TY - THES A1 - Zeller, Laura T1 - Auditorisches Hirnstamm-Implantat bei Neurofibromatose Typ 2: Charakteristika der elektrisch evozierten auditorischen Potentiale und deren Bedeutung für den Hörerfolg T1 - Auditory brainstem implants: intraoperative electrophysiology and hearing outcome N2 - Auditorische Hirnstammimplantate (ABI stellen die einzige Option der Hörrehabilitation bei bilateraler retrocochleärer Ertaubung dar. Die Implantate sind insbesondere in ihrer größten Nutzergruppe - Neurofibromatose Typ 2 Patienten - für ihr sehr variables Hörergebnis bekannt. Die Evozierbarkeit und die Qualität der intraoperativ abgeleiteten elektrisch evozierten auditorischen Hirnstammantworten wird als möglicher Einflussfaktor auf das Outcome diskutiert. Bisher gelten weder für die Frage des Einsatzes an sich, noch für die Methodik oder die Analyse und Bewertung der EABR in der ABI-Chirurgie einheitliche Konzepte. Ziel dieser Studie ist die detaillierte Analyse der intraoperativ registrierten EABR während ABI-Implantation bei NF2-Patienten. Zudem stellt Beurteilung der Hörfunktion mit ABI bei NF2-Patienten stellt aufgrund oftmals begleitender Symptomatik der Grunderkrankung eine besondere Herausforderung dar. Sprachtests allein spiegeln die Hörfunktion in dieser Patientengruppe nicht immer umfassend wider. Die in dieser Studie angewendete Würzburger Skala für Implantat-Hören soll dieser Problematik gerecht werden, indem Ergebnisse eines etablierten Sprachtests mit der klinischen Kommunikationsfähigkeit kombiniert werden. Zusammenfassung der Hauptergebnisse: Nach intraoperativer Stimulation mittels ABI zeigten sich EABR-Antworten mit null bis 3 Vertex-positiven Peaks (P1, P2, P3), welche in dieser Kohorte im Mittel nach 0,42 ms (P1), 1,43 ms (P2) bzw. 2,40 ms (P3) auftraten. Eine 2-Peak Wellenform war in dieser Studie die am häufigsten beobachtete Morphologie (78,8%). Bei der Stimulation unterschiedlicher Elektrodenkontakte zeigten sich Unterschiede in der EABR-Wellenmorphologie. Alle Antworten konnten in eine der fünf Kategorien der Würzburger EABR-Klassifikation eingeordnet werden. Für die Latenz von P2 konnte eine statistisch signifikante Korrelation mit der Tumorausdehnung nach Hannover Klassifikation gezeigt werden. Die Einstufung des Hörergebnisses mit ABI in NF2 nach Ergebnis im MTP-Test und nach Kommunikationsfähigkeit im Alltag unterschied sich in 7 von 22 Fällen (31,2%) um eine Kategorie. Bei der Einordnung in die Würzburger Skala für Implantat-Hören zeigte sich nach Diskussion der divergenten Fälle in 2 Fällen die Kategorisierung zugunsten des Ergebnisses im MTP-Test und in 5 Fällen zugunsten des Ergebnisses der Kommunikationsfähigkeit im Alltag. Nützliches Hören mit ABI konnte in 95,5% der Patienten gezeigt werden, davon erzielten 68,2% Sprachverständnis. Die Auslösbarkeit reproduzierbarer intraoperativer EABRs konnte in 95,5% Hörvermögen hervorsagen. N2 - Auditory brainstem implants (ABI) are primarily designed for neurofibromatosis type 2 (NF2) patients with bilateral deafness due to schwannomas. These neuro-prosthetic devices bypass the auditory nerve and produce hearing sensations by direct stimulation of the cochlear nuclei (CN). This study investigates the importance of intraoperative electrically evoked auditory brainstem responses (EABR) with regards to the auditory outcome. Out of a prospectively collected series of ABI implantations from 2005 to 2019, 22 patients (10 male, 12 female) fulfilled inclusion criteria (min. age of 15 y, NF2 diagnosis) and were analysed retrospectively for EABR and hearing outcome. EABR analysis relied on the presence and number of vertex positive peaks P1, P2 and P3 at brainstem stimulation. For post-operative hearing outcome a new Clinical ABI Outcome Classification was developed and applied at 6 to 12 months containing 4 categories: Category 1, Star Performer, with >80% speech understanding in auditory only MTP (mono- to polysyllabic) test and ability for continuous spoken conversation without any lip reading; Category 2, Good Performer, with <40 to 80% in auditory only MTP test and some speech understanding combined with lip reading; Category 3, Useful Performance, communication with some additional measures (hearing, lip-reading and written notes) possible; Category 4 Non-useful Performance, no or only scarce sound reception. In 22 patients, 146 EABR recordings at various sites of the implant were evaluated: A three-peak-formation was present in 7, a two-peek-formation in 115 cases, and one-peak in 13 cases, while 11 remained without any reproducible responses. EABR wave forms showed some variation: Peak P1 mostly developed just out of or after the stimulus artefact while peaks P2 and P3 sometimes showed melting and larger latency differences. Peak P1 appears to correspond to wave III of natural auditory ABR. Overall auditory outcome was useful or better (Categories 1, 2 or 3) in 95.5 % of cases, with Star or Good Performance in about 68 % of the patients. Presence of EABR predicted auditory rehabilitation correctly in 95.5%. False positive EABR are rare and a matter of open discussion such as on lead dislocation or secondary brainstem nuclei degeneration. Overall, intra-operative reproducible EABR are highly predictive of adequate brainstem activation and useful hearing rehabilitation with ABI in deaf NF2 patients and appear indispensable for implant positioning. The most reliable peak P1 of EABR may represent immediate activity of cochlear nuclei. The importance of further peaks P2 and P3 and their anatomic correlation still need further evaluation and possibly correlation with more long-term auditory development. The presented ABI hearing classification uses the internationally accepted MTP test and proves to be a universal tool to elucidate the patient’s capacity for speech communication. KW - Neurofibromatose KW - Audiologie KW - Elektrophysiologie KW - Hörrehabilitation KW - Auditory brainstem implant KW - Neurofibromatose Typ 2 KW - Electric auditory brainstem response KW - Hörprothese Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303373 ER - TY - THES A1 - Wilhelmi, Kai Alexander T1 - Untersuchung von Veränderungen der myelinisierten Nervenfasern durch Entmarkung in Haut- und Nervenbiopsien von Patienten mit Polyneuropathie T1 - Examination of changes in myelinated nerve fibers due to demyelination in skin and nerve biopsies of patients with polyneuropathy N2 - In dieser Arbeit wurde durch das immunhistochemische Anfärben von nodalen (Natriumkanäle, NF), paranodalen (Caspr, NF) und internodalen (MBP) Proteinen der in Fingerhautbiopsien vorhanden Nervenfasern untersucht, ob eine Veränderung der typischen Verteilungsmuster dieser Proteine, eine demyelinisierende Polyneuropathie anzeigen kann. Dazu wurden am Universitätsklinikum Würzburg prospektiv 93 Polyneuropathie-Patienten und 25 Kontrollpersonen rekrutiert. Bei allen Patienten wurden Hautstanzbiospien am Zeigefinger durchgeführt. Bei 35 Patienten mit schweren oder unklaren Verläufen, wurden konsiliarisch Nervus suralis Biopsien durchgeführt. Aus einem Abschnitt von 27 dieser Biopsien, konnten im Rahmen dieser Arbeit Zupfnervenpräparate angefertigt und analog zu den Hautbiopsien ausgewertet werden. Aus der Routinediagnostik der Klinik flossen weiterhin die Ergebnisse der elektrophysiologischen Routinediagnostik und der Histologiebefund der Nervus suralis Biopsien in die Auswertung ein. Zusammenfassend kamen veränderte Natriumkanalbanden in Fingerhautbiopsien signifikant häufiger bei Patienten mit elektrophysiologisch als demyelinisierend befundeten Polyneuropathien, als bei Patienten mit elektrophysiologisch als axonal befundeten Polyneuropathien vor. Vielfach fanden sich veränderte Natriumkanalbanden inmitten para- und internodal unauffälliger Schnürringe und umgekehrt. Diese Beobachtung stützt die bereits in Vorarbeiten vorgeschlagene und in der aktuellen Leitlinie zur Diagnostik für Polyneuropathien aufgegriffene Entität der Paranodopathien (Uncini, Susuki, & Yuki, 2013). Möglich wäre, dass eine veränderte Verteilung der Natriumkanäle die schnelle Leitfähigkeit beeinträchtigen und somit trotz intakter Bemarkung, elektrophysiologisch das Bild einer demyelinisierenden Neuropathie vermittelt. Ein direkter Zusammenhang zwischen dem Auftreten von doppelten und verlängerten Natriumkanalbanden und einzelnen Messwerten (z.B. Amplituden und Latenzzeiten) fand sich nicht. Auch in den Zupfnervenpräparaten der Nervus suralis Biopsien, konnten o.g. Verteilungsmuster untersucht werden. Deren Vorkommen zeigte sich als unabhängig vom elektrophysiologischen und histologischen Befund, von der Ätiologie der PNP und von den gefundenen Veränderungen in den Hautbiopsien des betreffenden Patienten. N2 - Myelinated nerve fibers in finger skin biopsies and sural nerve biopsies were examined using immunohistochemical staining to detect changes in the typical distribution patterns of nodal (voltage-gated sodium channels, neurofascin 186), paranodal (Caspr, neurofascin 155), and internodal (myelin basic protein) proteins, aiming to identify indicators for demyelinating polyneuropathies. A total of 93 polyneuropathy patients and 25 control subjects were prospectively recruited from the University Hospital Würzburg. Skin punch biopsies were conducted on all patients and control subjects. Additionally, sural nerve biopsies were performed on a consultative basis for 35 patients. Teased nerve fiber preparations were made from a section of 27 of these biopsies and evaluated similarly to the skin biopsies. In summary, altered sodium channel bands in myelinated nerve fibers from finger skin biopsies were significantly more prevalent in patients electrophysiologically diagnosed with demyelinating polyneuropathies. However, there was no significant difference in the means of individual electrophysiological measurements between patients with and without changes in the immunohistochemical stainings. Each of the investigated changes was significantly more common in the polyneuropathy group than in the control group. Further correlations, particularly in the comparison of results from skin and sural nerve biopsies, were not found KW - Polyneuropathie KW - Ranvier-Schnürring KW - Entmarkung KW - Elektrophysiologie KW - Caspr KW - Neurofascin KW - MBP KW - spannungsgesteuerter Natriumkanal Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360046 ER - TY - THES A1 - Voß, Lena Johanna T1 - Änderungen der Membranspannung und der Osmolarität als Auslöser für Calciumsignale in Pflanzen – Studien an Schließzellen von Nicotiana tabacum und Polypodium vulgare T1 - Induction of Calcium Signals by Changes in Membrane Potential and Osmolarity – Studies on Guard Cells of Nicotiana tabacum and Polypodium vulgare N2 - Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt. N2 - Stomata are small pores in the leaf surface that allow plants to adapt their water balance to changing environmental conditions. The turgor pressure of the guard cells determines the width of the stomatal aperture and is regulated by ion fluxes in or out of the guard cell. A network of different signal transduction pathways is necessary for the adaption of stomatal movements to ambient conditions. Many of these transduction pathways have been described in detail and many of their components have been identified. It is a well known fact that calcium acts as a second messenger in pathways regulating stomatal movements. However, the mechanisms that lead to transient elevations of the cytosolic calcium concentration are largely unknown. The molecular basis of the regulation of stomatal aperture in non-angiosperm species is also poorly understood. In order to gain new insights into these topics, mechanisms of calcium elevation and electrophysiological properties of guard cells were studied, focussing especially on the visualization of the cytosolic calcium concentration in guard cells. In the first part of this study, the application of hyperpolarizing voltage pulses by means of TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) was used to specifically trigger an increase in the cytosolic calcium concentration in individual guard cells in the angiosperm model plant Nicotiana tabacum. To visualize the dynamics of the cytosolic calcium concentration with high temporal and spatial resolution, a spinning disc system for confocal imaging was used simultaneously with the electrophysiological recordings. During the application of hyperpolarizing voltage pulses a transient increase in cytosolic volume was observed. This increase can be explained by an osmotically driven water flux caused by changes of the cytosolic ion concentration. These in turn are caused by the voltage-dependent activation of inward rectifying potassium channels in the guard cell plasma membrane and by the compensating current from the impaled microelectrode. Using the calcium-sensitive dye Fura-2, it could be shown that two mechanisms lead to the elevation of the cytosolic calcium concentration during the application of hyperpolarizing voltage pulses. The first mechanism is the activation of hyperpolarization-activated calcium permeable channels (HACCs) in the plasma membrane, which has already been described in 1998 by Grabov & Blatt. In addition to this mechanism of calcium release, a second previously unknown mechanism was discovered in which calcium is released into the cytosol from intracellular stores. This mechanism is related to the increase in cytosolic volume we described above and is probably caused by changes in membrane tension or osmolarity within the cell. These changes could lead to an activation of