immunocompromised patients. While the interaction of cells and molecules of innate immunity with C. albicans has been studied to great depth, comparatively little is known about the modulation of adaptive immunity by C. albicans. In particular, direct interaction of proteins secreted by C. albicans with CD4\(^{+}\) T cells has not been studied in detail. In a first screening approach, we identified the pH-regulated antigen 1 (Pra1) as a molecule capable of directly binding to mouse CD4\(^{+}\) T cells in vitro. Binding of Pra1 to the T cell surface was enhanced by extracellular Zn\(^{2+}\) ions which Pra1 is known to scavenge from the host in order to supply the fungus with Zn\(^{2+}\). In vitro stimulation assays using highly purified mouse CD4\(^{+}\) T cells showed that Pra1 increased proliferation of CD4\(^{+}\) T cells in the presence of plate-bound anti-CD3 monoclonal antibody. In contrast, secretion of effector cytokines such as IFNγ and TNF by CD4\(^{+}\) T cells upon anti-CD3/ anti-CD28 mAb as well as cognate antigen stimulation was reduced in the presence of Pra1. By secreting Pra1 C. albicans, thus, directly modulates and partially controls CD4\(^{+}\) T cell responses as shown in our in vitro assays. KW - Candida albicans KW - pH-regulated antigen 1 (Pra1) KW - CD4\(^{+}\) T cells KW - immune evasion KW - cytokine secretion Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158274 VL - 8 IS - 844 ER - TY - THES A1 - Biswas, Kajal T1 - Analysis of Nitrogen starvation induced filamentous growth and characterization of putative essential genes in the human fungal pathogen, Candida albicans N2 - 1. Zusammenfassung Candida albicans ist ein opportunistisch pathogener Hefepilz, der sowohl oberflächliche Infektionen der Schleimhaut als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen hervorrufen kann. Obwohl die Fähigkeit von C.albicans Infektionen auszulösen weitgehend vom Immunstatus des Wirts abhängt, besitzt der Pilz doch auch spezifische Eigenschaften, die eine Kolonisierung, Disseminierung und Anpassung an unterschiedliche Wirtsnischen ermöglichen und ihn vom harmlosen Kommensalen zum gefährlichen Krankheitsserreger werden lassen. Unter bestimmten Umweltbedingungen geht C.albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum invasiven, filamentösen Wachstum über, das eine wichtige Rolle in der Pathogenität des Pilzes spielt. Stickstoffmangel ist eines der Signale, die das filamentöse Wachstum in C.albicans induzieren, und die Kontrolle der Morphogenese durch die Verfügbarkeit von Stickstoff wurde in dieser Arbeit detailliert untersucht. Ammonium ist für Hefepilze eine bevorzugte Stickstoffquelle, die über spezifische Transporter in die Zelle aufgenommen wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass C.albicans zwei Ammoniumpermeasen besitzt, deren Expression durch Stickstoffmangel induziert wird. Während die Deletion von CaMEP1 oder CaMEP2 keinen Einfluss auf das Wachstum bei limitierenden Ammoniumkonzentrationen hatte, konnten mep1 mep2 Doppelmutanten bei Ammoniumkonzentrationen unter 5 mM nicht mehr wachsen. Im Gegensatz zu mep1 Mutanten bildeten mep2 Mutanten unter Stickstoffmangel keine Hyphen mehr und wuchsen ausschließlich in der Hefeform. CaMep2p hat also nicht nur eine Funktion als Ammoniumtransporter, sondern spielt auch eine Rolle bei der Induktion des filamentösen Wachstums. Weitere Experimente zeigten, dass CaMep2p ein weniger effizienter Ammoniumtransporter als CaMep1p ist, dafür aber stärker exprimiert wird, und dass dieser Unterschied wichtig für die Signalfunktion von CaMep2p ist. Durch Deletionsanalysen konnte bewiesen werden, dass die C-terminale, cytoplasmatische Domäne von CaMep2p essentiell für die Induktion des Hyphenwachstums ist, für den Ammoniumtransport jedoch nicht benötigt wird, und diese beiden Funktionen von CaMep2p daher voneinander getrennt werden können. In C.albicans gibt es mindestens zwei Signalwege die das filamentöse Wachstum steuern, eine MAP-Kinase-Kaskade und einen cAMP-abhängigen Signalweg, die in den Transkriptionsfaktoren Cph1p bzw. Efg1p enden. Bei Inaktivierung des einen oder des anderen Signalwegs induziert Stickstoffmangel kein filamentöses Wachstum mehr. Ein hyperaktives CaMEP2 Allel konnte den filamentösen Wachstumsdefekt sowohl von cph1 als auch efg1 Mutanten aufheben, nicht jedoch den einer cph1 efg1 Doppelmutante oder einer Mutante, der das G-Protein Ras1p fehlte, das beide Signalwege aktiviert. Umgekehrt wurde der filamentöse Wachstumsdefekt von mep2 Mutanten durch ein dominant-aktives RAS1 Allel bzw. durch die Zugabe von cAMP aufgehoben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CaMep2p bei Stickstoffmangel sowohl den MAP-Kinase- als auch den cAMP-abhängigen Signalweg aktiviert, um filamentöses Wachstum zu induzieren. In genügend hohen Konzentrationen reprimierte Ammonium das filamentöse Wachstum selbst wenn die Signalwege artifiziell aktiviert waren. Die bevorzugte Stickstoffquelle Ammonium ist deshalb ein Inhibitor der Morphogenese, der durch denselben Transporter in die Zelle aufgenommen wird, der bei Stickstoffmangel das filamentöse Wachstum von C.albicans induziert. Obwohl ein genaues Verständnis der Virulenzmechanismen von C.albicans auch neue Ansätze zur Bekämpfung von Infektionen durch diesen Pilz liefern kann, ist doch die Identifizierung und Charakterisierung von essentiellen Genen als potentielle Ziele für die Entwicklung neuer Antimykotika eine Strategie, die von der pharmazeutischen Industrie favorisiert wird. Aus diesem Grund wurden in Zusammenarbeit mit einem Industriepartner drei Gene von C.albicans ausgewählt, die in anderen Pilzen als essentiell beschrieben wurden, und im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert. RAP1 codiert für das Repressor/Aktivator Protein 1, ein Transkriptionsfaktor und Telomerbindeprotein, das in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae essentiell ist. Die Deletion des RAP1 Gens in C.albicans beeinträchtigte jedoch nicht die Lebensfähigkeit der Mutanten, so dass RAP1 kein vielversprechendes Ziel darstellt. CBF1 (centromere binding factor 1) ist in S.cerevisiae wichtig für die korrekte Chromosomenverteilung während der Mitose und außerdem auch für die transkriptionelle Aktivierung der Methioninbiosynthesegene; in den verwandten Hefen Kluyveromyces lactis und Candida glabrata ist CBF1 sogar essentiell. C.albicans cbf1 Mutanten wiesen jedoch keinen erhöhten Chromosomenverlust auf, so dass CBF1 hier offensichtlich keine Rolle bei der Chromosomensegregation spielt. Allerdings waren die Mutanten auxotroph für schwefelhaltige Aminosäuren und generell stark im Wachstum beeinträchtigt, was zeigte, dass Cbf1p für das normale Wachstum von C.albicans wichtig ist. YIL19 ist in S.cerevisiae ein essentielles Gen und hat eine Funktion bei der Reifung der 18S rRNA. YIL19 stellte sich auch in C.albicans als essentiell heraus. Konditionale Mutanten, in denen YIL19 durch induzierbare, FLP-vermittelte Rekombination aus dem Genom deletiert wurde, waren nicht lebensfähig und akkumulierten rRNA Vorstufen. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass YIL19 essentiell für diesen wichtigen zellulären Prozess und für die Lebensfähigkeit von C.albicans ist und sich möglicherweise als Ziel für die Entwicklung antifungaler Substanzen eignet. N2 - 1. Summary Candida albicans is an opportunistic human fungal pathogen that causes a variety of infections, ranging from superficial mucosal to deep-seated systemic infections, especially in immunocompromised patients. Although the ability of C.albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, the fungus also exhibits specific characteristics that facilitate colonization, dissemination, and adaptation to different host niches and thereby turn C.albicans from a harmless commensal to an aggressive pathogen. In response to various environmental stimuli C.albicans switches from growth as a budding yeast to invasive filamentous growth, and this morphogenetic switch plays an important role in C.albicans pathogenesis. Nitrogen limitation is one of the signals that induce filamentous growth in C.albicans, and the control of the morphogenetic transition by nitrogen availability was studied in detail in the present work. Ammonium is a preferred nitrogen source for yeasts that is taken up into the cells by specific transporters. It was found in this study that C.albicans possesses two major ammonium transporters, encoded by the CaMEP1 and CaMEP2 genes, expression of which is induced by nitrogen starvation. Whereas mep1 or mep2 single mutants grew as well as the wild-type strain on limiting concentrations of ammonium, deletion of both transporters rendered C.albicans unable to grow at ammonium concentrations below 5 mM. In contrast to mep1 mutants, mep2 mutants failed to filament and grew only in the yeast form under nitrogen starvation conditions, indicating that in addition to its role as an ammonium transporter CaMep2p also has a signaling function in the induction of filamentous growth. CaMep2p was found to be a less efficient ammonium transporter than CaMep1p and to be expressed at much higher levels, a distinguishing feature important for its signaling function. By the construction and analysis of serially truncated versions of CaMep2p, the C-terminal cytoplasmic tail of the protein was shown to be essential for signaling but dispensable for ammonium transport, demonstrating that these two functions of CaMep2p are separable. In C.albicans at least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators Cph1p and Efg1p, respectively, control filamentous growth, and mutants defective in either one of these pathways are defective for filamentation under nitrogen starvation conditions. A hyperactive CaMEP2 allele rescued the filamentation defect of a cph1 or a efg1 mutant, but not of a cph1 efg1 double mutant or a mutant deleted for RAS1, which acts upstream of and activates both signaling pathways. Conversely, a dominant active RAS1 allele or addition of exogenous cAMP rescued the filamentation defect of mep2 mutants. These results suggest that CaMep2p activates both the MAP kinase and the cAMP pathway in a Ras1p dependent manner to promote filamentous growth under nitrogen starvation conditions. At sufficiently high concentrations, ammonium repressed filamentous growth even when the signaling pathways were artificially activated. Therefore, C.albicans has established a regulatory circuit in which a preferred nitrogen source, ammonium, serves as an inhibitor of morphogenesis that is taken up into the cell by the same transporter that induces filamentous growth in response to nitrogen starvation. Although a detailed understanding of virulence mechanisms of C.albicans may ultimately lead to novel approaches to combat infections caused by this pathogen, the identification and characterization of essential genes as potential targets for the development of antifungal drugs is a strategy favoured by most pharmaceutical companies. Therefore, C.albicans homologs of three genes that are essential in other fungi were selected in collaboration with an industrial partner and functionally characterized in this work. RAP1 encodes the repressor/activator protein 1, a transcription factor and telomere binding protein that is essential for viability in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. However, deletion of the C.albicans RAP1 homolog did not affect viability or growth of the mutants, suggesting that it is not a promising target. CBF1 (centromere binding factor 1) is necessary for proper chromosome segregation and transcriptional activation of methionine biosynthesis genes in S.cerevisiae and is essential for viability in the related yeasts Kluyveromyces lactis and Candida glabrata. Deletion of CBF1 in C.albicans did not result in an increased frequency of chromosome loss, indicating that it has no role in chromosome segregation in this organism. However, the C.albicans cbf1 mutants exhibited severe growth impairment, temperature sensitivity at 42°C, and auxotrophy for sulphur amino acids, suggesting that Cbf1p is a transcription factor that is important for normal growth of C.albicans. YIL19 is an essential gene in S.cerevisiae that is involved in 18S rRNA maturation. YIL19 was found to be an essential gene also in C.albicans. Conditional mutants in which the YIL19 gene could be excised from the genome by inducible, FLP-mediated recombination were non-viable and accumulated rRNA precursors, demonstrating that YIL19 is essential for this important cellular process and for viability of C.albicans and could serve as a target for the development of antifungal drugs. KW - Candida albicans KW - Pathogenität KW - Stickstoff KW - Candida albicans KW - ammonium permease KW - nitrogen regulation KW - essential gene Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11554 ER - TY - THES A1 - Böhm, Lena T1 - Dissecting Mechanisms of Host Colonization by C. albicans T1 - Untersuchungen zur Wirtskoloniserung durch C. albicans N2 - The human body is laden with trillions of microorganisms that belong to all three domains of life. Some species of this microbiota subsist as harmless commensals in healthy adults, but under certain circumstances, they can cause mucosal disease or even systemic, life-threatening infections. While the bacterial members of our microbiota are heavily studied today, much less attention is afforded to eukaryotic species that colonize different mucocutaneous surfaces of the human body. This dissertation focuses on identifying regulatory circuits that enable a prominent member of these eukaryotes, C. albicans, to, on the one hand, live on a specific mammalian mucosal surface as a harmless commensal and, on the other hand, proliferate as a pathogen. Since the ultimate source of many fatal Candida infections is the gastrointestinal (GI) tract of the infected individual, this organism is particularly suited to distinguishing traits essential for the gut colonization of commensal fungi and their ability to cause disease. Sequence-specific DNA-binding proteins that regulate transcription are important to most biological processes; I thus used these proteins as starting points to gain insights into 1) how a specific transcription regulator promotes virulence in C. albicans; 2) which traits C. albicans requires to inhabit the GI tract of a specific, well-defined mouse model as a harmless commensal; and 3) how three previously undescribed transcriptional regulators contribute to the commensal colonization of the digestive tract of this mouse model. Altogether, this work advances the knowledge concerning the biology of commensal fungi in the mammalian gut and genetic determinants of fungal commensalism, as well as pathogenicity. N2 - Der menschliche Körper wird von unzähligen Mikroorganismen aus allen drei Domänen des Lebens besiedelt. Einige Spezies dieser so genannten Mikrobiota leben mit gesunden Menschen als harmlose Kommensale, können jedoch unter bestimmten Umständen auch Erkrankungen der Schleimhäute oder sogar systemische, lebensbedrohliche Krankheiten verursachen. Der bakterielle Anteil unserer Mikrobiota wurde bereits ausgiebig untersucht. Sehr viel weniger Aufmerksamkeit haben bisher eukaryotische Organismen erlangt, die unterschiedliche Schleimhäute des menschlichen Körpers besiedeln. Ziel dieser Dissertation ist es regulatorische Kreisläufe zu identifizieren, die es einem prominenten eukaryotischen Mitglied unserer Mikrobiota, Candida albicans, ermöglichen auf der einen Seite eine spezielle mukokutane Oberfläche von Säugern zu besiedeln, und sich auf der anderen Seite als Pathogen zu verbreiten. Da man annimmt, dass viele bedrohliche Candida Infektionen ihren Ursprung im Gastrointestinaltrakt desselben Individuums haben, eignet sich dieser Organismus im speziellen um Eigenschaften zu identifizieren, die es kommensalen Pilzen ermöglicht den Darm zu besiedeln aber auch Krankheiten zu verursachen. Sequenz-spezifische DNA Bindeproteine, die die Transkription regulieren sind zentrale Akteure in den meisten biologischen Prozessen; aus diesem Grund verwende ich diese Proteine als Startpunkte um Einblicke in Folgendes zu erlangen: Zuerst, wie ein spezieller Transkriptionsregulator C. albicans‘ Virulenz beeinflusst. Dann welche Eigenschaften von C. albicans Voraussetzung für die Kolonisierung des Gastrointestinaltrakts eines klar definierten Mausmodells sind. Und zuletzt wie drei bisher nicht beschriebene Transkriptionsregulatoren zu der kommensale Kolonisierung des Verdauungstrakts dieses Mausmodells beitragen. Zusammenfassend trägt diese Arbeit dazu bei, das Wissen über die Biologie kommensaler Pilze im Säugertrakt und über genetische Determinanten zu erweitern, die zum Kommensalismus aber auch zur Pathogenität von Pilzen beitragen. KW - Candida albicans KW - Host Colonization KW - Microbiota KW - Pathogenicity KW - Commensalism KW - Transcription Factor Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192303 ER - TY - JOUR A1 - Böhm, Lena A1 - Torsin, Sanda A1 - Tint, Su Hlaing A1 - Eckstein, Marie Therese A1 - Ludwig, Tobias A1 - Pérez, J. Christian T1 - The yeast form of the fungus Candida albicans promotes persistence in the gut of gnotobiotic mice JF - PLoS Pathogens N2 - Many microorganisms that cause systemic, life-threatening infections in humans reside as harmless commensals in our digestive tract. Yet little is known about the biology of these microbes in the gut. Here, we visualize the interface between the human commensal and pathogenic fungus Candida albicans and the intestine of mice, a surrogate host. Because the indigenous mouse microbiota restricts C. albicans settlement, we compared the patterns of colonization in the gut of germ free and antibiotic-treated conventionally raised mice. In contrast to the heterogeneous morphologies found in the latter, we establish that in germ free animals the fungus almost uniformly adopts the yeast cell form, a proxy of its commensal state. By screening a collection of C. albicans transcription regulator deletion mutants in gnotobiotic mice, we identify several genes previously unknown to contribute to in vivo fitness. We investigate three of these regulators—ZCF8, ZFU2 and TRY4—and show that indeed they favor the yeast form over other morphologies. Consistent with this finding, we demonstrate that genetically inducing non-yeast cell morphologies is detrimental to the fitness of C. albicans in the gut. Furthermore, the identified regulators promote adherence of the fungus to a surface covered with mucin and to mucus-producing intestinal epithelial cells. In agreement with this result, histology sections indicate that C. albicans dwells in the murine gut in close proximity to the mucus layer. Thus, our findings reveal a set of regulators that endows C. albicans with the ability to endure in the intestine through multiple mechanisms. KW - Candida albicans KW - deletion mutagenesis KW - gastrointestinal tract KW - fungi KW - regulator genes KW - gene regulation KW - mouse models KW - fungal genetics Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159120 VL - 13 IS - 10 ER - TY - THES A1 - Büchold, Christian T1 - Synthese und Testung cis-konfigurierter Aziridine als pseudo-irreversible Inhibitoren der sekretorischen Aspartatproteasen von Candida albicans T1 - Synthesis and testing of cis-configured aziridines as pseudo-irreversible inhibitors of Candida albicans secreted aspartic proteases N2 - Candida albicans gehört zu den für den Menschen fakultativ pathogenen Hefepilzen. Der normalerweise harmlose Begleiter der humanen Mikroflora findet sich hauptsächlich auf Schleimhäuten der Mundhöhle und des Magen-Darm-Trakt sowie in der vaginalen Flora. Menschen, deren Immunsystem geschwächt ist, sind jedoch besonders anfällig für Infektionen, die durch den Pilz hervorgerufen werden können. Neben oberflächlichen kann es dabei auch zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen kommen, die nicht selten zum Tod des Patienten führen. Durch ein zunehmendes Auftreten von Resistenzen gegen gebräuchliche Pharmaka besteht aktuell ein dringender Bedarf an neuen Wirkstoffen gegen Candida. Die zehn vom Hefepilz exprimierten sekretorischen Aspartatproteasen (SAP1-10), die als wichtige Virulenzfaktoren gelten, stellten sich dabei zunehmend als vielversprechende Targets heraus. Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der literaturbekannten cis-konfigurierten 3-Phenylaziridin-2-carboxylate A-07 und A-08 als irreversible Inhibitoren der SAP-Isoenzyme. Die Variation der Substituenten am Aziridinstickstoff für die Adressierung der S3-Tasche im Enzym erfolgte durch Alkyl-, Aryl- und Acylreste. Die Aminosäureester wurden in Konfiguration und Art der Seitenkette modifiziert, um eine Verbesserung der Anpassung an die S1‘-Tasche zu ermöglichen. Die cis-3-Phenylaziridin-2-carboxylate wurden durch Cromwell-Synthese als Racemate erhalten. Aminosäure- und Peptidkupplungen erfolgten mit gängigen Kupplungsreagenzien (PPA, DPPA). Die stereoselektive Synthese des methylenverbrückten Aziridin-2-carboxylats A-10 erfolgte durch Redoxkondensation nach Mukaiyama. Die synthetisierten Verbindungen wurden in einem fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre inhibitorische Wirkung gegen SAP2 getestet. Dabei war das im FRET-Assay bislang an SAP2 verwendete Substrat Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH auch für Testungen an SAP1, 3 & 8 sowie Cathepsin D geeignet. Neben den jeweiligen Km-Werten konnten für diese Enzyme auch die zugehörigen kcat-Werte bestimmt werden. Zur Bestimmung der Hemmkonstanten wurde für die aktiven Verbindungen ein Verdünnungsassay nach Kitz und Wilson durchgeführt. 20 der 46 Aziridin-2-carboxylate erreichten SAP2 k2nd-Werte von mindestens 7880 M-1min-1. Die mit k2nd-Werten von 60608 bis 118582 M-1min-1 potentesten Verbindungen wurden durch (R)-Aminosäuresubstitution (A-28, A-31) bzw. durch Cyclohexylmethyl-Verknüpfung am Aziridinstickstoff (A-43, A-45) erhalten. Für die einzelnen Diastereomere von A-31, A-31a und A-31b, wurde eine signifikant unterschiedliche Hemmwirkung festgestellt. Die Inhibitoren zeigten eine zeitabhängige Hemmung, die nach ca. 30 min Inkubationszeit jedoch wieder schwächer wurde. LC-MS- und NMR-Studien lassen einen pseudo-irreversiblen Hemmmechanismus vermuten: Der Inhibitor bindet zunächst irreversibel unter Ringöffnung des Aziridins an das Enzym. Der entstehende Ester wird danach unter den sauren Assaybedingungen wieder hydrolysiert. Der resultierende Aminoalkohol bindet anschließend als Übergangszustandsanalogon reversibel an das Enzym. Selektivitätsstudien an Cathepsin D zeigten für 36 der 46 Aziridin-2-carboxylate k2nd-Werte von 10350 bis 936544 M-1min-1. Damit sind die Verbindungen an CathD aktiver als an SAP2. Die 1-Cyclohexylmethyl-verknüpften Aziridine wiesen auch an CathD die höchsten k2nd-Werte auf, wenngleich sich dabei die (R)-Konfiguration der Aminosäurereste (A-57, A-59) als die aktivere Variante herausstellte. Mit dem (R)-Phe-substituierten 1-tert-Butylaziridin A-58 erreichte der potenteste Vertreter der Reihe bereits einen Ki-Wert im dreistelligen nano-molaren Bereich. Ebenso wurden für die (R)-Aminosäure-Analoga von A-07 und A-08 (A-28, A-31) erhöhte Hemmkonstanten erhalten. Wie SAP2 wird auch CathD durch die (an)getrennten Diastereomere A-31a und A-31b signifikant unterschiedlich stark inhibiert. Mit den (R)-Valin-verknüpften Aziridinen A-81, A-82 und A-85 fanden sich aktive verzweigt-Alkyl-substituierte CathD-Inhibitoren. N2 - Candida albicans is one of the most common fungal pathogens of human beings. Usually, Candida species reside as commensal organisms as part of the normal microflora, predomi-nantly colonizing the mucosal surfaces of the oral cavity, the gastrointestinal tract or the va-ginal flora. However, notably in immunosuppressed individuals, C. albicans can evolve into an opportunistic pathogen, causing superficial as well as life-threatening systemic infections with high mortality. Increasing resistances to current drug therapies demand research for new antifungal phar-maceuticals. The secreted aspartic proteases (SAP1-10), encoded by ten different sap genes, were discovered as key virulence factors and hence are considered to be potential targets for new antimycotic drugs. The goal of the present work was the improvement of the known cis-configured 3 phenyl-aziridine-2-carboxylates A-07 und A-08 as irreversible inhibitors of the SAP isoenzymes. In order to address their S3 pocket, the substituent at the aziridine-nitrogen was modified (alkyl, aryl and acyl residues). Furthermore, various amino acid esters (D, L) were included in order to improve their fit into the S1’ pocket. The cis-3-phenylaziridine-2-carboxylates were obtained as racemates via Cromwell synthesis. Amino acid and peptide coupling reactions were performed with common coupling reagents (PPA, DPPA). The stereoselective synthesis of the methylene-bridged aziridine-2-carboxylate A-10 was achieved via redox condensation according to Mukaiyama. The synthesized compounds were tested for inhibition of SAP2 by using a fluorometric FRET assay using Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH as sub-strate. This substrate, designed for SAP2, was found to be also suitable for assays with SAP1, 3 & 8 and Cathepsin D. Additionally, the corresponding Km- and kcat values were determined. For the determination of the inhibition constants of the active compounds a dilution assay according to Kitz and Wilson was performed. 20 of the 46 aziridine-2-carboxylates yielded k2nd values of at least 7880 M-1min-1 against SAP2. With k2nd values between 60608 and 118582 M-1min-1, the most potent compounds were achieved with (R)-amino acids (A-28, A-31) and by cyclohexylmethyl substitution of the aziridine-nitrogen (A-43, A-45). Significantly different inhibition potencies were found for the single diastereomers of A-31, A-31a and A-31b. The inhibitors showed a time-dependent inhibition that decreased after 30 min incubation time. LC-MS and NMR studies suppose a pseudo-irreversible mechanism of inhibition: First, the inhibitor irreversibly binds to the enzyme under ring opening of the aziridine. Then the generated ester is hydrolyzed under the acidic assay conditions. The resulting amino alcohol subsequently could bind as a transition-state mimetic inhibitor to the enzyme. In selectivity studies on CathD 36 of the 46 aziridine-2-carboxylates showed k2nd values be-tween 10350 and 936544 M-1min-1. Thus, the compounds show higher activity against CathD than against SAP2. Again, the 1-cyclohexylmethyl-substituted aziridines show the highest k2nd values. However, in these cases the compounds with (R)-configured amino acid residues are the more active ones (A-57, A-59). With the (R)-Phe-substituted 1-tert-butylaziridine A-58, the most active compound reached a Ki value in the nanomolar region. Similarly to the results obtained for SAP2, the (R)-amino acid analogues to A-07 und A-08 (A-28, A-31) show higher inhibition constants. Again, the separated diastereomers A-31a and A-31b display significantly different inhibition potencies. With the (R) valin linked aziridines A-81, A-82 and A-85 a highly active group of alkyl-substituted inhibitors with branched side-chains was found. KW - Candida albicans KW - Aspartatproteasen KW - Enzymkinetik KW - Enzyminhibitor KW - Plasmodium falciparum KW - Malaria KW - Würzburg / Sonderforschungsbereich Erkennung KW - Gewinnung und Funktionale Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten KW - Hefeartige Pilze KW - sekretorische Aspartatproteasen KW - Aziridine KW - irreversible Inhibitoren KW - secreted aspartic proteases KW - aziridines KW - irreversible inhibitors Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39358 ER - TY - JOUR A1 - Czakai, Kristin A1 - Leonhardt, Ines A1 - Dix, Andreas A1 - Bonin, Michael A1 - Linde, Joerg A1 - Einsele, Hermann A1 - Kurzai, Oliver A1 - Loeffler, Jürgen T1 - Krüppel-like Factor 4 modulates interleukin-6 release in human dendritic cells after in vitro stimulation with Aspergillus fumigatus and Candida albicans JF - Scientific Reports N2 - Invasive fungal infections are associated with high mortality rates and are mostly caused by the opportunistic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. Immune responses against these fungi are still not fully understood. Dendritic cells (DCs) are crucial players in initiating innate and adaptive immune responses against fungal infections. The immunomodulatory effects of fungi were compared to the bacterial stimulus LPS to determine key players in the immune response to fungal infections. A genome wide study of the gene regulation of human monocyte-derived dendritic cells (DCs) confronted with A. fumigatus, C. albicans or LPS was performed and Krüppel-like factor 4 (KLF4) was identified as the only transcription factor that was down-regulated in DCs by both fungi but induced by stimulation with LPS. Downstream analysis demonstrated the influence of KLF4 on the interleukine-6 expression in human DCs. Furthermore, KLF4 regulation was shown to be dependent on pattern recognition receptor ligation. Therefore KLF4 was identified as a controlling element in the IL-6 immune response with a unique expression pattern comparing fungal and LPS stimulation. KW - gene regulation in immune cells KW - fungal host response KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181185 VL - 6 ER - TY - THES A1 - Dabas, Neelam T1 - Control of Nitrogen Regulated Virulence Traits of the Human Fungal Pathogen Candida albicans T1 - Steuerung von stickstoffregulierten Virulenzeigenschaften des human-pathogenen Pilzes Candida albicans N2 - Der Hefepilz Candida albicans ist ein harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten des Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Bei einer Störung der natürlichen Mikroflora oder des Wirtsimmunsystems kann der Pilz jedoch auch oberflächliche und sogar systemische Infektionen verursachen. C. albicans weist eine Reihe von Eigenschaften auf, die zur Virulenz des Erregers beitragen. Dazu gehören die Adhärenz an unterschiedliche Wirtsoberflächen, die morphologische Variabilität des Pilzes und die Sekretion von Aspartatproteasen. Die Expression vieler dieser Virulenzfaktoren wird unter anderem durch die Verfügbarkeit von Stickstoff