TY - THES A1 - Trinks, Nora Isabel T1 - Super-resolution fluorescence microscopic visualization and analysis of interactions between human immune cells and \(Aspergillus\) \(fumigatus\) T1 - Hochaufgelöste, fluoreszenzmikroskopische Visualisierung und Analyse der Interaktionen zwischen humanen Immunzellen und \(Aspergillus\) \(fumigatus\) N2 - The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view. Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately. The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a “ring-shaped” structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species. A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein. Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells. In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM. N2 - Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist bekannt als Humanpathogen und kann lebensbedrohliche Infektionen bei Menschen mit einem geschwächten Immunsystem verursachen. Dies ist eine bekannte Komplikation bei Patienten die Glucocorticoide erhalten, z.B. nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation oder soliden Organtransplantation. Obwohl die Forschung im Bereich der Immunzelle/Pilz Interaktion Schlüsselstrategien entdeckt hat, wie Immunzellen infektiöse Pilze bekämpfen, ist unser Wissen immer noch unvollständig. Um effektive Therapieoptionen gegen Pilzinfektionen zu entwickeln, ist ein detailliertes Verständnis ihrer Interaktionen äußerst wichtig. Die Visualisierung von Immunzelle und Pilz ist daher ein exzellenter Ansatz um weitere Erkenntnisse zu gewinnen. Für einen detaillierten Einblick in solche Interaktionsprozesse ist eine hohe optische Auflösung im Nanometerbereich erforderlich. Hierzu gibt es eine Vielzahl an hochauflösenden Mikroskopietechniken, die es ermöglichen, Fluoreszenzbildgebung jenseits der Beugungsbegrenzung zu erzielen. Diese Arbeit kombiniert die Nutzung von drei sich ergänzenden hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die Interaktion von Immunzelle/Pilz aus verschiedenen Blickwinkeln zu studieren. Ziel dieser Arbeit ist das Einführen der kürzlich entwickelten Bildgebungsmethode, namens Expansions-Mikroskopie (engl. expansion microscopy, kurz: ExM), um Immunzelle/Pilz Interaktionen zu studieren. Kernaspekt dieser Methode ist die physische Vergrößerung der Probe, wodurch der Abstand zwischen nahe beieinanderliegenden Proteinstrukturen vergrößert wird und diese daher separiert aufgenommen werden können. Die simultane Vergrößerung von primären humanen Natürlichen Killerzellen (engl. Natural Killer, kurz: NK) und A. fumigatus Hyphen wurde in dieser Arbeit mittels ExM etabliert. Durch Expansion der Immunologischen Synapse (engl. immunological synapse, kurz: IS), ausgebildet zwischen NK Zellen und A. fumigatus, konnte hier die Reorganisation von Bestandteilen des Zytoskeletts interagierender NK Zellen gezeigt werden. Darüber hinaus konnte eine Reorganisation des Mikrotubuli-organisierenden Zentrums (engl. microtubule-organizing center, kurz: MTOC) in Richtung Pilzhyphen, sowie eine Anreicherung von Aktin an der IS beobachtet werden. Außerdem konnte ExM genutzt werden, um lytische Granula von NK Zellen nach Degranulation zu visualisieren. Für das Lysosom-assoziierte Membranprotein 1 (engl. lysosome-associated protein 1, kurz: LAMP1) konnte nach Vergrößerung der Probe gezeigt werden, dass es Perforin umgibt. Unter Abwesenheit des Plasmamembran-exponierten Degranulations-Markers LAMP1 wurde oft eine „ringförmige“ Struktur für fluoreszenzmarkiertes Perforin beobachtet. Die Volumen Berechnung von lytischen Granula demonstrierte den Nutzen der ExM. Im Vergleich zu Analysen von Bildern vor Expansion, zeigten Analysen von Bildern nach Expansion zwei Verteilungen für die Volumengröße degranulierter und nicht-degranulierter NK Zellen. Zusätzlich unterstreicht diese Arbeit die Wichtigkeit, den Expansionsfaktor für eine Struktur aus jeder Spezies zu bestimmen, da Variationen für Expansionsfaktoren beobachtet wurden. Dieser Faktor sollte ebenso wie mögliche Proben-Deformationen in Betracht gezogen werden, wenn ExM genutzt wird, um die Interaktion zwischen zwei Spezies zu analysieren. Ein zweiter Fokus dieser Arbeit ist die Visualisierung eines chimärischen Antigenrezeptors (engl. chimeric antigen receptor, kurz: CAR), der ein Epitop auf der Zellwand von A. fumigatus erkennt. Strukturierte Beleuchtungs-Mikroskopie (engl. structured illumination microscopy, kurz: SIM) zeigte, dass der CAR Teil der Immunologischen Synapse von primären CAR-T Zellen und CAR-NK-92 Zellen ist. Eine Anreicherung des CARs, an der Interaktionsseite wurde beobachtet, so wie das Vorhandensein von Perforin. Die Anreicherung vom CAR an der Pilz-Hyphe wurde ferner durch automatisierte Lebend-Zell-Bildgebung interagierender CAR-NK-92 Zellen demonstriert, die ein fluoreszierendes Fusionsprotein exprimieren. Zusätzlich lieferte das Nutzen von direkter stochastischer optischer Rekonstruktions-Mikroskopie (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy, kurz: dSTORM) erste Einblicke in CAR Expressionslevel auf der basalen Membran von CAR-NK-92 Zellen, mit Einzelmolekül Empfindlichkeit. CAR Cluster Analysen zeigten eine heterogene CAR Dichte auf der basalen Membran transfizierter NK-92 Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit erstmals Einblicke in die Anwendung von ExM für die Untersuchung der Interaktion von primären humanen NK Zellen und A. fumigatus liefert. Zudem präsentiert die Thesis erste Einblicke hinsichtlich der Charakterisierung eines A. fumigatus-erkennenden CARs, unter Anwendung von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie, wie SIM oder dSTORM. KW - Mikroskopie KW - Konfokale Mikroskopie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Aspergillus fumigatus KW - Natürliche Killerzelle KW - Expansion Microscopy KW - Structured Illumination Microscopy Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266407 ER - TY - THES A1 - Etter, Sonja T1 - Einfluss von beruflicher \(Aspergillus\) \(fumigatus\)-Exposition auf die adaptive Immunantwort via ELISpot und Western Blot T1 - Effect of chronic occupational mold exposure on adaptive immune response via ELISpot and Western Blot N2 - Bereits in Vorstudien konnte dargelegt werden, dass eine signifikante Korrelation zwischen der T-Zell-Zytokin-Antwort und der berufs- bzw. umweltbedingten Schimmelpilzbelastung besteht. Ziel der vorliegenden Studie war, eine mögliche Kombination von Biomarkern ausfindig zu machen, die veränderte T-Zell-Antworten auf A. fumigatus- Antigene bei beruflich Exponierten im Vergleich zu Kontrollprobanden/-innen vorhersagen kann. Um geeignete Marker für das Bio-Monitoring zu finden, wurden zur T-Zell-Aktivierung ein myzeliales A. fumigatus - Lysat und 12 proteinogene Antigene in ELISpot-Versuchen für die Signaturzytokine IFN-γ (TH1), IL-5 (TH2) und IL-17A (TH17) der Haupt-TH-Subpopulationen getestet. Es zeigten sich bei den Biolandwirten/-innen erwartungsgemäß erhöhte TH1- und TH2-Antworten auf die Mehrzahl der verwendeten spezifischen A. fumigatus-Antigene, die möglicherweise eine Schimmelpilzbelastung serologisch nachweisbar machen. Insbesondere die spezifischen A. fumigatus-Antigene Aspf22, CatB und CipC konnten eine Trennschärfe zwischen den beiden Kohorten hinsichtlich ihrer IFN-γ- und IL-5-Zytokinantwort erzielen. Unterschiede in der TH17-Antwort aufgrund chronischer beruflicher Sporenbelastung ohne Krankheitskorrelat konnten nicht explizit festgestellt werden. Weiterhin ergab sich, dass erhöhte TH2-Immunreaktionen, sofern sie mit einer adäquaten TH1-gerichteten Immunantwort einhergehen und damit eine ausgeglichene TH2/TH1-Balance besteht, nicht zwangsläufig zu Hypersensitivitätserkrankungen führen. Im Vergleich zu Langzeitexponierten wurden teilweise überlappende TH-Zellfrequenzen bei beruflich exponierten Biolandwirten/-innen ermittelt. Welche entscheidende Rolle Treg-Zellen bei der Eindämmung überschießender Immunantworten einnehmen, kann hieraus erahnt werden. N2 - Preliminary studies have already set out a significant correlation between T-cell-cytokine-responses and professional and/or environmental mold contaminations. This study aimed for a possible combination of biomarkers to predict altered T-cell-responses to A. fumigatus- antigens in a defined professionally exposed cohort in comparison with controls. To find out suitable markers for the biomonitoring, T-cell-activation was performed with a mycelial A. fumigatus- lysate and 12 proteinaceous antigens in ELISpot assays with look at the main signature cytokines of T-helper cell subsets IFN-γ (TH1), IL-5 (TH2) and IL-17A (TH17). As immunoglobulins play an important role in pathophysiology and diagnostic of allergies, sera of the subjects were examined regarding IgE-specific antibodies against mycelial A. fumigatus - lysate and 12 proteinaceous antigens in Western Blot-technique. As expected, increased levels of TH1- and TH2-cytokine responses were found for a majority of examined specific A. fumigatus-antigens, which may help to verify mold exposure in a serological way. Differences in TH17-immune response in agricultural workers without a hypersensitivity disease has not been found. Furthermore, increased TH2-immune responses don’t necessarily lead to a pathologic value since it is followed by an adequate TH1-answer for upholding the TH2/TH1-balance. TH-frequencies of not occupational exposed individuals partly show overlaps with those of agricultural workers. Therefore, the important role of Treg-cells in containing extensive immune responses is conceivable. The specific A. fumigatus-antigens Aspf22, CatB and CipC are (in contrast to Aspergillus-lysate) able to drag selectivity in-between the two cohorts regarding their IFN- - and IL-5-cytokine response. Even though further investigations must be made, specific antigens are more suitable for exposition-analysis and, eventually, for the depiction of associated hypersensitivity diseases. The discrimination based on B-cell-triggered IgE- immune responses remains difficult, conceivably by reason of the subclinical status of the subjects. Solely Aspf3, which is already established in the Immuno-CAP-analysis, shows differential power. KW - Schimmelpilzallergie KW - Aspergillus fumigatus KW - Immunoblot KW - Hypersensitivität KW - Immunreaktion KW - ELISpot KW - adaptive Immunantwort KW - chronische berufliche Exposition KW - Hypersensitivitätsreaktion KW - T-Helfer-Zellen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348582 ER -