mechanosensitive calciumpermeable channels. The second part of this thesis deals with the molecular basis of the regulation of stomata in non-angiosperms. In guard cells of Polypodium vulgare voltage-dependent currents across the plasma membrane similar to those described in angiosperm model plants could be measured using TEVC. Furthermore, the application of hyperpolarizing voltage pulses induced increases in cytosolic calcium concentration in guard cells of Polypodium and Asplenium indicating the existence of voltage-dependent calcium permeable channels in the plasma membrane. The diffusion of iontophoretically injected fluorescent dyes into the neighboring guard cells in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris and Selaginella showed that in these species a symplastic connection between neighboring guard cells exists, which could not be observed in guard cells of angiosperms. Electron microscopic images of Polypodium glycyrrhiza guard cells showed that this connection is probably formed by plasmodesmata between adjacent guard cells. Analysis of the calcium dynamics in neighboring guard cells after hyperpolarizing voltage pulses revealed that calcium homeostasis seems to be regulated independently in both guard cells despite their symplastic connection. As part of the investigations on guard cells of ferns, a new method for the application of ABA was established, which allows the phytohormone to be charged iontophoretically into the apoplast with the aid of microelectrodes. In contrast to the guard cells of Nicotiana tabacum, which reacted with loss of turgor and subsequential stomatal closure to this method of ABA-application, no closure of the stomata could be induced in Polypodium vulgare in this way. However, since the ABA response of fern stomata is also dependent on other factors such as growth conditions (Hõrak et al., 2017), an ABA-responsiveness in this fern species can still not be completely excluded. The release of calcium from intracellular stores, as shown in this work, could play an important role for the regulation of stomatal aperture. To clarify this question, the identification of the channels involved in osmotically/mechanically induced calcium release from internal stores would be of great interest. Further studies on fern guard cells could clarify the physiological significance of ion channels known from angiosperms for the stomatal movements in early land plants, and thus contribute significantly to the understanding of the evolution of stomatal regulation. In addition, the question arises as to what role the symplastic connection of the neighboring guard cells through plasmodesmata plays for the function of stomata. KW - Schließzelle KW - Nicotiana tabacum KW - Polypodium vulgare KW - Calcium Imaging KW - Elektrophysiologie KW - Schließzellen KW - Farne KW - Abscisinsäure KW - Oregon Green-BAPTA KW - Fura-2 KW - Hyperpolarisierung KW - guard cells KW - ferns KW - abscisic acid KW - hyperpolarisation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219639 ER - TY - THES A1 - Vetter, Sebastian T1 - Elektrophysiologische Charakterisierung von STIM2-Knock-Out-Mäusen T1 - Electrophysiological characterization of STIM2 knockout mice N2 - Um eine mögliche elektrophysiologische, kardiale Ursache für den plötzlichen Tod von STIM2 Knock-Out Mäusen zu prüfen, wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung mittels Ruhe- und Stress-EKG, telemetrischem Langzeit-EKG sowie Elektrophysiologischer Untersuchung durchgeführt. Hierbei konnte keine kardial-elektrophysiologische Grundlage für den plötzlichen Tod dieser Tiere gefunden werden. N2 - For testing a possible electrophysiological, cardiac reason for the sudden death of STIM2 knockout mice, a electrophysiological characterization was performed by use of resting and stress ecg, telemetric long-term ecg and electrophysiology study. In this study couldn't be found any cardiac electrophysiological cause for the sudden death of these animals. KW - Knock-Out KW - Knockout KW - Elektrophysiologie KW - Maus KW - Maus KW - Kardiologie KW - Elektrophysiologische Untersuchung KW - STIM2 KW - STIM2 KW - electrophysiology study KW - electrocardiography KW - telemetry KW - ecg Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77005 ER - TY - THES A1 - Unterlauft, Jan Darius T1 - Optimierung der Reizmuster zur Bestimmung des kortikalen Aktivitätsbeginns bei multifokal evozierten Potenzialen (mfVEP) T1 - Optimizing stimuli for measurement of the start of activity in multifocal visual evoked potentials (mfVEP) N2 - No abstract available KW - Elektrophysiologie KW - mfVEP KW - frühe Latenz KW - Aktivitätsbeginn KW - Elektrophysiologie KW - mfVEP KW - frühe Latenz KW - Aktivitätsbeginn KW - elektrophysiology KW - mfVEP KW - early latency Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27245 ER - TY - THES A1 - Ullrich, Sybille T1 - Biochemische und biophysikalische Analyse der strukturellen Integrität von Channelrhodopsin 2 und dessen Mutanten T1 - Biochemical and biophysical analysis of the structural integrity of Channelrhodopsin 2 and its mutants N2 - Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii gehört zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine (Typ1-Rhodopsine). ChR2 besteht aus einem extrazellulär gelegenen N-Terminus, 7 Transmembranhelices und einem zytosolisch gelegenen C-Terminus. Der lichtreaktive Bestandteil (Chromophor) all-trans-Retinal ist via Schiff´ Base kovalent an ein Lysinrest der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei Applikation von Blaulicht isomerisiert all-trans- zu 13-cis-Retinal, was in einer Konformationsänderung und dem Öffnen des Kanals resultiert. Abhängig vom elektrochemischen Gradienten können ein- und zweiwertige Kationen in die Zelle ein- oder aus der Zelle herausströmen. Eine retinalabhängige Stabilität konnte bereits für Bakteriorhodopsin (BR) bestätigt werden (Booth, Farooq et al. 1996, Turner, Chittiboyina et al. 2009, Curnow and Booth 2010), bezüglich ChR2 waren bisher nur wenige Daten verfügbar (Hegemann, Gartner et al. 1991, Lawson, Zacks et al. 1991). Die heterologe Expression von wildtypischem und modifiziertem ChR2 in Oozyten von X. laevis erlaubte einen detaillierteren Einblick in die retinalabhängige Stabilität und pH-abhängige Dunkelleitfähigkeit von Guanidinium. Wildtypisches Chop2 zeigte bei Zugabe von Retinal zum Inkubationsmedium, direkt nach RNA-Injektion, Stromamplituden im µA-Bereich und deutliche Fluoreszenzintensitäten. Ausschließlich endogen vorhandenes Retinal hatte verminderten Fluoreszenzen und Stromamplituden zur Folge, was auf ein geringes Vorhandensein von Chop2-Proteinen in der Plasmamembran hindeutete. Da die Inkubation über Nacht in retinalsupplementierter Lösung nur eine minimale Erhöhung des resultierenden Stromes erbrachte, deuten die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stark auf eine verminderte Stabilität des Proteins bei fehlender Bindung des Kofaktors Retinal. Das Einfügen einer aromatischen Aminosäure (Y/F/W) an Position 159 führte zu einer, von der Retinalsupplementation unabhängigen, in beiden Ansätzen gleichwertigen Expressionsstärke. Diese äusserte sich in äquivalenten Fluoreszenzintensitäten. Die erhaltenen Stromamplituden wiesen eine starke Differenz auf: ohne Zugabe zusätzlichen Chromophors lag die Stromstärke bei nur wenigen Nanoampere, die bei Inkubation in einer retinalhaltigen Lösung über Nacht auf das Niveau von retinalsupplementierten Oozyten anstieg. Des Weiteren konnte die Zunahme der Stromamplitude innerhalb von 15 Minuten beobachtet werden, wenn die vermessenen Oozyten mit einer retinalhaltigen Lösung perfundiert wurden. Zusammengefasst weisen die Ergebnisse auf eine Stabilisierung des aromatisch substituierten Proteins hin. Bei der von Berndt et al. (2011) beschriebenen Mutante T159C konnten diese Eigenschaften nicht nachgewiesen werden. Die Modifikation der Retinalbindestelle (K257) in Verbindung mit einer aromatischen Substitution an Position 159 resultierte in deutlichen Fluoreszenzintensitäten, unabhängig von der Retinalverfügbarkeit bei, in beiden Fällen, fehlenden lichtaktivierten Strömen. Diese und die gleichwertigen Bandenstärken des Proteinimmunoblots von aromatisch substituierten ChR2-Varianten unterstützen die Hypothese der retinalunabhängigen Stabilität zusätzlich. Die Ergebnisse legen, im Falle von Chop2-WT, eine Degradation des Apoproteins nahe. Bei Einfügen einer aromatischen AS an Position 159 ist das Apoprotein davor geschützt (siehe Abb. 75). Infolge der strukturellen Similarität, dem Vorhandensein delokalisierter π-Elektronen und der räumlichen Größe der aromatischen AS ist eine strukturelle Veränderung des Apoproteins denkbar, die eine Degradation aufgrund von nunmehr unzugänglichen Ubiquitinierungsstellen verhindert. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass sich bei fehlender Bindung des Kofaktors Wassermoleküle in der Nähe der Bindetasche befinden, welche von umliegenden Aminosäuren (u.a. T159, D156) unter großem Energieaufwand koordiniert werden und die strukturelle Integrität bis hin zur Degradation beeinträchtigen können. Dies könnte durch eine Erhöhung der Hydrophobizität bei Einfügen einer aromatischen Aminosäure verhindert werden. Bei Substitutionen durch eine aromatische AS (Y/W/F) an Position 159 zeigte sich ein weiteres, bisher nicht beschriebenes, Charakteristikum. Bei Perfusion der Oozyten mit einer guanidiniumhaltigen Lösung, konnten in Abhängigkeit des pH-Wertes ohne die Applikation von Licht Stöme im µA Bereich aufgezeichnet werden. Die Größe der Stromamplitude korreliert hierbei mit dem Anstieg des pH-Wertes und der Konzentration an Guanidiniumionen der perfundierten Lösung und kann durch das Hinzufügen von 1mM Lanthan reversibel geblockt werden. Des Weiteren konnten die vorgenommenen Messungen die Ergebnisse der retinalabhängigen Degradation verifizieren, da der Einstrom von Gua+ sowohl bei retinalsupplementierter Inkubation, als auch bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal zu beobachten war. Des Weiteren zeigte auch die Doppelmutante T159Y/K257R trotz ihres Unvermögens Retinal zu binden, die beschriebenen lichtunabhängigen Ströme. Die Ergebnisse bei Substitution durch Phenylalanin (F) stellen eine Abweichung des Musters dar. Bei Inkubation von T159F-injizierten Zellen bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal konnte eine stark erhöhte Guanidiniumleitfähigkeit festgestellt werden, diese kam jedoch bei retinalsupplementierter Inkubation nicht zum Tragen. Dies könnte ein Hinweis auf eine sterische Hinderung durch das gebundene Chromophor sein, die bei den Substitutionen durch Tyrosin und Tryptophan, möglicherweise durch unterschiedliche chemische Eigenschaften der AS, nicht auftreten. Die hervorgerufene pH-Abhängigkeit kann in zwei möglichen Ursachen begründet liegen: • Vorhandensein einer (de)protonierbaren Gruppe wie Histidin, Arginin oder Lysin, die als pH-Sensor dienen könnte • Deprotonierung der Schiff´ Base durch Guandininium Das Vorhandensein eines pH-Sensors konnte durch die vorgenommenen Modifikationen von H114, R115, R120 und H249 nicht bestätigt werden. Bei Substitution von K257 (in Verbindung mit T159Y) zu Arginin (R) konnte weiterhin ein pH-abhängiger Gua+-Dunkelstrom festgestellt werden. Die Modifikation zu Alanin (A) oder Glutamin (Q) hingegen resultierte im Ausbleiben der Ströme. Der Austausch einer basischen zu einer neutralen Gruppe ohne protonierbaren Rest deutet auf die Beteiligung der Schiff´ Base bzw. der Aminosäure an Position 257 am Mechanismus der Dunkelleitfähigkeit hin. N2 - Channelrhodopsin 2 (ChR2) from the eyespot of C. rheinhardtii belongs to the group of microbial-type rhodopsins (Type1-rhodopsins). It consists of an extracellular N-terminus, seven transmembranehelices and a cytosolic C-terminus. The light-reactive element (Chromophor) all-trans-retinal is covalently bound to a lysine of the seventh transmembrane helix via Schiff´ Base. The isomerisation from all-trans- to 13-cis-Retinal after illumination leads to a conformational change within the protein, resulting in the opening of the channel and thereby in an in- or efflux of mono- and divalent cations, depending on the electrochemical gradient. For bacteriorhodopsin (BR) a retinal dependent stability could be confirmed (Booth, Farooq et al. 1996, Turner, Chittiboyina et al. 2009, Curnow and Booth 2010), concerning ChR2 only limited data is available (Hegemann, Gartner et al. 1991, Lawson, Zacks et al. 1991). Heterologous expression of wildtype (WT) and mutant ChR2 in the oocytes of X. laevis revealed a more detailed insight into retinal dependent stability and pH-dependent conductance of guanidinium without the application of light. ... KW - Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin 2 KW - Rhodopsin KW - Induzierte Mutation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92006 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Nadine T1 - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen T1 - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates N2 - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht. Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht. Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat. Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren. Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen. Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein. N2 - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species. In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera. To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate. Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions. To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops. Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms. KW - Dattelpalme KW - Gerste KW - Elektrophysiologie KW - Hitzestress KW - Schließzelle KW - Anionenkanal KW - Zuckertransporter KW - SLAC1 KW - SUT1 KW - Signaltransduktion KW - ZmSUT1 KW - Phoenix dactylifera KW - Hordeum vulgare KW - Zea mays Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491 ER - TY - THES A1 - Schmalz, Fabian Dominik T1 - Processing of behaviorally relevant stimuli at different levels in the bee brain T1 - Die Verarbeitung verhaltensrelevanter Stimuli auf unterschiedlichen Ebenen im Bienengehirn N2 - The behavior of honeybees and bumblebees relies on a constant sensory integration of abiotic or biotic stimuli. As eusocial insects, a sophisticated intraspecific communication as well as the processing of multisensory cues during foraging is of utter importance. To tackle the arising challenges, both honeybees and bumblebees have evolved a sophisticated olfactory and visual processing system. In both organisms, olfactory reception starts at the antennae, where olfactory sensilla cover the antennal surface in a sex-specific manner. These sensilla house olfactory receptor neurons (ORN) that express olfactory receptors. ORNs send their axons via four tracts to the antennal lobe (AL), the prime olfactory processing center in the bee brain. Here, ORNs specifically innervate spheroidal structures, so-called glomeruli, in which they form synapses with local interneurons and projection neurons (PN). PNs subsequently project the olfactory information via two distinct tracts, the medial and the lateral antennal-lobe tract, to the mushroom body (MB), the main center of sensory integration and memory formation. In the honeybee calyx, the sensory input region of the MB, PNs synapse on Kenyon cells (KC), the principal neuron type of the MB. Olfactory PNs mainly innervate the lip and basal ring layer of the calyx. In addition, the basal ring receives input from visual PNs, making it the first site of integration of visual and olfactory information. Visual PNs, carrying sensory information from the optic lobes, send their terminals not only to the to the basal ring compartment but also to the collar of the calyx. Receiving olfactory or visual input, KCs send their axons along the MB peduncle and terminate in the main output regions of the MB, the medial and the vertical lobe (VL) in a layer-specific manner. In the MB lobes, KCs synapse onto mushroom body output neurons (MBON). In so far barely understood processes, multimodal information is integrated by the MBONs and then relayed further into the protocerebral lobes, the contralateral brain hemisphere, or the central brain among others. This dissertation comprises a dichotomous structure that (i) aims to gain more insight into the olfactory processing in bumblebees and (ii) sets out to broaden our understanding of visual processing in honeybee MBONs. The first manuscript examines the olfactory processing of Bombus terrestris and specifically investigates sex-specific differences. We used behavioral (absolute conditioning) and electrophysiological approaches to elaborate the processing of ecologically relevant odors (components of plant odors and pheromones) at three distinct levels, in the periphery, in the AL and during olfactory conditioning. We found both sexes to form robust memories after absolute conditioning and to generalize towards the carbon chain length of the presented odors. On the contrary, electroantennographic (EAG) activity showed distinct stimulus and sex-specific activity, e.g. reduced activity towards citronellol in drones. Interestingly, extracellular multi-unit recordings in the AL confirmed stimulus and sex-specific differences in olfactory processing, but did not reflect the differences previously found in the EAG. Here, farnesol and 2,3-dihydrofarnesol, components of sex-specific pheromones, show a distinct representation, especially in workers, corroborating the results of a previous study. This explicitly different representation suggests that the peripheral stimulus representation is an imperfect indication for neuronal representation in high-order neuropils and ecological importance of a specific odor. The second manuscript investigates MBONs in honeybees to gain more insights into visual processing in the VL. Honeybee MBONs can be categorized into visually responsive, olfactory responsive and multimodal. To clarify which visual features are represented at this high-order integration center, we used extracellular multi-unit recordings in combination with visual and olfactory stimulation. We show for the first time that information about brightness and wavelength is preserved in the VL. Furthermore, we defined three specific classes of visual MBONs that distinctly encode the intensity, identity or simply the onset of a stimulus. The identity-subgroup exhibits a specific tuning towards UV light. These results support the view of the MB as the center of multimodal integration that categorizes sensory input and subsequently channels this information into specific MBON populations. Finally, I discuss differences between the peripheral representations of stimuli and their distinct processing in high-order neuropils. The unique activity of farnesol in manuscript 1 or the representation of UV light in manuscript 2 suggest that the peripheral representation of a stimulus is insufficient as a sole indicator for its neural activity in subsequent neuropils or its putative behavioral importance. In addition, I discuss the influence of hard-wired concepts or plasticity induced changes in the sensory pathways on the processing of such key stimuli in the peripheral reception as well as in high-order centers like the AL or the MB. The MB as the center of multisensory integration has been broadly examined for its olfactory processing capabilities and receives increasing interest about its visual coding properties. To further unravel its role of sensory integration and to include neglected modalities, future studies need to combine additional approaches and gain more insights on the multimodal aspects in both the input and output region. N2 - Honigbienen und Hummeln sind aufgrund ihrer Lebensweise auf die ständige Verarbeitung sensorischer Eindrücke abiotischen und biotischen Ursprungs angewiesen. Als eusoziale Insekten ist hierbei für beide Arten die Wahrnehmung innerartlicher Kommunikation wie auch die Verarbeitung multisensorischer Einflüsse während der Nahrungssuche von essenzieller Bedeutung. Um die daraus resultierenden vielfältigen Herausforderungen erfolgreich bewältigen zu können, verfügen Honigbienen und Hummeln über eine fortschrittliche Verarbeitung olfaktorischer und visueller Reize. In beiden Arten beginnt die Geruchsrezeption an den Antennen, welche geschlechtsspezifisch von zahlreichen olfaktorischen Sensillen besetzt sind. Diese beinhalten olfaktorische Rezeptorneurone (ORN), in welchen die Expression der Geruchsrezeptoren stattfindet. Axone der ORNs laufen dabei gebündelt über vier verschiedene Trakte in den Antennallobus (AL), das erste olfaktorische Verarbeitungszentrum im Bienengehirn. Im AL verschalten ORNs mit lokalen Interneuronen und Projektionsneuronen (PN) in kugelförmigen Strukturen, den sogenannten Glomeruli. PNs leiten die olfaktorische Information daraufhin über zwei charakteristische Trakte, den medialen und lateralen Antennallobustrakt, in den Pilzkörper (MB), das Verarbeitungszentrum für die Integration sensorischer Eindrücke und Gedächtnisbildung. Im Calyx der Honigbiene, der sensorischen Eingangsregion des MB, bilden die Endköpfchen der PNs synaptische Verbindungen mit Kenyonzellen (KC), den primären Nervenzellen im MB. Die Innervation des Calyx durch die PNs ist dabei spezifisch in drei verschiedenen Zonen organisiert, nämlich in Lippe, Hals und basalen Ring. Während die Lippe vornehmlich olfaktorische Information von PNs aus dem AL erhält, wird der basale Ring zusätzlich auch von visuellen PNs, welche Informationen aus dem optischen Lobus einbringen, angesteuert. Der basale Ring der Honigbiene wird dabei Ort der ersten räumlichen Integration visuellen und olfaktorischen Eingangs. Wiederum ähnlich zum unimodalen Eingang der Lippe, bezieht auch der Hals des Calyx grundsätzlich nur sensorischen Eingang einer Modalität, nämlich visuelle Information von PNs aus dem optischen Lobus. KCs verschalten im weiteren Verlauf die olfaktorischen und visuellen Informationen an Pilzkörperausgangsneurone (MBON). In einem bisher kaum erforschten Vorgang wird diese multimodale Information dabei verarbeitet und dann mithilfe der MBONs in verschiedene Bereiche des Gehirns geleitet, z.B. in die protocerebralen Loben, die kontralaterale Gehirnhemisphäre oder das Zentralgehirn. Diese Dissertation ist zweigeteilt und behandelt zuerst (i) die geschlechtsspezifische Verarbeitung olfaktorischer Reize in Hummeln und bespricht im zweiten Teil (ii) neue Einblicke in die neuronale Weiterverarbeitung visueller Reize durch MBONs in der Honigbiene. Manuskript 1 untersucht die Abläufe der Geruchsverarbeitung von Bombus terrestris und beschreibt geschlechtsspezifische Unterschiede. Hierbei wurden sowohl verhaltensbasierte als auch elektrophysiologische Methoden genutzt um die Wahrnehmung ökologisch relevanter Duftstoffe (Komponenten unterschiedlicher Pflanzendüfte oder Pheromone) auf drei verschiedene Weisen zu untersuchen, nämlich in der Peripherie, im AL und mittels olfaktorischer Konditionierung. Wir fanden in beiden Geschlechtern eine robuste Gedächtnisbildung nach absoluter Konditionierung und eine ausgeprägte Generalisierung anhand der Kohlenstoffkettenlänge der präsentierten Duftstoffe. Anders stellten sich die Ergebnisse der elektroantennographischen (EAG) Untersuchungen dar. Hier zeigten sowohl Drohnen als auch Arbeiterinnen neuronale Aktivität mit spezifischen Unterschieden zwischen den Stimuli, aber auch zwischen den Geschlechtern auf, z.B. löste die Applikation von Citronellol eine deutliche verringerte Reaktion in der EAG Aktivität der Drohnen aus. Interessanterweise zeigten auch extrazelluläre Ableitungen im AL stimulus- und geschlechtsspezifische Unterschiede, jedoch in unterschiedlicher Konstellation als in den EAG-Experimenten. Besonders Farnesol und 2,3-Dihydrofarnesol wiesen vor allem bei Arbeiterinnen eine deutliche Repräsentation in der neuronalen Aktivität auf; ein Alleinstellungsmerkmal welches für Farnesol bereits in einer früheren Studie beschrieben wurde. Diese explizit unterschiedliche neuronale Darstellung von Farnesol und 2,3-Dihydrofarnesol in der Peripherie und im AL führt zu der Annahme, dass die rezeptive Darstellung eines Stimulus in der Peripherie keine zuverlässigen Rückschlüsse über die neuronale Repräsentation in höheren Zentren oder die ökologische Relevanz zulässt. Im zweiten Manuskript stehen MBONs der Honigbiene im Fokus, um mehr Einblicke in die visuelle Verarbeitung im VL zu erlangen. Bisher können MBONs in folgende Klassen unterteilt werden: Visuelle, olfaktorische und multimodale MBONs, welche sensitiv für beide Modalitäten sind. Kern dieser Arbeit ist, mittels extrazellulärer Ableitungen festzustellen, welche zusätzlichen Aspekte eines visuellen Stimulus in diesem zentralen Verarbeitungszentrum repräsentiert sind. Dabei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Informationen über die Wellenlänge und die Intensität des Lichtstimulus im VL erhalten sind. Im weiteren Verlauf konnte eine Spezifizierung der bisherigen Kategorisierung visueller und multimodaler MBONs in drei weitere Untergruppen vollzogen werden: MBONs die spezifisch die Intensität, die Identität und dein Eingang eines Stimulus kodieren. Des Weiteren zeigte vor allem die Gruppe der Identitäts-MBONs eine bemerkenswerte Kategorisierung von UV-Licht. Diese neuen Erkenntnisse bestätigen die Ansicht, dass der MB, als Zentrum für sensorische Integration, eine Kategorisierung der verarbeiteten Eindrücke vornimmt und diese daraufhin auf die MBONs verschalten wird. Abschließend diskutiere ich Unterschiede in der peripheren Repräsentation von Stimuli und ihrer späteren neuronalen Verarbeitung. Hier zeige ich, die Aktivität von Farnesol in MS1 und UV-Licht MS2 als Beispiel nehmend, dass die periphere Repräsentation eines Stimulus keine sicheren Schlussfolgerungen über die nachfolgend induzierte neurale Aktivität oder die verhaltensrelevante Bedeutung zulässt. Im weiteren Verlauf werden dabei die Einflüsse konservierter Strukturen und plastischer Änderungen auf die Abläufe der sensorischen Peripherie oder der höheren Verarbeitungszentren, wie dem AL oder dem MB gezeigt. Obwohl der MB, das Zentrum für multimodale Integration und Gedächtnis, hinsichtlich seiner Rolle in der Geruchswahrnehmung ausgiebig erforscht ist, gibt es bezüglich der visuellen Verarbeitung oder dem Einfluss anderer Modalitäten noch ungeklärte Abläufe und Fragen. Wenngleich auch hier die Kenntnis speziell über die visuelle Verarbeitung im MB stetig zunimmt, sollten zukünftige Arbeiten mithilfe weiterer Methoden den MB Eingang und Ausgang explizit auf den Einfluss weiterer Modalitäten untersuchen, um so ein umfassenderes Bild über die Abläufe multimodaler Integration zu erhalten. KW - Biene KW - Elektrophysiologie KW - bee KW - electrophysiology KW - olfaction KW - vision KW - multi-unit recording KW - Olfaktorik KW - Sehen KW - Multi-Unit Aufnahmen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288824 ER - TY - THES A1 - Ruchty, Markus T1 - Sensory basis of thermal orientation in leaf-cutting ants T1 - Sensorische Grundlagen der