reguliert. Unter Stickstoffmangelbedingungen wechselt C. albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum filamentösen Wachstum, und dieser Wechsel wird durch die Ammoniumpermease Mep2p reguliert. Wie die Induktion des filamentösen Wachstums durch Mep2p kontrolliert wird, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsanalyse von Mep2p durchgeführt, um Aminosäuren zu identifizieren, die an der Signalfunktion dieser Permease beteiligt sind. Die C-terminale cytoplasmatische Domäne von Mep2p wird für den Ammoniumtransport nicht benötigt, ist jedoch essentiell für die Signaltransduktion. Progressive C-terminale Verkürzungen von Mep2p zeigten, dass ein MEP2DC433-Allel immer noch in der Lage war, das filamentöse Wachstum zu induzieren, wohingegen die Deletion einer weiteren Aminosäure die Morphogenese blockierte. Das Tyrosin an Position 433 (Y433) ist deshalb die letzte Aminosäure, die für die Signalfunktion von Mep2p essentiell ist. Um besser zu verstehen, wie die Signalaktivität von Mep2p durch die Verfügbarkeit und den Transport von Ammonium reguliert wird, wurden verschiedene hochkonservierte Aminosäuren mutiert, die vermutlich an der Bindung oder dem Transport von Ammonium in die Zelle beteiligt sind. Die Mutation von D180, von dem postuliert wurde, dass es den initialen Kontakt mit extrazellulärem Ammonium ermöglicht, oder der im Transportkanal lokalisierten Histidine H188 und H342 hatte zur Folge, dass Mep2p nicht mehr exprimiert wurde, so dass diese Aminosäuren vermutlich für die Proteinstabilität wichtig sind. Die Mutation von F239, das zusammen mit F126 eine extracytosolische Pforte zur Transportpore bildet, verhinderte trotz korrekter Membranlokalisation sowohl den Ammoniumtransport als auch das filamentöse Wachstum. Allerdings führte auch die Mutation von W167, das vermutlich zusammen mit Y122, F126 und S243 an der Rekrutierung des Ammoniumions an der extrazellulären Seite der Membran beteiligt ist, zur Blockierung des filamentösen Wachstums, obwohl der Ammoniumtransport kaum beeinflusst war. Dies zeigte, dass die intrazelluäre Signaltransduktion durch extrazelluläre Veränderungen in Mep2p beeinflusst werden kann. Die Mutation von Y122 reduzierte die Ammoniumaufnahme weitaus starker als die Mutation von W167, erlaubte jedoch immer noch ein effizientes filamentöses Wachstum. Die Signalaktivität von Mep2p ist deshalb offensichtlich nicht direkt mit der Transportaktivität des Proteins korreliert. Ein wichtiger Aspekt in der Fähigkeit von Mep2p, die Morphogenese zu stimulieren, ist die vergleichsweise starke Expression des Proteins. Um die Regulation der MEP2-Expression aufzuklären, wurden die cis-regulatorischen Sequenzen und die trans-aktivierenden Faktoren, die die MEP2-Induktion unter Stickstoffmangel vermitteln, identifiziert. Eine Promotoranalyse zeigte, dass zwei mutmaßliche Bindungsstellen für GATA-Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle in der MEP2-Expression haben, da die Deletion oder Mutation dieser GATAA-Sequenzen die Expression von MEP2 stark reduzierte. Um die Rolle der GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p bei der Regulation der MEP2-Expression zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die entsprechenden Gene deletiert waren. Die Expression von Mep2p war in gln3D und gat1D Einzelmutanten stark verringert und in gln3D gat1D Doppelmutanten nicht mehr nachweisbar. Die Deletion von GLN3 hatte auch eine starke Reduktion des filamentösen Wachstums zur Folge, die durch die konstitutive Expression von MEP2 unter Kontrolle des ADH1-Promotors aufgehoben wurde. Dagegen hatte die Deletion von GAT1 keinen Einfluss auf das filamentöse Wachstum. Überraschenderweise war das filamentöse Wachstum in den gat1D Mutanten teilweise unabhängig von Mep2p, was darauf hinwies, dass in Abwesenheit von GAT1 andere Signalwege aktiviert werden, die die Morphogenese stimulieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p die Expression der Ammoniumpermease MEP2 kontrollieren und dass Gln3p auch ein wichtiger Regulator des durch Stickstoffmangel induzierten filamentösen Wachstums von C. albicans ist. Mutanten, in denen die beiden GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p fehlten, waren nicht mehr in der Lage, in einem Medium zu wachsen, das bovines Serumalbumin (BSA) als einzige Stickstoffquelle enthält. Die Fähigkeit von C. albicans, Proteine als einzige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden, wird durch die sekretierte Aspartatprotease Sap2p, die die Proteine zu Peptiden abbaut, und durch Oligopeptidtransporter, die diese Peptide in die Zelle aufnehmen, vermittelt. Der Wachstumsdefekt der gln3D gat1D Doppelmutanten war hauptsächlich durch einen Defekt in der SAP2-Expression verursacht, da die Expression von SAP2 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors die Fähigkeit zum Wachstum auf BSA wieder herstellte. Es zeigte sich, dass Gln3p und Gat1p die Expression des Transkriptionsfaktors STP1, der für die Induktion von SAP2 in Gegenwart von Proteinen notwendig ist, regulieren. Bei einer Expression von STP1 unter Kontrolle des induzierbaren Tet-Promotors waren Gln3p und Gat1p nicht mehr notwendig für das Wachstum auf Proteinen. Wenn bevorzugte Stickstoffquellen verfügbar sind, wird SAP2 auch in Gegenwart von Proteinen reprimiert, und diese Stickstoff-Katabolitrepression korrelierte mit einer reduzierten STP1-Expression. Die Expression von STP1 unter Kontrolle des Tet-Promotors hob diese Repression auf, was zeigte, dass die Regulation der STP1-Expression durch die GATA-Transkriptionsfaktoren eine Schlüsselrolle sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Kontrolle der SAP2-Expression spielt. Eine regulatorische Kaskade, in der die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors Stp1p durch die allgemeinen Regulatoren Gln3p und Gat1p kontrolliert wird, stellt die Expression von SAP2 in C. albicans deshalb unter Stickstoffkontrolle und gewährleistet eine angepasste Expression dieses Virulenzfaktors. Die Ergebnisse dieser Arbeit illustrieren, dass die GATA-Faktoren Gln3p und Gat1p zum Teil überlappende aber auch spezifische Funktionen in der Anpassung von C. albicans an die Verfügbarkeit verschiedener Stickstoffquellen haben. Diese Anpassungsmechanismen spielen auch eine Rolle in der Pathogenität des Pilzes, wobei die relative Bedeutung von Gln3p und Gat1p vom Zielgen und der Stickstoffquelle abhängt. Diese Erkenntnisse geben einen vertieften Eiblick in die molekularen Grundlagen der Anpassung von C. albicans an unterschiedliche Umweltbedingungen. N2 - The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions. The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions. KW - Transkriptionsfaktor KW - Candida albicans KW - Stickstoff KW - Stickstoffkontrolle KW - Ammoniumpermease KW - Sekretion von Aspartatproteasen KW - Candida albicans KW - ammonium permease KW - secreted aspartic protease KW - nitrogen regulation KW - transcription factor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29769 ER - TY - THES A1 - Degel, Björn T1 - Synthese und Testung elektrophiler Verbindungen als Inhibitoren der sekretorischen Aspartat-Proteasen (SAPs) von Candida albicans T1 - Synthesis and testung of electrophilic compounds as inhibitors of the secreted aspartic proteases (SAPs) of Candida albicans N2 - In den letzten Jahren haben Pilzinfektionen zugenommen und bakterielle Infektionen nahezu überholt, wofür vor allem der massive Einsatz von Medikamenten sowie operative Eingriffe verantwortlich sind. Einer der gefährlichsten Auslöser schwerer Pilzinfektionen, die innere Organe schädigen und sehr schwer zu behandeln sind, ohne dabei den Wirtsorganismus zu schädigen, ist der opportunistische Hefepilz Candida albicans. Da aufgrund der immer größer werdenden Zahl von Resistenzen von Candida albicans nur ein relativ kleines Repertoire für die Therapie zur Verfügung steht, war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Synthese einer Reihe peptidischer Inhibitoren mit elektrophilen Bausteinen als potentielle irreversible Inhibitoren der sekretorischen Aspartat-Proteasen (SAPs) des Hefepilzes Candida albicans und deren Testung an dem am stärksten exprimierten SAP-Isoenzym SAP2 sowie anderen Proteasen. Dabei sollte geklärt werden, ob neben der HIV-1-Protease auch andere Aspartat-Proteasen durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar sind, ob andere elektrophile Ringe sowie elektronenarme Michael-Systeme in der Lage sind, als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren zu fungieren, und ob die Z-Konfiguration der Olefine für die Hemmung von Aspartat-Proteasen ebenso wichtig ist wie die cis-Konfiguration bei Epoxiden. Die Aziridin-2-carboxylat-Bausteine wurden als Racemate über Cromwell-Synthese gewonnen und die Aziridin-2,3-dicarboxylat-Bausteine stereoselektiv aus Tartraten dargestellt. Die Oxiran-2-carboxylat-Bausteine wurden enantioselektiv ausgehend von Threonin bzw. als Racemate über Darzens-Glycidester-Synthese dargestellt. Die Synthese der Oxiran-2,3-dicarboxylat-Bausteine gelang mittels tertButylhydroperoxid / BuLi aus den Maleaten. Die Z-Olefinbausteine wurden durch Kupplung von Alkoholen bzw. AS an Maleinsäureanhydrid erhalten oder über Wittig- bzw. Horner-Wadsworth-Emmons-Reaktion dargestellt. Die Kupplung von AS bzw. Peptiden an die elektrophilen Bausteine erfolgte mit gängigen AS- / Peptidkupplungsmethoden. Die als irreversible Inhibitoren der SAP2 konzipierten Verbindungen wurden in einem neu entwickelten fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre SAP2-Hemmung getestet. Dazu wurde ein Verdünnungsassay nach Kitz und Wilson durchgeführt und die zunehmende Fluoreszenz durch das Spaltprodukt der enzymatischen Hydrolyse des Substrats bei 540 nm detektiert (Anregung 355 nm). Als Substrat diente das Undecapeptid Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe / Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH (/ markiert die Spaltstelle). Von den Inhibitoren wurden IC50-, k2nd- und, falls möglich, ki- und Ki-Werte ermittelt. Von den 41 an der SAP2 getesteten AS- / Peptid-verknüpften Verbindungen stellen die beiden Aziridine A-07 und A-08 mit k2nd-Werten im mittleren fünfstelligen Bereich [M-1min-1] die besten Inhibitoren dar. Bis auf zwei Verbindungen zeigen alle aktiven Verbindungen an der SAP2 sinkende IC50-Werte bei längerer Inkubationszeit und somit eine zeitabhängige und irreversible Hemmung. Zur Untersuchung der Selektivität wurden die Verbindungen mittels kontinuierlicher Assays an den Cystein-Proteasen Cathepsin B (human), Cathepsin L (Paramecium tetraurelia) und Rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense) getestet. Als Substrat wurde dabei Cbz-Phe-Arg-AMC verwendet. Erfreulicherweise waren bis auf das E-konfigurierte Olefin E-Ol-04 alle Verbindungen an den Cystein-Proteasen inaktiv. Die Ergebnisse zeigen, dass neben den HIV-Proteasen auch die sekretorische Aspartat-Protease SAP2 durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar ist. Desweiteren zeigt sich, dass mit Aziridinen auch andere elektrophile Ringe als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren fungieren können. An der SAP2 zeigen sich die Aziridine sogar aktiver. Auch elektronenarme Michael-Systeme sind in der Lage Aspartat-Proteasen zu hemmen, auch wenn ihre Hemmung deutlich schwächer ist als die der Aziridine. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass nicht, wie angenommen, die Z-Konfiguration der Olefine entscheidend ist, sondern dass E-Olefine sogar bessere Hemmungen aufweisen. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Joachim Morschhäuser und Dr. Peter Staib vom Institut für Molekulare Infektionsbiologie der Universität Würzburg, konnte gezeigt werden, dass die Aziridine A-07 und A-08 neben dem isolierten Enzym auch die SAP2-Produktion in Candida albicans-Zellkulturen hemmen ohne auf die Pilzzellen toxisch zu wirken. Neben der Hemmung der SAP2 wirken die Aziridine A-07 und A-08 auch antiplasmodial. Bei Testungen am Malaria-Erreger Plasmodium falciparum zeigten beide Aziridine einen IC50-Wert im unteren mikromolaren Bereich. Der Grund der Hemmung des Parasiten ist jedoch noch unklar, da A-07 und A-08 weder an den isolierten Cystein-Proteasen des Malaria-Erregers Falcipain 2 und 3 aktiv sind, noch dessen Aspartat-Protease Plasmepsin II hemmen. N2 - Over the last years fungal infections have increased dramatically and now nearly exceed the number of bacterial infections. Reasons are the massive use of antibiotics and the increasing number of surgeries. One of the most serious pathogens that causes superficial as well as severe systemic infections, which are difficult to treat without affecting the host organism, is the opportunistic fungal pathogen Candida albicans. Due to an increase of resistances of Candida species towards antifungal drugs only a limited repertoire of drugs is available for systemic therapy. The goal of the present work was the synthesis of series of peptide inhibitors containing electrophilic building blocks as potential irreversible inhibitors of the secreted aspartic proteases (SAPs) of Candida albicans. The synthesized compounds should be tested against SAP2, which is the mostly expressed SAP-isoenzyme, and other proteases. This work should elucidate whether cis-configured epoxides can be used to irreversibly block other aspartic proteases than the HIV-1-protease and whether other small electrophilic building blocks like aziridines and electron poor Michael acceptor systems can react as irreversible inhibitors of aspartic proteases as well. Additionally, the role of the configuration of the Michael systems (Z / E) for inhibition potency should be investigated. The aziridine-2-carboxylates were obtained as racemates by Cromwell synthesis and the aziridine-2,3-dicarboxylates were synthesized stereoselectively by a chiral pool synthesis starting from tartrates. The oxirane-2-carboxylates were synthesized enantioselectively starting from threonine or were obtained as racemates by Darzens glycide ester synthesis. The oxirane-2,3-dicarboxylates were obtained by Weitz-Schäffer epoxidation of maleates with tertbutylhydroperoxide / butyllithium. The Z-configured olefinic building blocks were synthesized by reactions of alcohols or amino acids with maleinic anhydride or by Wittig and Horner-Wadsworth-Emmons reactions. The electrophilic building blocks obtained by these pathways were coupled with amino acids and peptides using known methods of peptide chemistry. The compounds which were designed as irreversible aspartic protease inhibitors were tested for SAP2 inhibition using a newly-developed FRET assay. The inhibition constants (IC50-, k2nd-, ki- and Ki-values) were determined in dilution assays measuring the increase of fluorescence at 540 nm. The undecapeptide Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe / Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH (/ designates the cleavage site) was used as substrate. Within the series of 41 synthesized compounds the aziridines A-07 and A-08 exhibiting k2nd-values of about 50000 M-1min-1 were found to be the most active inhibitors. With the exception of two compounds all inhibitors showed time-dependent inhibition indicating irreversible inactivation of the target enzyme. In order to elucidate the selectivity the compounds were tested against the cysteine proteases cathepsin B (human), cathepsin L (Paramecium tetraurelia) und rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense) using a continuous fluorometric microplate assay. In all cases, the substrate Cbz-Phe-Arg-AMC was used. With the exception of the E-configured olefin E-Ol-04 all compounds were found to be inactive against cysteine proteases. In summary, the results prove that besides the HIV-proteases other aspartic proteases like SAP2 can also be inhibited irreversibly by cis-configured epoxides. Furthermore, it is shown that cis-configured aziridines can also be used as building blocks for irreversible inhibitors of aspartic proteases, being even more active against SAP2 than corresponding epoxides. Electron poor Michael acceptor systems can also be used, but they are obviously weaker than the three-membered heterocycles. The results obtained with the olefins show that the E-configured compounds are superior to Z-configured ones. In collaboration with the group of Prof. Dr. Joachim Morschhäuser and Dr. Peter Staib (Department of Molecular Infection Biology, University of Würzburg) it was proven that the aziridines A-07 and A-08, which are the most active inhibitors of the target enzyme, also inhibit SAP2 in Candida albicans cell cultures leading to growth inhibition without being cytotoxic against the fungi. These aziridines (A-07 and A-08) display antiplasmodial activity as well. Tests against the malaria parasite Plasmodium falciparum revealed for both aziridines IC50-values in the low micromolar range. The reasons for the antiplasmodial activity are uncertain at the moment: A-07 and A-08 are only weakly active against the plasmodial cysteine proteases falcipain 2 and falcipain 3 and, furthermore, they do not inhibit the parasitic aspartic protease plasmepsin II. KW - Candida albicans KW - Aspartatproteasen KW - Inhibitorpeptide KW - Aspartat-Proteasen KW - Candida albicans KW - Aziridine KW - Epoxide KW - aspartic proteases KW - Candida albicans KW - aziridines KW - epoxides Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18339 ER - TY - THES A1 - del Olmo Toledo, Valentina T1 - Evolution of DNA binding preferences in a family of eukaryotic transcription regulators T1 - Evolutionäre Entwicklung der Bindeaffinität an bestimmte DNA Sequenzen in einer Familie von eukaryotischen Transkriptionsfaktoren N2 - Regulation of gene expression by the control of transcription is essential for any cell to adapt to the environment and survive. Transcription regulators, i.e. sequence-specific DNA binding proteins that regulate gene expression, are central elements within the gene networks of most organisms. Transcription regulators are grouped into distinct families based on structural features that determine, to a large extent, the DNA sequence(s) that they can recognise and bind. Less is known, however, about how the DNA binding preferences can diversify within transcription regulator families during evolutionary timescales, and how such diversification can affect the biology of the organism. In this dissertation I study the SREBP (sterol regulatory element binding protein) family of transcriptional regulators in yeasts, and in Candida albicans in particular, as an experimental system to address these questions. The SREBPs are conserved from fungi to humans and represent a subgroup of basic helix-loop-helix DNA binding proteins. Early chromatin immunoprecipitation experiments with SREBPs from humans and yeasts showed that these proteins bound in vivo to the canonical DNA sequence, termed E-box, most basic helix-loop-helix proteins bind to. By contrast, most recent analysis carried out with less-studied fungal SREBPs revealed a non-canonical DNA motif to be the most overrepresented sequence in the bound regions. This study aims to establish the intrinsic DNA binding preferences of key branches of this family and to determine how the divergence in DNA binding affinities originated. To this end, I combined phylogenetic and ancestral reconstruction with extensive biochemical characterisation of key SREBP proteins. The results indicated that while the most-studied SREBPs (in mammals) indeed show preference for the E-box, a second branch of the family preferentially binds the non-E-box, and a third one is able to bind both sequences with similar affinity. The preference for one or the other DNA sequence is an intrinsic property of each protein because their purified DNA binding domain was sufficient to recapitulate their in vivo binding preference. The ancestor that gave rise to these two different types of SREBPs (the branch that binds E-box and the one that binds non-E-box DNA) appears to be a protein with a broader DNA binding capability that had a slight preference for the non-canonical motif. Thus, the results imply these two branches originated by either enhancing the original ancestral preference for non-E-box or tilting it towards the E-box DNA and flipping the preference for this sequence. The main function associated with members of the SREBP family in most eukaryotes is the control of lipid biosynthesis. I have further studied the function of these proteins in the lineage that encompasses the human associated yeast C. albicans. Strikingly, the three SREBPs present in the fungus’ genome contribute to the colonisation of the mammalian gut by regulating cellular processes unrelated to lipid metabolism. Here I describe that two of the three C. albicans SREBPs form a regulatory cascade that regulates morphology and cell wall modifications under anaerobic conditions, whereas the third SREBP has been shown to be involved in the regulation of glycolysis genes. Therefore, I posit that the described diversification in DNA binding specificity in these proteins and the concomitant expansion of targets of regulation were key in enabling this fungal lineage to associate with animals. N2 - Für jede Zelle ist es essenziell die Transkription über die Genexpression zu regulieren, um sich an unterschiedliche Lebensbedingungen anzupassen. Regulatoren der Transkription, zum Beispiel sequenzspezifische DNA-binde Proteine, sind ein zentrales Element des Genregulationsnetzwerks in den meisten Organismen. Auf Grund ihres Aufbaus sowie der daraus resultierenden spezifischen Eigenschaften DNA zu binden, werden diese Regulatoren in unterschiedliche Familien unterteilt. Bisher ist wenig darüber bekannt, wie unterschiedlich die DNA Sequenzen sein können, welche von einer Familie von Transkriptionsregulatoren gebunden werden, wie sich diese Diversität der Bindung in der Evolution über die Zeit verändert hat und ob diese unterschiedlichen Bindeaffinitäten die Biologie eines Organismus beeinflussen. In dieser Dissertation befasse ich mich mit der Transkriptionsregulator Familie der SREBPs (sterol regulatory element binding protein) in Hefen, als Modelorganismus diente dabei Candida albicans. Die Familie der SREBPs ist vom Pilz zu den Menschen genetisch weitestgehend konserviert und repräsentiert eine Unterfamilie der Helix-loop-helix DNA-binde Proteine. Erste Chromatin-Immunpräzipitation Experimente der SREBPs in Menschen und Hefen zeigen in vivo eine Bindung an eine kanonische DNA Sequenz genannt E-box, welche von den meisten der Helix-loop-helix Proteine gebunden wird. Im Gegensatz zeigen neuere Analysen, welche mit weniger bekannten SREBPs aus Pilzen durchgeführt wurden, dass hauptsächlich nicht-kanonische DNA Sequenzen gebunden werden. Diese Arbeit versucht die Präferenzen, mit welchen einige der wichtigsten Mitglieder der Familie der SREBPs an bestimmte DNA Sequenzen binden aufzudecken und heraus zu finden wie es innerhalb dieser Gruppe zu unterschiedlichen Bindungsaffinitäten kam. Dafür wurden phylogenetische Rekonstruktionsanalysen und aufwändige biochemische Charakterisierungen einiger der Proteine der SREBP Familie durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten der bisher charakterisierten SREBPs (in Säugetieren) es vorziehen an die E-box Sequenz zu binden, ein anderer Zweig des SREBP Familienstammbaums bevorzugt hingegen die non-E-box Sequenz, ein dritter Zweig des Stammbaums ist in der Lage beide Sequenzen mit gleicher Affinität zu binden. Das Bevorzugen einer der beiden DNA Sequenzen ist eine natürliche Eigenschaft des jeweiligen Proteins, da in Experimenten die isolierte DNA-binde Domäne der Proteine ausreichend war, um die in vivo Bindepräferenzen zu replizieren. Der Ursprung dieser beiden Gruppen (der E-box bindenden Gruppe und der Gruppe die non-E-box Sequenzen bindet) liegt wahrscheinlich in einem Protein, welches beide Sequenzen binden konnte, mit einem Vorzug für die nicht-kanonische Sequenz. Dies impliziert, dass die Gruppen entstanden sind indem sich entweder eine Präferenz des Vorgängerproteins für die nicht-kanonische Sequenz durchgesetzt hat oder, dass sich eine Präferenz für die E-box bindende Sequenz durchgesetzt hat und somit die Affinität dahingehend verschoben wurde. Die Hauptfunktion der meisten Proteine der SREBP Familie in Eukaryoten ist die Kontrolle der Lipid Biosynthese. In meiner Arbeit habe ich mich auf die Erforschung der SREBPs in einer Gruppe von Organismen zugewandt, die auch den mit dem Menschen assoziierten Hefepilz Candida albicans umfasst. Erstaunlicherweise beeinflussen die drei SREBPs die im Candida albicans Genom zu finden sind, die Kolonisierung des Säugetierdarms, jedoch nicht durch die Kontrolle der Lipid Biosynthese. Im Folgenden werde ich beschreiben wie zwei der drei SREBPs aus Candida albicans eine regulatorische Kaskade bilden, welche Einfluss auf die Regulierung der Morphologie und der Zellwandzusammensetzung des Pilzes unter anaeroben Bedingungen hat, wohingegen das dritte Protein der SREBP Familie für die Regulierung der Glykolyse von Bedeutung ist. Ich habe festgestellt, dass die beschriebene Vielfalt mit der diese Proteine an bestimmte DNA Sequenzen binden und die damit einhergehende Expansion der regulierbaren Ziele ein wesentlicher Grund dafür ist, dass Organismen dieses Stammbaums erfolgreich Säugetiere kolonisieren können. KW - Candida albicans KW - SREBP KW - evolution Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187890 ER - TY - THES A1 - Diwischek, Florian T1 - Development of synthesis pathways and characterization of cerulenin analogues as inhibitors of the fatty acid biosynthesis of Mycobacterium tuberculosis and of efflux pump resistant Candida albicans T1 - Entwicklung von Synthesewegen und Charakterisierung von Ceruleninanaloga als Inhibitoren der Fettsäuresynthese von Mycobacterium tuberculosis und Effluxpumpen-resistentem Candida albicans N2 - The work deals with the synthesis and characterization of cerulenin analogues as inhibitors of efflux pump mediated resistance of Candida albicans isolates and as inhibitors of the fatty acid synthesis enzyme KasA of Mycobacterium tuberculosis. Cerulenin was chosen as the lead structure, being a substrate of the efflux pumps in Candida albicans on one hand and therefore variations on the structure could lead to a blocking of the efflux pumps as in the case of tetracycline and inhibitor 13-CPTC of the TetB efflux pump. On the other hand, cerulenin is a known inhibitor of the FAS system but inhibition is unselective in type I and II FAS. Therefore, analogues could result in increased selectivity towards the type II FAS system in M. tuberculosis. The first cerulenin derivatives were prepared by coupling 2,3-dihydrofuran to the before synthesized 1-octaniodide, followed by ring opening and oxidation in one step by chromic acid and transfer of the resulting 4-keto acid to amides to give analogues 4a-d, 4e was prepared in analogy. To include the epoxide function especially with regard to the mechanism of action of cerulenin in the FAS system (considering known crystal structures of cerulenin and the KasA analogue of E. coli) tetrahydro- and dihydrocerulenin analogues were synthesized. Starting from the corresponding aldehyde, lactone 5 (tetrahydrocerulenin analogues) was obtained via two different routes A and B. Route A included the coupling of the aldehyde 1-nonanal to propiolic acid via a Grignard reaction with subsequent hydrogenation with the Lindlar catalyst under hydrogen pressure to give 5. Via Route B 1-nonanal was coupled to methyl propiolate by n-BuLi with subsequent hydrogenation under reflux with the catalytic system Lindlar cat./NH4HCO2 to yield 5. These hydrogenations were also executed in a microwave oven resulting in better yields and/or reaction times. The lactone 5 was then epoxidized, the ring opened by amidation and the remaining alcohol was oxidized via Collins oxidation to result in tetrahydrocerulenin analogues 8a-e. The same procedure was used for dihydrocerulenin analogues 10a-c except that to obtain the corresponding lactone 9a only route A was used and a further step had to be executed for ring closure. To obtain analogues with all structural features of cerulenin including two double bonds and the epoxide function, a third pathway was chosen. To obtain the future side chain, aldehyde 12 was synthesized by coupling protected 4-pentyn-1-ol to either crotyl bromide or crotyl chloride, which then was deprotected, hydrogenated with Lindlar catalyst under hydrogen pressure and oxidized via a Swern oxidation. The following synthesis sequence starting from 12 was executed similar to that of dihydrocerulenins via the corresponding lactone (51) with the major exception of the oxidation procedure in the last step via TPAP/NMO to result in (4Z,7E)-cerulenin analogues 15a-b. A fourth class of cerulenin analogues was synthesized with the aromatic analogues 17a-e. This synthesis pathway started with the formation of the benzoyl acrylamides 16a-e from benzoylacrylic acid via a mixed anhydride which was prepared with isobutylchloroformate followed by the addition of the corresponding amine. Subsequent epoxidation with H2O2 in basic EtOH gave the aromatic cerulenin analogues 17a-e. Pharmacological testings for the synthesized substances were executed on efflux pump-resistant and -sensitive Candida albicans isolates, on the fatty acid synthesis enzyme KasA of Mycobacterium tuberculosis and on other organisms such as Leishmania major, Trypanosoma brucei brucei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa within the Sonderforschungsbereich 630. N2 - Die Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung von Ceruleninanaloga als Inhibitoren effluxpumpenresistenter Candida-albicans-Isolate und als Inhibitoren des Fettsäuresyntheseenzyms KasA von Mycobacterium tuberculosis. Der Naturstoff Cerulenin wurde als Leitstruktur gewählt, da er einerseits ein Substrat der bekannten Effluxpumpen von Candida albicans ist und deshalb Strukturvariationen zu einer Blockierung der Effluxpumpen, wie im Fall von Tetrazyklin und dem Inhibitor 13-CPTC der TetB Effluxpumpe, führen können. Andererseits ist Cerulenin ein bekannter Inhibitor der Fettsäuresynthese, allerdings unselektiv für Typ I und II. Ceruleninanaloga als Fettsäureinhibitoren