thermischen Orientierung bei Blattschneiderameisen N2 - Leaf-cutting ants have a highly developed thermal sense which the insects use to regulate the own body temperature and also to optimize brood and fungus development. Apart from the already described temperature guided behaviors inside the nest it is unknown to what extent the ants may use their thermal sense outside the nest. As part of the present thesis, the question was addressed whether leaf-cutting ants (Atta vollenweideri) are able to learn the position of a warm object as landmark for orientation during foraging. Using absolute conditioning, it was shown that ten training trials are sufficient to elicit the association be-tween food reward and the temperature stimulus. In the test situation (without reward) a significantly higher amount of ants preferred the heated site compared to the unheated con-trol. Importantly, thermal radiation alone was sufficient to establish the learned association and served as orientation cue during the test situation (chapter IV). Based on the experi-mental design used in the previous chapter, the localization of thermosensitive neurons, which detect the underlying thermal stimuli, is restricted to the head or the antennae of the ants. The antennal sensillum coeloconicum is a potential candidate to detect the thermal stimuli during the orientation behavior. In chapter V the sensillum coeloconicum of Atta vollenweideri was investigated concerning its gross morphology, fine-structure and the phy-siology of the associated thermosensitive neuron. The sensillum is predominantly located on the apical antennal segment (antennal tip) where around 12 sensilla are clustered, and it has a peg-in-pit morphology with a double walled, multiporous peg. The sensory peg is deeply embedded in a cuticular pit, connected to the environment only by a tiny aperture. The sen-sillum houses three receptor neurons of which one is thermosensitive whereas the sensory modality of the other two neurons remains to be shown. Upon stimulation with a drop in temperature, the thermosensitve neuron responds with a phasic-tonic increase in neuronal activity (cold-sensitive neuron) and shows rapid adaptation to prolonged stimulation. In ad-dition, it is shown that thermal radiation is an effective stimulus for the thermosensitive neuron. This is the first evidence that sensilla coeloconica play an important role during the thermal orientation behavior described in chapter IV. During the test situation of the classic-al conditioning paradigm, the ants showed rapid antennal movements, indicating that they scan their environment in order to detect the heated object. Rapid antennal movements will result in rapid discontinuities of thermal radiation that re-quire thermosensitive neurons with outstanding sensitivity and high temporal resolution. In Chapter VI the question was addressed whether the thermosensitive neuron of the sensilla coeloconica fulfils these preconditions. Extracellular recordings revealed that the neuron is extremely sensitive to temperature transients and that, due to the response dynamics, an estimated stimulus frequency of up to 5 Hz can be resolved by the neuron. Already a tem-perature increase of only 0.005 °C leads to a pronounced response of the thermosensitive neuron. Through sensory adaptation, the sensitivity to temperature transients is maintained over a wide range of ambient temperatures. The discovered extreme sensitivity, the high temporal resolution and the pronounced adaptation abilities are further evidence support-ing the idea that sensilla coeloconica receive information of the thermal environment, which the ants may use for orientation. In order to understand how the ants use their thermal environment for orientation, it is ne-cessary to know where and how thermal information is processed in their central nervous system. In Chapter VII the question is addressed where in the brain the thermal information, specifically received by the thermosensitive neuron of sensilla coeloconica, is represented. By selectively staining single sensilla coeloconica, the axons of the receptor neurons could be tracked into the antennal lobe of Atta vollenweideri workers. Each of the three axons termi-nated in a single functional unit (glomerulus) of the antennal lobe. Two of the innervated glomeruli were adjacent to each other and are located lateral, while the third one was clear-ly separate and located medial in the antennal lobe. Using two-photon Ca2+ imaging of an-tennal lobe projection neurons, the general representation of thermal information in the antennal lobe was studied. In 11 investigated antennal lobes up to six different glomeruli responded to temperature stimulation in a single specimen. Both, warm- and cold-sensitive glomeruli could be identified. All thermosensitive glomeruli were located in the medial half of the antennal lobe. Based on the correlative evidence of the general representation of thermal information and the results from the single sensilla stainings, it is assumed that thermal information received by sensilla coeloconica is processed in the medial of the three target glomeruli. This part of the thesis shows the important role of the antennal lobe in temperature processing and links one specific thermosensitive neuron to its target region (a single glomerulus). In chapter V it was shown that the sensilla coeloconica are clustered at the antennal tip and have an extraordinary peg-in-pit morphology. In the last chapter of this thesis (Chapter VIII) the question is addressed whether the morphology of the sensilla coeloconica predicts the receptive field of the thermosensitive neuron during the detection of thermal radiation. The sensory pegs of all sensilla coeloconica in the apical cluster have a similar orientation, which was not constraint by the shape of the antennal tip where the cluster is located. This finding indicates that the sensilla coeloconica function as a single unit. Finally the hypothesis was tested whether a single sensillum could be direction sensitive to thermal radiation based on its eye-catching morphology. By stimulating the thermosensitive neuron from various angles around the sensillum this indeed could be shown. This is the last and most significant evi-dence that the sensilla coeloconica may be adapted to detect spatially distributed heated objects in the environment during the thermal landmark orientation of ants. N2 - Blattschneiderameisen besitzen einen hochgradig entwickelten Temperatursinn, den sie hauptsächlich zur Regulation ihrer Körpertemperatur, aber auch zur Optimierung der Brut- und Pilzentwicklung einsetzen. Abgesehen von temperaturgesteuerten Verhaltensweisen innerhalb des Nests ist nicht bekannt, ob die Tiere ihren Temperatursinn auch außerhalb des Nests einsetzen können. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird der Frage nachgegan-gen, ob Blattschneiderameisen (Atta vollenweideri) die Position eines warmen Objektes de-tektieren können und ob sie das Objekt anschließend als erlernte Landmarke zur Orientie-rung während des Furagierens nutzen können. Mit Hilfe eines absoluten Konditionierungs-paradigmas konnte gezeigt werden, dass nach zehn Trainingsdurchläufen die Assoziation zwischen Futter und einem thermischem Stimulus von den Tieren gebildet wird. In der unbe-lohnten Testsituation entscheiden sich die signifikant höhere Anzahl der Tiere für die er-wärmte Seite. Alleine die thermische Strahlung des erwärmten Körpers ist bereits ausrei-chend, um die Assoziation zu bilden und während des Tests als Orientierungssignal zu dienen (Kapitel IV). Durch die Art und Weise der Durchführung des Experiments im vorangegangenen Kapitel, konnte der Ort, an dem sich die nötigen thermosensitiven Neurone befinden, auf den Kopf bzw. die Antennen der Tiere beschränkt werden. Aufgrund ihrer Position auf den Antennen gelten die Sensilla coeloconica als potentielle Kandidaten für die Detektion der notwendigen Stimuli während des thermischen Orientierungsverhaltens. In Kapitel V dieser Arbeit wird das Sensillum coeloconicum in Bezug auf seine Morphologie, seine Ultrastruktur und die Physiologie des assoziierten thermosensitiven Neurons untersucht. Sensilla coeloconica be-finden sich hauptsächlich auf dem letzen Antennensegment, der Antennenspitze, in einer Gruppe von bis zu 12 einzelnen Sensillen. Morphologisch kann das Sensillum als Grubensensillum klassifiziert werden und es enthält einem doppelwandigen Zapfen, der von zahlreichen Poren durchzogen ist. Der Zapfen ist tief in eine kutikuläre Grube eingelassen und nur über eine winzige Apertur mit der Umwelt verbunden. Das Sensillum beherbergt drei Rezeptorneurone, von denen eines thermosensitiv ist, während die sensorische Modali-tät der anderen beiden Neurone bis auf weiteres unklar ist. Als Antwort auf eine Abnahme in der Stimulustemperatur generiert das thermosensitive Neuron eine phasisch-tonische Erhö-hung der neuronalen Aktivität (kältesensitives Neuron) und adaptiert sehr schnell an anhaltende Stimulationen. Zusätzlich kann gezeigt werden, dass thermische Strahlung ein wirksa-mer Stimulus für das thermosensitive Neuron ist. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind ein erster Hinweis darauf, dass die Sensilla coeloconica eine wichtige Rolle während des thermischen Orientierungsverhaltens spielen. Bei der klassischen Konditionierung wurden schnelle Antennenbewegungen bei den Ameisen festgestellt, die sich in der Testsituation zwischen dem warmen Objekt und dem Kontrollob-jekt entscheiden mussten. Diese schnellen Bewegungen könnten bedeuten, dass die Tiere Ihre Umgebung nach dem konditionierten warmen Objekt absuchen. Solche schnellen An-tennenbewegungen führen zu schnellen Temperaturänderungen und die Detektion dieser Stimuli setzt thermosensitive Neurone mit besonderer Sensitivität und erhöhtem zeitlichen Auflösungsvermögen voraus. In Kapitel VI wird untersucht, ob das thermosensitive Neuron der Sensilla coeloconica diese Voraussetzungen erfüllt. Extrazelluläre Ableitungen zeigen, dass das Neuron extrem sensitiv auf Temperaturänderungen reagiert und dass aufgrund der Antwortdynamik Stimulationsfrequenzen von bis zu fünf Hertz aufgelöst werden können. Schon eine Temperaturänderung von 0.005 °C führt zu einer ausgeprägten Antwort des thermosensitiven Neurons. Durch sensorische Adaption bleibt diese erhöhte Sensitivität über einen großen Umgebungstemperaturbereich erhalten. Die außergewöhnliche Sensitivi-tät, die hohe zeitliche Auflösung sowie die Adaptionsfähigkeit des thermosensitiven Neurons sind weitere Hinweise darauf, dass die Sensilla coeloconica in der Lage sind Stimuli zu rezi-pieren, welche zur thermischen Orientierung genutzt werden könnten. Um zu verstehen, wie sich die Tiere anhand ihrer thermischen Umwelt orientieren, ist es nötig zu wissen, wo im Zentralnervensystem die thermische Information prozessiert wird. In Kapitel VII wird analysiert, in welchem Bereich des Gehirns die thermische Information der Sensilla coeloconica repräsentiert ist. Mittels selektiver Färbung einzelner Sensilla coeloconica können die Axone der Rezeptorneurone im Gehirn verfolgt werden. Jedes der drei Axone endet in jeweils einer funktionellen Einheit (Glomerulus) im Antennallobus. Zwei der innervierten Glomeruli sind direkt benachbart und liegen im lateralen Teil des Antennallobus während der dritte Glomerulus im medialen Bereich zu finden ist. Mit Hilfe von zwei-Photonen Ca2+ Imaging der Projektionsneurone wurde die Repräsentation von thermischer Information im Antennallobus untersucht. In 11 untersuchten Antennalloben antworten bis zu sechs einzelne Glomeruli auf die Temperaturstimulation. Sowohl warm- als auch kalt-sensitive Glomeruli konnten identifiziert werden. Alle thermosensitiven Glomeruli tende Stimulationen. Zusätzlich kann gezeigt werden, dass thermische Strahlung ein wirksa-mer Stimulus für das thermosensitive Neuron ist. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind ein erster Hinweis darauf, dass die Sensilla coeloconica eine wichtige Rolle während des thermischen Orientierungsverhaltens spielen. Bei der klassischen Konditionierung wurden schnelle Antennenbewegungen bei den Ameisen festgestellt, die sich in der Testsituation zwischen dem warmen Objekt und dem Kontrollob-jekt entscheiden mussten. Diese schnellen Bewegungen könnten bedeuten, dass die Tiere Ihre Umgebung nach dem konditionierten warmen Objekt absuchen. Solche schnellen An-tennenbewegungen führen zu schnellen Temperaturänderungen und die Detektion dieser Stimuli setzt thermosensitive Neurone mit besonderer Sensitivität und erhöhtem zeitlichen Auflösungsvermögen voraus. In Kapitel VI wird untersucht, ob das thermosensitive Neuron der Sensilla coeloconica diese Voraussetzungen erfüllt. Extrazelluläre Ableitungen zeigen, dass das Neuron extrem sensitiv auf Temperaturänderungen reagiert und dass aufgrund der Antwortdynamik Stimulationsfrequenzen von bis zu fünf Hertz aufgelöst werden können. Schon eine Temperaturänderung von 0.005 °C führt zu einer ausgeprägten Antwort des thermosensitiven Neurons. Durch sensorische Adaption bleibt diese erhöhte Sensitivität über einen großen Umgebungstemperaturbereich erhalten. Die außergewöhnliche Sensitivi-tät, die hohe zeitliche Auflösung sowie die Adaptionsfähigkeit des thermosensitiven Neurons sind weitere Hinweise darauf, dass die Sensilla coeloconica in der Lage sind Stimuli zu rezipieren, welche zur thermischen Orientierung genutzt werden könnten. KW - Neurobiologie KW - Temperatur KW - Orientierung KW - Neurobiologie KW - soziale Insekten KW - Elektrophysiologie KW - Infrared radiation KW - thermal orientation KW - social insects KW - imaging KW - neurobiology Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48906 ER - TY - THES A1 - Ramirez Pasos, Uri Eduardo T1 - Subthalamic Nucleus Neural Synchronization and Connectivity during Limbic Processing of Emotional Pictures: Evidence from Invasive Recordings in Patients with Parkinson's Disease T1 - Synchronisierung und Konnektivität des Nucleus subthalamicus während limbischer Bearbeitung affektiver Bilder: Evidenz aus invasiven Aufzeichnungen in Patienten mit Morbus Parkinson N2 - In addition to bradykinesia and tremor, patients with Parkinson’s disease (PD) are known to exhibit non-motor symptoms such as apathy and hypomimia but also impulsivity in response to dopaminergic replacement therapy. Moreover, a plethora of studies observe differences in electrocortical and autonomic responses to both visual and acoustic affective stimuli in PD subjects compared to healthy controls. This suggests that the basal ganglia (BG), as well as the hyperdirect pathway and BG thalamocortical circuits, are involved in affective processing. Recent studies have shown valence and dopamine-dependent changes in synchronization in the subthalamic nucleus (STN) in PD patients during affective tasks. This thesis investigates the role of dopamine, valence, and laterality in STN electrophysiology by analyzing event-related potentials (ERP), synchronization, and inter-hemispheric STN connectivity. STN recordings were obtained from PD patients with chronically implanted electrodes for deep brain stimulation during a passive affective picture presentation task. The STN exhibited valence-dependent ERP latencies and lateralized ‘high beta’ (28–40 Hz) event-related desynchronization. This thesis also examines the role of dopamine, valence, and laterality on STN functional connectivity with the anterior cingulate cortex (ACC) and the amygdala. The activity of these limbic structures was reconstructed using simultaneously recorded electroencephalographic signals. While the STN was found to establish early coupling with both structures, STN-ACC coupling in the ‘alpha’ range (7–11 Hz) and uncoupling in the ‘low beta’ range (14–21 Hz) were lateralized. Lateralization was also observed at the level of synchrony in both reconstructed sources and for ACC ERP amplitude, whereas dopamine modulated ERP latency in the amygdala. These results may deepen our current understanding of the STN as a limbic node within larger emotional-motor networks in the brain.
 N2 - Neben Bradykinese und Tremor weisen Patienten mit Morbus Parkinson (PD) bekannterweise nicht-motorische Symptome auf wie Apathie und Hypomimie, aber auch Impulsivität, welche durch Dopaminersatztherapien bedingt ist. Viele Studien belegen außerdem Unterschiede von kortikalen und autonomen Reaktionen auf sowohl visuelle als auch akustische Reize bei Patienten mit PD im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen. Dies legt nahe, dass sich die Basalganglien (BG), und auch die hyperdirekte Verbindung sowie die BG-thalamokortikalen Schleifen, an der Affektbearbeitung beteiligen. Jüngere Studien haben Valenz- und Dopamin-bedingte Veränderungen der Synchronisierung im Nucleus subthalamicus (STN) von Parkinson-Patienten bei affektiven Aufgaben belegt. Diese Promotionsarbeit untersucht die Rolle von Dopamin, Valenz und Lateralität in der STN-Elektrophysiologie mittels Analysen von ereigniskorrelierten Potentialen (ERP), Synchronisierung und interhemisphärischer funktioneller Konnektivität. STN-Aufzeichnungen wurden von Patienten mit dauerhaft implantierten Elektroden für die Tiefenhirnstimulation während einer passiven Aufgabe abgeleitet, bei den ihnen Bilder mit emotionalen Inhalten gezeigt wurden. Der STN wies Valenz-bedingte ERP-Latenz und lateralisierte ereigniskorrelierte Desynchronisierung in ‘hohem Beta’ (28–40 Hz) auf. Diese Dissertation untersucht auch die Rolle von Dopamin, Valenz und Lateralität bezüglich der funktionellen Konnektivität zwischen dem STN und dem Gyrus cinguli pars anterior (ACC) sowie der Amygdala. Die Aktivität dieser Strukturen wurde aus simultanen elektroenzephalographischen Aufzeichnungen rekonstruiert. Obwohl eine STN-Kopplung mit beiden Strukturen auftritt, war die STN-ACC-Kopplung im ‘Alpha’- Bereich (7–11 Hz) und die Entkopplung im ‘niedrigen Beta’-Bereich (14–21 Hz) lateralisiert. Lateralisierung wurde auch an der Synchronisierung in beiden rekonstruierten Quellen und an der ACC-ERP-Amplitude festgestellt, wohingegen Dopamin die ERP-Latenz in der Amygdala modulierte. Diese Ergebnisse mögen das gegenwärtige Wissen vom STN als limbischem Knoten innerhalb größerer affektiv-motorischer Schleifen im Gehirn vertiefen. KW - Nucleus subthalamicus KW - subthalamic nucleus KW - Emotionales Verhalten KW - functional connectivity KW - oscillations KW - emotion KW - Affekt KW - Elektrophysiologie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169850 ER - TY - THES A1 - Marten, Holger T1 - Rolle und Regulation von Anionenkanälen während der Stomabewegung als Reaktion auf Licht, CO2 und Wasserstress T1 - Role and regulation of anion channels during stomatal movements in response to light, CO2 and water stress N2 - Die Stomata in der Epidermis von Pflanzen sind Poren, die den Gasaustausch mit der Atmosphäre regulieren. Die Öffnungsweite der Stomata kann verändert werden, was eine Optimierung der CO2 Aufnahme für die Photosynthese ermöglicht und gleichzeitig den Wasserverlust durch Transpiration minimiert. Um diese Funktion zu erfüllen, können Stomata verschiedene Stimuli wie Wasserstress (durch Abscisinsäure), Licht und CO2 wahrnehmen. Die oben genannten Reize führen dann zu einer Aufnahme oder Abgabe von osmotisch aktiven Substanzen in zwei Schließzellen, welche die Stomaöffnung kontrollieren. Die Rezeptoren zur Wahrnehmung dieser Stimuli, die intrazellulären Signalwege und die beteiligten Ionentransportproteine in den Schließzellen sind nur lückenhaft bekannt. In dieser Arbeit lag ein Hauptaugenmerk auf der Rolle von Anionenkanälen der Plasmamembran bei Stomabewegungen, sowie auf den Signalwegen welche diese Kanäle steuern. Die Aktivität der Anionenkanäle wurde mit der DEVC (Double Electrode Voltage Clamp) Einstich-Methode in Schließzellen in der intakten Pflanze gemessen, kombiniert mit Calcium Imaging durch den Ca2+ Indikator Farbstoff FURA2. Stomaschlussreaktionen werden durch Abscisinsäure (ABA), CO2 und Dunkelheit induziert und bei allen drei Stimuli konnten wir in Nicotiana tabacum eine Aktivierung von Anionenkanälen beobachten. Das führt zu Anionenefflux aus den Schließzellen und einer Depolarisation der Plasmamembran, was wiederum Kalium-Efflux-Kanäle spannungsabhängig aktiviert. Der resultierende Verlust osmotisch aktiver Teilchen führt dann zu Turgorabnahme der Schließzellen und Stomaschluss. Das zeitliche Muster der Anionenkanalaktivität bei dem Stomaschluss, ausgelöst durch CO2, Dunkelheit und ABA war bei allen Reizen ähnlich. Es zeigte sich eine charakteristische transiente starke und darauf folgende schwächere Anionenkanalaktivität. Dieses konservierte Muster lässt Überschneidungen bei der Signaltransduktion der verschiedenen Stimuli vermuten. Die gesteigerte Aktivität der Anionenkanäle während der Reaktion auf ABA und Dunkelheit wurde in ungefähr der Hälfte der Antworten von einem Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration begleitet. Bei beiden Stimuli scheinen somit Ca2+ abhängig und unabhängig Signale intrazellulär weitergeleitet zu werden. Allerdings war der Effekt der Ca2+ Signale auf die Aktivität der Anionenkanäle bei den beiden Stimuli unterschiedlich. Eine zytosolisch erhöhte Ca2+ Konzentration konnte bei Antworten auf ABA nicht mit einer erhöhten Anionenkanalaktivität in Verbindung gebracht werden, bei Dunkelheit hingegen wurde die Aktivität der Anionenkanäle in Anwesenheit von Ca2+ gesteigert. Die wichtige Rolle von Anionenkanälen beim Stomaschluss lässt vermuten, dass ihre Deaktivierung eine Vorraussetzung für eine Stomaöffnung ist. Blaulicht führt bei niedrigen Photonen-Fluss Raten zu Stomaöffnung und sollte daher Anionenkanäle inhibieren. Übereinstimmend damit konnten wir tatsächlich zeigen, dass Blaulicht in Schließzellen von Vicia faba und Arabidopsis thaliana Anionenkanäle deaktiviert. Diese Deaktivierung ist von den Phototropin-Blaulichtrezeptoren abhängig, da die Deaktivierung der Anionenkanäle in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 Doppelmutanten nicht beobachtet werden konnte. Neben einer Blaulicht spezifischen Antwort öffnen Stomata auch in Antwort auf photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die PAR Wahrnehmung scheint zu einem wesentlichen Teil über Veränderungen der interzellulären CO2 Konzentration, ausgelöst durch die Photosyntheseaktivität des Mesophylls, stattzufinden (Roelfsema et al., 2002). In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir in Schließzellen in Albino Blattarealen von Chlorophytum comosum und gebleichten Vicia faba keine Reaktion auf PAR beobachten, obwohl Schließzellen von Chlorophytum comosum in Albino Bereichen funktionierende Chloroplasten besitzen. Die Rolle von CO2 bei der PAR Antwort haben wir des Weiteren in NtMPK4 antisense Pflanzen untersucht. Stomata von NtMPK4 antisense Pflanzen haben nicht auf Änderungen in der atmosphärischen CO2 Konzentration reagiert und zeigten eine stark reduzierte Antwort auf PAR. Diese Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der intrazellulären CO2 Konzentration bei der PAR Antwort, sie zeigen aber auch, dass es anscheinend zusätzlich zu CO2 noch ein weiteres PAR abhängiges Signal für Stomaöffnung gibt. N2 - Stomata in the epidermis of plants are pores, which regulate the gas exchange with the atmosphere. The aperture of these stomata can be altered and thus enable the plant to optimize the uptake of CO2 for photosynthesis, while minimizing loss of water via transpiration. To fulfil this function, stomata are able to sense several stimuli like water stress (through abscisic acid), light and CO2. The mentioned stimuli can induce accumulation in or release of osmotically active substances from two guard cells that control the stomatal aperture. The receptors for perception of these stimuli, the intracellular signal transduction pathways and the involved ion transporters of the guard cells are only partially resolved. This work focuses on the role of plasma membrane anion channels during stomatal movements and the signal transduction pathways that controls these channels. The activity of the anion channels was studied with the DEVC (double electrode voltage clamp) impalement method, in combination with FURA2 based calcium imaging in guard cells located in intact plants. Closure of stomata is induced by abscisic acid (ABA), CO2 and darkness and all these stimuli were found to activate anion channels in Nicotiana tabacum. This response not only leads to an anion efflux from the guard cells, but also causes depolarization of the plasma membrane, which in turn activates voltage dependent potassium efflux channels. As a result, osmotically active particles are lost, causing a decrease of the guard cell turgor and stomatal closure. The timing of anion channel activation in response to CO2, darkness and ABA displayed a similar pattern for all three stimuli. It was characterized by a transient strong-, followed by a steady low activity of anion channels. This conserved pattern suggests conserved steps in the signal transduction pathways of these stimuli. The activation of anion channels in response to ABA and darkness was in approximately half of the responses accompanied by an increase in the cytosolic Ca2+ concentration. This suggests that ABA and darkness are transmitted through Ca2+-dependent as well as Ca2+-independent signalling pathways. However, the effect of Ca2+ signals on the degree on anion channel activity differed for both stimuli. During ABA responses, an increase in the cytosolic Ca2+ concentration could not be linked to enhanced anion channel activity, but Ca2+ signals were related to large anion currents in responses to darkness. The important role of anion channels for inducing stomatal closure suggests that their deactivation is a prerequisite for stomatal opening. Blue light provokes stomatal opening, at low photon flux densities, and thus should inhibit anion channels in guard cells. We were able to show that blue light indeed deactivates anion channels in Vicia faba and Arabidopsis thaliana. This response depends on phototropin blue light receptors, because it was not observed in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 double mutants. In addition to a blue light-specific response, stomata open in response to photosynthetically active radiation (PAR). The perception of PAR seems to depend mainly on a decrease of the intercellular CO2 concentration, which is caused by photosynthetic activity of the mesophyll (Roelfsema et al., 2002). In agree with this proposed mechanism, we observed no response to PAR in guard cells located in albino leaf areas of Chlorophytum comosum and bleached Vicia faba, even though guard cells of Chlorophytum comosum in albino areas contain functional chloroplasts. We further studied the role of CO2 in the PAR response with NtMPK4 antisense plants. Stomata of NtMPK4 silenced plants did not respond to changes in the atmospheric CO2 concentration and showed a strongly reduced response to PAR. These data thus confirms the important role of intracellular CO2 in the PAR response, but also point to an additional PAR dependent signal for stomatal opening. KW - Elektrophysiologie KW - Ionenkanal KW - Abscisinsäure KW - Phototropine KW - Schließzellen KW - CO2 Reaktion KW - Phototropins KW - Guard Cells KW - CO2 Response KW - Abscisic Acid Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29349 ER - TY - THES A1 - Kugler, Sabrina T1 - Wirkung von Cannabinoiden auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 T1 - Effects of cannabinoids on the two-pore-domain potassium channels TASK-1 and TASK-3 N2 - In dieser Arbeit wurde die Wirkung der ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Zunächst wurden für alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese führten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81% gehemmt. Die IC50 beträgt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativität vor. Arachidonsäure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63%. Die IC50 beträgt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativität. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] beträgt 32,4% (± 9,7). Fünf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidonsäure verursachen eine Hemmung um 32,1% (± 5,4) bzw. um 20,3% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminosäuren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminosäure übereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgeführt. • Es wurden die sechs Aminosäuren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidonsäure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, während es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminosäuren in Position 243-248. Außerdem wurden die endständigen Aminosäuren RSSV an das Restprotein angefügt, da diese für einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidonsäure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unverändert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabhängige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminosäuren in Position 243-248 sind für diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung. N2 - Effects of the fatty acid arachidonic acid, the endocannabinoid anandamide and the synthetic cannbinoid receptor agonist WIN55,212-2 on the two-pore-domain potassium channles TASK-1 and TASK-3 were examined using the Xenopus oocyte expression system. Electrophysiological recordings have been performed with the two-electrode-voltage-clamp technique. At first dose-response relationships between the channel-proteins and the cannabinoids have been performed. All three substances had inhibitory effects on both channels. On TASK-1 WIN55,212-2 showed the strongest inhibition (ca. 81%), followed by anandamide (ca. 71%) and arachidonic acid (ca.63%). The inhibitory effects of all three substances on TASK-3 have been low. Furthermore the C terminus was targeted for mutation in order to examine the importance of the six-residue sequence at position 243-248. TASK-1 and TASK-3 contain nearly the same sequence at this position except only one amino acid. The first mutations performed were TASK-1 [243-248] and TASK-3 [243-248], both lacking the amino acids in position 243-248. The lack of this sequence reduced inhibitory effects of the cannabinoids on TASK-1 [243-248] nearly completely. On TASK-3 [243-248] various effects could be observed. Deletion of the whole C terminus of TASK-1 except the amino-acids in position 243-248 and the terminal motif RSSV, crucial for membrane trafficing (TASK-1 [249-390RSSV], lead to very similar inhibitory effects of the cannabinoids as on TASK-1 [wild-type]. The amino acid leucin of TASK-3 at position 247 has been changed to methionin (TASK-3 [L247M]) in order to construct a mutation of TASK-3 containing the same sequence as TASK-1. The effects of the examined cannabinoids on TASK-3 [L247M] did not differ from those on TASK-3 [wild-type]. These results suggest, that anandamide, arachidonic acid and WIN55,212-2 inhibit the two-pore-domain potassium channels TASK-1 and TASK-3 specific and reversible, independently of receptors. The six-residue sequence at position 243-248 has a basic impact. KW - Kaliumkanal KW - Elektrophysiologie KW - Strommessung KW - Indischer Hanf KW - Arachidonsäure KW - Endocannabinoide KW - Xenopus Oozyten KW - Zwei-Elektroden-Spannungsklemme KW - Anandamid KW - WIN 55 KW - 212-2 KW - Xenopus oocytes KW - two-electrode-voltage clamp KW - anandamide KW - WIN 55 KW - 212-2 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27922 ER - TY - THES A1 - Kretzer, Katharina T1 - Einfluss der Form elektrischer Impulse auf die intracochleäre neuronale Antwort bei Cochlea-Implantat-Trägern: triphasische Pulse mit anodischer und kathodischer zweiter Phase T1 - Influence of the shape of electrical pulses on the intracochlear neural response in cochlear implant recipients: triphasic pulses with anodic and cathodic second phase N2 - Vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Verbesserung von Defiziten der elektrischen Stimulation durch Cochlea Implantate (CI) mit alternativen Pulsformen. Dabei wurde mit elektrophysiologischen und psychophysikalischen Methoden untersucht, wie sich die Pulsformen auf die Effektivität der Stimulation auswirken. Es wurden präzisions-triphasische Pulse (pTP) mit anodischer und kathodischer zweiter Phase anhand der Daten von elf Probanden untersucht. Im Rahmen der objektiven elektrophysiologischen Messung wurde mit den unterschiedlichen Formen des pTP an drei unterschiedlichen Kontaktpositionen auf den CI-Elektrodenträgern stimuliert, und die Stärke der jeweils evozierten neuronalen Antwort aufgezeichnet. Der subjektive psychophysikalische Test diente dazu, die pulsformspezifischen Hörschwellen zu bestimmen und wurde an zwei unterschiedlichen Kontakten auf den CI-Elektrodenträgern durchgeführt. Dabei erzielten pTP, welche eine symmetrisch-triphasische Pulsform aufwiesen, geringere neuronale Antwortstärken und höhere Hörschwellen als die pTP, die einer biphasischen Pulsform glichen. Diejenigen pTP, die biphasischen Pulsen mit anodischer erster Phase glichen, erzielten dabei die höchsten neuronalen Antwortstärken und die niedrigsten Hörschwellen. N2 - Present work dealt with the improvement of deficits of electrical stimulation by cochlear implants (CI) by means of alternative pulse shapes. This involved the use of electrophysiological und psychophysical methods to investigate the effect of pulse shape on the effectiveness of stimulation. Precision-triphasic pulses (pTP) with anodic and cathodic second phase were examined using data from eleven subjects. In the objective electrophysiological measurement, the different shapes of the pTP were stimulated from three different contact positions on the CI electrode arrays and the strength of the neural response evoked in each case was recorded. In the subjective psychophysical test, pTP stimulation was performed from two different contact positions on the CI electrode arrays and the pulse shape-specific detection thresholds were compared. The results showed that pTP, which exhibited a symmetric-triphasic pulse shape, achieved lower neuronal response strengths and higher detection thresholds than pTP that resembled a biphasic pulse shape. Those pTP, that resembled biphasic pulses with an anodic first phase, achieved the highest neuronal response strengths and the lowest detection thresholds. KW - Cochlear-Implantat KW - Elektrophysiologie KW - Psychophysik KW - elektrische Stimulation KW - cochlear implant KW - electrical stimulation KW - psychophysics KW - electrophysiology Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281650 ER - TY - THES A1 - Kratz, Salome T1 - Früherkennung Alzheimer-Demenz: Untersuchung zur Korrelation von Vagus-evozierten Potenzialen mit dem Aufmerksamkeitsblinzeln (Attentional Blink) T1 - Early detection of Alzheimer's dementia: Study on the correlation of vagus evoked potentials with the attentional blink N2 - Prävention ist der zentrale Hebel, um dem gesundheitspolitischen und sozialen Problem der Alzheimer-Krankheit (AD) zu begegnen. Ein Ansatz ist der Einsatz krankheitsmodifizierender Therapien in der präklinischen Krankheitsphase. Zwei mögliche Früherkennungsmethoden sind die somatosensibel evozierten Potenziale des Nervus vagus (VSEP) und das Aufmerksamkeitsblinzeln (Attentional Blink, ATB). Beide werden möglicherweise über den Locus coeruleus vermittelt, der sehr früh im Krankheitsverlauf strukturelle Veränderungen aufweist. Ziel der Arbeit war es, Korrelationen zwischen den Parametern beider Methoden zu untersuchen. Hierfür mussten individuumspezifische ATB-Parameter entwickelt werden. Außerdem wurden Korrelationen mit psychometrischen Parametern der Demenzdiagnostik und Gruppenunterschiede zwischen Personen mit und ohne Mild Cognitive Impairment (MCI) analysiert. Es wurden insgesamt 108 Teilnehmer der „Vogel-Studie“, einer prospektiven Längsschnittstudie zur Frühdiagnostik dementieller Erkrankungen, untersucht. Die VSEP wurden mittels der durch Fallgatter et al. (2003) entwickelten Technik bestimmt. Die ATB-Messung erfolgte in einem an Zylberberg et al. (2012) angelehnten Versuchsablauf. Die gemessenen Parameter siedelten sich zwischen dem aus der Literatur bekannten Wertebereich gesunder und an Alzheimer-Demenz erkrankter Probanden an. Auffallend war das Auftreten von Attentional Masking Errors (AME), die bisher ausschließlich bei Patienten mit Alzheimer- und Lewy-Body-Demenz beschrieben wurden. Somit sprechen die Ergebnisse für eine beginnende Alzheimer-Pathologie im untersuchten Studienkollektiv. Es konnten keine signifikanten Korrelationen zwischen VSEP- und ATB-Parametern nachgewiesen werden. Die explorative Analyse weist auf zahlreiche Zusammenhänge zwischen ATB-Parametern und psychometrischen Tests hin. 16 % der Probanden erfüllten die Kriterien eines MCI (Portet et al., 2006). Wie in der vorbestehenden Literatur ergaben sich auch in dieser Arbeit keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen Probanden mit und ohne MCI. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die bestehende Evidenz dahingehend, dass beide Methoden frühe subklinische Alzheimer-Pathologien detektieren könnten. Insbesondere AME scheinen ein vielversprechender Parameter zu sein. Weiterführende Ergebnisse zum Vorhersagewert der einzelnen Parameter wird das Follow-Up der „Vogel-Studie“ erbringen. N2 - Prevention is the key to address the public health and social problem of Alzheimer's disease (AD). One approach is the use of disease-modifying therapies in the preclinical phase. Two potential early detection methods are the somatosensory evoked potentials of the vagus nerve (VSEP) and the attentional blink (ATB). Both are possibly mediated by the locus coeruleus, which shows structural changes very early on in the course of the disease. The aim of this thesis was to investigate correlations between the parameters of both methods. For this purpose, individual-specific ATB parameters had to be developed first. In addition, correlations with psychometric tests of dementia diagnosis and group differences between individuals with and without Mild Cognitive Impairment (MCI) were analyzed. A total of 108 participants of the "Vogel Study," a prospective longitudinal study on early diagnosis of dementia, were examined. VSEP were determined using the technique developed by Fallgatter et al. (2003). ATB measurement was performed in an experimental procedure adapted from Zylberberg et al. (2012). The measured parameters corresponded with the value range known from healthy subjects and subjects suffering from Alzheimer's dementia. The occurrence of attentional masking errors (AME), which have so far been described exclusively in patients with Alzheimer's and Lewy body dementia, was striking. Thus, the results are suggestive of incipient AD pathology in the examined study population. No significant correlations were found between VSEP and ATB parameters. Exploratory analysis indicates numerous correlations between ATB parameters and psychometric tests. 