könnten daher eine erhöhte Selektivität bezüglich des Typ II Fettsäuresystems in M. tuberculosis aufweisen. Die in dieser Arbeit zuerst synthetisierten Ceruleninderivate wurden durch Kupplung von 2,3-Dihydrofuran und dem zuvor dargestellten 1-Octaniodid gefolgt von Ringöffnung und Oxidation mittels Chromsäure zur 4-Ketosäure, und Umsetzung zum entsprechenden Amid und somit den Ceruleninanaloga 4a-d hergestellt. Substanz 4e wurde entsprechend synthetisiert. Um die Epoxidfunktion der Leitstruktur zu integrieren, die besonders hinsichtlich des Wirkmechanismus von Cerulenin im FAS-System wichtig zu sein scheint (wenn man die bekannten Kristallstrukturen von Cerulenin und dem KasA-Analogon in E. coli berücksichtigt), wurden Tetrahydro- und Dihydroceruleninanaloga synthetisiert. Ausgehend von dem entsprechendem Aldehyd wurde (im Fall der Tetrahydrocerulenine) Lacton 5 auf zwei verschiedene Arten dargestellt: mittels Route A und B. Route A beinhaltete die Kupplung des Aldehyds 1-Nonanal mit Propiolsäure durch eine entsprechende Grignardreaktion mit anschließender Hydrierung über Lindlar-Katalysator unter Wasserstoffdruck. Bei Route B wurden 1-Nonanal und Methylpropiolat mittels n-BuLi gekuppelt und anschließend hydriert durch Refluxieren mit Lindlar-Katalysator und NH4HCO2. Die Hydrierungen von Route A und B wurden auch in der Mikrowelle durchgeführt, wodurch bessere Ausbeuten und/oder Reaktionszeiten erzielt werden konnten. Das so dargestellte Lacton 5 wurde dann epoxidiert, der Lactonring durch den Angriff eines Amins geöffnet und der so entstandene Alkohol mittels Collins Oxidierung zu den Tetrahydroceruleninanaloga 8a-e oxidiert. Dihydroceruleninanaloga 10a-c wurden auf analogem Syntheseweg hergestellt mit dem Unterschied, dass die entsprechende Lactonzwischenstufe 9a nur durch Route A synthetisiert und ein weiterer Zwischenschritt zum Ringschluss benötigt wurde. Um Ceruleninanaloga mit allen strukturellen Komponenten des Cerulenins inklusive zweier Doppelbindungen und Epoxidfunktion zu erhalten, wurde ein dritter Syntheseweg gewählt. Zur Integration der späteren Seitenkette wurde zuerst Aldehyd 12 durch Kupplung von geschütztem 4-Pentyn-1-ol mit entweder Crotylbromid oder Crotylchlorid, anschließendem Entschützen und Hydrierung über Lindlar-Katalysator und unter Wasserstoffdruck und nachfolgender Swern Oxidation synthetisiert. Die anschließende Synthesesequenz startete von Substanz 12 und wurde in Anlehnung der Synthese an die Dihydroceruleninderivate über Lacton 51 durchgeführt. Die größte Abweichung stellte dabei die Oxidation im letzten Schritt dar, die mittels TPAP/NMO durchgeführt wurde und in den (4Z,7E)-Ceruleninanaloga 15a-b resultierte. Eine vierte Klasse von Ceruleninanaloga wurde mit den aromatischen Derivaten 17a-e synthetisiert. Diese Route startete mit der Synthese der Benzoylacrylamide 16a-e aus Benzoylacrylsäure über das gemischte Anhydrid, das mit Isobutylchloroformiat hergestellt wurde, gefolgt von der Zugabe des entsprechenden Amins. Die nachfolgende Epoxidierung mit H2O2 in basischem EtOH ergab die aromatischen Ceruleninanaloga 17a-e. Pharmakologische Testungen der synthetisierten Substanzen wurden an Efflux-pumpen-resistenten und -sensitiven Candida albicans Isolaten, am Fettsäuresyntheseenzym KasA von Mycobacterium tuberculosis und an anderen Mikroorganismen wie Leishmania major, Trypanosoma brucei brucei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa im Sonderforschungsbereich 630 durchgeführt. KW - Organische Synthese KW - Candida albicans KW - Tuberkelbakterium KW - Instrumentelle Analytik KW - Naturstoff KW - Cerulenin KW - KasA KW - Effluxpumpen KW - Fettsäurebiosynthese KW - fatty acid biosynthesis KW - efflux pumps KW - kasA KW - cerulenin KW - tuberculosis KW - Candida albicans Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27532 ER - TY - JOUR A1 - Dreschers, Stephan A1 - Saupp, Peter A1 - Hornef, Mathias A1 - Prehn, Andrea A1 - Platen, Christopher A1 - Morschhäuser, Joachim A1 - Orlikowsky, Thorsten W. T1 - Reduced PICD in Monocytes Mounts Altered Neonate Immune Response to Candida albicans JF - PLoS ONE N2 - Background Invasive fungal infections with Candida albicans (C. albicans) occur frequently in extremely low birthweight (ELBW) infants and are associated with poor outcome. Phagocytosis of C.albicans initializes apoptosis in monocytes (phagocytosis induced cell death, PICD). PICD is reduced in neonatal cord blood monocytes (CBMO). Hypothesis Phagocytosis of C. albicans causes PICD which differs between neonatal monocytes (CBMO) and adult peripheral blood monocytes (PBMO) due to lower stimulation of TLR-mediated immune responses. Methods The ability to phagocytose C. albicans, expression of TLRs, the induction of apoptosis (assessment of sub-G1 and nick-strand breaks) were analyzed by FACS. TLR signalling was induced by agonists such as lipopolysaccharide (LPS), Pam3Cys, FSL-1 and Zymosan and blocked (neutralizing TLR2 antibodies and MYD88 inhibitor). Results Phagocytic indices of PBMO and CBMO were similar. Following stimulation with agonists and C. albicans induced up-regulation of TLR2 and consecutive phosphorylation of MAP kinase P38 and expression of TNF-α, which were stronger on PBMO compared to CBMO (p < 0.005). Downstream, TLR2 signalling initiated caspase-3-dependent PICD which was found reduced in CBMO (p < 0.05 vs PBMO). Conclusion Our data suggest direct involvement of TLR2-signalling in C. albicans-induced PICD in monocytes and an alteration of this pathway in CBMO. KW - Candida albicans KW - monocytes KW - immune response KW - PICD Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166778 VL - 11 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Dunkel, Nico T1 - Regulation of virulence-associated traits of the human fungal pathogen Candida albicans by nitrogen availability T1 - Regulation Virulenz-assoziierter Faktoren im humanpathogenen Pilz Candida albicans durch Stickstoffverfügbarkeit N2 - Nitrogen-regulated pathogenesis describes the expression of virulence attributes as direct response to the quantity and quality of an available nitrogen source. As consequence of nitrogen availability, the opportunistic human fungal pathogen Candida albicans changes its morphology and secretes aspartic proteases [SAPs], both well characterized virulence attributes. C. albicans, contrarily to its normally non-pathogenic relative Saccharomyces cerevisiae, is able to utilize proteins, which are considered as abundant and important nitrogen source within the human host. To assimilate complex proteinaceous matter, extracellular proteolysis is followed by uptake of the degradation products through dedicated peptide transporters (di-/tripeptide transporters [PTRs] and oligopeptide transporters [OPTs]). The expression of both traits is transcriptionally controlled by Stp1 - the global regulator of protein utilization - in C. albicans. The aim of the present study was to elucidate the regulation of virulence attributes of the pathogenic fungus C. albicans by nitrogen availability in more detail. Within a genome wide binding profile of Stp1, during growth with proteins, more than 600 Stp1 target genes were identified, thereby confirming its role in the usage of proteins, but also other nitrogenous compounds as nitrogen source. Moreover, the revealed targets suggest an involvement of Stp1 in the general adaption to nutrient availability as well as in the environmental stress response. With the focus on protein utilization and nitrogen-regulated pathogenesis, the regulation of the major secreted aspartic protease Sap2 - additionally one of the prime examples of allelic heterogeneity in C. albicans - was investigated in detail. Thereby, the heterogezygous SAP2 promoter helped to identify an unintended genomic alteration as the true cause of a growth defect of a C. albicans mutant. Additionally, the promoter region, which was responsible for the differential activation of the SAP2 alleles, was delimited. Furthermore, general Sap2 induction was demonstrated to be mediated by distinct cis-acting elements that are required for a high or a low activity of SAP2 expression. For the utilization of proteins as nitrogen source it is also crucial to take up the peptides that are produced by extracellular proteolysis. Therefore, the function and importance of specific peptide transporters was investigated in C. albicans mutants, unable to use peptides as nitrogen source (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ septuple null mutants). The overexpression of individual transporters in these mutants revealed differential substrate specificities and expanded the specificity of the OPTs to dipeptides, a completely new facet of these transporters. The peptide-uptake deficient mutants were further used to elucidate, whether indeed proteins and peptides are an important in vivo nitrogen source for C. albicans. It was found that during competitive colonization of the mouse intestine these mutants exhibited wild-type fitness, indicating that neither proteins nor peptides are primary nitrogen sources required to efficiently support growth of C. albicans in the mouse gut. Adequate availability of the preferred nitrogen source ammonium represses the utilization of proteins and other alternative nitrogen sources, but also the expression of virulence attributes, like Sap secretion and nitrogen-starvation induced filamentation. In order to discriminate, whether ammonium availability is externally sensed or determined inside the cell by C. albicans, the response to exterior ammonium concentrations of ammonium-uptake deficient mutants (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ null mutants) was investigated. This study showed that presence of an otherwise suppressing ammonium concentration did not inhibit Sap2 proteases secretion and arginine-induced filamentation in these mutants. Conclusively, ammonium availability is primarily determined inside the cell in order to control the expression of virulence traits. In sum, the present work contributes to the current understanding of how C. albicans regulates expression of virulence-associated traits in response to the presence of available nitrogen sources - especially proteins and peptides - in order to adapt its lifestyle within a human host. N2 - Stickstoffregulierte Pathogenität bezeichnet die Kontrolle von Virulenz-assoziierten Eigenschaften als direkte Folge der verfügbaren Quantität und Qualität einer Stickstoffquelle. Im Zusammenhang mit der Stickstoffverfügbarkeit verändert der opportunistisch krankheitserregende Pilz Candida albicans seine Morphologie und sekretiert Aspartat-Proteasen [SAPs], beides gut charakterisierte Virulenzattribute. Im Gegensatz zu seinem normalerweise apathogenen Verwandten Saccharomyces cerevisiae ist C. albicans in der Lage Proteine zu verwerten, welche als sehr häufige und wichtige Stickstoffquelle im menschlichen Wirt angesehen werden. Zur Nutzung von Proteinen sekretiert C. albicans Aspartat-Proteasen für den außerzellulären Verdau der Proteine und exprimiert Peptidtransporter (Di- /Tripeptidtransporter [PTRs] und Oligopeptidtransporter [OPTs]) um die Abbauprodukte aufzunehmen. Beide Eigenschaften werden transkriptionell von Stp1 - dem globalen Regulator zur Verwertung von Proteinen - kontrolliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation von Virulenzattributen im pathogenen Pilz C. albicans durch die Verfügbarkeit von Stickstoff genauer zu untersuchen. Innerhalb einer genomweiten Bindestudie von Stp1 wurden mehr als 600 Stp1-Zielgene während des Wachstums mit Proteinen identifiziert. Dadurch bestätigte sich die Funktion von Stp1 in der Proteinverwertung und wurde zudem auch auf die allgemeine Verwertung von Stickstoffquellen erweitert. Des Weiteren deuten die aufgedeckten Zielgene an, dass Stp1 womöglich in der Adaption an die generelle Nährstoffverfügbarkeit sowie in der Antwort auf Stresssignale beteiligt ist. Mit dem Fokus auf die Proteinverwertung und stickstoffregulierter Pathogenität wurde die Regulation der wichtigsten sekretierten Protease Sap2 - welche außerdem ein Paradebeispiel für allelische Heterogenität ist - im Detail untersucht. Dabei half der heterogene SAP2-Promoter bei der Identifizierung einer unbeabsichtigten genomischen Veränderung als wahren Grund eines Wachstumsdefektes einer C. albicans Mutante. Zusätzlich wurde der Promotorbereich eingegrenzt, welcher für die unterschiedliche Aktivierung der beiden SAP2 Allele verantwortlich ist. Weiterhin wurden verschiedene cis-aktive Elemente identifiziert, die entweder für eine hohe oder eine niedrige SAP2 Expression benötigt werden. Die Aufnahme von Peptiden, die durch den außerzellulären Verdau entstehen, ist für die Verwertung von Proteinen ebenso wichtig. Deshalb wurde die Funktion und Bedeutung der spezifischen Peptidtransporter anhand von C. albicans Mutanten untersucht, welche Peptide nicht aufnehmen können (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ Septuplemutanten). Die Überexpression von individuellen Transportern in diesen Septuplemutanten offenbarte unterschiedliche Substratspezifitäten und erweiterte die Spezifität für die OPTs auf Dipeptide, eine komplett neue Facette dieser Transporter. Des Weiteren ermöglichten die Septuplemutanten eine Aufklärung, ob Proteine und Peptide tatsächlich eine wichtige In Vivo Stickstoffquelle für C. albicans sind. Dieses Arbeit zeigte, dass während der kompetitiven Kolonisierung des Mäusedarms die Septuplemutanten wildtypische Fitness aufwiesen. Dies deutet daraufhin, dass weder Proteine noch Peptide eine wichtige Stickstoffquelle für ein effizientes Wachstum in diesem In Vivo Model sind. Die ausreichende Verfügbarkeit der bevorzugten Stickstoffquelle Ammonium unterdrückt die Verwertung von Proteinen und anderen alternativen Stickstoffquellen. Aber auch die Expression von Virulenzattributen, wie die Proteasesekretion und die stickstoffmangel-induzierte Filamentierung, wird durch Ammonium inhibiert. Um zu unterscheiden, ob C. albicans die Ammoniumverfügbarkeit außerzellulär oder in der Zelle bestimmt, wurde das Verhalten auf außerzelluläre Ammoniumkonzentrationen in Mutanten untersucht, welche Ammonium nicht aufnehmen können (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ Mutanten). Diese Arbeit zeigte, dass in diesen Mutanten eine ansonsten inhibierende Ammoniumkonzentration nicht in der Lage war, die Sekretion der Sap2-Protease oder die Arginin-induzierte Hyphenbildung zu unterdrücken. Folglich wird, um die Expression von Virulenzattributen zu regulieren, die Ammoniumverfügbarkeit vorrangig in der Zelle bestimmt. Zusammenfassend erweitert die vorliegende Arbeit das Verständnis zur Regulation der Expression von Virulenzattributen durch die Verfügbarkeit von Stickstoffquellen - insbesondere Proteine und Peptide - die eine Anpassung von C. albicans an ein Leben im menschlichen Wirt ermöglichen. KW - Candida albicans KW - Regulation KW - Stickstoff KW - Virulenz KW - Proteasen KW - Nitrogen KW - SAP2 KW - STP1 KW - peptide KW - transport KW - ammonium KW - protease KW - Proteine Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83076 ER - TY - JOUR A1 - Dühring, Sybille A1 - Germerodt, Sebastian A1 - Skerka, Christine A1 - Zipfel, Peter F. A1 - Dandekar, Thomas A1 - Schuster, Stefan T1 - Host-pathogen interactions between the human innate immune system and Candida albicans - understanding and modeling defense and evasion strategies JF - Frontiers in Microbiology N2 - The diploid, polymorphic yeast Candida albicans is one of the most important human pathogenic fungi. C. albicans can grow, proliferate and coexist as a commensal on or within the human host for a long time. However, alterations in the host environment can render C. albicans virulent. In this review, we describe the immunological cross-talk between C. albicans and the human innate immune system. We give an overview in form of pairs of human defense strategies including immunological mechanisms as well as general stressors such as nutrient limitation, pH, fever etc. and the corresponding fungal response and evasion mechanisms. Furthermore, Computational Systems Biology approaches to model and investigate these complex interactions are highlighted with a special focus on game-theoretical methods and agent-based models. An outlook on interesting questions to be tackled by Systems Biology regarding entangled defense and evasion mechanisms is given. KW - agent-based model KW - antimicrobial peptides KW - fungal pathogens KW - Candida albicans KW - immunological cross-talk KW - beta-lactamase inhibition KW - in vitro KW - biomaterial surfaces KW - biofilm formation KW - dendritic cells KW - infection KW - resistance KW - human immune system KW - host-pathogen interaction KW - computational systems biology KW - defense and evasion strategies Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151621 VL - 6 IS - 625 ER - TY - THES A1 - Eckstein, Marie-Therese T1 - Exploring the biology of the fungus Candida albicans in the gut of gnotobiotic mice T1 - Untersuchung der Biologie des Hefepilzes Candida albicans im Verdauungstrakt gnotobiotischer Mäuse N2 - The human body is colonized by trillions of microbes from all three domains of life – eukaryotes, bacteria and archaea. The lower gastrointestinal tract is the most densely colonized part of the body, harbouring a diverse and dynamic community of microbes. While the importance of bacteria in this so-called microbiota is well acknowledged, the role of commensal fungi remains underexplored. The most prominent fungus of the human gastrointestinal microbiota is Candida albicans. This fungus occasionally causes life-threatening disseminated infections in individuals with debilitated immune defences. It is this “pathogenic” facet that has received the most attention from researchers in the past, leaving many aspects of its “commensal” lifestyle understudied. Using gnotobiotic mice as a model system to explore the biology of C. albicans in the mammalian gut, in this dissertation I establish the global response of the host to C. albicans monocolonization as well as the spatial distribution of the fungus in the intestine in the context of co-colonization with single gut bacterial species. The fungus elicited transcriptome changes in murine intestinal tissue, which included the activation of a reactive oxygen species-related defence mechanism and the induction of regulators of the circadian clock circuitry. Both responses have previously been described in the context of a complete bacterial microbiota. Imaging the intestine of animals monocolonized with the fungus or co-colonized with C. albicans and the gut bacteria Bacteroides thetaiotaomicron or Lactobacillus reuteri revealed that the fungus was embedded in a B. thetaiotaomicron-promoted outer mucus layer in the murine colon. The gel-like outer mucus constitutes a unique microhabitat, distinct in microbial composition from the adjacent intestinal lumen. This finding indicates that bacteria can shape the specific microhabitat occupied by the fungus in the intestine. Overall, the results described in this dissertation suggest that gnotobiotic mice constitute a valuable tool to dissect multiple aspects of the interactions among host, commensal fungi and cohabiting bacteria. N2 - Der menschliche Körper beheimatet Billionen von Mikroorganismen aus allen drei Domänen des Lebens – Eukaryoten, Bakterien und Archaeen. Der menschliche Dickdarm ist dabei das am dichtesten besiedelte Organ des Körpers. Er beherbergt eine sehr diverse und dynamische Gemeinschaft von Mikroorganismen. Während die Relevanz der so genannten Mikrobiota weitreichend anerkannt ist, wurde die Bedeutung der kommensalen Pilze bisher noch vernachlässigt. Der am häufigsten vorkommende Pilz im menschlichen Gastrointestinaltrakt ist Candida albicans. Der Hefepilz kann vor allem in Patienten mit geschwächtem Immunsystem zum Ursprung lebensbedrohlicher Krankheiten werden. Diese Pathogenität des Pilzes wurde in den letzten Jahren ausführlich beleuchtet, wohingegen die kommensalen Aspekte des Pilzes vernachlässigt wurden. In dieser Dissertation habe ich, mit Hilfe von gnotobiotischen Mausmodellen, (i) das Leben von C. albicans im Säugetierdarm untersucht, (ii) die Reaktion des Wirts auf diese Kolonisierung ermittelt, (iii) sowie das Kolonisierungsverhalten und die Interaktionen von verschiedenen Darmbakterienspezies und C. albicans erforscht. Durch die alleinige Kolonisierung des Darms mit Candida albicans konnte ich Veränderungen im Transkriptom der Darmepithelzellen nachweisen, wie etwa die Aktivierung einer reaktiven Sauerstoffspezies-vermittelten Wirtsantwort und die Induktion von mehreren Regulatoren des zirkadianen Rhythmus. Beide dieser Wirtsreaktionen wurden zuvor nur in der Anwesenheit einer bakteriellen Mikrobiota nachgewiesen. Durch die Visualisierung der Pilzzellen im Darm während der Monokolonisierung, sowie während der Kolonisierung des Darms mit dem Pilz und den Darmbakterien, Bacteroides thetaiotaomicron oder Lactobacillus reuteri, konnten wir zeigen, dass der Pilz den von B. thetaiotaomicron neu geschaffenen Lebensraum, die äußere Mukusschicht, besiedeln kann. Diese äußere gelartige Mukusschicht ist ein einzigartiger Lebensraum, welcher sich stark von der inneren, sterilen Mukusschicht unterscheidet. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass einzelne Bakterienspezies den Lebensraum des Pilzes verändern können. Zusammenfassend konnte ich feststellen, dass die gnotobiotischen Mausmodelle sich sehr gut eignen, um die unterschiedlichen Aspekte der kommensalen Kolonisierung des Darms durch C. albicans, sowie dessen Interaktionen mit dem Wirt und den anwesenden Bakterien zu untersuchen. KW - Candida albicans KW - microbiota KW - Bacteroides thetaiotaomicron KW - spatial organization KW - Lactobacillus reuteri KW - intestinal mucus KW - gastronintestinal microbiota Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218705 ER - TY - THES A1 - El-Barkani, Abdelmalic T1 - Molekulargenetische Charakterisierung des pH-regulierten Dimorphismus und der pH-abhängigen Genexpression von Candida albicans und Entwicklung eines Reportersystem für Candida glabrata T1 - Molecular genetic Characterisation of the pH Regulated Dimorphism and the pH Dependent Gene Expression of Candida albicans and Development of a Reporter System for Candida glabrata N2 - Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können. N2 - Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata. KW - Candida albicans KW - Wasserstoffionenkonzentration KW - Genexpression KW - Torulopsis glabrata KW - Markierungsgen KW - Candida albicans KW - pH KW - Dimorphismus KW - Genexpression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - Reportergen KW - Candida albicans KW - pH KW - dimorphism KW - gene expression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - reporter gene Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1125 ER - TY - JOUR A1 - Hampe, Irene A. I. A1 - Friedman, Justin A1 - Edgerton, Mira A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - An acquired mechanism of antifungal drug resistance simultaneously enables Candida albicans to escape from intrinsic host defenses JF - PLoS Pathogens N2 - The opportunistic fungal pathogen Candida albicans frequently produces genetically altered variants to adapt to environmental changes and new host niches in the course of its life-long association with the human host. Gain-of-function mutations in zinc cluster transcription factors, which result in the constitutive upregulation of their target genes, are a common cause of acquired resistance to the widely used antifungal drug fluconazole, especially during long-term therapy of oropharyngeal candidiasis. In this study, we investigated if C. albicans also can develop resistance to the antimicrobial peptide histatin 5, which is secreted in the saliva of humans to protect the oral mucosa from pathogenic microbes. As histatin 5 has been shown to be transported out of C. albicans cells by the Flu1 efflux pump, we screened a library of C. albicans strains that contain artificially activated forms of all zinc cluster transcription factors of this fungus for increased FLU1 expression. We found that a hyperactive Mrr1, which confers fluconazole resistance by upregulating the multidrug efflux pump MDR1 and other genes, also causes FLU1 overexpression. Similarly to the artificially activated Mrr1, naturally occurring gain-of-function mutations in this transcription factor also caused FLU1 upregulation and increased histatin 5 resistance. Surprisingly, however, Mrr1-mediated histatin 5 resistance was mainly caused by the upregulation of MDR1 instead of FLU1, revealing a previously unrecognized function of the Mdr1 efflux pump. Fluconazole-resistant clinical C. albicans isolates with different Mrr1 gain-of-function mutations were less efficiently killed by histatin 5, and this phenotype was reverted when MRR1 was deleted. Therefore, antimycotic therapy can promote the evolution of strains that, as a consequence of drug resistance mutations, simultaneously have acquired increased resistance against an innate host defense mechanism and are thereby better adapted to certain host niches. KW - antimicrobial resistance KW - transcriptional control KW - Candida albicans KW - transcription factors KW - mutation KW - hyperexpression techniques KW - antifungals KW - point mutation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158883 VL - 13 IS - 9 ER - TY - THES A1 - Hampe, Irene Aurelia Ida T1 - Analysis of the mechanism and the regulation of histatin 5 resistance in \(Candida\) \(albicans\) T1 - Analyse des Mechanismus und der Regulierung von Histatin 5 Resistenz in \(Candida\) \(albicans\) N2 - Antimycotics such as fluconazole are frequently used to treat C. albicans infections of the oral mucosa. Prolonged treatment of the fungal infection with fluconazole pose a risk to resistance development. C. albicans can adapt to these stressful environmental changes by regulation of gene expression or by producing genetically altered variants that arise in the population. Adapted variants frequently carry activating mutations in zinc cluster transcription factors, which cause the upregulation of their target genes, including genes encoding efflux pumps that confer drug resistance. MDR1, regulated by the zinc cluster transcription factor Mrr1, as well as CDR1 and CDR2, regulated by the zinc cluster transcription factor Tac1, are well-known examples of genes encoding efflux pumps that extrude the antimycotic fluconazole from the fungal cell and thus contribute to the survival of the fungus. In this study, it was investigated if C. albicans can develop resistance to the antimicrobial peptide histatin 5, which serves as the first line of defence in the oral cavity of the human host. Recently, it was shown that C. albicans transports histatin 5 outside of the Candia cell via the efflux pump Flu1. As efflux pumps are often regulated by zinc cluster transcription factors, the Flu1 efflux pump could also be regulated by a zinc cluster transcription factor which could in a hyperactive form upregulate the expression of the efflux pump, resulting in increased export of histatin 5 and consequently in histatin 5 resistance. In order to find a zinc cluster transcription factor that upregulates FLU1 expression, a comprehensive library of C. albicans strains containing artificially activated forms of zinc cluster transcription factors was screened for suitable candidates. The screening was conducted on medium containing mycophenolic acid because mycophenolic acid is also a substrate of Flu1 and a strain expressing a hyperactive zinc cluster transcription factor that upregulates FLU1 expression should exhibit an easily recognisable mycophenolic acid-resistant phenotype. Further, FACS analysis, quantitative real-time RT-PCR analysis, broth microdilution assays as well as histatin 5 assays were conducted to analyse the mechanism and the regulation of histatin 5 resistance. Several zinc cluster transcription factors caused mycophenolic acid resistance and upregulated FLU1 expression. Of those, only hyperactive Mrr1 was able to confer increased histatin 5 resistance. Finding Mrr1 to confer histatin 5 resistance was highly interesting as fluconazole-resistant strains with naturally occurring Mrr1 gain of function mutations exist, which were isolated from HIV-infected patients with oral candidiasis. These Mrr1 gain of function mutations as well as artificially activated Mrr1 cause fluconazole resistance by upregulation of the efflux pump MDR1 and other target genes. In the course of the study, it was found that expression of different naturally occurring MRR1 gain-of-function mutations in the SC5314 wild type background caused increased FLU1 expression and increased histatin 5 resistance. The same was true for fluconazole-resistant clinical isolates with Mrr1 gain of function mutations, which also caused the overexpression of FLU1. Those cells were less efficiently killed by histatin 5 dependent on Mrr1. Surprisingly, FLU1 contributed only little to histatin 5 resistance, rather, overexpression of MDR1 mainly contributed to the Mrr1-mediated histatin 5 resistance, but also additional Mrr1-target genes were involved. These target genes are yet to be uncovered. Moreover, if a link between the yet unknown Mrr1-target genes contributing to fluconazole resistance and increased histatin 5 resistance can be drawn remains to be discovered upon finding of the responsible target genes. Collectively, this study contributes to the understanding of the impact of prolonged antifungal exposure on the interaction between host and fungus. Drug therapy can give rise to resistance evolution resulting in strains that have not only developed resistance to fluconazole but also to an innate host mechanism, which allows adaption to the host niche even in the absence of the drug. N2 - Antimykotika wie Fluconazol werden häufig zur Behandlung von C. albicans Infektionen der Mundschleimhaut verwendet. Dabei stellt eine langzeitige Behandlung der Pilzinfektion mit Fluconazol ein Risiko zur Resistenzentwicklung dar. C. albicans kann sich an solche Umweltveränderungen anpassen, indem es die Genexpression reguliert oder genetisch veränderte Varianten produziert, welche in der Population entstehen. Adaptierte Varianten tragen häufig aktivierende Mutationen in Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren, welche die Hochregulierung der Expression von Genen verursachen, darunter solche, die für Multidrug-Effluxpumpen kodieren und dadurch Antimykotikaresistenz verleihen können. MDR1, reguliert durch den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor Mrr1, sowie CDR1 und CDR2, reguliert durch den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor Tac1, sind bekannte Beispiele für Effluxpumpen, die das Antimykotikum Fluconazol aus der Pilzzelle extrudieren und somit zum Überleben der Pilzzelle beitragen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob C. albicans eine Resistenz gegen das antimikrobielle Peptid Histatin 5 entwickeln kann, das in der Mundhöhle des menschlichen Wirtes als erste Verteidigungsbarriere gegen den Pilz dient. Kürzlich wurde gezeigt, dass C. albicans Histatin 5 über die Effluxpumpe Flu1 aus der Candia-Zelle heraustransportiert (Li et al., 2013). Da Effluxpumpen häufig durch Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren reguliert werden, könnte auch die Flu1-Effluxpumpe durch solch einen Transkriptionsfaktor reguliert werden, der in einer hyperaktiven Form die Expression der Effluxpumpe hochregulieren könnte, was wiederrum zu einem erhöhten Export von Histatin 5 und folglich zur Histatin 5 Resistenz führen könnte. Um einen Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor zu finden, der die FLU1-Expression hochreguliert, wurde mit Hilfe einer Bibliothek von C. albicans-Stämmen, die künstlich aktivierte Formen von Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren enthält, nach geeigneten Kandidaten gesucht. Das Screening wurde auf Mycophenolsäure-haltigem Medium durchgeführt, da Mycophenolsäure ebenfalls ein Substrat von Flu1 ist. Folglich sollte ein Stamm mit hyperaktivem Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor, welcher die FLU1-Expression hochreguliert, einen leicht erkennbaren Mycophenolsäure-resistenten Phänotyp aufweisen. Weiterhin wurden FACS-Analysen, quantitative real-time RT-PCR-Analysen, Broth microdilution-Assays sowie Histatin 5-Assays durchgeführt, um den Mechanismus und die Regulierung der Histatin-5-Resistenz zu analysieren. Mehrere Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren verursachten Mycophenolsäure-Resistenz und erhöhten die FLU1-Expression. Von diesen war nur hyperaktives Mrr1 in der Lage, eine erhöhte Histatin-5-Resistenz zu verleihen. Das Auffinden von Mrr1 als Regulator der Histatin 5-Resistenz war hochinteressant, da fluconazolresistente Stämme mit natürlich vorkommenden MRR1 gain-of-function Mutationen existieren, die aus HIV-infizierten Patienten mit oropharyngealer Candidiasis isoliert wurden. Diese gain-of-function Mutationen sowie künstlich aktivierendes Mrr1 verursachen Fluconazol-Resistenz durch Hochregulation der Effluxpumpe MDR1 und anderer Zielgene. Im Verlauf der Studie wurde herausgefunden, dass verschiedene natürlich vorkommende MRR1 gain-of-function Mutationen im SC5314 Wildtyp Hintergrund eine erhöhte FLU1-Expression und eine erhöhte Histatin-5-Resistenz verursachten. Das Gleiche galt für Fluconazol-resistente klinische Isolate mit Mrr1 gain-of-function Mutationen, welche die Überexpression von FLU1 verursachten. Zellen dieser Isolate wurden, abhängig von Mrr1, weniger wirksam durch Histatin 5 abgetötet. Überraschenderweise trug FLU1 nur wenig zur Histatin-5-Resistenz bei, vielmehr trug die Überexpression von MDR1 hauptsächlich zur Mrr1-vermittelten Histatin-5-Resistenz bei, aber auch weitere Mrr1-Zielgene waren daran beteiligt. Diese Mrr1-Zielgene gilt es nun noch zu entdecken. Ob ein Zusammenhang zwischen diesen noch unbekannten Mrr1-Zielgenen hergestellt werden kann, die zur Fluconazolresistenz sowie zu einer erhöhten Histatin-5-Resistenz beitragen, wird erst nach dem Auffinden der verantwortlichen Zielgene geprüft werden können. Zusammenfassend trägt diese Studie zum Verständnis der Auswirkungen einer anhaltenden antimykotischen Exposition auf die Interaktion zwischen Wirt und Pilz bei. Eine medikamentöse Therapie kann zu einer Resistenzentwicklung führen, aus der Stämme hervorgehen, welche nicht nur eine Resistenz gegen Fluconazol entwickelt haben, sondern gleichzeitig eine Resistenz gegen einen angeborenen Wirtsabwehrmechanismus, der eine Adaption an die Wirtsnische auch in Abwesenheit des Antimykotikums ermöglicht. KW - Histatin 5 KW - Candida albicans KW - Efflux pump KW - MDR1 KW - MRR1 KW - Mrr1 KW - MDR1 KW - Fluconazole KW - Efflux pump Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159634 ER - TY - THES A1 - Heinz, Werner J. T1 - Identifikation und Charakterisierung von PHR3, einem zu der PHR/GAS-Familie homologen Gen bei Candida albicans T1 - Identification and characterization of PHR3, a gene homologous to the PHR/GAS familiy of candida albicans N2 - Es konnte mit PHR3 bei Candida albicans ein drittes GAS-homologes Gen nachgewiesen werden. Dieses weist überzeugende Übereinstimmungen der Nuklein- und Aminosäurensequenz und mit der fehlenden GPI-Verankerungsstelle und der pH-konstitutiven Expression auch interessante Unterschiede zu den bisher bekannten Genen der PHR-Familie auf. Eine funktionelle Homologie zu den weiteren PHR-Genen bei Candida albicans konnte nicht belegt werden. Es sind bisher in verschiedenen Spezies mehrere homologe Gene dieser Familie nachgewiesen worden. So sind auch bei Candida albicans weitere möglich und die endgültige Zahl der PHR-Gene wird erst nach Abschluß des Candida albicans-Genomprojektes bestimmt werden können. Der Zweck mehrerer homologer Gene ist insbesondere für die bei unterschiedlichen pH-Werten vorliegenden Proteine Phr1p und Phr2p noch nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung ist, dass ihre Translation auf unterschiedliche Weise die Expression anderer Gene oder die Prozessierung und Funktion von Proteinen beeinflusst. Eine solche feine Regulation von Wachstums- und Virulenzfaktoren und somit eine Anpassung an Umweltbedingungen und Infektionswege ist für die Pathogenität von Candida albicans von Bedeutung. Die spezifischen Faktoren für die Induktion von PHR3 sind, sollte eine differenzierte Regulation vorliegen, dagegen ebenso wenig wie für GAS4, als nähestes verwandtes Gen, und für die weiteren GAS-Gene bekannt. Zum Nachweis einer solchen signalspezifischen Transkription sind Experimente mit anderen Versuchsanordnungen, mit welchen sich komplexere Milieus und Infektionswege untersuchen lassen, wie DNA-Chips oder induktionsabhängige Signalkassetten (Morschhäuser et al., 1999; Staib et al., 1999) hilfreich. Da eine fehlende C-terminale Region bei GAS1 zur Sekretion eines vergrößerten Proteins mit Hypermannosylierung der serinreichen Region führt (Popolo et Vai, 1998), erscheint auch eine extrazelluläre Funktion von Phr3p, welches dieses hydrophobe 3’ Ende nativ nicht besitzt, möglich. Dabei ist eine zu Phr1p und Phr2p ähnliche oder gleiche enzymatische Funktion, welche in Diskussion 112 unterschiedlichen Kompartimenten oder von unterschiedlicher Lokalisation aus den Aufbau der Zellwand beeinflusst, denkbar. KW - PHR3 KW - PHR/GAS KW - Candida albicans KW - PHR3 KW - PHR/GAS KW - candida albicans Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179719 ER - TY - THES A1 - Hornbach, Anke T1 - Aktivierungsmuster humaner neutrophiler Granulozyten nach Kontakt mit den pathogenen Pilzen Candida albicans und Aspergillus fumigatus T1 - Activation patterns of human neutrophils after contact with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus und Candida albicans N2 - Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adhäsion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen können. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberflächenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilität (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschläuchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verstärkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings führte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abtötung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abtötung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabhängig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgelöste Wachstumsinhibition von Keimschläuchen. Die hier präsentierten Daten verbinden die Aktivität der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunität. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivität der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten während der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringfügig beeinflusst wird und eine schnelle Abtötung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht. N2 - Human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) play a major role in the immune defence against invasive infections caused by the pathogenic fungi Candida albicans and Aspergillus fumigatus. The aim of this work was to further characterize the interaction of both fungi with PMNs with a focus on diverse PMN effector functions. C. albicans expresses a set of aspartic proteases which are associated with virulence and can contribute to adhesion, tissue invasion and immune evasion. Here, the role of the aspartic proteases Sap1-6, Sap9 and Sap10 in the interaction with human neutrophils was analysed. It could be demonstrated that, in contrast to other aspartic proteases, the cell surface associated GPI-anchored enzyme Sap9 has a major impact on recognition of C. albicans by PMNs. SAP9 expression is required for the effective induction of PMN chemotaxis towards C. albicans filaments, an essential prerequisite of effective PMN activation. Targeted motility can be enhanced by autologous secretion of IL-8, but no influence of SAP9 on the process of IL-8 secretion could be observed here. However, deletion of SAP9 led to a mitigated release of reactive oxygen intermediates (ROI) in human PMNs. Likewise, C. albicans induced apoptosis triggered by ROI formation was decreased. In confrontation assays, killing of a SAP9 deletion mutant was reduced in comparison to the wild-type. Beside ROI production, degranulation represents an additional important effector mechanism contributing to microbial killing, however, the release of elastase in response to C. albicans was found to be not dependent on SAP9, as well as the PMN-mediated growth inhibition of germ tubes. The data presented here clearly implicate Sap9 protease activity, which was already attributed to immune evasion before, with the initiation of protective innate immunity. Like C. albicans, A. fumigatus evokes PMN antifungal activity. Custom-made microarray analyses focusing on the cytokine profile of PMNs during interaction with A. fumigatus hyphae revealed that only few cytokines are upregulated during the course of infection. In summary it could be demonstrated that the interaction between Saps and PMNs is revealing novel molecular mechanisms which lead to an activation of these cells. Furthermore, microarray analyses lead to the awareness that de novo cytokine synthesis of PMNs is barely influenced by A. fumigatus, pointing out that instant killing of the fungus might be of higher importance. KW - Neutrophile Granulozyten KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans KW - Immunreaktion KW - neutrophile Granulozyten KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans KW - neutrophils KW - Aspergillus fumigatus KW - Candida albicans Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53520 ER - TY - JOUR A1 - Ickrath, Pascal A1 - Sprügel, Lisa A1 - Beyersdorf, Niklas A1 - Scherzad, Agmal A1 - Hagen, Rudolf A1 - Hackenberg, Stephan T1 - Detection of Candida albicans-Specific CD4+ and CD8+ T Cells in the Blood and Nasal Mucosa of Patients with Chronic Rhinosinusitis JF - Journal of Fungi N2 - Candida albicans is ubiquitously present, and colonization in the nose and oral cavity is common. In healthy patients, it usually does not act as a pathogen, but in some cases can cause diseases. The influence of C. albicans as a trigger of T cell activation on the pathogenesis of chronic rhinosinusitis (CRS) is controversial, and its exact role is not clear to date. The aim of the present study was to detect and characterize C. albicans-specific CD4+ and CD8+ T cells in patients with CRS, with and without nasal polyps. Tissue and blood samples were collected from patients suffering from chronic rhinosinusitis with (CRSwNP) and without nasal polyps (CRSsNP), and from healthy controls. A peptide pool derived from C. albicans antigen was added to tissue and blood samples. After 6 days, lymphocytes were analyzed by multicolor flow cytometry. Activation was assessed by the intracellular marker Ki-67, and the cytokine secretion was measured. Tissue CD8+ T cells of CRSsNP patients showed a significantly higher proportion of Ki-67+ cells after activation with C. albicans antigen compared to peripheral blood CD8+ T cells. Cytokine secretion in response to C. albicans antigen was similar for all study groups. In this study, C. albicans-specific CD4+ and CD8+ T cells were detected in peripheral blood and mucosal tissue in all study groups. In patients suffering from CRSsNP, C. albicans-specific CD8+ T cells were relatively enriched in the nasal mucosa, suggesting that they might play a role in the pathogenesis of CRSsNP. KW - Candida albicans KW - chronic rhinosinusitis KW - T cell activation KW - nasal polyps Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239671 SN - 2309-608X VL - 7 IS - 6 ER - TY - JOUR A1 - Irmer, Henriette A1 - Tarazona, Sonia A1 - Sasse, Christoph A1 - Olbermann, Patrick A1 - Loeffler, Jürgen A1 - Krappmann, Sven A1 - Conesa, Ana A1 - Braus, Gerhard H. T1 - RNAseq analysis of Aspergillus fumigatus in blood reveals a just wait and see resting stage behavior JF - BMC Genomics N2 - Background: Invasive aspergillosis is started after germination of Aspergillus fumigatus conidia that are inhaled by susceptible individuals. Fungal hyphae can grow in the lung through the epithelial tissue and disseminate hematogenously to invade into other organs. Low fungaemia indicates that fungal elements do not reside in the bloodstream for long. Results: We analyzed whether blood represents a hostile environment to which the physiology of A. fumigatus has to adapt. An in vitro model of A. fumigatus infection was established by incubating mycelium in blood. Our model allowed to discern the changes of the gene expression profile of A. fumigatus at various stages of the infection. The majority of described virulence factors that are connected to pulmonary infections appeared not to be activated during the blood phase. Three active processes were identified that presumably help the fungus to survive the blood environment in an advanced phase of the infection: iron homeostasis, secondary metabolism, and the formation of detoxifying enzymes. Conclusions: We propose that A. fumigatus is hardly able to propagate in blood. After an early stage of sensing the environment, virtually all uptake mechanisms and energy-consuming metabolic pathways are shut-down. The fungus appears to adapt by trans-differentiation into a resting mycelial stage. This might reflect the harsh conditions in blood where A. fumigatus cannot take up sufficient nutrients to establish self-defense mechanisms combined with significant growth. KW - Saccharomyces cerevisiae KW - cerebral aspergillosis KW - gene expression KW - Aspergillus fumigatus KW - iron homeostasis KW - invasive pulmonary aspergillosis KW - Candida albicans KW - cell wall KW - lysine biosynthesis KW - human pathogen KW - murine model KW - virulence KW - mRNA-Seq KW - transcriptome KW - human pathogenic fungi KW - secondary metabolite gene cluster KW - detoxification Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151390 VL - 16 IS - 640 ER - TY - THES A1 - Klengel, Torsten T1 - Molekulare Charakterisierung der Carboanhydrase Nce103 im Kontext des CO2 induzierten Polymorphismus in Candida albicans T1 - Molecular characterisation of the carbonic anhydrase Nce103 in the context of carbon dioxide induced polymorphism in Candida albicans N2 - Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe. N2 - Detection of environmental signals and subsequently directed reaction is essential for the survival of all living organisms. Candida albicans, as the predominant human fungal pathogen is exposed to severely different physical and chemical conditions, which influence cell morphology as well as virulence in human. In the present work, the influence of carbon dioxide as ubiquitous gaseous molecule on virulence and cell morphology was analysed. Elevated concentrations of carbon dioxide are a robust signal to induce the morphological transition from yeast growth to an elongated hyphal growth form, which is believed to be one of the main virulence factors in Candida albicans. The role of the putative carbonic anhydrase Nce103p in carbon dioxide signalling is reviewed by generating knockout mutant strains, which exhibited a carbon dioxide dependent phenotype. Growth under aerobic conditions (0,033 % carbon dioxide) is inhibited but feasible in 5% carbon dioxide. Therefore, Nce103p is essential for growth in host niches with aerobic conditions. Analysis of the biochemical properties of Nce103p by stopped – flow kinetics revealed carbonic anhydrase activity. It is hypothesised, that Nce103p is essential for fixation of carbon dioxide and bicarbonate within the cell in order to sustain basic metabolic reactions. Furthermore, the induction of hyphal growth was independent of aquaporine-mediated transport of carbon dioxide. Bicarbonate rather carbon dioxide activates directly the adenylyl cyclase Cdc35p generating cyclic AMP as second messenger and influencing the transcription of hyphal specific genes in Candida albicans thus promoting the morphological transition from yeast growth to elongated hyphal growth. This signal transduction cascade is present in Candida albicans as well as Cryptococcus neoformans and it is believed to be a pan fungal signal transduction cascade. The specific inhibition of carbon dioxide mediated polymorphism may serve as a new target for antifungal therapeutic agents. KW - Candida KW - Candida albicans KW - Kohlendioxid KW - Kohlendioxidfixierung KW - Virulenz KW - Morphologie KW - Signaltransduktion KW - Cyclo-AMP KW - Soor KW - Carboanhydrase KW - Cryptococcus neoformans KW - Morphogenese KW - Hyphe KW - Hefeartige Pilze KW - Knockout KW - Aquaporin KW - Candida albicans KW - Morphology KW - carbon dioxide KW - carbonic anhydrase KW - aquaporine Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34573 ER - TY - JOUR A1 - Leonhardt, Ines A1 - Spielberg, Steffi A1 - Weber, Michael A1 - Albrecht-Eckardt, Daniela A1 - Bläss, Markus A1 - Claus, Ralf A1 - Barz, Dagmar A1 - Scherlach, Kirstin A1 - Hertweck, Christian A1 - Löffler, Jürgen A1 - Hünniger, Kerstin A1 - Kurzai, Oliver T1 - The fungal quorum-sensing molecule farnesol activates innate immune cells but suppresses cellular adaptive immunity JF - mBio N2 - Farnesol, produced by the polymorphic fungus Candida albicans, is the first quorum-sensing molecule discovered in eukaryotes. Its main function is control of C. albicans filamentation, a process closely linked to pathogenesis. In this study, we analyzed the effects of farnesol on innate immune cells known to be important for fungal clearance and protective immunity. Farnesol enhanced the expression of activation markers on monocytes (CD86 and HLA-DR) and neutrophils (CD66b and CD11b) and promoted oxidative burst and the release of proinflammatory cytokines (tumor necrosis factor alpha [TNF-\(\alpha\)] and macrophage inflammatory protein 1 alpha [MIP-1 \(\alpha\)]). However, this activation did not result in enhanced fungal uptake or killing. Furthermore, the differentiation of monocytes to immature dendritic cells (iDC) was significantly affected by farnesol. Several markers important for maturation and antigen presentation like CD1a, CD83, CD86, and CD80 were significantly reduced in the presence of farnesol. Furthermore, farnesol modulated migrational behavior and cytokine release and impaired the ability of DC to induce T cell proliferation. Of major importance was the absence of interleukin 12 (IL-12) induction in iDC generated in the presence of farnesol. Transcriptome analyses revealed a farnesol-induced shift in effector molecule expression and a down-regulation of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) receptor during monocytes to iDC differentiation. Taken together, our data unveil the ability of farnesol to act as a virulence factor of C. albicans by influencing innate immune cells to promote inflammation and mitigating the Th1 response, which is essential for fungal clearance. KW - human dendritic cells KW - Pseudomonas aeruginosa KW - induced apoptosis KW - cytokine production KW - biofilm formation KW - Candida albicans KW - mouse model KW - systemic candidiasis KW - oxidative stress KW - carcinoma cells Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143756 VL - 6 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Lermann, Ulrich T1 - Molekulare Untersuchungen zur Regulation und Funktion der sekretierten Aspartatproteasen von Candida albicans T1 - Molecular investigations on regulation and function of secreted aspartic proteases of Candida albicans N2 - Die sekretorischen Aspartatproteasen (Saps) des Hefepilzes Candida albicans gelten als wichtiger Virulenzfaktor dieses opportunistischen Krankheitserregers. Die zehn Sap-Isoenzyme werden von einer Genfamilie codiert, deren Vertreter (SAP1-SAP10) in der Vergangenheit bereits intensiv untersucht wurden. SAP-Expressionsanalysen und die Charakterisierung von sap-Deletionmutanten, die in einem auxotrophen Laborstamm hergestellt wurden, führten aber zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen, weshalb die Rolle der einzelnen Proteine bis heute nicht zweifelsfrei aufgeklärt ist. Eine differentielle Expression der SAP-Gene in unterschiedlichen Stadien einer Infektion wurde jedoch in vielen unabhängigen Studien gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Expression der Gene SAP1-SAP6 in einem etablierten in vitro-Modell einer Candida-Vaginitis untersucht, das auf der Infektion von rekonstituiertem humanem Epithel (RHE) basiert. Dazu wurden Reporterstämme verwendet, die bereits früher für Expressionsanalysen in verschiedenen in vivo-Infektionsmodellen in Mäusen eingesetzt worden waren. Dies erlaubte es einerseits unterschiedliche Nachweismethoden zur SAP-Genexpression in einem standardisierten Modell zu vergleichen und andererseits das Expressionsmuster der SAP-Gene in einem in vitro-Infektionsmodell mit den Ergebnissen von in vivo-Infektionsexperimenten zu korrelieren. Es zeigte sich in Übereinstimmung mit Ergebnissen früherer in vivo-Experimente in Mäusen, dass bei der Infektion des vaginalen Gewebes vor allem das SAP5-Gen induziert wurde. Allerdings weicht dieses Ergebnis deutlich von Ergebnissen anderer Studien ab, die mit Hilfe anderer Methoden ein ungleiches Muster der SAP-Expression detektierten. Um die Rolle der Gene SAP1-SAP6 bei der Infektion genauer zu untersuchen, wurden deshalb Mutanten hergestellt, in denen einzelne oder mehrere SAP-Gene mit Hilfe einer neuartigen Mutagenesestrategie erstmals aus dem Genom eines wildtypischen C. albicans-Stammes deletiert wurden. Überraschenderweise konnte sowohl in Einzelmutanten der Gene SAP1-SAP6 als auch in sap1 sap2 sap3- und sap4 sap5 sap6-Triplemutanten keine verminderte Fähigkeit zur Invasion und Schädigung von humanem Gewebe in RHE festgestellt werden. Eine in früheren Arbeiten beschriebene abgeschwächte Virulenz solcher Mutanten konnte auch in einem murinen Modell für eine disseminierende Infektion nicht beobachtet werden. Die Sekretion von Aspartatproteasen ermöglicht es C. albicans Proteine als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden. Unter diesen Bedingungen wird spezifisch die Expression des SAP2-Gens induziert; jedoch ist über die Mechanismen dieser Regulation noch wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Promotor-Deletionsanalysen des SAP2-Gens und des mit diesem co-regulierten Oligopeptidtransportergens OPT1 durchgeführt. Es zeigte sich, dass unterschiedliche Bereiche innerhalb der 3,5 kb großen regulatorischen Region von SAP2 gemeinsam eine Expression dieses Gens unter induzierenden Bedingungen ermöglichen. Für das OPT1-Gen konnte eine regulatorische Region eingegrenzt werden, die für die Expression dieses Gens essentiell ist. In den für die Expression von SAP2 und OPT1 wichtigen Regionen wurden ähnliche Sequenzen gefunden, die als Bindungsstellen für regulatorische Faktoren dienen könnten. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur Regulation und Bedeutung der sekretierten Aspartatproteasen von C. albicans erhalten. Um eine endgültige Bewertung der Rolle dieser Enzyme in der Virulenz des Erregers zu ermöglichen, sind jedoch noch weitere detaillierte Studien unter Verwendung verschiedenster Infektionsmodelle nötig. N2 - The secreted aspartic proteases (Saps) of the yeast Candida albicans are considered as an important virulence trait of this opportunistic pathogen. The ten Sap isoenzymes are encoded by a gene family, whose members (SAP1-SAP10) have been analysed intensively already in the past. However, the analysis of the expression pattern of the SAP genes and the characterisation of sap deletion mutants, which were generated from an auxotrophic laboratory strain, yielded partially contradictory results. Therefore, the role of the individual proteins is still not fully elucidated. A differential expression of the SAP genes in various stages of an infection has been demonstrated in many independent studies. In the present work the expression of the SAP1-SAP6 genes was analyzed in an established in vitro model of vaginal candidiasis that is based on the infection of reconstituted human epithelium (RHE). For this purpose, reporter strains were used which had already been utilized previously to study the SAP expression pattern in various in vivo infection models in mice. This allowed the comparison of different detection methods for SAP gene expression in a standardized model and also to correlate the SAP expression pattern in an in vitro infection model with the results of in vivo infection experiments. It was found that SAP5 was the predominantly expressed SAP gene during infection of the vaginal tissue, in agreement with the results of previous in vivo experiments in mice. However, this result contrasts with those of other studies that, using alternative methods, detected a different SAP expression pattern. To investigate the role of the SAP1-SAP6 genes during infection in more detail, a new set of mutants was generated, in which single or multiple SAP genes were deleted for the first time from the genome of a C. albicans wild-type strain with the help of a novel mutagenesis strategy. Surprisingly, neither single mutants lacking one the SAP1-SAP6 genes nor triple mutants lacking all of the SAP1-SAP3 or the SAP4-SAP6 genes exhibited a detectable defect in invasion and damage of reconstituted human epithelium. A previously reported attenuated virulence of sap mutants was also not observed in a murine model of disseminated candidiasis. The secretion of aspartic proteases enables C. albicans to utilize proteins as a sole source of nitrogen for growth. Under these conditions expression of the SAP2 gene is specifically induced, however, little is known about the mechanisms of this regulation. Therefore, promoter deletion analyses of the SAP2 gene and the co-regulated oligopeptide transporter gene OPT1 were performed in the present work. It was found that different regions within the approximately 3,5 kb large SAP2 promoter jointly allowed the expression of this gene under inducing conditions. For OPT1, a region could be delimited that is essential for the expression of this gene. The regions that were found to be important for SAP2 and OPT1 expression contain similar sequences, which may serve as binding sites for regulatory factors. This study provides new insights into the regulation and importance of the secreted aspartic proteases of C. albicans. For a definite evaluation of the role of these enzymes in the virulence of the pathogen, however, further detailed studies that employ a variety of different infection models are necessary. KW - Candida KW - Candida albicans KW - Proteasen KW - Virulenzfaktor KW - Mykose KW - secreted aspartic proteases KW - candida albicans KW - virulence factor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29168 ER - TY - JOUR A1 - Luther, Christian H. A1 - Brandt, Philipp A1 - Vylkova, Slavena A1 - Dandekar, Thomas A1 - Müller, Tobias A1 - Dittrich, Marcus T1 - Integrated analysis of SR-like protein kinases Sky1 and Sky2 links signaling networks with transcriptional regulation in Candida albicans JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - Fungal infections are a major global health burden where Candida albicans is among the most common fungal pathogen in humans and is a common cause of invasive candidiasis. Fungal phenotypes, such as those related to morphology, proliferation and virulence are mainly driven by gene expression, which is primarily regulated by kinase signaling cascades. Serine-arginine (SR) protein kinases are highly conserved among eukaryotes and are involved in major transcriptional processes in human and S. cerevisiae. Candida albicans harbors two SR protein kinases, while Sky2 is important for metabolic adaptation, Sky1 has similar functions as in S. cerevisiae. To investigate the role of these SR kinases for the regulation of transcriptional responses in C. albicans, we performed RNA sequencing of sky1Δ and sky2Δ and integrated a comprehensive phosphoproteome dataset of these mutants. Using a Systems Biology approach, we study transcriptional regulation in the context of kinase signaling networks. Transcriptomic enrichment analysis indicates that pathways involved in the regulation of gene expression are downregulated and mitochondrial processes are upregulated in sky1Δ. In sky2Δ, primarily metabolic processes are affected, especially for arginine, and we observed that arginine-induced hyphae formation is impaired in sky2Δ. In addition, our analysis identifies several transcription factors as potential drivers of the transcriptional response. Among these, a core set is shared between both kinase knockouts, but it appears to regulate different subsets of target genes. To elucidate these diverse regulatory patterns, we created network modules by integrating the data of site-specific protein phosphorylation and gene expression with kinase-substrate predictions and protein-protein interactions. These integrated signaling modules reveal shared parts but also highlight specific patterns characteristic for each kinase. Interestingly, the modules contain many proteins involved in fungal morphogenesis and stress response. Accordingly, experimental phenotyping shows a higher resistance to Hygromycin B for sky1Δ. Thus, our study demonstrates that a combination of computational approaches with integration of experimental data can offer a new systems biological perspective on the complex network of signaling and transcription. With that, the investigation of the interface between signaling and transcriptional regulation in C. albicans provides a deeper insight into how cellular mechanisms can shape the phenotype. KW - sky kinases KW - kinase signaling KW - network analysis KW - transcriptome KW - transcriptional regulation KW - phosphoproteome KW - Candida albicans Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311771 SN - 2235-2988 VL - 13 ER - TY - JOUR A1 - Mottola, Austin A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - An intragenic recombination event generates a Snf4-independent form of the essential protein kinase SNF1 in Candida albicans JF - mSphere N2 - The heterotrimeric protein kinase SNF1 plays a key role in the metabolic adaptation of the pathogenic yeast Candida albicans. It consists of the essential catalytic α-subunit Snf1, the γ-subunit Snf4, and one of the two β-subunits Kis1 and Kis2. Snf4 is required to release the N-terminal catalytic domain of Snf1 from autoinhibition by the C-terminal regulatory domain, and snf4Δ mutants cannot grow on carbon sources other than glucose. In a screen for suppressor mutations that restore growth of a snf4Δ mutant on alternative carbon sources, we isolated a mutant in which six amino acids between the N-terminal kinase domain and the C-terminal regulatory domain of Snf1 were deleted. The deletion was caused by an intragenic recombination event between two 8-bp direct repeats flanking six intervening codons. In contrast to truncated forms of Snf1 that contain only the kinase domain, the Snf4-independent Snf1\(^{Δ311 − 316}\) was fully functional and could replace wild-type Snf1 for normal growth, because it retained the ability to interact with the Kis1 and Kis2 β-subunits via its C-terminal domain. Indeed, the Snf4-independent Snf1\(^{Δ311 − 316}\) still required the β-subunits of the SNF1 complex to perform its functions and did not rescue the growth defects of kis1Δ mutants. Our results demonstrate that a preprogrammed in-frame deletion event within the SNF1 coding region can generate a mutated form of this essential kinase which abolishes autoinhibition and thereby overcomes growth deficiencies caused by a defect in the γ-subunit Snf4. KW - AMP-activated kinases KW - Candida albicans KW - genetic recombination KW - metabolic adaptation KW - suppressor mutation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202170 VL - 4 IS - 3 ER - TY - JOUR A1 - Mottola, Austin A1 - Ramírez-Zavala, Bernardo A1 - Hünninger, Kerstin A1 - Kurzai, Oliver A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - The zinc cluster transcription factor Czf1 regulates cell wall architecture and integrity in Candida albicans JF - Molecular Microbiology N2 - The fungal cell wall is essential for the maintenance of cellular integrity and mediates interactions of the cells with the environment. It is a highly flexible organelle whose composition and organization is modulated in response to changing growth conditions. In the pathogenic yeast Candida albicans, a network of signaling pathways regulates the structure of the cell wall, and mutants with defects in these pathways are hypersensitive to cell wall stress. By harnessing a library of genetically activated forms of all C. albicans zinc cluster transcription factors, we found that a hyperactive Czf1 rescued the hypersensitivity to cell wall stress of different protein kinase deletion mutants. The hyperactive Czf1 induced the expression of many genes with cell wall-related functions and caused visible changes in the cell wall structure. C. albicans czf1Δ mutants were hypersensitive to the antifungal drug caspofungin, which inhibits cell wall biosynthesis. The changes in cell wall architecture caused by hyperactivity or absence of Czf1 resulted in an increased recognition of C. albicans by human neutrophils. Our results show that Czf1, which is known as a regulator of filamentous growth and white-opaque switching, controls the expression of cell wall genes and modulates the architecture of the cell wall. KW - cell wall KW - zinc cluster transcription factor KW - Candida albicans KW - protein kinases Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259583 VL - 116 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Mottola, Austin A1 - Schwanfelder, Sonja A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - Generation of Viable Candida albicans Mutants Lacking the "Essential" Protein Kinase Snf1 by Inducible Gene Deletion JF - mSphere N2 - The protein kinase Snf1, a member of the highly conserved AMP-activated protein kinase family, is a central regulator of metabolic adaptation. In the pathogenic yeast Candida albicans, Snf1 is considered to be essential, as previous attempts by different research groups to generate homozygous snf1 Delta mutants were unsuccessful. We aimed to elucidate why Snf1 is required for viability in C. albicans by generating snf1 Delta null mutants through forced, inducible gene deletion and observing the terminal phenotype before cell death. Unexpectedly, we found that snf1 Delta mutants were viable and could grow, albeit very slowly, on rich media containing the preferred carbon source glucose. Growth was improved when the cells were incubated at 37 degrees C instead of 30 degrees C, and this phenotype enabled us to isolate homozygous snf1 Delta mutants also by conventional, sequential deletion of both SNF1 alleles in a wild-type C. albicans strain. All snf1 Delta mutants could grow slowly on glucose but were unable to utilize alternative carbon sources. Our results show that, under optimal conditions, C. albicans can live and grow without Snf1. Furthermore, they demonstrate that inducible gene deletion is a powerful method for assessing gene essentiality in C. albicans. IMPORTANCE Essential genes are those that are indispensable for the viability and growth of an organism. Previous studies indicated that the protein kinase Snf1, a central regulator of metabolic adaptation, is essential in the pathogenic yeast Candida albicans, because no homozygous snf1 deletion mutants of C. albicans wild-type strains could be obtained by standard approaches. In order to investigate the lethal consequences of SNF1 deletion, we generated conditional mutants in which SNF1 could be deleted by forced, inducible excision from the genome. Unexpectedly, we found that snf1 null mutants were viable and could grow slowly under optimal conditions. The growth phenotypes of the snf1 Delta mutants explain why such mutants were not recovered in previous attempts. Our study demonstrates that inducible gene deletion is a powerful method for assessing gene essentiality in C. albicans. KW - Candida albicans KW - Snf1 KW - conditional mutants KW - essential genes KW - protein kinases Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-230524 VL - 5 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Müller, Verena T1 - Candida albicans-induzierte Genexpression in primären humanen Endothelzellen - Mechanismen der Signaltransduktion und Möglichkeiten der Intervention T1 - Candida albicans-induced gene expression in primary human endothelial cells - mechanisms of signal transduction and possibilities of intervention N2 - Endothelzellen sind ein aktiver Bestandteil der angeborenen Immunabwehr des Menschen gegen mikrobielle Pathogene. Unter ungünstigen Bedingungen kann die Abwehrreaktion sogar zu einer lebensbedrohlichen Sepsis führen. Hier wurde die bislang wenig bekannte Endothelantwort auf den fakultativ humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, einem der häufigsten Verursacher von letaler Sepsis beim Menschen, näher untersucht. Mittels Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse von HUVEC nach Exposition mit C. albicans konnten 56 hochregulierte Gene identifiziert werden, während 69 Gene herunterreguliert wurden. Ein bedeutender Anteil der regulierten Gene ist an Prozessen der angeborenen Immunantwort beteiligt und dient hauptsächlich der Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen ergaben eine zentrale Rolle des proinflammatorischen NF-kappaB-Weges bei der Regulation des Candida-induzierten Transkriptoms von Endothelzellen. Es konnte gezeigt werden, dass C. albicans diesen Signalweg sequenziell aktiviert. Zusätzlich konnte durch die Expression einer dominant-negativen Mutante einer Signalkomponente des NF-kappaB-Signalwegs die Candida-vermittelte Induktion von kappaB-abhängigen Genen gehemmt werden. Mit einem pharmakologischen Ansatz wurde der p38 MAP Kinase-Signalweg als weiterer bedeutsamer Signalweg identifiziert, der die Expression einzelner Candida-Zielgene wie CXCL8/IL-8 moduliert. Schließlich wurde gezeigt, dass die Candida-induzierte NF-kappaB-Aktivierung im untersuchten endothelialen Zellsystem unabhängig von den Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 geschieht, die üblicherweise an der Erkennung mikrobieller Pathogene beteiligt sind. Durch RNA-Interferenz-Experimente konnte jedoch dargelegt werden, dass das Adaptermolekül MyD88 und die Kinase IRAK1, die beide entscheidend an der TLR-vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind, essentiell für die Weiterleitung des Signals in Endothelzellen sind. Nachfolgend konnte mit TLR3 zumindest einer der signaltransduzierenden Rezeptoren identifiziert werden. Als erste umfassende Untersuchung der endothelialen Antwort auf Candida albicans erlaubt die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die komplexen Signalmuster von Endothelzellen, die dieser klinisch bedeutende Krankheitserreger auslöst. N2 - Endothelial cells (ECs) actively participate in the innate defence against microbial pathogens. Under unfavourable conditions defence reactions can even turn into life-threatening responses resulting in sepsis. Here the so far largely unknown EC reaction patterns to Candida albicans were studied. C. albicans is a facultative human pathogenic fungus and a major cause of lethality in septic patients. Oligonucleotide microarray analysis revealed 56 genes that were transcriptionally up-regulated and 69 that were suppressed upon exposure of ECs to C. albicans. A major portion of these genes is involved in defence mechanisms of the innate immune system with a high representation of genes serving the recruitment of neutrophils to sites of infection. Further examination of candidate signalling cascades established a central role of the proinflammatory NF-kappaB pathway in the regulation of the Candida-modulated transcriptome of ECs. It was shown that the NF-kappaB signalling pathway becomes activated at various levels. In addition, expression of a dominant negative mutant of a NF-kappaB signalling pathway compound blocked the Candida-induced kappaB-dependent gene expression. Using a pharmacological approach the stress-activated p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway was identified as a second major regulatory pathway which critically contributes to the regulation of selected Candida target genes such as CXCL8/IL-8. Candida-induced NF-kappaB activation is mediated independently of Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 that commonly have been implicated with microbial pattern recognition. Nevertheless, knock-down of the adapter molecule MyD88 and the essential downstream kinase of TLR-, IL-1R- and IL-18R-signalling, IRAK1, suggested that recognition and signalling via a TLR apart from TLR2/TLR4 is crucial for Candida-induced gene expression in primary ECs. Finally, RNAi experiments indicate that most likely TLR3 represents this receptor. These data provide the first comprehensive analysis of endothelial gene responses to Candida albicans and present novel insights into the complex signalling patterns triggered by this important pathogen. KW - Angeborene Immunität KW - Endothelzelle KW - Toll-like-Rezeptoren KW - Candida albicans KW - Entzündung KW - innate immunity KW - endothelial cell KW - toll-like receptors KW - Candida albicans KW - inflammation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26224 ER - TY - THES A1 - Park, Yang-Nim T1 - Etablierung eines Tetrazyklin-induzierbaren Genexpressionssystems und Analyse des White-Opaque-Switchings in Candida albicans T1 - Establishment of a tetracycline-inducible gene expression system and anlysis of White-Opaque switching in Candida albicans N2 - Der Hefepilz Candida albicans kommt bei den meisten gesunden Menschen als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten des Verdauungs- und Urogenitaltraktes vor, kann aber insbesondere bei immunsupprimierten Patienten sowohl lokal beschränkte mukokutane als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen verursachen. C. albicans zeichnet sich durch eine große morphologische Variabilität aus, die dazu beiträgt, dass der Pilz viele unterschiedliche Wirtsnischen erfolgreich besiedeln und infizieren kann. Neben dem durch Umweltsignale gesteuerten Wechsel zwischen Hefe- und Hyphenform kann C. albicans auch spontan und reversibel von der normalen Hefemorphologie (white) in eine sogenannte opaque-Zellform wechseln. Das white-opaque-Switching tritt nur bei Stämmen auf, die homozygot für den mating-type-Lokus (MTLa oder MTL) geworden sind, und ermöglicht das Mating von opaque-Zellen komplementären Paarungstyps. Da white- und opaque-Zellen unterschiedlich gut an bestimmte Wirtsnischen angepasst sind, scheint das white-opaque-Switching auch eine Bedeutung in der Pathogenität des Pilzes zu haben, und es ist von großem Interesse herauszufinden, wie dieser komplexe Prozess gesteuert wird. Die genetische Analyse von C. albicans ist durch das Fehlen einer haploiden Phase und durch eine Abweichung vom universalen Codon-Gebrauch in diesem Pilz erschwert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur gezielten Geninaktivierung und andere Werkzeuge für die funktionelle Genanalyse in C. albicans entwickelt. Die Möglichkeiten zur kontrollierten Genexpression sind jedoch noch begrenzt. In dieser Arbeit wurde deshalb ein System etabliert, das eine Tetrazyklin-induzierbare Expression von Genen in den verschiedenen morphologischen Formen von C. albicans und unabhängig von den Wachstumsbedingungen erlaubt. Zu diesem Zweck wurde eine Kassette konstruiert, die einen an C. albicans adaptierten, reversen Tetrazyklin-abhängigen Transaktivator (rtTA) enthält und in die Zielgene unter Kontrolle eines rtTA-abhängigen Promotors inseriert werden können. Nach Integration der Kassette ins C. albicans-Genom wird der Transaktivator konstitutiv exprimiert und ermöglicht die Induktion des Zielgens durch Zugabe von Doxyzyklin. Mit Hilfe des GFP-Reportergens wurde bestätigt, dass dieses Tet-On-System eine effiziente, Doxyzyklin-induzierbare Genexpression in Hefe-, Hyphen- und opaque-Zellen von C. albicans erlaubt. Die Tetrazyklin-induzierte Expression eines dominant-negativen CDC42-Allels blockierte in Hefezellen die Ausbildung von Knospen und resultierte in vergrößerten, mehrkernigen Zellen, während die Expression des NRG1-Repressors das filamentöse Wachstum unter allen getesteten Hypheninduktionsbedingungen effizient inhibierte. Eine Expression des MTLa1-Gens unter Kontrolle des Tet-abhängigen Promotors in opaque-Zellen eines MTL-Stammes führte zum Switching der Zellen in die white-Phase, was darauf hinwies, dass der nach dem Mating von a- und -opaque-Zellen gebildete a1/2-Repressorkomplex das Switching in die white-Phase bewirkt. Dagegen induzierte die Expression des MTLa2-Transkriptionsfaktors in -opaque-Zellen das Shmooing, das normalerweise durch das Pheromon des Matingpartners ausgelöst wird. Die Expression der site-spezifischen FLP-Rekombinase unter Kontrolle des Tet-abhängigen Promotors ermöglichte eine Tetrazyklin-induzierbare Deletion von essentiellen Genen und damit die Herstellung von konditional letalen Mutanten. In Kombination mit dem dominanten caSAT1-Selektionsmarker konnte das Tet-On-System auch in C. albicans-Wildtypstämmen eingesetzt werden und stellt daher eine vielseitig verwendbare Methode zur funktionellen Genanalyse und zur Manipulation des zellulären Verhaltens von C. albicans dar. In weiteren Experimenten wurde die Rolle des globalen Transkriptionsrepressors Tup1, der in heterozygoten MTLa/-C. albicans-Stämmen das filamentöse Wachstum inhibiert, und der phasenspezifischen Gene WH11 und OP4 beim white-opaque-Switching untersucht. Die Deletion des TUP1-Gens im MTL-Stamm WO-1 bewirkte, dass die Mutanten keine white- oder opaque-Zellen mehr bilden konnten. Stattdessen produzierten sie vier unterschiedliche Zell- und Koloniephänotypen, die ein verändertes Expressionsmuster von white- und opaque-spezifischen Genen zeigten und zwischen denen sie spontan und reversibel wechseln konnten. Interessanterweise waren drei der vier Varianten zum Mating mit MTLa-opaque-Zellen fähig und bildeten rekombinante Nachkommen. Diese Ergebnisse zeigten, dass Tup1 zwar auch in MTL-Zellen für die Aufrechterhaltung der normalen Zellmorphologie und Genexpression wichtig ist, jedoch nicht für das Switching an sich. Die Deletion des white-spezifischen Gens WH11 im Stamm WO-1 hatte keinen erkennbaren Effekt auf die Zell- und Koloniemorphologie von white- und opaque-Zellen, die phasenspezifische Genexpression oder die Frequenz des Switchings. Ein ähnliches Ergebnis wurde nach Inaktivierung des opaque-spezifischen OP4-Gens erhalten, und die Deletion von OP4-Gen hatte auch keinen Effekt auf das Mating der opaque-Zellen. Allerdings zeigten opaque-Zellen der op4-Mutanten ein im Vergleich zum Wildtyp verlangsamtes Wachstum bei niedrigen Temperaturen und bildeten spontan einen weiteren Koloniephänotyp aus. Die phasenspezifischen Gene WH11 und OP4 sind daher nicht notwendig für das white-opaque-Switching und haben vermutlich spezifischere Funktionen in der Ausprägung des phasenspezifischen Phänotyps. N2 - The yeast Candida albicans is a harmless commensal on mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenitary tracts in most healthy people, but it can also cause local mucocutaneous as well as life-threatening systemic infections, especially in immunocompromised patients. C. albicans exhibits a high morphological variability, which contributes to the capacity of the fungus to colonize and infect many different host niches. In addition to the transition between growth in yeast and hyphal forms, which is regulated by environmental signals, C. albicans can also switch from the normal yeast cell morphology (white) to an elongated, so-called opaque cell type. This white-opaque switching occurs only in strains that have become homozygous for the mating type locus and allows mating between opaque cells of opposite mating types (MTLa or MTL). As white and opaque cells differ in their adaptation to certain host niches, white-opaque switching also seems to have a role in the pathogenicity of C. albicans. Therefore, it is of great interest to elucidate how this complex morphogenetic process is controlled. The genetic analysis of C. albicans is hampered by the absence of a haploid phase and the non-canonical codon usage of this fungus. In the past years, methods for targeted gene inactivation and other molecular tools for functional gene analysis in C. albicans have been developed. However, tools for controlled gene expression are still limited. In this work, a system for tetracycline-inducible expression of genes in the various morphological forms of C. albicans was established. For this purpose, a cassette was constructed which contains a C. albicans-adapted, reverse tetracycline-dependent transactivator (rtTA) and into which target genes can be inserted under the control of an rtTA-dependent promoter. After integration of the cassette into the C. albicans genome, the transactivator is constitutively expressed and allows the induction of the target gene by the addition of doxycycline. Using GFP as a reporter gene it was confirmed that this Tet-On system enables an efficient, doxycycline-inducible gene expression in yeast, hyphal, and opaque cells of C. albicans. Tetracycline-induced expression of a dominant-negative CDC42 allele prevented the formation of buds in yeast cells and resulted in the production of large, multinucleate cells, whereas expression of the NRG1 repressor efficiently inhibited filamentous growth under all tested hyphal inducing conditions. Expression of the MTLa1 gene under control of the Tet-dependent promoter in opaque cells of an MTL strain forced the cells to switch into the white phase, which indicated that the a1/2 repressor complex formed after mating of a and  opaque cells induces switching to the white phase. In contrast, expression of the MTLa2 transcription factor in  opaque cells resulted in the formation of shmoos, which normally is induced by the pheromone of a mating partner. Expression of the site-specific FLP recombinase under control of the Tet-dependent promoter allowed tetracycline-inducible deletion of essential genes and thus the generation of conditional-lethal mutants. In combination with the dominant caSAT1 selection marker the Tet-On system was also used in various C. albicans wild-type strains and, therefore, is an efficient and versatile tool to study gene function and manipulate cellular behaviour in this model pathogenic fungus. In additional experiments, the role of the global transcriptional repressor Tup1, which in heterozygous MTLa/ strains inhibits filamentous growth, and of the phase-specific WH11 and OP4 genes in white-opaque switching was investigated. Deletion of TUP1 in the MTL strain WO 1 abolished its ability to form white and opaque cells. Instead, the tup1 mutants spontaneously and reversibly switched between four different cell and colony phenotypes which exhibited an altered expression pattern of white- and opaque-specific genes. Interestingly, three of the four variants retained the capacity to mate with MTLa opaque cells and generate recombinant progeny. Therefore, Tup1 is required for normal cell morphology and gene expression also in MTL cells, but not for switching. Deletion of the white-specific WH11 gene in strain WO-1 did not have a detectable effect on the cell and colony morphology of white and opaque cells, phase-specific gene expression, or switching frequency. Similar results were obtained after inactivation of the opaque-specific OP4 gene and deletion of OP4 also did not affect mating of opaque cells. However, opaque cells of the op4 mutants exhibited reduced growth at temperatures below 25°C as compared with the wild type and they spontaneously generated an additional colony phenotype. Therefore, the phase-specific WH11 and OP4 genes are not required for white-opaque switching and presumably have more specific functions in the expression of the phase-specific phenotype. KW - Tet-On system KW - Candida albicans KW - White-Opaque Switching KW - Tet-On system KW - Candida albicans KW - White-Opaque Switching Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19451 ER - TY - THES A1 - Popp, Christina T1 - Evolution of antifungal drug resistance of the human-pathogenic fungus \(Candida\) \(albicans\) T1 - Evolution der Antimykotikaresistenz im humanpathogenen Pilz \(Candida\) \(albicans\) N2 - Infections with the opportunistic yeast Candida albicans are frequently treated with the first-line drug fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis. An alarming problem in clinics is the development of resistances against this azole, especially during long-term treatment of patients. Well-known resistance mechanisms include mutations in the zinc cluster transcription factors (ZnTFs) Mrr1 and Tac1, which cause an overexpression of efflux pump genes, and Upc2, which results in an overexpression of the drug target. C. albicans strains with such gain-of-function mutations (GOF) have an increased drug resistance conferring a selective advantage in the presence of the drug. It was previously shown that this advantage comes with a fitness defect in the absence of the drug. This was observed in different conditions and is presumably caused by a deregulated gene expression. One aim of the present study was to examine whether C. albicans can overcome the costs of drug resistance by further evolution. Therefore, the relative fitness of clinical isolates with one or a combination of different resistance mutations in Mrr1, Tac1 and/or Upc2 was analyzed in competition with the matched fluconazole-susceptible partner. Most fluconazole-resistant isolates had a decreased fitness in competition with their susceptible partner in vitro in rich medium. In contrast, three fluconazole-resistant strains with Mrr1 resistance mutations did not show a fitness defect in competition with their susceptible partner. In addition, the fitness of four selected clinical isolate pairs was examined in vivo in mouse models of gastrointestinal colonization (GI) and disseminated infection (IV). In the GI model all four fluconazole-resistant strains were outcompeted by their respective susceptible partner. In contrast, in the IV model only one out of four fluconazole-resistant isolates did show a slight fitness defect in competition with its susceptible partner during infection of the kidneys. It can be stated, that in the present work the in vitro fitness did not reflect the in vivo fitness and that the overall fitness was dependent on the tested conditions. In conclusion, C. albicans cannot easily overcome the costs of drug resistance caused by a deregulated gene expression. In addition to GOFs in Mrr1, Tac1 and Upc2, resistance mutations in the drug target Erg11 are a further key fluconazole resistance mechanism of C. albicans. Clinical isolates often harbor several resistance mechanisms, as the fluconazole resistance level is further increased in strains with a combination of different resistance mutations. In this regard, the question arises of how strains with multiple resistance mechanisms evolve. One possibility is that strains acquire mutations successively. In the present study it was examined whether highly drug-resistant C. albicans strains with multiple resistance mechanisms can evolve by parasexual recombination as another possibility. In a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations could combine these advantageous traits by mating. Thereupon selection could act on the mating progeny resulting in even better adapted derivatives. Therefore, strains heterozygous for a resistance mutation and the mating type locus (MTL) were grown in the presence of fluconazole. Derivatives were isolated, which had become homozygous for the resistance mutation and at the same time for the MTL. This loss of heterozygosity was accompanied by increased drug resistance. In general, strains which are homozygous for one of both MTL configurations (MTLa and MTLα) can switch to the opaque phenotype, which is the mating-competent form of the yeast, and mate with cells of the opposite MTL. In the following, MTLa and MTLα homozygous strains in the opaque phenotype were mated in all possible combinations. The resulting mating products with combined genetic material from both parents did not show an increased drug resistance. Selected products of each mating cross were passaged with stepwise increasing concentrations of fluconazole. The isolated progeny showed high levels of drug resistance and loss of wild-type alleles of resistance-associated genes. In conclusion, selective pressure caused by fluconazole exposure selects for resistance mutations and at the same time induces genomic rearrangements, resulting in mating competence. Therefore, in a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations can mate with each other and generate mating products with combined genetic backgrounds. Selection can act on these mating products and highly drug-resistant und thus highly adapted derivatives can evolve as a result. In summary, the present study contributes to the current understanding of the evolution of antifungal drug resistance by elucidating the effect of resistance mutations on the fitness of the strains in the absence of the drug selection pressure and investigates how highly drug-resistant strains could evolve within a mammalian host. N2 - Infektionen mit dem opportunistischen Hefepilz Candida albicans werden häufig mit dem First-Line-Medikament Fluconazol behandelt, welches die Ergosterol-Biosynthese hemmt. Ein besorgniserregendes Problem in der Klinik, insbesondere bei der Langzeitbehandlung von Patienten, ist die Entwicklung von Resistenzen gegen dieses Azol. Zu den bekannten Resistenzmechanismen gehören Resistenzmutationen in den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren (ZnTFs) Mrr1 und Tac1, die eine Überexpression von Effluxpumpen-Genen bewirken und Resistenzmutationen in Upc2, die zu einer Überexpression des Wirkstofftargets führen. C. albicans Stämme mit solchen Gain-of-Function-Mutationen (GOF) weisen eine erhöhte Medikamentenresistenz auf, was einen selektiven Vorteil in Gegenwart des Medikaments bedeutet. Es wurde zuvor gezeigt, dass dieser Vorteil mit einem Fitnessdefekt in Abwesenheit des Medikaments einhergeht. Dies wurde in verschiedenen Bedingungen nachgewiesen und wird vermutlich durch eine deregulierte Genexpression verursacht. Ein Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, ob C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz durch Evolution kompensieren kann. Daher wurde die relative Fitness von klinischen Isolaten mit einer oder einer Kombination verschiedener Resistenzmutationen in Mrr1, Tac1 und/oder Upc2 im Wettbewerb mit dem zugehörigen Fluconazol-sensitiven Partner analysiert. Die meisten Fluconazol-resistenten Isolate hatten eine verminderte Fitness im Wettbewerb mit ihrem sensitiven Partner in vitro in vollwertigem Medium. Dennoch zeigten drei Fluconazol-resistente Stämme mit Mrr1-Resistenzmutationen keinen Fitnessdefekt im Wettbewerb mit ihrem jeweiligen Partner. Zusätzlich wurde die Fitness von vier ausgewählten klinischen Isolat-Paaren in vivo in Mausmodellen für gastrointestinale Kolonisation (GI) und disseminierte Infektion (IV) untersucht. Im GI-Modell wurden alle vier Fluconazol-resistenten Stämme von ihren sensitiven Partnern überwachsen. Im Gegensatz dazu zeigte im IV-Modell nur einer der vier Fluconazol-resistenten Isolate einen leichten Fitnessdefekt im Wettbewerb mit dem jeweiligen Fluconazol-sensitiven Partner während der Infektion der Nieren. Es kann festgestellt werden, dass in der vorliegenden Arbeit die in vitro-Fitness nicht die in vivo-Fitness widerspiegelt und dass die Gesamtfitness von den getesteten Bedingungen abhängig ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz, die durch eine deregulierte Genexpression verursacht werden, nur schwer überwinden kann. Neben GOFs in Mrr1, Tac1 und Upc2 sind Resistenzmutationen im Wirkstofftarget Erg11 ein wichtiger Resistenzmechanismus von C. albicans. Klinische Isolate weißen oft mehrere Resistenzmechanismen auf, da die Kombination verschiedener Resistenzmutationen die Fluconazol-Resistenz potenziert. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, wie sich Stämme mit mehreren Resistenzmechanismen entwickeln. Eine Möglichkeit ist, dass Stämme Mutationen sequenziell erwerben. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob als weitere Möglichkeit hochresistente C. albicans Stämme mit multiplen Resistenzmechanismen durch parasexuelle Rekombination evolvieren können. In einer klonalen Population könnten Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen diese vorteilhaften Eigenschaften durch Paarung kombinieren. Daraufhin könnte Selektionsdruck auf die Matingprodukte wirken und so die Entstehung von besser angepassten Derivaten begünstigen. Daher wurden Resistenzmutation und Mating Type Locus (MTL) heterozygote Stämme in Gegenwart von Fluconazol kultiviert. So konnten Derivate isoliert werden, die homozygot für die Resistenzmutation und gleichzeitig für den MTL geworden waren. Dieser Verlust der Heterozygotie ging mit einer erhöhten Medikamentenresistenz einher. Generell können Stämme, die homozygot für eine der beiden MTL-Konfigurationen (MTLa und MTLα) sind, in den opaque Phänotyp wechseln, der die paarungskompetente Form der Hefe darstellt, und sich mit Zellen des gegensätzlichen MTL paaren. Im Folgenden wurden MTLa und MTLα homozygote Stämme im opaque Phänotyp in allen möglichen Kombinationen verpaart. Die resultierenden Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Material beider Elternteile wiesen keine erhöhte Medikamentenresistenz auf. Ausgewählte Paarungsprodukte jeder Kreuzung wurden mit stufenweise ansteigenden Konzentrationen von Fluconazol passagiert. Die isolierten Nachkommen zeigten ein hohes Maß an Medikamentenresistenz und den Verlust von Wildtyp-Allelen der resistenzassoziierten Gene. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der selektive Druck, der durch die Fluconazol-Exposition verursacht wird, für Resistenzmutationen selektiert und gleichzeitig genomische Umlagerungen induziert, die eine Paarung ermöglichen. Daher können sich in einer klonalen Population Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen miteinander paaren und Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Hintergrund generieren. Auf diese Matingprodukte kann die Selektion wirken, woraufhin sich hochresistente und damit stark an ihre Umwelt angepasste Derivate entwickeln können. Zusammenfassend trägt die vorliegende Studie zum aktuellen Verständnis der Evolution der Antimykotika-Resistenz bei, indem sie den Effekt von Resistenzmutationen auf die Fitness der Stämme in Abwesenheit des Medikamenten-Selektionsdrucks untersucht und aufklärt, wie sich hochgradig resistente Stämme in einem Säugetierwirt entwickeln könnten. KW - Evolution KW - Resistenz KW - Fitness KW - Candida albicans KW - Fluconazol KW - Resistance KW - Fluconazole KW - Drug resistance KW - Human-pathogenic KW - Yeast Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243515 ER - TY - JOUR A1 - Popp, Christina A1 - Ramírez-Zavala, Bernardo A1 - Schwanfelder, Sonja A1 - Krüger, Ines A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - Evolution of fluconazole-resistant Candida albicans strains by drug-induced mating competence and parasexual recombination JF - mBio N2 - The clonal population structure of Candida albicans suggests that (para)sexual recombination does not play an important role in the lifestyle of this opportunistic fungal pathogen, an assumption that is strengthened by the fact that most C. albicans strains are heterozygous at the mating type locus (MTL) and therefore mating-incompetent. On the other hand, mating might occur within clonal populations and allow the combination of advantageous traits that were acquired by individual cells to adapt to adverse conditions. We have investigated if parasexual recombination may be involved in the evolution of highly drug-resistant strains exhibiting multiple resistance mechanisms against fluconazole, an antifungal drug that is commonly used to treat infections by C. albicans. Growth of strains that were heterozygous for MTL and different fluconazole resistance mutations in the presence of the drug resulted in the emergence of derivatives that had become homozygous for the mutated allele and the mating type locus and exhibited increased drug resistance. When MTLa/a and MTLα/α cells of these strains were mixed in all possible combinations, we could isolate mating products containing the genetic material from both parents. The initial mating products did not exhibit higher drug resistance than their parental strains, but further propagation under selective pressure resulted in the loss of the wild-type alleles and increased fluconazole resistance. Therefore, fluconazole treatment not only selects for resistance mutations but also promotes genomic alterations that confer mating competence, which allows cells in an originally clonal population to exchange individually acquired resistance mechanisms and generate highly drug-resistant progeny. KW - Candida albicans KW - drug resistance evolution KW - mating KW - parasexual recombination Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200901 VL - 10 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Ramírez-Zavala, Bernardo A1 - Betsova, Darina A1 - Schwanfelder, Sonja A1 - Krüger, Ines A1 - Mottola, Austin A1 - Krüger, Thomas A1 - Kniemeyer, Olaf A1 - Brakhage, Axel A. A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - Multiple phosphorylation sites regulate the activity of the repressor Mig1 in \(Candida\) \(albicans\) JF - mSphere N2 - ABSTRACT The highly conserved heterotrimeric protein kinase SNF1 is important for metabolic adaptations in the pathogenic yeast Candida albicans. A key function of SNF1 is to inactivate the repressor protein Mig1 and thereby allow the expression of genes that are required for the utilization of alternative carbon sources when the preferred carbon source, glucose, is absent or becomes limiting. However, how SNF1 controls Mig1 activity in C. albicans has remained elusive. Using a phosphoproteomics approach, we found that Mig1 is phosphorylated at multiple serine residues. Replacement of these serine residues by nonphosphorylatable alanine residues strongly increased the repressor activity of Mig1 in cells lacking a functional SNF1 complex, indicating that additional protein kinases are involved in the regulation of Mig1. Unlike wild-type Mig1, whose levels strongly decreased when the cells were grown on sucrose or glycerol instead of glucose, the levels of a mutant Mig1 protein lacking nine phosphorylation sites remained high under these conditions. Despite the increased protein levels and the absence of multiple phosphorylation sites, cells with a functional SNF1 complex could still sufficiently inhibit the hyperactive Mig1 to enable wild-type growth on alternative carbon sources. In line with this, phosphorylated forms of the mutant Mig1 were still detected in the presence and absence of a functional SNF1, demonstrating that Mig1 contains additional, unidentified phosphorylation sites and that downstream protein kinases are involved in the control of Mig1 activity by SNF1. IMPORTANCE The SNF1 protein kinase signaling pathway, which is highly conserved in eukaryotic cells, is important for metabolic adaptations in the pathogenic yeast Candida albicans. However, so far, it has remained elusive how SNF1 controls the activity of one of its main effectors, the repressor protein Mig1 that inhibits the expression of genes required for the utilization of alternative carbon sources when glucose is available. In this study, we have identified multiple phosphorylation sites in Mig1 that contribute to its inactivation. Mutation of these sites strongly increased Mig1 repressor activity in the absence of SNF1, but SNF1 could still sufficiently inhibit the hyperactive Mig1 to enable growth on alternative carbon sources. These findings reveal features of Mig1 that are important for controlling its repressor activity. Furthermore, they demonstrate that both SNF1 and additional protein kinases regulate Mig1 in this pathogenic yeast. KW - Candida albicans KW - SNF1 KW - Mig1 KW - protein kinase KW - signaling pathway Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350060 VL - 8 IS - 6 ER - TY - JOUR A1 - Ramírez-Zavala, Bernardo A1 - Krüger, Ines A1 - Dunker, Christine A1 - Jacobsen, Ilse D. A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - The protein kinase Ire1 has a Hac1-independent essential role in iron uptake and virulence of Candida albicans JF - PLoS Pathogens N2 - Protein kinases play central roles in virtually all signaling pathways that enable organisms to adapt to their environment. Microbial pathogens must cope with severely restricted iron availability in mammalian hosts to invade and establish themselves within infected tissues. To uncover protein kinase signaling pathways that are involved in the adaptation of the pathogenic yeast Candida albicans to iron limitation, we generated a comprehensive protein kinase deletion mutant library of a wild-type strain. Screening of this library revealed that the protein kinase Ire1, which has a conserved role in the response of eukaryotic cells to endoplasmic reticulum stress, is essential for growth of C. albicans under iron-limiting conditions. Ire1 was not necessary for the activity of the transcription factor Sef1, which regulates the response of the fungus to iron limitation, and Sef1 target genes that are induced by iron depletion were normally upregulated in ire1Δ mutants. Instead, Ire1 was required for proper localization of the high-affinity iron permease Ftr1 to the cell membrane. Intriguingly, iron limitation did not cause increased endoplasmic reticulum stress, and the transcription factor Hac1, which is activated by Ire1-mediated removal of the non-canonical intron in the HAC1 mRNA, was dispensable for Ftr1 localization to the cell membrane and growth under iron-limiting conditions. Nevertheless, expression of a pre-spliced HAC1 copy in ire1Δ mutants restored Ftr1 localization and rescued the growth defects of the mutants. Both ire1Δ and hac1Δ mutants were avirulent in a mouse model of systemic candidiasis, indicating that an appropriate response to endoplasmic reticulum stress is important for the virulence of C. albicans. However, the specific requirement of Ire1 for the functionality of the high-affinity iron permease Ftr1, a well-established virulence factor, even in the absence of endoplasmic reticulum stress uncovers a novel Hac1-independent essential role of Ire1 in iron acquisition and virulence of C. albicans. KW - protein kinase KW - Ire1 KW - Candida albicans Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300225 VL - 18 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Ramírez-Zavala, Bernardo A1 - Krüger, Ines A1 - Wollner, Andreas A1 - Schwanfelder, Sonja A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - The Ypk1 protein kinase signaling pathway is rewired and not essential for viability in \(Candida\) \(albicans\) JF - PLoS Genetics N2 - Abstract Protein kinases are central components of almost all signaling pathways that control cellular activities. In the model organism Saccharomyces cerevisiae, the paralogous protein kinases Ypk1 and Ypk2, which control membrane lipid homeostasis, are essential for viability, and previous studies strongly indicated that this is also the case for their single ortholog Ypk1 in the pathogenic yeast Candida albicans. Here, using FLP-mediated inducible gene deletion, we reveal that C. albicans ypk1Δ mutants are viable but slow-growing, explaining prior failures to obtain null mutants. Phenotypic analyses of the mutants showed that the functions of Ypk1 in regulating sphingolipid biosynthesis and cell membrane lipid asymmetry are conserved, but the consequences of YPK1 deletion are milder than in S. cerevisiae. Mutational studies demonstrated that the highly conserved PDK1 phosphorylation site T548 in its activation loop is essential for Ypk1 function, whereas the TORC2 phosphorylation sites S687 and T705 at the C-terminus are important for Ypk1-dependent resistance to membrane stress. Unexpectedly, Pkh1, the single C. albicans orthologue of Pkh1/Pkh2, which mediate Ypk1 phosphorylation at the PDK1 site in S. cerevisiae, was not required for normal growth of C. albicans under nonstressed conditions, and Ypk1 phosphorylation at T548 was only slightly reduced in pkh1Δ mutants. We found that another protein kinase, Pkh3, whose ortholog in S. cerevisiae cannot substitute Pkh1/2, acts redundantly with Pkh1 to activate Ypk1 in C. albicans. No phenotypic effects were observed in cells lacking Pkh3 alone, but pkh1Δ pkh3Δ double mutants had a severe growth defect and Ypk1 phosphorylation at T548 was completely abolished. These results establish that Ypk1 is not essential for viability in C. albicans and that, despite its generally conserved function, the Ypk1 signaling pathway is rewired in this pathogenic yeast and includes a novel upstream kinase to activate Ypk1 by phosphorylation at the PDK1 site. Author summary Protein kinases are key components of cellular signaling pathways, and elucidating the specific roles of individual kinases is important to understand how organisms adapt to changes in their environment. The protein kinase Ypk1 is highly conserved in eukaryotic organisms and crucial for the maintenance of cell membrane homeostasis. It was previously thought that Ypk1 is essential for viability in the pathogenic yeast Candida albicans, as in the model organism Saccharomyces cerevisiae. Here, by using forced, inducible gene deletion, we reveal that C. albicans mutants lacking Ypk1 are viable but have a strong growth defect. The phenotypes of the mutants indicate that the known functions of Ypk1 are conserved in C. albicans, but loss of this kinase has less severe consequences than in S. cerevisiae. We also unravel the puzzling previous observation that C. albicans mutants lacking the Ypk1-activating kinase Pkh1, which is essential in S. cerevisiae, have no obvious growth defects. We show that the protein kinase Pkh3, which has not previously been implicated in the Ypk1 signaling pathway, can substitute Pkh1 and activate Ypk1 in C. albicans. These findings provide novel insights into this conserved signaling pathway and how it is rewired in a human-pathogenic fungus. KW - Ypk1 KW - protein kinase KW - signaling pathway KW - Candida albicans Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350076 VL - 19 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - Raschig, Martina A1 - Ramírez‐Zavala, Bernardo A1 - Wiest, Johannes A1 - Saedtler, Marco A1 - Gutmann, Marcus A1 - Holzgrabe, Ulrike A1 - Morschhäuser, Joachim A1 - Meinel, Lorenz T1 - Azobenzene derivatives with activity against drug‐resistant Candida albicans and Candida auris JF - Archiv der Pharmazie N2 - Increasing resistance against antimycotic drugs challenges anti‐infective therapies today and contributes to the mortality of infections by drug‐resistant Candida species and strains. Therefore, novel antifungal agents are needed. A promising approach in developing new drugs is using naturally occurring molecules as lead structures. In this work, 4,4'‐dihydroxyazobenzene, a compound structurally related to antifungal stilbene derivatives and present in Agaricus xanthodermus (yellow stainer), served as a starting point for the synthesis of five azobenzene derivatives. These compounds prevented the growth of both fluconazole‐susceptible and fluconazole‐resistant Candida albicans and Candida auris strains. Further in vivo studies are required to confirm the potential therapeutic value of these compounds. KW - antifungal drug KW - azobenzenes KW - Candida auris KW - Candida albicans Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312295 VL - 356 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Remmele, Christian W. A1 - Luther, Christian H. A1 - Balkenhol, Johannes A1 - Dandekar, Thomas A1 - Müller, Tobias A1 - Dittrich, Marcus T. T1 - Integrated inference and evaluation of host-fungi interaction networks JF - Frontiers in Microbiology N2 - Fungal microorganisms frequently lead to life-threatening infections. Within this group of pathogens, the commensal Candida albicans and the filamentous fungus Aspergillus fumigatus are by far the most important causes of invasive mycoses in Europe. A key capability for host invasion and immune response evasion are specific molecular interactions between the fungal pathogen and its human host. Experimentally validated knowledge about these crucial interactions is rare in literature and even specialized host pathogen databases mainly focus on bacterial and viral interactions whereas information on fungi is still sparse. To establish large-scale host fungi interaction networks on a systems biology scale, we develop an extended inference approach based on protein orthology and data on gene functions. Using human and yeast intraspecies networks as template, we derive a large network of pathogen host interactions (PHI). Rigorous filtering and refinement steps based on cellular localization and pathogenicity information of predicted interactors yield a primary scaffold of fungi human and fungi mouse interaction networks. Specific enrichment of known pathogenicity-relevant genes indicates the biological relevance of the predicted PHI. A detailed inspection of functionally relevant subnetworks reveals novel host fungal interaction candidates such as the Candida virulence factor PLB1 and the anti-fungal host protein APP. Our results demonstrate the applicability of interolog-based prediction methods for host fungi interactions and underline the importance of filtering and refinement steps to attain biologically more relevant interactions. This integrated network framework can serve as a basis for future analyses of high-throughput host fungi transcriptome and proteome data. KW - candida genome database KW - computational prediction KW - potential role KW - network inference KW - bioinformatics and computational biology KW - protein interaction database KW - Aspergillus fumigatus KW - cell wall KW - functional modules KW - alzheimers disease KW - molecular cloning KW - Candida albicans KW - pathogen-host interaction (PHI) KW - protein-protein interaction KW - pathogenicity KW - interolog Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148278 VL - 6 IS - 764 ER - TY - THES A1 - Reuter-Weissenberger, Philipp T1 - The role of a fungal-specific transcription regulator on vacuolar biology and host interaction in \(Candida\) \(albicans\) T1 - Die Rolle eines pilzspezifischen Transkriptionsfaktors für die Vakuole und Wirtsinteraktion von \(Candida\) \(albicans\) N2 - Microorganisms that colonize the human body face large fluctuations in their surroundings. Therefore, those microbes developed sophisticated mechanisms that allow them to adapt their cell biology and maintain cellular homeostasis. One organelle vital to preserve cell physiology is the vacuole. The vacuole exhibits a wide range of functions and is able to adjust itself in response to both external and internal stimuli. Moreover, it plays an important role in host interaction and virulence in fungi such as Candida albicans. Despite this connection, only a few regulatory proteins have been described to modulate vacuolar biology in fungal pathogens. Furthermore, whether such regulation alters fungus-host interplay remains largely unknown. This thesis focuses on the characterization of ZCF8, a fungus-specific transcription regulator in the human-associated yeast C. albicans. To this end, I combined genome-wide protein-DNA interaction assays and gene expression analysis that identified genes regulated by Zcf8p. Fluorescence microscopy uncovered that several top targets of Zcf8p localize to the fungal vacuole. Moreover, deletion and overexpression of ZCF8 resulted in alterations in vacuolar morphology and in luminal pH and rendered the fungus resistant or susceptible to a vacuole-disturbing drug. Finally, in vitro adherence assays showed that Zcf8p modulates the attachment of C. albicans to human epithelial cells in a vacuole-dependent manner. Given those findings, I posit that the previously uncharacterized transcription regulator Zcf8p modulates fungal attachment to epithelial cells in a manner that depends on the status of the fungal vacuole. Furthermore, the results highlight that vacuolar physiology is a substantial factor influencing the physical interaction between Candida cells and mammalian mucosal surfaces. N2 - Mikroorganismen, die den Menschen besiedeln, sind großen Schwankungen in ihrer Umgebung ausgesetzt. Daher haben sie ausgeklügelte Mechanismen entwickelt, die es ihnen ermöglichen, ihre Zellbiologie anzupassen und die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Eine für die Aufrechterhaltung der Zellphysiologie wichtige Organelle ist die Vakuole. Sie verfügt über ein breites Spektrum an Funktionen und ist in der Lage, auf externe und interne Stimuli zu reagieren. Außerdem spielt dieses Organell eine wichtige Rolle bei der Pilz-Wirt-Interaktion und somit für die Pathogenität von Pilzen wie Candida albicans. Trotz dieses Zusammenhangs wurden bisher nur wenige regulatorische Proteine beschrieben, welche die Biologie der Vakuolen in pathogenen Pilzen modulieren. Zudem ist weitgehend unbekannt, ob eine solche Regulierung das Zusammenspiel von Pilz und Wirt verändert. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung von ZCF8, einem pilzspezifischen Transkriptionsregulator in der pathogenen Hefe C. albicans. Zu diesem Zweck wurden Protein-DNA-Interaktionstests und Genexpressionsanalysen kombiniert, um Gene zu identifizieren, die direkt von Zcf8p reguliert werden. Fluoreszenzmikroskopie zeigte zudem, dass mehrere der wichtigsten Ziele von Zcf8p in der Pilzvakuole lokalisiert sind. Darüber hinaus führte die Deletion und Überexpression von ZCF8 zu Veränderungen der Morphologie und des luminalen pH-Werts der Vakuole, und veränderte die Sensitivität des Pilzes gegenüber Stoffen, welche Funktionen der Vakuole beeinträchtigen. Schließlich deuteten In-vitro-Adhärenztests daraufhin, dass Zcf8p die Anheftung von C. albicans an menschliche Epithelzellen auf eine Weise moduliert, die abhängig von der Vakuole ist. Angesichts dieser Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass der bisher unbekannte Transkriptionsregulator ZCF8 die Interaktion zwischen Pilz- und Epithelzellen des Wirts kontrolliert, und das auf eine Weise, die von der Pilzvakuole abhängig ist. Des Weiteren, unterstreichen die Ergebnisse, dass die Physiologie der Vakuole ein wesentlicher Faktor ist, welcher die Interaktion zwischen C. albicans und dem Wirt beeinflusst. KW - Vakuole KW - Transkriptionsfaktor KW - Candida albicans KW - vacuole KW - host colonization KW - Candida albicans KW - transcription regulator Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259287 ER - TY - THES A1 - Reuß, Oliver Rainer T1 - Funktionelle Analyse einer Familie von Oligopeptidtransportern des humanpathogenen Hefepilzes Candida albicans T1 - Functional analysis of a family of oligopeptide transporters in the human pathogenic yeast Candida albicans N2 - Der Hefepilz Candida albicans ist Teil der natürlichen Mikroflora auf den Schleimhäuten des Verdauungs- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Allerdings kann C. albicans vor allem in immunsupprimierten Patienten auch schwerwiegende Infektionen verursachen. Diese reichen von oberflächlichen Mykosen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen. C. albicans besitzt eine Reihe von Eigenschaften, die es diesem opportunistisch humanpathogenen Pilz ermöglichen unterschiedliche Wirtsgewebe zu kolonisieren und zu infizieren. Ein wichtiger Virulenzfaktor sind sekretorische Aspartylproteasen (SAPs), die von einer großen Genfamilie von zehn SAP-Genen codiert werden. Die SAPs werden während der Infektion differentiell exprimiert und übernehmen unterschiedliche Rollen im Infektionsverlauf. So tragen sie zur Adhärenz bei, können Wirtsbarrieren und Moleküle der Wirtsimmunabwehr zerstören oder liefern Nährstoffe, indem sie Proteine abbauen. Unter den zehn SAP-Genen ist SAP2 für ein Wachstum von C. albicans auf Proteinen als alleiniger Stickstoffquelle verantwortlich. Allerdings ist wenig über die Regulation der SAP2-Expression und über die Aufnahme der proteolytischen Abbauprodukte in die Zelle bekannt. In dieser Arbeit wurde eine Familie von Oligopeptidtransportern von C. albicans funktionell analysiert. Da aus früheren Arbeiten bekannt war, dass SAP2 durch Peptide mit mindestens acht Aminosäuren induziert werden kann, könnten einzelne Mitglieder dieser Familie neben der Transportfunktion auch eine Sensorfunktion für Peptide übernehmen und somit über einen Signalweg SAP2 induzieren. In der Genomsequenz von C. albicans wurden neben dem bereits beschriebenen OPT1-Gen sieben weitere Gene identifiziert, deren Genprodukte signifikante Homologie zu Opt1p aufwiesen und die deshalb als OPT2-OPT8 bezeichnet wurden. Um die Rolle dieser putativen Oligopeptidtransporter bei der SAP2-Induktion und beim Transport der durch Sap2p-Aktivität bereitgestellten proteolytischen Abbauprodukte zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die OPT-Gene spezifisch deletiert waren. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur gezielten Geninaktivierung etabliert, die auf einem neuen, recycelbaren dominanten Selektionsmarker (caSAT1) beruht, der Resistenz gegen Nourseothricin verleiht. Die “SAT1-Flipping“-Strategie kann direkt in C. albicans Wildstämmen angewendet werden und umgeht somit alle Probleme, die mit der Verwendung von auxotrophen Ausgangsstämmen verbunden sind. Alle Mutanten, in denen jeweils eines der OPT-Gene inaktiviert war, verhielten sich wie der Wildtyp und zeigten keinen Wachstumsdefekt auf bovinem Serumalbumin (BSA) als alleiniger Stickstoffquelle, während eine sap2-Nullmutante unter diesen Bedingungen nicht wachsen kann. Somit ist kein einzelnes OPT-Gen für C. albicans notwendig, um auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle zu wachsen. Dagegen zeigten opt123-Triplemutanten ähnlich wie die sap2-Mutante einen starken Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle, der durch Reintegration einer intakten Kopie von OPT1, OPT2 oder OPT3 wieder aufgehoben werden konnte. Der Wachstumsdefekt der opt123-Triplemutanten war nicht auf eine fehlende Induktion von SAP2 zurückzuführen, sondern auf das Unvermögen dieser Mutanten, die durch den proteolytischen Abbau von BSA entstandenen Peptide zu transportieren. Mit Hilfe von Reportergenen konnte gezeigt werden, dass die einzelnen OPT-Gene differentiell exprimiert werden. Während keines der Gene in einem Vollmedium (YPD) exprimiert wurde, wurde eine starke Induktion von OPT1 und OPT3 in Gegenwart von BSA als alleiniger Stickstoffquelle beobachtet. Nach Expression von OPT4 und OPT5 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors in den opt123-Triplemutanten konnte deren Wachstumsdefekt auf BSA als alleiniger Stickstoffquelle ebenfalls kompensiert werden, während die zusätzliche Deletion dieser Gene in den dabei entstandenen opt1234-Quadruple- und opt12345-Quintuplemutanten den Wachstumsdefekt noch verstärkte. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die Gene OPT1-OPT5 für funktionelle Oligopeptidtransporter codieren. Weitere Experimente zeigten, dass die Oligopeptidtransporter unterschiedliche Substratpräferenzen haben. Während das Tetrapeptid LWMR für Stämme, die spezifisch OPT3, OPT4, oder OPT5 exprimierten, ein besseres Substrat war als das Tetrapeptid LSKL, konnten Stämme, die spezifisch OPT2 exprimierten, das LSKL-Peptid verwerten, nicht aber das LWMR-Peptid. Experimente mit Peptiden definierter Länge und Zusammensetzung wiesen außerdem darauf hin, dass die Oligopeptidtransporter in der Lage sind, auch längere Peptide mit bis zu mindestens acht Aminosäuren zu transportieren. Die Evolution einer Genfamilie, die für Oligopeptidtransporter mit unterschiedlicher Substratpräferenz codieren, hat deshalb vermutlich dazu beigetragen, dass C. albicans Proteine sehr effizient als Stickstoffquelle verwerten und sich an die Nahrungsbedingungen in verschiedenen Wirtsnischen optimal anpassen kann. N2 - The yeast Candida albicans is a member of the microflora on mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenitary tract in most healthy people. However, in immunocompromised patients C. albicans can cause superficial as well as life-threatening systemic infections. C. albicans exhibits a variety of characteristics that enable this opportunistic human fungal pathogen to colonize and infect different host tissues. Among these virulence factors are secreted aspartic proteinases (SAPs), which are encoded by a family of ten SAP genes. The SAPs are differentially expressed during infection and play different roles in disease progression by contributing to adherence, by degrading tissue barriers and host defence molecules or by providing nutrients through the digestion of proteins. Of the ten SAP genes, SAP2 enables C. albicans to grow on proteins as a sole source of nitrogen. However, little is known about how SAP2 expression is regulated and how proteolytic products are taken up into the cell. In this work a family of oligopeptide transporters of C. albicans was functionally characterized. Since earlier studies had demonstrated that SAP2 expression can be induced by peptides of at least eight amino acids in length, oligopeptide transporters, in addition to transporting peptides, might also serve as sensors which in the presence of peptides activate a signalling pathway that induces SAP2 expression. Beside the already described OPT1 gene, seven additional genes were identified in the C. albicans genome sequence whose encoded products exhibit significant similarity to Opt1p and hence were designated as OPT2-OPT8. To elucidate the role of these putative oligopeptide transporters in SAP2 induction and in the uptake of proteolytic products provided by Sap2p activity, a series of mutants lacking specific OPT genes was constructed. For this purpose, a method for targeted gene inactivation was established that relies on the use of a new recyclable, dominant selection marker, caSAT1, which confers resistance to nourseothricin upon C. albicans transformants. The SAT1 flipping strategy can be used directly in C. albicans wild-type strains and, therefore, circumvents all problems related to the use of auxotrophic host strains. All knockout mutants lacking single OPT genes behaved like the wild-type parental strain and did not show a growth defect in a medium containing bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source, conditions in which a sap2 null mutant can not grow. Therefore, no single OPT gene is required for growth of C. albicans on BSA as the sole source of nitrogen. In contrast, opt123 triple mutants, similar to a sap2 mutant, had a severe growth defect on BSA as the sole nitrogen source, which could be rescued by reintroduction of an intact copy of either OPT1, OPT2 or OPT3. The poor growth of the opt123 triple mutants was not caused by failure to induce SAP2 expression but by the inability of these mutants to efficiently transport the peptides produced by proteolytic degradation of BSA into the cell. By using reporter genes it could be demonstrated that individual members of the OPT gene family are differentially expressed. While none of the OPT genes was detectably expressed in rich YPD medium, a strong induction of OPT1 and OPT3 was observed in the presence of BSA as the sole nitrogen source. Forced expression of OPT4 and OPT5 under control of the constitutive ADH1 promoter in the opt123 triple mutants also complemented their growth defect on BSA as a sole nitrogen source, whereas the additional deletion of these genes in the resulting opt1234 quadruple and opt12345 quintuple mutants exacerbated the growth defect. These results confirmed that at least OPT1-OPT5 encode functional oligopeptide transporters. Additional experiments showed that the individual oligopeptide transporters differ in their substrate preferences. While the tetrapeptide LWMR was a better substrate than the tetrapeptide LSKL for strains that specifically expressed OPT3, OPT4 or OPT5, strains specifically expressing OPT2 grew on the LSKL peptide, but not on the LWMR peptide. Furthermore, experiments with peptides of defined length and sequence suggested that the oligopeptide transporters are also able to transport longer peptides up to at least eight amino acids in length. Therefore, the evolution of a gene family encoding oligopeptide transporters with different substrate preferences probably contributed to the ability of C. albicans to efficiently utilize proteins as a nitrogen source and adapt to the nutritional conditions in different host niches. KW - Candida albicans KW - Stickstoffversorgung KW - Oligopeptide KW - Genanalyse KW - Stickstoff-Verwertung KW - Oligopeptide KW - Peptidtransport KW - sekretorische Aspartylprotease KW - Candida albicans KW - nitrogen utilization KW - oligopeptides KW - peptide transport KW - secreted aspartic proteinase KW - Candida albicans Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20515 ER - TY - JOUR A1 - Sasse, Christoph A1 - Schillig, Rebecca A1 - Dierolf, Franziska A1 - Weyler, Michael A1 - Schneider, Sabrina A1 - Mogavero, Selene A1 - Rogers, David P. A1 - Morschhäuser, Joachim T1 - The Transcription Factor Ndt80 Does Not Contribute to Mrr1-, Tac1-, and Upc2-Mediated Fluconazole Resistance in Candida albicans N2 - The pathogenic yeast Candida albicans can develop resistance to the widely used antifungal agent fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis, by the overexpression of genes encoding multidrug efflux pumps or ergosterol biosynthesis enzymes. Zinc cluster transcription factors play a central role in the transcriptional regulation of drug resistance. Mrr1 regulates the expression of the major facilitator MDR1, Tac1 controls the expression of the ABC transporters CDR1 and CDR2, and Upc2 regulates ergosterol biosynthesis (ERG) genes. Gain-of-function mutations in these transcription factors result in constitutive overexpression of their target genes and are responsible for fluconazole resistance in many clinical C. albicans isolates. The transcription factor Ndt80 contributes to the drug-induced upregulation of CDR1 and ERG genes and also binds to the MDR1 and CDR2 promoters, suggesting that it is an important component of all major transcriptional mechanisms of fluconazole resistance. However, we found that Ndt80 is not required for the induction of MDR1 and CDR2 expression by inducing chemicals. CDR2 was even partially derepressed in ndt80D mutants, indicating that Ndt80 is a repressor of CDR2 expression. Hyperactive forms of Mrr1, Tac1, and Upc2 promoted overexpression of MDR1, CDR1/CDR2, and ERG11, respectively, with the same efficiency in the presence and absence of Ndt80. Mrr1- and Tac1-mediated fluconazole resistance was even slightly enhanced in ndt80D mutants compared to wild-type cells. These results demonstrate that Ndt80 is dispensable for the constitutive overexpression of Mrr1, Tac1, and Upc2 target genes and the increased fluconazole resistance of strains that have acquired activating mutations in these transcription factors. KW - Candida albicans Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69201 ER - TY - JOUR A1 - Schielmann, Marta A1 - Szweda, Piotr A1 - Gucwa, Katarzyna A1 - Kawczyński, Marcin A1 - Milewska, Maria J. A1 - Martynow, Dorota A1 - Morschhäuser, Joachim A1 - Milewski, Sławomir T1 - Transport deficiency is the molecular basis of \(Candida\) \(albicans\) resistance to antifungal oligopeptides JF - Frontiers in Microbiology N2 - Oligopeptides incorporating \(N3\)-(4-methoxyfumaroyl)-L-2,3-diaminopropanoic acid (FMDP), an inhibitor of glucosamine-6-phosphate synthase, exhibited growth inhibitory activity against \(Candida\) \(albicans\), with minimal inhibitory concentration values in the 0.05–50 μg mL\(^{-1}\) range. Uptake by the peptide permeases was found to be the main factor limiting an anticandidal activity of these compounds. Di- and tripeptide containing FMDP (F2 and F3) were transported by Ptr2p/Ptr22p peptide transporters (PTR) and FMDP-containing hexa-, hepta-, and undecapeptide (F6, F7, and F11) were taken up by the oligopeptide transporters (OPT) oligopeptide permeases, preferably by Opt2p/Opt3p. A phenotypic, apparent resistance of \(C. albicans\) to FMDP-oligopeptides transported by OPT permeases was triggered by the environmental factors, whereas resistance to those taken up by the PTR system had a genetic basis. Anticandidal activity of longer FMDP-oligopeptides was strongly diminished in minimal media containing easily assimilated ammonium sulfate or L-glutamine as the nitrogen source, both known to downregulate expression of the OPT genes. All FMDP-oligopeptides tested were more active at lower pH and this effect was slightly more remarkable for peptides F6, F7, and F11, compared to F2 and F3. Formation of isolated colonies was observed inside the growth inhibitory zones induced by F2 and F3 but not inside those induced by F6, F7, and F11. The vast majority (98%) of those colonies did not originate from truly resistant cells. The true resistance of 2% of isolates was due to the impaired transport of di- and to a lower extent, tripeptides. The resistant cells did not exhibit a lower expression of \(PTR2\), \(PTR22\), or \(OPT1–3\) genes, but mutations in the \(PTR2\) gene resulting in T422H, A320S, D119V, and A320S substitutions in the amino acid sequence of Ptr2p were found. KW - microbiology KW - Candida albicans KW - oligopeptides KW - resistance mechanism KW - permease KW - antifungals Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173245 VL - 8 ER - TY - THES A1 - Schillig, Rebecca T1 - Funktionelle Analyse der Zink-Cluster-Transkriptionsfaktorfamilie von Candida albicans durch artifizielle Aktivierung T1 - Functional analysis of the zinc cluster transcription factor family of Candida albicans by artificial activation N2 - Der Hefepilz Candida albicans gehört zu den opportunistischen Infektionserregern. Er ist Teil der natürlichen Mikroflora der Schleimhäute des Gastrointestinal- und Urogenitaltraktes des Menschen. Bei Störungen des natürlichen Gleichgewichts dieser Flora kann es zu oberflächlichen Mykosen, z. B. der oropharyngealen Candidiasis (Mundsoor), kommen. Besonders immunsupprimierte Patienten, wie AIDS-Patienten, leiden häufig unter immer wiederkehrenden Infektionen, die mitunter auch zu schwerwiegenden Infektionsverläufen, bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Mykosen führen können. Zur Therapie solcher Erkrankungen werden oft Ergosterolbiosyntheseinhibitoren, wie Fluconazol, eingesetzt. Besonders bei wiederkehrenden Infektionen und wiederholender Therapie ist C. albicans in der Lage, gegen diese häufig verabreichten Antimykotika Resistenzen zu entwickeln. Hierbei spielen Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle. Zink-Cluster-Proteine gehören zu einer pilzspezifischen Familie von Transkriptionsfaktoren, die ein großes Spektrum an zellulären Prozessen regulieren. Die gut charakterisierten Regulatoren Upc2, Tac1 und Mrr1 gehören zu den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren, die maßgeblich zur Resistenzentwicklung von C. albicans beitragen. Upc2 kontrolliert die Expression vieler Ergosterolbiosynthesegene, besonders die von ERG11, welches für die Zielstruktur des gängigen Antimykotikums Fluconazol kodiert. Tac1 und Mrr1 hingegen regulieren die Expression von Multidrug-Effluxpumpen, den ABC-Transportern CDR1 und CDR2 bzw. dem Major Facilitator MDR1. Gain-of-function-Mutationen in diesen Transkriptionsfaktoren resultieren in einer konstitutiven Überexpression ihrer Zielgene und sind verantwortlich für die Resistenz vieler klinischer Isolate. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Fusion von Mrr1 mit der Gal4-Aktivierungsdomäne von Saccharomyces cerevisiae zu einem konstitutiv aktiven Hybridtranskriptionsfaktor führte, der eine MDR1-Überexpression bewirkte und Fluconazolresistenz vermittelte. Dieses Hybridprotein vermittelte sogar eine höhere Resistenz als ein Mrr1 mit natürlich vorkommenden gain-of-function-Mutationen. Analoge Fusionen mit Tac1 und Upc2 resultierten ebenfalls in einer konstitutiven Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren, die einen starken Anstieg der Fluconazolresistenz zur Folge hatte. Daraus ergab sich die Schlussfolgerung, dass dies eine generelle Methode sein könnte, die Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren künstlich zu aktivieren und so ihre biologischen Funktionen zu offenbaren, ohne die genauen Bedingungen für ihre Aktivität zu kennen. Deshalb wurde auf der Basis dieser Strategie eine Bibliothek von C.-albicans-Stämmen konstruiert, in der alle 82 putativen Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren in dieser möglicherweise hyperaktiven Form exprimiert werden. Untersuchungen dieser Bibliothek offenbarten neue Transkriptionsfaktoren, die Fluconazolresistenz vermittelten, aber auch noch unbekannte Regulatoren der Morphogenese und andere Phänotypen konnten beobachtet werden. Um einen tieferen Einblick in die Funktionsweise zu bekommen, wurden die Transkriptionsprofile der vier Transkriptionsfaktoren ermittelt, die in ihrer hyperaktiven Form die höchste Fluconazolresistenz bewirkten. Dabei stellte sich heraus, dass die zwei künstlich aktivierten (*) Regulatoren ZCF34* und ZNC1* die Expression der wichtigsten Multidrug-Effluxpumpe CDR1 stark hochregulierten. Der Transkriptionsfaktor mit dem vorläufigen Namen ZCF34 konnte im Verlauf dieser Arbeit als ein wichtiger Regulator für die CDR1-Expression identifiziert werden. Er ist sowohl an der Aktivierung der Expression von CDR1 beteiligt als auch für die basale CDR1-Promotoraktivität notwendig. Aus diesem Grund wurde er in MRR2 (multidrug resistance regulator 2) umbenannt. Mit der Entdeckung eines neuen Regulators der wichtigsten Multidrug-Effluxpumpe von C. albicans wurde ein wichtiger Beitrag zum Verständnis der Regulation solcher Transporter geleistet. Die Überexpression dieser Pumpen ist einer der häufigsten Resistenzmechanismen in C. albicans. Auf diesem Wege kann Resistenz gegen strukturell völlig unterschiedliche Antimykotika bewirkt werden. Somit stellen sowohl diese Effluxpumpen, als auch deren Regulatoren mögliche Angriffsziele für die Entwicklung neuer oder Weiterentwicklung bereits vorhandener Antimykotika dar. N2 - The yeast Candida albicans is an oppotunistic fungal pathogen, usually a harmless colonizer of mucosal surfaces of the gastrointestinal und urogenital tract of healthy people. If the balance of this microflora is disturbed, it can cause superficial mycoses, like oropharyngeal candidiasis. Especially immunocompromised patients, like AIDS patients suffer from recurrent infections, occasionally causing life-threatening systemic infections. The antifungal agent fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis, is frequently used to treat Candida-infections. Particularly during long term treatments of recurrent infections, C. albicans can develop resistance to the commonly used antifungal drugs. Zinc cluster transcription factors often play key roles in the development of such resistances. The zinc cluster proteins are a fungus-specific family of transcription factors that regulate a variety of cellular processes. The well characterized regulators Upc2, Tac1 und Mrr1 are among these zinc cluster transcription factors, being significantly involved in mediating drug resistance. Upc2 controls the expression of ergosterol biosynthesis genes, e. g. of ERG11, encoding the target enzyme of fluconazole. Tac1 and Mrr1 regulate the expression of multidrug efflux pumps, the ABC transporters CDR1 and CDR2 and the major facilitator MDR1, respectively. Gain-of-function mutations in these transcription factors result in constitutive overexpression of their target genes and are responsible for drug resistance in many clinical C. albicans strains. In this thesis it could be shown that fusion of the full-length Mrr1 with the Gal4 activation domain from Saccharomyces cerevisiae produced a constitutively active hybrid transcription factor that mediated MDR1 overexpression and increased drug resistance. The hybrid transcription factor exhibited even higher activity than Mrr1 with a naturally occurring gain-of-function mutation. Analogous fusions with Tac1 and Upc2 also resulted in constitutively activated transcription factors that conferred strongly increased drug resistance, suggesting that this might be a generally applicable approach for the artificial activation of zinc cluster transcription factors, which could reveal their biological function without prior knowledge about inducing conditions. Therfore a library of C. albicans strains expressing all 82 predicted zinc cluster transcription factors of this pathogen was constructed, by using this strategy, resulting in strains with potentially hyperactive regulators. Screening of this comprehensive set of strains revealed novel transcription factors mediating drug resistance, but also previously unknown regulators of morphogenesis and other phenotypes. To gain insight into their mechanism of action, transcriptional profiles were determined of the four transcription factors that produced the strongest increase in fluconazole resistance when expressed in a hyperactive form. This analysis revealed that two out of these four artificially activated (*) transcription factors, ZCF34* and ZNC1*, strongly upregulate the expression of the most important multidrug efflux pump CDR1, which could be verified by Northern hybridization. The transcription factor previously named ZCF34 could be identified as a new and important regulator of CDR1, being involved in the activation of CDR1 expression as well as in basal promoter activity of this pump. Therefore it was renamed MRR2 (multidrug resistance regulator 2). The identification of MRR2 as a new regulator of the most important multidrug efflux pump in C. albicans represents a major step forward in understanding the regulation of such transporters. The overexpression of these efflux pumps is one of the most common resistance mechanism in C. albicans, conferring resistance to many structurally and functionally unrelated toxic compounds. Therefore these transporters, as well as their regulators, provide potential tagets of new or further developed antifungal agents. KW - Candida albicans KW - Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren KW - Resistenzmechanismen KW - artifizielle Aktivierung KW - CDR1-Effluxpumpe KW - Fluconazol KW - Zink-Finger-Proteine KW - Resistenz KW - Antimykotikum Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79608 ER - TY - THES A1 - Schubert, Sabrina T1 - Funktionelle Analyse des „Multidrug-Resistance“-Regulators MRR1 im humanpathogenen Hefepilz Candida albicans T1 - Functional analysis of the multidrug resistance regulator MRR1 in the pathogenic yeast Candida albicans N2 - Der Hefepilz Candida albicans gehört zu den fakultativ pathogenen Infektionserregern und ist Teil der natürlichen Mikroflora der Schleimhäute des Verdauungs- und Urogenitaltraktes der meisten gesunden Menschen. Ist das Gleichgewicht der Flora gestört, kann es zu oberflächlichen Mykosen kommen, wie z.B. der oropharyngealen Candidiasis (Mundsoor), die in der Regel durch die Gabe eines Antimykotikums in wenigen Tagen zu behandeln sind. In seltenen Fällen kann es auch zu schwerwiegenden Infektionsverläufen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Mykosen kommen. Hauptsächlich immunsupprimierte Patienten, wie z.B. AIDS-Patienten oder Personen, die kürzlich einer Organ- oder Knochenmarkstransplantation unterzogen wurden, leiden häufig an oberflächlichen C. albicans-Infektionen. Insbesondere bei wiederkehrenden Infektionen ist der Pilz in der Lage, gegen das häufig verabreichte Medikament Fluconazol eine Resistenz zu entwickeln. Ein wichtiger Mechanismus dieser Resistenzentwicklung ist die Überexpression von Effluxpumpen, die das Medikament aus der Zelle heraustransportieren. Zwei Arten von Effluxpumpen, die eine Rolle in der Resistenzentwicklung in C. albicans spielen, konnten bisher identifiziert werden, die ABC (ATP binding cassette)-Transporter Cdr1 und Cdr2 sowie der MFS (major facilitator superfamily)-Transporter Mdr1. Der Zinc-Cluster Transkriptionsfaktor Mrr1 spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der MDR1-E¬ffluxpumpe. Er kontrolliert die MDR1-Expression in Anwesenheit induzierender Substanzen und sogenannte "gain-of-function" Mutationen in MRR1 konnten als die Ursache der konstitutiven MDR1-Hochregulierung und der "Multidrug-Resistance" in C. albicans identifiziert werden. In dieser Arbeit konnte ein Ortholog zu MRR1 aus C. albicans in Candida dubliniensis, einer zu C. albicans nahe verwandten Hefe, identifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass in den untersuchten klinischen und in vitro generierten Fluconazol-resistenten C. dubliniensis-Stämmen ebenfalls gain-of-funcion Mutationen in MRR1 die MDR1-Überexpression und eine Resistenz bewirken. Die Ergebnisse demonstrieren, dass der Transkriptionsfaktor Mrr1 eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Resistenz in diesen humanpathogenen Pilzen spielt. Bisher ist nicht bekannt, wie der Zinc-Cluster Transkriptionsfaktor MRR1 durch induzierende Substanzen oder gain-of-function Mutationen aktiviert wird. Um zu verstehen, wie die Mrr1- Aktivität reguliert wird, wurden in dieser Arbeit durch Deletionsstudien funktionelle Domänen des Transkriptionsfaktors identifiziert. Um einen besseren Einblick in die Regulation der MDR1-vermittelten Resistenz in C. albicans zu bekommen, wurde in dieser Arbeit die gegenseitige Abhängigkeit von Mrr1 und Cap1 bzw. Upc2 in Bezug auf die MDR1-Expression untersucht. Es wurden ChIP-on-chip Analysen und Transkriptionsprofile mit aktiviertem Mrr1 durchgeführt, um direkte Targets von Mrr1 zu identifizieren. Mit der vorliegenden Arbeit wurde ein wichtiger Beitrag zum Verständnis der Entwicklung der Multidrug-Resistenz in C. albicans geleistet. E¬ffluxpumpen und deren Regulatoren stellen in der Bekämpfung von C. albicans-Infektionen ein interessantes Angriffsziel für die Entwicklung neuer Medikamente und die Weiterentwicklung bereits vorhandender Antimykotika dar. N2 - The yeast Candida albicans is a human fungal pathogen and is part of the microflora of mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in most healthy people. If the balance of the flora is disturbed C. albicans can cause super cial mycoses, e.g. oropharyngeal Candidiasis, also known as "thrush", which are usually easy to cure within a few days by treatment with antimycotic drugs. Infections with the yeast can also result in serious as well as life-threatening systemic mycoses. However, immunocompromised patients, e.g. AIDS patients, often suffer from super cial C. albicans infections and especially in recurrent infections the yeast can develop resistance to the commonly used antifungal drug fluconazole. An important mechanism of drug resistance is the overexpression of e¬ux pumps, which mediate the transport of toxic compounds out of the cell. Two types of e¬fflux pumps, which play a role in die development of resistance in C. albicans, have been described so far, the ABC (ATP binding cassette) transporters Cdr1 and Cdr2, and the MFS (major facilitator superfamily) transporter Mdr1. The zinc cluster transcription factor Mrr1 plays an important role in the regulation of the MDR1 gene. It controls the MDR1 expression in response to inducing chemicals and gain-of function mutations in MRR1 are responsible for the constitutive upregulation of MDR1 and fluconazole resistance. In this work a CaMRR1 ortholog was found in Candida dubliniesis, a yeast closely related to C. albicans. It could be shown that gain-of-function mutations in CdMRR1 were the cause of MDR1 overexpression and drug resistance in all investigated clinical and in vitro generated strains. The results showed that Mrr1 plays an important role in the development of drug resistence in these human fungal pathogens. Currently it is not understood how these zinc cluster transcription factors are activated under inducing conditions or by gain-of-function mutations. To better understand the regulation of Mrr1 activation, in this work deletion studies were performed to identify functional domains of the transcription factor. To gain better insight into the regulation of MDR1-mediated drug resistance in C. albicans, the interdependence of Mrr1 and two other MDR1 regulators, Cap1 and Upc2, was studied in this work. ChIP-on-chip analyses and transcriptional profiles with acitvated Mrr1 were performed to identify direct targets of Mrr1. This thesis contributes to the understanding of the development of multidrug resistance in C. albicans. Efflux pumps and their transcriptional regulators provide an interesting target for the development of new antifungal drugs or the further development of available drugs against C. albicans infections. KW - Candida albicans KW - Resistenz KW - Effluxpumpen KW - Candida albicans KW - resistance KW - efflux pump Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70916 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Christin Marliese T1 - Approaching antimicrobial resistance – Structural and functional characterization of the fungal transcription factor Mrr1 from Candida albicans and the bacterial ß-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from Mycobacterium tuberculosis T1 - Auf den Spuren der antimikrobiellen Resistenz – Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Mrr1 aus Candida albicans und der bakteriellen β-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 aus Mykobakterium tuberculosis N2 - The number of fungal infections is rising in Germany and worldwide. These infections are mainly caused by the opportunistic fungal pathogen C. albicans, which especially harms immunocompromised people. With increasing numbers of fungal infections, more frequent and longer lasting treatments are necessary and lead to an increase of drug resistances, for example against the clinically applied therapeutic fluconazole. Drug resistance in C. albicans can be mediated by the Multidrug resistance pump 1 (Mdr1), a membrane transporter belonging to the major facilitator family. However, Mdr1-mediated fluconazole drug resistance is caused by the pump’s regulator, the transcription factor Mrr1 (Multidrug resistance regulator 1). It was shown that Mrr1 is hyperactive without stimulation or further activation in resistant strains which is due to so called gain of function mutations in the MRR1 gene. To understand the mechanism that lays behind this constitutive activity of Mrr1, the transcription factor should be structurally and functionally (in vitro) characterized which could provide a basis for successful drug development to target Mdr1-mediated drug resistance caused by Mrr1. Therefore, the entire 1108 amino acid protein was successfully expressed in Escherichia coli. However, further purification was compromised as the protein tended to form aggregates, unsuitable for crystallization trials or further characterization experiments. Expression trials in the eukaryote Pichia pastoris neither yielded full length nor truncated Mrr1 protein. In order to overcome the aggregation problem, a shortened variant, missing the N-terminal 249 amino acids named Mrr1 ‘250’, was successfully expressed in E. coli and could be purified without aggregation. Similar to the wild type Mrr1 ‘250’, selected gain of function variants were successfully cloned, expressed and purified with varying yields and with varying purity. The Mrr1 `250’ construct contains most of the described regulatory domains of Mrr1. It was used for crystallization and an initial comparative analysis between the wild type protein and the variants. The proposed dimeric form of the transcription factor, necessary for DNA binding, could be verified for both, the wild type and the mutant proteins. Secondary structure analysis by circular dichroism measurements revealed no significant differences in the overall fold of the wild type and variant proteins. In vitro, the gain of function variants seem to be less stable compared to the wild type protein, as they were more prone to degradation. Whether this observation holds true for the full length protein’s stability in vitro and in vivo remains to be determined. The crystallization experiments, performed with the Mrr1 ‘250’ constructs, led to few small needle shaped or cubic crystals, which did not diffract very well and were hardly reproducible. Therefore no structural information of the transcription factor could be gained so far. Infections with M. tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, are the leading cause of mortality among bacterial diseases. Especially long treatment times, an increasing number of resistant strains and the prevalence of for decades persisting bacteria create the necessity for new drugs against this disease. The cholesterol import and metabolism pathways were discovered as promising new targets and interestingly they seem to play an important role for the chronic stage of the tuberculosis infection and for persisting bacteria. In this thesis, the 3-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from M. tuberculosis was characterized and the potential for specifically targeting this enzyme was investigated. FadA5 catalyzes the last step of the β-oxidation reaction in the side-chain degradation pathway of cholesterol. We solved the three dimensional structure of this enzyme by X-ray crystallography and obtained two different apo structures and three structures in complex with acetyl-CoA, CoA and a hydrolyzed steroid-CoA, which is the natural product of FadA5. Analysis of the FadA5 apo structures revealed a typical thiolase fold as it is common for biosynthetic and degradative enzymes of this class for one of the structures. The second apo structure showed deviations from the typical thiolase fold. All obtained structures show the enzyme as a dimer, which is consistent with the observed dimer formation in solution. Thus the dimer is likely to be the catalytically active form of the enzyme. Besides the characteristic structural fold, the catalytic triad, comprising two cysteines and one histidine, as well as the typical coenzyme A binding site of enzymes belonging to the thiolase class could be identified. The two obtained apo structures differed significantly from each other. One apo structure is in agreement with the characteristic thiolase fold and the well-known dimer interface could be identified in our structure. The same characteristics were observed in all complex structures. In contrast, the second apo structure followed the thiolase fold only partially. One subdomain, spanning 30 amino acids, was in a different orientation. This reorientation was caused by the formation of two disulfide bonds, including the active site cysteines, which rendered the enzyme inactive. The disulfide bonds together with the resulting domain swap still permitted dimer formation, yet with a significantly shifted dimer interface. The comparison of the apo structures together with the preliminary activity analysis performed by our collaborator suggest, that FadA5 can be inactivated by oxidation and reactivated by reduction. If this redox switch is of biological importance requires further evaluation, however, this would be the first reported example of a bacterial thiolase employing redox regulation. Our obtained complex structures represent different stages of the thiolase reaction cycle. In some complex structures, FadA5 was found to be acetylated at the catalytic cysteine and it was in complex with acetyl-CoA or CoA. These structures, together with the FadA5 structure in complex with a hydrolyzed steroid-CoA, revealed important insights into enzyme dynamics upon ligand binding and release. The steroid-bound structure is as yet a unique example of a thiolase enzyme interacting with a complex ligand. The characterized enzyme was used as platform for modeling studies and for comparison with human thiolases. These studies permitted initial conclusions regarding the specific targetability of FadA5 as a drug target against M. tuberculosis infection, taking the closely related human enzymes into account. Additional analyses led to the proposal of a specific lead compound based on the steroid and ligand interactions within the active site of FadA5. N2 - Die Zahl der Pilzinfektionen, welche hauptsächlich durch den opportunistisch-pathogenen Pilz C. albicans verursacht werden, ist nicht nur in Deutschland, sondern weltweit steigend. Die auftretenden Infektionen betreffen vor allem immunsupprimierte Personen. Dieser Anstieg an Pilzinfektionen verursacht häufigere und immer länger andauernde Behandlungen und resultiert auch im vermehrten Auftreten von Resistenzen gegen Antimykotika, unter anderem gegen das klinisch eingesetzte Fluconazol. Eine Möglichkeit der Resistenzbildung in C. albicans ist die Expression der ‚Multidrug resistance pump 1‘ (Mdr1), einer Membranpumpe, die zur Major-Facilitator-Superfamilie zählt. Diese durch Mdr1-vermittelte Fluconazolresistenz wird durch den Mdr1 regulierenden Transkriptionsfaktor Mrr1 (‚Multidrug resistance regulator 1‘) gesteuert. In resistenten C. albicans Stämmen befindet sich Mrr1 ohne weitere Stimulation oder externe Aktivierung bereits in einem hyperaktiven Zustand, der durch Mutationen mit Funktionsgewinn im MRR1 Gen verursacht wird. Um die Mechanismen, die sich hinter der konstitutiven Aktivität von Mrr1 verbergen, zu entschlüsseln, sollte dieser Transkriptionsfaktor in vitro strukturell und funktionell charakterisiert werden. Diese Charakterisierung könnte im Anschluss genutzt werden, um Wirkstoffe gegen die von Mrr1 gesteuerte und von Mdr1-vermittelte Resistenz zu entwickeln. Zu diesem Zweck, wurde das gesamte, 1108 Aminosäuren umfassende, Protein in Escherichia coli exprimiert. Die anschließende Proteinreinigung war allerdings durch Aggregatbildung beeinträchtigt, welche Kristallisationsansätze oder eine weitere Charakterisierung dieses Proteinkonstruktes verhinderten. Im Eukaryot Pichia pastoris durchgeführte Expressionsanalysen, waren leider erfolglos und weder die Expression des Volllängen-Mrr1 noch seiner verkürzten Proteinvarianten konnte nachgewiesen werden. Um Proteinaggregation zu umgehen, wurde deshalb ein N-terminal, um 249 Aminosäuren, verkürztes Proteinkonstrukt, Mrr1 ‚250‘, in E. coli exprimiert und erfolgreich, ohne Aggregation, gereinigt. Zusätzlich zum wildtypischen Mrr1 ‚250‘ Protein wurden auch ausgewählte Varianten kloniert, exprimiert und gereinigt, allerdings mit unterschiedlicher Ausbeute und Reinheit. Da das verkürzte Mrr1 ‚250‘ Protein noch immer fast alle in der Literatur beschriebenen Regulierungsdomänen besitzt, wurde es zur Kristallisation und für einen initialen Vergleich zwischen Wildtyp und Varianten genutzt. So konnte zum Beispiel die vermutete Dimerisierung des Transkriptionsfaktors sowohl für das Wildtypprotein als auch für die Varianten gezeigt werden. Eine weiterführende Untersuchung der Sekundärstruktur mittels zirkular Dichroismus Messungen zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mutanten und dem Wildtypprotein. Allerdings erscheinen die Funktionsgewinn Varianten von Mrr1 in vitro instabiler als das Wildtypprotein, was sich durch stärkeren Abbau der Variantenproteine zeigt. Ob diese Beobachtungen allerdings vom verkürzten Protein auf das Gesamtprotein und dessen in vitro und in vivo Stabilität übertragbar sind, ist derzeit noch unklar. Kristallisationsansätze, die mit den verschiedenen Varianten des Mrr1 ‚250‘ Konstrukts durchgeführt wurden, führten zu sehr wenigen, nadelförmigen oder kubischen Kristallen, die kaum reproduzierbar waren und schlecht diffraktierten. Bisher konnten deshalb keine strukturellen Daten für den untersuchten Transkriptionsfaktor erhalten werden. Noch immer sind Infektionen, die durch M. tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, verursacht werden die Haupttodesursache im Bereich der bakteriellen Infektionen. In diesem Zusammenhang stellen vor allem lange Behandlungszeiten, das vermehrte Auftreten resistenter Stämme und das Vorkommen persistierender Bakterien, die Jahrzehnte in ihrem Wirt überdauern können, nach wie vor große Herausforderungen dar und die Entwicklung neuer Tuberkulosemedikamente ist dringend erforderlich. Sowohl der Cholesterinimport als auch dessen Stoffwechselweg wurden als vielversprechende Wirkstoffziele identifiziert. Nicht zuletzt, da beide Mechanismen eine wichtige Rolle während der chronischen Phase der Tuberkuloseinfektion und für persistierende Bakterien zu spielen scheinen. Im Laufe dieser Arbeit wurde die 3-ketoacyl-CoA Thiolase FadA5 aus M. tuberculosis strukturell charakterisiert und auf ihre Tauglichkeit als spezifisches Wirkstoffziel hin untersucht. FadA5 katalysiert den letzten Schritt der β-Oxidation im Zuge des Seitenkettenabbaus von Cholesterin. Wir konnten die Proteinstruktur des FadA5 Proteins mittels Röntgenkristallographie ermitteln und erhielten zwei unterschiedliche apo-Strukturen sowie drei Komplexstrukturen. In den Komplexstrukturen waren entweder Acetyl-CoA, CoA oder ein hydrolisiertes Steroid-CoA, welches das natürliche Produkt von FadA5 darstellt, an das Enzym gebunden. Die Strukturanalyse der apo-Strukturen lies für eine der beiden Modelle die typische Thiolasefaltung erkennen, welche für biosynthetische und degradative Enzyme dieser Klasse üblich ist. In der zweiten apo-Struktur konnte diese Faltung nur teilweise identifiziert werden. Das Protein liegt in allen erhaltenen Strukturen als Dimer vor, was auch in Lösung beobachtet werden konnte und darauf hinweist, dass das Dimer die katalytisch aktive Form des Proteins darstellt. Neben der charakteristischen Faltung, wurde das aktive Zentrum, bestehend aus zwei Cysteinen und einem Histidin, sowie die für Thiolasen übliche Coenzym A Bindetasche identifiziert. Die erhaltenen apo-Strukturen unterschieden sich deutlich voneinander. Die zuvor beschriebene typische Dimer-Interaktionsfläche wird auch in den Komplexstrukturen beobachtet. Dahingegen war die Thiolasefaltung in der zweiten Apo-Struktur nur teilweise vorhanden, da beispielsweise eine Domäne, die 30 Aminosäuren umfasst, umorientiert vorlag. Die Bildung zweier Disulfidbrücken, welche beide katalytischen Cysteine involviert, verursachte die beschriebene Umorientierung und damit gepaart eine wahrscheinliche Inaktivität des Enzyms. Trotz der beschriebenen Umorientierung und Disulfidbrückenbildung liegt das Protein noch immer als Dimer vor, allerdings mit einer deutlich verschobenen Interaktionsfläche. Der Vergleich der beiden apo-Strukturen in Kombination mit einer vorläufigen Aktivitätsanalyse, die von unseren Kollaborationspartnern durchgeführt wurde, lassen vermuten, dass FadA5 durch Oxidation inaktiviert und durch Reduktion reaktiviert werden kann. Ob diese Redoxregulierung biologisch relevant ist, muss noch geklärt werden, allerdings wäre dies der erste beschriebene Fall einer redoxregulierten bakteriellen Thiolase. Die Komplexstrukturen stellen verschiedene Stufen der Thiolasereaktion dar. In einigen dieser Strukturen lag FadA5 am katalytischen Cystein acetyliert vor und befand sich im Komplex mit acetyl-CoA oder CoA. Durch eine weitere Struktur, in der FadA5 im Komplex mit einem hydrolisierten Steroid-CoA vorlag, konnten wichtige Einblicke in die Enzymdynamik während der Ligandenbindung und Freisetzung gewonnen werden. Die Steroid gebundene Struktur stellt derzeit ein einzigartiges Beispiel einer Thiolase im Komplex mit einem großen, mehrere Ringsysteme umfassenden Liganden dar. Das charakterisierte Enzym diente als Ausgangspunkt für Modellierungsversuche und Vergleiche mit humanen Thiolasen. Diese Analysen erlaubten initiale Schlussfolgerungen bezüglich einer Verwendung von FadA5 als spezifisches Wirkstoffziel gegen Tuberkuloseinfektionen, im Kontext verwandter humaner Enzyme. Zusätzliche Untersuchungen ermöglichten die Ausarbeitung einer spezifischen Leitsubstanz, die auf den analysierten Interaktionen zwischen dem aktiven Zentrum von FadA5 und den gebundenen Liganden basiert. KW - Multidrug-Resistenz KW - Candida albicans KW - Tuberkulose KW - Röntgenkristallographie KW - Cholesterinstoffwechsel KW - Structural Biology KW - Transcription factor KW - Thiolase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108400 ER - TY - THES A1 - Staib, Peter T1 - Analyse der Expression einer Virulenzgenfamilie von Candida albicans während der Infektion T1 - Analysis of the expression of a Candida albicans virulence gene family during infection N2 - Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können. N2 - The opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans is a member of the microflora on mucosal surfaces of many healthy people but can cause superficial infections as well as life-threatening deep organ mycoses in immunocompromised patients. Although the ability of C. albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, it is generally assumed that a number of virulence factors also contribute to the pathogenicity of C. albicans, thereby supporting colonization, distribution and multiplication of the fungal cells and allowing an adaption to various host niches. The production of secreted aspartic proteases (SAPs), encoded by a large family of homologous genes, plays an important role in C. albicans pathogenicity. It is likely that the individual proteases fullfill various functions during infection or are optimally adapted to different host niches. However, the contribution of single SAP genes to pathogenicity is not well understood. Because the host-induced activation of these virulence genes at a certain infection stage might give clues to their specific role in pathogenicity, an in vivo-expression technology (IVET) was developed in this work that allows the detection of gene activation in C. albicans during infection. The method is based on genetic recombination as a reporter of gene expression, resulting in the specific excision of a mycophenolic acid resistance marker from the genome by a site-specific recombinase after induction of the target gene. Because deletion of the marker represents an irreversible event that is inherited by the progeny of the corresponding cell, even a transient gene expression at a certain infection stage or in specific organs can be detected in single cells recovered from infected tissue by plating on appropriate indicator medium. The suitability of the reporter system for detecting a biologically meaningful gene activation in C. albicans was confirmed by analyzing expression of the SAP2 gene, which is induced in vitro during growth in a medium containing bovine serum albumin as the sole nitrogen source, but repressed in other commonly used laboratory media. IVET was then used to analyze the in vivo expression of six different SAP genes of C. albicans, SAP1-SAP6, in various animal models. It could be demonstrated that the individual protease genes are indeed differentially regulated, depending on the type of the infection, i.e. locally restricted mucosal infection or systemic infection, and the stage of an infection. Even the highly homologous SAP4-SAP6 genes, which from the results of in vitro experiments had been supposed to be hyphae-specific genes, were differentially regulated in vivo. SAP5 and SAP6, but not the other SAP genes, were significantly activated in a mouse model of oesophageal candidiasis when C. albicans hyphae invaded into the epithelium. A stage-specific expression of SAP genes was observed in a mouse model of Candida peritonitis. Soon after inoculation of C. albicans yeasts into the peritoneal cavity, before hyphae formation was observed, SAP5 but not SAP6 or any of the other SAP genes analyzed was activated in a significant part of the infecting cell population. Therefore, SAP5 seems to be important for tissue invasion during mucosal infection and also during the initial steps of a disseminated infection. By intravenous inoculation of C. albicans into mice, thereby bypassing the early infection stages, it was demonstrated that expression of SAP5 and SAP6, but also SAP4, continued into the later stages of a disseminated infection. In contrast, an induction of the SAP2 gene was observed predominantly in the late stages of a systemic infection, when the fungal cells had spread to deep organs. Hence, SAP2 presumably supports the multiplication of the fungal cells within the infected organs, perhaps by providing nutrient supply, rather than the invasion into host tissues. The in vivo regulation of SAP2 was shown to be influenced by certain repeat structures in the promotor region of this gene. In the C. albicans model strain CAI4 that was used in this study even the two SAP2 alleles, which differed in this repeat region, were differentially regulated during the course of a systemic infection, the SAP2-2 allele being induced at an earlier infection stage than the SAP2-1 allele. In contrast to the other SAP genes, expression of SAP1 and SAP3 could be detected in only few infecting cells, and a role in pathogenicity could not be attributed to these genes in the infection models used in this work. During the course of an infection C. albicans presumably employs many different virulence factors at the same time in order to achieve the best possible adaptation to the corresponding host niche. Yet, a question that has hardly been addressed but may enhance our understanding of the host-microbe interactions is whether different properties of the fungal cell are regulated in a coordinated fashion by specific host signals. At least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators CPH1 and EFG1, respectively, control hyphae formation in C. albicans. As dimorphic growth is important for infection and because expression of the genes SAP4-SAP6 is linked to the hyphal growth form in vitro, a possible dependence of hyphae-associated SAP gene expression on these regulators was analyzed by studying SAP5 expression in corresponding signal transduction mutants. SAP5 activation in vivo was reduced in cph1 as well as in efg1 single mutants. Therefore, both CPH1 and EFG1 contribute to SAP5 activation during infection. Since the cph1 mutant formed hyphae in infected tissue as efficiently as the wild-type strain, hyphae formation alone evidently was not sufficient for full SAP5 induction in vivo. On the other hand, induction of SAP5 in vivo did not depend on the hyphal growth form, because a reduced but still significant SAP5 expression was also detected in the efg1 mutant that grew only in the yeast form in the infected animals. In cells defective in both of the regulators an induction of SAP5 was hardly detectable. Therefore, these signalling pathways are important for the control of various cellular programs during infection and coordinate the expression of different virulence genes in C. albicans. The in vivo analysis of virulence gene expression of C. albicans provided insights into regulatory adaptation mechanisms of the pathogen in various host niches. The individual members of a virulence gene family of this fungus are differentially and stage-specifically regulated during infection and thus presumably contribute very specifically to pathogenesis. Moreover, various virulence traits can be regulated in a coordinated fashion during infection and in this way together support the adaptability of C. albicans to the host. Overall, these findings enhance our understanding of the pathogenicity of this important opportunistic fungal pathogen. KW - Candida albicans KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Pilzinfektionen KW - Virulenzmechanismen KW - Genregulation KW - Reportergene KW - In Vivo Expressionstechnologie KW - Proteasen KW - Candida albicans KW - fungal infections KW - virulence mechanisms KW - gene regulation KW - reporter genes KW - in vivo expression technology KW - Candida albicans Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179875 ER - TY - THES A1 - Theiß, Stephanie T1 - Identifizierung und Charakterisierung des vakuolaren ABC-Transporters Mlt1p und der Phospholipase B Plb5p von Candida albicans T1 - Identification and characterisation of the vacuolar ABC-transporter Mlt1p and the phospholipase B Plb5p of Candida albicans N2 - Die opportunistische Hefe Candida albicans ist in der Lage durch ein koordiniertes Zusammenspiel bestimmter zellulärer Eigenschaften sich unterschiedlichen Umweltbedingungen anzupassen und unterschiedliche Nischen innerhalb des menschlichen Wirts zu kolonisieren. Die Sekretion hydrolytischer Enzyme, wie Proteinasen und Phospholipasen, stellt eine wichtige Eigenschaft des Pilzes dar, die als wesentlicher Faktor für die Aufrechterhaltung der Pathogenität von C. albicans angesehen wird. Ein Schwerpunkt der hier vorliegenden Studie ist die funktionale Charakterisierung des caPLB5-Gens, eines neuen Mitglieds der insgesamt 5 Mitglieder umfassenden Phospholipase-B-Genfamilie. Im Gegensatz zu den gut untersuchten sekretorischen PLBs caPlb1p and caPlb2p scheint das caPlb5-Protein GPI-verankert und letztlich zellwandgebunden zu sein. Mittels Northernexpressions-Studien ließen sich in verschiedenen C.-albicans-Stämmen und unterschiedlichen Wachstumsbedingungen caPLB5-spezifische Transkripte nachweisen. Während des Hefe-Hyphe-Wechsels in Lee’s Medium zeigte sich interessanterweise eine differentielle Regulation der Gene caPLB5, caPLB1 and caPLB2. Durch Sequenzanalyse einzelner caPLB5-Allele konnte die Anwesenheit zweier unterschiedlicher Allele in C. albicans bei verschiedenen Stämmen nachgewiesen werden. Die gezielte Geninaktivierung beider Allele in zwei verschiedenen Stämmen resultierte in einer attenuierten Virulenz, was sich im Mausmodell für systemische Infektion anhand des Kolonisationsgrads des Wirtsgewebes messen ließ. Die Phänotypen sowohl der Nullmutanten als auch der caPLB5-Revertanten belegen, dass die Phospholipase B caPlb5p für die vollständige Virulenz des Pathogens benötigt wird und dabei eine Rolle bei der in vivo Organbesiedlung spielt. Diese Arbeit präsentiert zudem die Isolierung und Charakterisierung des ATP-Binding-Cassette-(ABC)-Transporter-Gens caMLT1 aus C. albicans. CaMlt1p zählt zur MRP/CFTR-Unterfamilie ATP-bindender Transportproteine, eine Proteinkategorie, die in diesem Pilz bislang noch nicht beschrieben wurde. Energiebetriebene Transportproteine der ABC-Superfamilie schleusen eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate aktiv durch biologische Membranen und erfüllen dabei wichtige Funktionen im zellulären Metabolismus und in der Entgiftung. Das caMlt1-Protein zeigt hohe sequenzielle und strukturelle Ähnlichkeiten zu den vakuolaren Efflux-Pumpen Ycf1p und Bpt1p von S. cerevisiae. Durch genomische Markierung mit dem grün fluoreszierenden GFP-Protein konnte caMlt1p in der vakuolaren Membran lokalisiert werden. Northernblothybridisierungen belegten die Induzierbarkeit der Gentranskripte durch die metabolischen Gifte Cadmium und CDNB, beides Substrate der scYcf1-Pumpe. Obwohl diese Untersuchungen darauf hindeuten, dass caMlt1p ein Ortholog von scYcf1p sein könnte, zeigte sich bei dem Komplementationsversuch einer scycf1-negativen S.-cerevisiae-Mutante mit einer caMLT1-Genkopie keine Reversion des sensitiven Phänotyps gegenüber Cadmium oder CDNB. Auch wiesen die in dieser Arbeit konstruierten, camlt1-negativen Mutanten in C. albicans, die zur Identifizierung potentieller caMlt1p-Substrate eingesetzt wurden, keinen hypersensitiven Phänotyp gegenüber CdCl2, CDNB oder irgendeiner anderen getesteten inhibitorischen Substanz auf. CaMlt1p ist demzufolge kein funktionales Homolog von scYcf1p. Als vakuolar lokalisiertes Protein weist caMLT1 ein für diese Proteingruppe typisches Transkriptionsprofil auf. Die mRNA-Expression erfolgt dabei wachstumsphasenabhängig mit der höchsten Geninduktion während des Diauxic-Shifts, wenn ein Mangel an Glucose (und anderen Nährstoffen) im Medium entsteht. Eine generierte camlt1-Nullmutante war interessanterweise in einem murinen Peritonitismodell in ihrer Fähigkeit die Leber zu invadieren drastisch reduziert. Durch Reintegration einer funktionalen caMLT1-Genkopie konnte der Virulenzdefekt aufgehoben werden. CaMlt1p scheint in die Fähigkeit von C. albicans involviert zu sein an intestinale Organe adhärieren und Gewebebarrieren penetrieren zu können, möglicherweise durch Einbindung des Transporters in Stressantwort- und Detoxifikationsmechanismen. Beide Gene, caMLT1 und caPLB5, wurden auf zweierlei Weise inaktiviert: mittels einer klassischen Mutagenesemethode für C. albicans (dem URA3-Blaster-System im Ura--auxotrophen Stamm CAI4) und durch Entwicklung eines neuen dominanten Selektionssysstems. Die dominante Selektion basiert dabei auf der genomischen Insertion einer Einzelkopie eines mutierten caIMH3-Allels (MPAR), das Transformanten Resistenz gegenüber Mycophenolsäure (MPA) verleiht. Dieses System ermöglicht die genetische Manipulation von C. albicans Wildtypstämmen, wodurch die mühselige Konstruktion auxotropher und oft avirulenter Stämme nicht mehr nötig ist. N2 - A coordinated interplay of certain traits enables the opportunistic yeast Candida albicans to adapt to different environmental conditions and to colonize different niches of the human host. Secretion of hydrolyzing enzymes, like proteinases and phospholipases, is an important characteristic of C. albicans which is considered to be integral to pathogenesis. This study focuses on the functional characterisation of the caPLB5 gene, a new member of the phospholipase B multigene family with five putative members. In contrast to the well characterized secretory PLBs caPlb1p and caPlb2p, the putative caPlb5-protein is likely to be GPI-anchored and ultimately bound to the cell wall. Northern expression studies showed caPLB5-specific transcripts in several strains of C. albicans under each growth condition tested. Interestingly, differential regulation of caPLB5, caPLB1 and caPLB2 could be detected during the yeast to hyphae transition in Lee’s medium. Sequence analysis of single caPLB5 allels resulted in the identification of two different alleles in several strains of C. albicans. The targeted gene disruption of both alleles in two different strains resulted in attenuated virulence as measured by host tissue colonization in a mouse model of systemic infection. The phenotypes expressed by null mutants and revertant strains of caPLB5 indicate that the phospholipase is required for complete virulence of this pathogen by playing a role for in vivo organ colonization. This study further presents the isolation and characterisation of the ABC-transporter gene caMLT1 in C. albicans belonging to the MRP/CFTR-subfamily of ATP-binding casette (ABC) transporters, a class of proteins so far not described in this fungus. Energy-driven transport proteins within the ABC-superfamily actively transport a wide variety of substances across biological membranes and fulfill important functions in cellular metabolism and detoxification. The protein encoded by the caMLT1 gene shows high similarities to the vacuolar efflux-pumps Ycf1p and Bpt1p of S. cerevisiae. Genomic tagging with the green fluorescent protein (GFP) revealed vacuolar membrane localization of caMlt1p. Northern hybridisation experiments documented the inducibility of gene transcripts by the metabolic poisons cadmium and CDNB, which are also substrates of the scYcf1-pump. While caMlt1p could be an orthologue of scYcf1p, complementation of a scycf1-negative S. cerevisiae mutant with a caMLT1-gene copy did not reverse the sensitive phenotype to these toxins. Moreover, the construction of camlt1-negative mutants in C. albicans allowed for screening of substrates putatively transported by caMlt1p. These null mutants showed no hypersensitive phenotype to neither CdCl2 nor CDNB or any other tested inhibitory substances, hence caMlt1p is not a functional homologue of scYcf1p. The caMLT1 mRNA expression pattern is typical for a vacuolar gene, showing an extensively growth phase dependent regulation with the highest gene induction during the diauxic transition when glucose (and other nutrients) becomes limited. Most interestingly, a generated mlt1 null mutant showed a dramatic reduction in liver invasion in a mouse peritonitis model. Reintegration of a functional caMLT1 gene copy reverted the virulence defect. CaMlt1p seems to be involved in the capability of C. albicans to adhere to the intestinal organs and penetrate tissue barriers putatively because of its involvement in mechanisms of stress response and detoxification. Both genes, caMLT1 and caPLB5, were inactivated by using a classical disruption method for C. albicans (the URA3-Blaster-system in Ura- auxotrophic strain CAI4) and by developing a new dominant selection system. Dominant selection is based on genomic insertion of a single copy of a mutated caIMH3 allel (MPAR) that renders transformants resistant to mycophenolic acid (MPA). Using this system, the cumbersome generation of auxotrophic strains, which are often avirulent, is obsolete, while C. albicans wild-type strains become amenable to genetic manipulation. KW - Candida albicans KW - Lysophospholipase KW - Virulenz KW - Gen KW - ABC-Transporter KW - Candida KW - albicans KW - Transporter KW - Phospholipase KW - Selektionsmarker KW - Candida KW - albicans KW - transporter KW - phospholipase KW - selectionmarker Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12905 ER - TY - THES A1 - Zeller, Daniel T1 - Konsequenzen progressiver trunkierender Mutationen des Transkriptionsfaktors RIM101 in Candida albicans für Wachstum und pH-abhängigen Dimorphismus T1 - Effects of successively truncated RIM101 allels in Candida albicans point to the role of a newly defined domain in regulating filamentation N2 - Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren. N2 - Among the environmental cues that influence morphological development in Candida albicans, the ambient pH has a defining role. The morphogenetic programme that is induced by this signal is termed “pH-regulated dimorphism”. In C. albicans the pH-response pathway activates Rim101p, which shows functional homologies to the transcription factors PacC of Aspergillus nidulans and Rim101p of Saccharomyces cerevisiae. Fundamental cell functions, including morphological development as well as cell wall biosynthesis are under the control of C. albicans-Rim101p. Insight into the roles of PHR1, PHR2 and the pH-response in polymorphism was gained through reversion analysis of homozygous phr2D mutants. Analyses of fourteen revertants demonstrated that they had acquired dominant activation mutations in RIM101 leading to premature stop codons. A null mutation of Efg1p was epistatic to the RIM101 mutation and suppressed filamentation but not RIM101 mediated activation of PHR1 expression. Thus, Rim101p effects are mediated both in an Efg1p-dependent and independent manner. We differentiated between RIM101 regions involved in the regulation of polymorphism from those controlling pH-dependent gene expression. We constructed 6 strains containing a carboxy-terminal truncated RIM101 gene by replacing codons 281, 305, 333, 385, 411 and 464 with nonsense codons. The replacement of codons 281, 305 and 333, located within or in proximity to the zinc-finger domain, did not allow growth at pH 4. Replacement of codons 385 and 411 resulted in strains which: (i) grew at pH 4, (ii) expressed the PHR1 gene at pH 4, but in contrast to mutagenesis of codon 464 (iii) were not able to filament at pH 4. These results suggest that the region located between codons 411 and 464 is essential for the Rim101p mediated induction of filamentation in C. albicans. In addition to beeing a regulator of morphological development, which is linked to pathogenesis, Rim101p also plays an important role in cell wall biosynthesis. Understanding the function of Rim101p in C. albicans will provide key insights into how these two fundamental processes are integrated. Besides the switch between growth forms, the secretion of aspartic proteases (SAPs) seems to be one of the important virulence factors in C. albicans. In order to provide an optimum adaption to different host niches, it is likely that various virulence factors are regulated in coordinated fashion by specific host signals. In the final part of this work, we started to investigate a potential role of Rim101p in regulating the expression of a set of SAP-genes. By using the URA3 gene of C. albicans as a reporter of gene expression, we tended to observe consequences of RIM101 mutations on the induction of SAP4, SAP5 and SAP6, which are members of a hypha-specific gene family. Linking the respective regulatory pathways of the known virulence factors might be a crucial step towards a comprehensive view of the pathogenetic process preceding candidiasis in humans. KW - Candida albicans KW - pH KW - RIM101 KW - Dimorphismus KW - Filamentierung KW - Candida albicans KW - pH KW - RIM101 KW - dimorphism KW - filamentation Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11223 ER -