16% of subjects met criteria for MCI (Portet et al., 2006). As in the prior literature, this study found no significant group differences between subjects with and without MCI. The results of this thesis support the existing evidence that both methods could detect early subclinical AD pathologies. In particular, AME seem to be a promising parameter. Further results on the predictive value of the investigated parameters will be provided by the follow-up of the "Vogel study". KW - Alzheimerkrankheit KW - Locus coeruleus KW - Senile Demenz KW - Elektrophysiologie KW - Frühdiagnostik KW - attentional blink KW - Somatosensibel evozierte Potenziale des Nervus vagus Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242201 ER - TY - THES A1 - Koers, Sandra T1 - Die Rolle der S-Typ Anionenkanäle in der Reaktion von Gerstenschließzellen auf Blumeria graminis f. sp. hordei T1 - Role of S-type anion channels in the reaction of barley guard cells towards Blumeria graminis f. sp. hordei N2 - In ihrer Evolution mussten Pflanzen Strategien entwickeln um sich sowohl gegen Pathogene aus der Luft als auch solche im Boden zu verteidigen. Diese Resistenzmechanismen der Pflanzen zu verstehen ist von höchster Wichtigkeit für die moderne Gesellschaft. Die Weltbevölkerung wächst schnell, was zu der Notwendigkeit führt, die landwirtschaftlichen Flächen möglichst optimal zu nutzen. Ohne die Weiterentwicklung der landwirtschaftlichen Methoden wird eine ausreichende Versorgung mit Grundnahrungsmitteln nicht möglich sein. Obwohl nicht viele Daten zu diesem Thema vorliegen, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein hoher Prozentsatz der jährlichen Ernteverluste auf Pflanzenkrankheiten zurückzuführen ist (Orke et al. 1994, Pinstrup-Andersen; 2001). Der Ernteverlust ist nicht ausschließlich auf den Tod der infizierten Pflanze zurückzuführen, sondern vielmehr auf die sogenannten Resistenzkosten Walters und Heil; 2007). Um sich gegen das Pathogen zu schützen müssen Ressourcen genutzt werden, die sonst für die korrekte Entwicklung der Pflanze, sowie der Samen und Früchte verwendet würden. Die pflanzliche Cuticula, welche die Blattoberfläche bedeckt, ist die erste Verteidigungslinie gegen pathogene Microorganismen, die durch die Luft verbreitet werden. Um diese Barriere zu umgehen nutzen Bakterien und einige Pilze die Stomata als Eingang in den Apoplasten der Blätter. Dies kann durch die Pflanze allerdings verhindert werden, indem diese Poren geschlossen werden. Diese Schließzellantwort wurde zunächst als Teil der Immunantwort auf Bakterien angesehen (Melotto et al. 2006). Nichtsdestotrotz konnte beobachtet werden, dass die Stomata auch während der Infektion des Mehltaupilzes schließen, obwohl dieser nicht durch die Stomata in das Blatt eindringen. Daher haben wir Einzelzellstudien an intakten Gerstenpflanzen vorgenommen um zu klären, wie die Signale erkannt und weitergeleitet werden, die schließlich zum pathogen-induzierten Stomaschluss führen (Koers et al. 2011). Zusammengefasst kann gesagt werden, dass der Stomaschluss ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Immunantwort ist. Innerhalb dieser Antwort der Stomata auf durch Wind übertragene Pathogene, spielt die Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle eine entscheidende Rolle. Es konnte dabei gezeigt werden, dass die Immunantwort die Licht-induzierte Inhibierung dieser Anionenkanäle außer Kraft setzt. S-Typ Anionenkanäle sind aber nicht allein in der Pathogenabwehr von Bedeutung, sondern auch in der Reaktion der Pflanzen auf Trockenstress. Es ist jedoch nicht bekannt, in wie weit sich die beiden Signalwege überschneiden. Zusammen mit den neuen mutierten Gerstenlinien, werden die in dieser Arbeit beschriebenen Techniken zur Messung von Einzelzellen tiefere Einsichten in das Zusammenspiel zwischen Trockenstress und Pathogenabwehr in Pflanzen ermöglichen. Die daraus resultierenden Ergebnisse können zur Optimierung von Getreide für die moderne Landwirtschaft genutzt werden. Dies wird einer der wichtigsten Ansätze sein, um die Menschheit auch in Zukunft mit ausreichend Nahrung versorgen zu können. N2 - During evolution, plants had to evolve potent strategies to defend themselves against airborne pathogens, as well as against those encountered in the soil. Understanding the mechanisms that provide plant immunity is crucial for modern society. The world population is growing at rapid pace, leading to the necessity of using agricultural areas as productive as possible. Without improvement of agricultural practice, a sufficient supply with staple foods will not be possible. It is very likely that an important percentage of crop loss is due to plant diseases, even though precise data on this issue are lacking, (Orke et al. 1994, Pinstrup-Andersen; 2001). Crop loss is not exclusively caused by the death of infected plants, but more often by so called costs of resistance (Walters and Heil; 2007). To gain protection against an attacking pathogen, resources have to be consumed, which otherwise would be used for proper plant, crop and fruit development. Plant cuticles, that cover the leaf surface, are the first line of defence to airborne pathogenic microorganisms. To bypass this barrier, bacteria and some fungi use stomata as an entry site into the apoplastic space of leaves. The entry of pathogens through stomata can be prevented by plants upon closure of these pores. This guard cell response was proposed to contribute to plant innate immunity against bacteria (Melotto et al. 2006). However, stomata were found to close during the infection of powdery mildew fungi, which do not use open stomata to enter the leaf. We therefore pursued single cell studies within intact barley plants to elucidate the signal perception and transduction mechanisms that evoke stomatal closure during a pathogen attack (Koers et al. 2011). All results taken together, stomatal closure is an integral part of plant innate immunity. Within the stomatal response to airborne pathogens, the activation of S-type anion channels is essential. It is shown, that the immunity responses of guard cells bypass light induced inhibition of anion channels. S-type anion channels are not only crucial for responses to pathogens, but they are also involved in the response of guard cells towards drought. However, it is unknown to which extent both signals share mutual components. Together with the, now available, mutant lines of barley, the single cell techniques described in this thesis can provide a further insight into the interplay of drought and pathogen responses in plants. The results are likely to be used for optimizing crops for the future agriculture, which is a pivotal step in providing enough food for mankind in the near future. KW - Elektrophysiologie KW - Erysiphe graminis KW - Spaltöffnung KW - Gerste KW - Abwehrreaktion KW - Ionenkanal KW - electrophysiology KW - stomata KW - powdery mildew KW - immunity response KW - ion channel KW - Pflanzenphysiologie KW - Mehltau Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77335 ER - TY - THES A1 - Kaltwasser, Christoph T1 - Rekonstruktion und Simulation der Ausbreitung und Rückbildung der elektrischen Erregung im Herzmuskel des Menschen : Visualisierung kardialer Potentiale mit Methoden der magnetresonanztomographischen Bildgebung, der kardialen Biosignalverarbeitung und der numerischen Lösung des Inversen Problems der Elektrokardiographie T1 - Reconstruction and simulation of the electric depolarization and repolarization in the human heart N2 - Die elektrophysiologischen Vorgänge während der Depolarisation und Repolarisation des Myokards können mittels der Signale des 12-Kanal EKGs selbst bei Vorliegen großen Expertenwissens nur unzureichend beobachtet bzw. interpretiert werden. Grund hierfür sind vor allen Dingen Inhomogenitäten in der kardialen und thorakalen elektrischen Leitfähigkeit sowie die starke Signalabschwächung in den durchlaufenen Geweben. Intrakardiale Verfahren der Signalableitung sind ein Ansatz zu Lösung dieses Problems; sie sind jedoch aufwändig und risikobehaftet. In dem in dieser Arbeit eingesetzten Verfahren hingegen konnte, durch patientenindividuelle Modellierung der Herz- und Thoraxanatomie sowie der Leitfähigkeitsverhältnisse, mittels numerischer Verfahren aus einer Vielzahl von Oberflächen-EKG Ableitungen auf die elektrophysiologischen Vorgänge im Myokard in ihrem zeitlichen und örtlichen Verlauf geschlossen werden (Inverses Problem der Elektrokardiographie). Es konnten bei gesunden Probanden sowie bei Patienten mit verschiedenen kardialen Pathologien zeitlich und örtlich hochaufgelöste Rekonstruktionen von epikardialen- und Transmembranpotentialverteilungen angefertigt werden. Es zeigte sich, dass insbesondere im Bereich großer Infarktnarben der Herzvorder- sowie der Herzhinterwand elektrophysiologische Auffälligkeiten nachweisbar waren. So zeigten sich während der Depolarisationsphase Myokardareale mit einer verminderten Aktivität und Polarisationsumkehr, Bezirke mit verzögerter Depolarisationsaktivität sowie Areale mit atypisch verlaufender Repolarisationsaktivität. Anhand der vorliegenden Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass eine Rekonstruktion der physiologischen Abläufe im Myokard während der Depolarisation und der Repolarisation mit dem hierzu implementierten Verfahren möglich ist. Anhand von elektroanatomischen Modellen konnten darüber hinaus die physiologische sowie die pathologisch veränderte Erregungsausbreitung im Myokard simuliert werden. Durch Verbesserung der Rekonstruktionsalgorithmen, der Methoden der Signalverarbeitung und der Regularisierung der Lösungsverfahren ist zukünftig eine weitere Verbesserung der Rekonstruktionsergebnisse zu erwarten. Vor dem klinischen Einsatz der Methode muss eine eingehende Validation erfolgen. N2 - The electrophysiological processes that occur during cardiac depolarization and repolarization can be interpreted via 12-channel ECG only in a limited manner. This is due to inhomogeneities in the cardiac and thoracic electric conductivity and the attenuation of the electric signals in the body. Invasive cardiac measurements can avoid these problems but are expensive and not free of risk for the patient. In this work therefore a method of non-invasive electrocardiographic imaging was established which permits the reconstruction of cardiac electrophysiological processes using exclusively information obtained by non-invasive methods (MR-imaging, electrocardiographic mapping). Using anatomic information from MR-images of the patient’s heart and chest, a patient-individual model of electric conductivity could be created (finite-element method). Numerical algorithms were used to solve the inverse problem of electrocardiography, i.e. finding cardiac potential distributions that explain the measured surface potential distribution. In two healthy volunteers as well as in 7 patients with different cardiac pathologies, reconstructions of epicardial potentials and transmembrane voltages were performed. Specific electrophysiological abnormalities (decreased electric activity, polarization reversal, delayed depolarization and atypical repolarization patterns) could be detected in the proximity of myocardial scars. To optimize reconstruction algorithms and regularization methods, cardiac potentials were also simulated using a cellular automaton and the patient individual conductivity model. This study shows that the reconstruction of cardiac electrophysiology is feasible with this method and that myocardial scars and atypical patterns of depolarization and repolarization can be detected. By further improving the method and after a process of validation, clinically relevant data might be obtained. KW - Elektrophysiologie KW - Herzmuskelfunktion KW - Elektrisches Potenzial KW - Rekonstruktion KW - NMR-Tomographie KW - Computersimulation KW - Depolarisation KW - Repolarisation KW - Elektrokardiologie KW - Vorwärtsproblem KW - nichtinvasive elektrokardiographische Bildgebung KW - ECGI KW - NICE KW - Inverses Problem KW - electrocardiology KW - non-invasive electrocardiographic imaging KW - ECGI KW - NICE KW - NMR-tomography KW - mapping KW - inverse problem Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26316 ER - TY - THES A1 - Kaeser, Emanuel T1 - Die Trennung von lateralen Interaktionsantworten und Helligkeitsantworten im Muster-Elektroretinogramm des Menschen T1 - The isolation of lateral interaction components and local luminance components in the human ERG N2 - Das PERG gilt als Standardmethode, um den Funktionszustand der retinalen Ganglienzellen zu testen. Jedoch tragen im PERG neben diesen Ganglienzellen, welche zu den Komponenten lateraler Interaktion in der Retina zählen, auch lokale Mechanismen zur Entstehung der Reizantwort bei.Im Gegensatz zum PERG werden beim liERG unterschiedliche Frequenzen für die Reizdarbietung verwendet. Die Retina wird gezielt nach Reizantworten untersucht, welche durch laterale Interaktion der retinalen Zellen entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe des liERGs die lokalen und lateralen Anteile des PERG getrennt, um sie untersuchen zu können und dadurch mehr Aufschluss über die Zusammensetzung und Entstehung des PERGs zu gewinnen. Letztendlich wurde anhand der erhobenen Daten und Erkenntnisse eine rechnerische Synthese des PERGs aus seinen Komponenten durchgeführt. N2 - The pattern electroretinography (PERG) is considered as standard technique for testing ganglion cell function. In addition to the signals from the ganglion cells, it reflects also local luminance mechanisms. Unlike the PERG, the liERG uses two different frequencies for the pattern stimulus. It allows a direct investigation of the retina for lateral interaction components. Via liERG, local luminance and lateral interaction components of the PERG have been isolated and investigated. After that, a PERG has been constructed mathematically by synthesis of its components. KW - PERG KW - liERG KW - Elektrophysiologie KW - PERG KW - liERG KW - electrophysiology Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25614 ER - TY - THES A1 - Jeworutzki, Elena T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen zur frühen Erkennungsphase zwischen Pflanzen und Mikroorganismen T1 - Electrophysiological analyses of the early recognition phase between plants and microorganism N2 - An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molekülen, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten frühe Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der über die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunität in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der kürzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminosäuren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenflüssen in der Initiationsphase der basalen Immunität. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in höchstem Masse reproduzierbar und öffnen eine neue Sicht, über die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verzögerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abhängige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen können. Das um 2 Aminsäuren kürzere Peptid flg22 Δ2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) führten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungsänderungen in dem Arabidopsis Ökotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung für flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgeführt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abhängigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. Möglicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitfähigkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation benötigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 – eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist – fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zusätzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. Ähnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenströme von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgeführt, während in der externen Lösung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine Änderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkanäle blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkanäle die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von auswärtsgerichteten Kaliumkanälen folgt. Zukünftige Studien mit Doppelläufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen über die Natur der Ionenkanäle in der basalen Immunität oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. Über die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenströme in der basalen Immunität hinaus, ist natürlich der nächste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die für die Ionenkanäle oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden. N2 - The plant plasma membrane represents the first site for recognition of microbial patterns called MAMPs. MAMP receptors mediate early defense responses including production of reactive oxygen species (ROS), external alkalinisation or ethylene. The Arabidopsis FLS2 receptor-like kinase (RLK) represents a plasma-membrane localized MAMP receptor that provides for innate immunity in Arabidopsis thaliana plants by specifically recognizing the flagellum (flg) of Pseudomonas species. Flg22, the shortest active part of flagellin, composed by 22 aminoacids is the best established bacterial elicitor that. About the role of ion channels in innate immunity nothing was known yet. In the current work we show a strong involvement of ion fluxes in the initiating phase of innate immunity. Our measurements on intact Arabidopsis plants and plant tissues are highly reproducible and open a new view of ion channel functions in plant microbe interactions. In response to the application of flg22, after a delay of about 2 minutes, we recorded a transient, dose-dependent depolarization (EC50=0.2 nM) in mesophyll and root hair cells of A. thaliana. Following wash-out of the peptide elicitor and recovery of the membrane potential to resting potential values within 70 ± 9 min, depolarizations could be elicited several times. No membrane depolarization was evoked upon application of flg22Δ2, a truncated flg22 peptide, or by application of flagellin from other bacteria (Agrobacterium or Azospirillum). Likewise, depolarization was not observed in the natural knockout mutant of the Arabidopsis ecotype Ws-0 lacking the functional FLS2 receptor. Complementation of transgenic Ws-0 plants with the functional FLS2 receptor restored flg22 sensitivity, indicating that FLS2 is essential for flg22 evoked membrane potential changes. Similar results were obtained using the E. coli EF-Tu elicitor peptide elf18, which is recognized by the Arabidopsis MAMP receptor EFR. Aequorin based calcium measurements allowed us to record a transient increase in cytosolic calcium concentration in response to applied flg22. Dose-response studies revealed two distinct EC50 values for the calcium response of 43 ± 2 pM and 67 ± 42 nM respectively. This indicates that two different calcium pools or two different calcium permeabilities in the plasma membrane were activated by flg22. In line with a requirement of receptor-kinase activity for ion channel activation and subsequent depolarization, the latter was completely blocked by the kinase inhibitor K-252a. In bak1-4 Arabidopsis plants, lacking the FLS2 subunit BAK1 – a promiscuous RLK also associated with the brassinosteroid receptor - no depolarisation was measured in response to flg22. This indicated that both RLKs – FLS2 and BAK1 – are required for flagellin induced ion channel activation. Arabidopsis mesophyll cells showed the typical alkalinization of the apoplast in response to flg22. Noninvasive experiments with vibrating ion-selective electrodes revealed that this pH rise was due to an influx of protons. In addition an efflux of chloride and potassium was recorded. All fluxes were transient in nature, as was the observed calcium signal. Simultaneous measurements using two ion-selective electrodes showed a delay of the potassium efflux in comparison to the other ions that participate in the flg22 response. In the second approach, membrane potential measurements were performed while changing extracellular concentrations of protons, calcium, potassium or anions. Changing the anion gradient had the greatest impact on flg22 induced depolarization, suggestive of anion channel activation. Exudates analyses of flg22 treated leaves revealed that nitrate was the favored anion transported. Among many putative channel blocking agents tested, only lanthanum was identified to be potent in blocking the flg22 induced the cytosolic calcium rise, proton influx, and membrane potential depolarization. Since lanthanum represents a non-specific cation channel blocker, we favor to conclude that a calcium dependent activation of anion channels mediated membrane potential depolarization and consequently outward rectifying potassium channels. Future studies with double-barreled microelectrode voltage-clamp or external ion selective electrodes on intact guard cells may help to gain further information about the nature of ion channels in innate immunity or plant microbe interaction in general. Of course, all over the electrophysiological characterization of the multiple ion fluxes in innate immunity the next important step would be to discover the gene(s) coding for ion channels or transporters activated by non necrotic elicitors as flg22 in the innate immune response of plants. KW - Calcium KW - Induzierte Resistenz KW - Ackerschmalwand KW - Ionenkanal KW - Elektrophysiologie KW - Pseudomonas syringae KW - Membranpotenzial KW - Flagelline KW - Ionenkanäle KW - Anionen KW - Rezeptorkinasen KW - basale Immunität KW - Einstichmessungen KW - innate immunity KW - Calcium KW - Anion KW - ion channels KW - receptor kinases KW - flagellin KW - membrane potential KW - Pseudomonas syringae KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47489 ER - TY - THES A1 - Hummel, Maria T1 - Neurophysiologische Veränderungen der Hörbahn während und nach Vestibularisschwannom-Operationen T1 - Neurophysiological changes of the auditory pathway during and after vestibular schwannoma surgery N2 - Aufgrund von Fallberichten bei Patienten mit operativer Resektion eines Vestibularisschwannoms über verzögerte Ertaubung bei endoperativ erhaltenem Resthörvermögen, war es das Ziel dieser Arbeit die intraoperative und frühe postoperative Phase mittels ABR-Monitoring näher zu charakterisieren und prädiktive Faktoren für die postoperative Entwicklung und die resultierende Hörfunktion zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass der ABR-Befund sowohl zu Beginn der Operation als auch postoperativ mit dem jeweiligen Hörbefund korreliert. Fälle mit erhaltenem ABR und sekundärer Ertaubung müssen am ehesten auf das Vorhandensein weniger noch leitender Fasern ohne funktionellen Nutzen oder eine Veränderung der Elektrophysiologie zurückgeführt werden. Die detaillierte Betrachtung des intraoperativen Verlaufes ergab eine Untergliederung in sechs Gruppen: - Gruppe 1: ABR-Verbesserung - Gruppe 2: ABR kontinuierlich erhalten - Gruppe 3: ABR temporär abweichend, letztlich erhalten - Gruppe 4: ABR verschlechtert im Vergleich zum Ausgangsniveau - Gruppe 5: ABR-Verlust intraoperativ bei fluktuierendem Verlauf - Gruppe 6: klarer intraoperativer ABR-Verlust, welche eine sinnvolle Korrelation mit dem Hörergebnis und der postoperativen Entwicklung zeigten. Im Gegensatz zur bisher verbreiteten Auffassung, dass die endoperative ABR-Qualität einen bleibenden Zustand nach den intraoperativen Veränderungen darstellt, wurde in dieser Studie erstmals nachgewiesen, dass in den ersten Stunden und mit weiteren Fluktuationen in der ersten Woche erhebliche Veränderungen auftreten mit erheblichen Auswirkungen auf das Endergebnis. Darüber hinaus konnten verschiedene Typen dieser veränderlichen physiologischen Funktionszustände identifiziert und hier erstmals beschrieben werden: - Gruppe mit stabilem und erhaltenem ABR - Gruppe mit fluktuierendem und erhaltenem ABR - Gruppe mit fluktuierendem und verlorenem ABR - Gruppe mit stabilem ABR-Verlust. In der Analyse und Korrelation der intra- mit den postoperativen Entwicklungen wurde die ABR-Qualität nach 60% Tumorresektion als prognostisch signifikantes Merkmal erkannt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass Patienten mit postoperativem Erholungspotential als typisches Merkmal Tumore der Klasse T3A oder kleiner nach der Hannover Klassifikation zeigen. Diese Studie deutet darauf hin, dass sich der intraoperative Verlauf postoperativ fortsetzt. Während bei intraoperativ instabilem Verlauf (Gruppen 3-5) sich postoperativ eine fluktuierende Entwicklung anschließt oder die ABR-Qualität sich sogar dauerhaft im Vergleich zum endoperativen Status ändert, behalten Patienten mit intraoperativ stabilem Verlauf (Gruppen 1 und 2) oder mit verlorenem ABR (Gruppe 6) diesen Status auch in der frühen postoperativen Phase in der Regel bei. Im Hinblick auf mögliche Empfehlungen zur mikrochirurgischen Strategie stellten sich die Phase der knöchernen Eröffnung des IAC sowie die direkte Präparation der Tumor-Nerven-Grenze als besonders gefahrenträchtig heraus. Unter Kenntnis der zwar gegebenen aber begrenzten postoperativen Erholungschancen verschlechterter ABRs muss das chirurgische Vorgehen also in dieser Phase auf schonendste Präparation und rasche Reaktion auf kritisches Monitoring-Feedback ausgerichtet sein. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe bei Patienten mit auffälligen intraoperativen ABR-Fluktuationen (intraoperative Gruppen 3, 4 und 5) postoperativ ein ABR-Monitoring bis zum 5. Tag nach Duraschluss durchzuführen. Auf der Grundlage der hier vorgelegten Studie ist ein postoperatives ABR-Monitoring gleichermaßen für Patienten mit erhaltenem oder erloschenem ABR jeweils nach Fluktuationen zu empfehlen, da sich intraoperative Fluktuationen fortsetzen und postoperativ sowohl ein ABR-Verlust als auch eine ABR-Erholung erfolgen kann. Dies ist besonders indiziert, wenn in Zukunft die medikamentösen Interventionsmöglichkeiten näher evaluiert und weiterentwickelt sind, aber auch mit den aktuellen Standardmedikamenten HAES, Nimodipin und Kortison ist eine Unterstützung der Regeneration bei Feststellung einer postoperativen Verschlechterung zu empfehlen. N2 - OBJEKTIVE: Reliable hearing preservation is still a unachieved goal in vestibular schwannoma surgery, especially in large tumors. The present study analyzed the hearing function intraoperative and postoperative by ABR to find implications for the surgical strategy to receive this aim. METHODS: In a prospective study from 2010 to 2012 46 patients (median age 47, 27 female, 22 male) with pre-operative hearing (up to 80 dB hearing loos, >10% speech discrimination) and a tumor size between T2 and T4 (Hannover classification) were investigated by intraoperative and intermittent postoperative ABR monitoring. We analyzed, if there are intraoperative marker for the postoperative development and which side factors are important. RESULTS: A postoperative ABR monitoring was made in 30 of 46 patients, in cases with at least temporary reproducible ABRs at the end of surgery. In 73% cases we saw ABR quality change during the first five days. Intraoperative ABR development correlates with the postoperative development, especially the ABR status after 60% tumor resection. Particularly critical surgical steps are the drilling and the preparation of the intrameatal channel. The strongest influencing side factor is the tumor expansion. ABR recovery in the postoperative phase was only seen in tumors of T3a or smaller. CONCLUSION: Intraoperative critical ABR developments continue in the early postoperative phase. A postoperative improvement because of a good start ABR status is a wrong assumption. For a reliable hearing preservation we have to avoid a stable deterioration especially in large tumors and in cochlear nerve preparation. KW - Akustikusneurinom KW - Elektrophysiologie KW - Vestibularisschwannom KW - ABR Monitoring KW - postoperative Phase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109102 ER - TY - THES A1 - Hilse, Claudia T1 - Zeitgangmessung mit phasenkorrigierten Stimuli T1 - "Zeitgang"(Time-step)-measurements with phase-corrected stimuli N2 - Bekannte Methoden zur Optimierung von FAEP-basierenden Hörscreeningmethoden beruhen darauf, bessere Signal-Rausch-Verhältnisse durch möglichst große Amplituden der evozeirten Potentiale zu schaffen. Große Potentiale können schnell und sicher im Mittelungsverfahren detektiert werden. Sie führen so zu einer Steigerung der Sensitivität und Spezifität und zu einer Verringerung der benötigten Messzeit bei den AEP-basierenden Screeningverfahren. Zu den Ansätzen zur Optimierung der Reizmethodik zählz die hohe Reizratentechnik, die den Nachweis der Antworten über die Bildung von Überlappungspotentialen erlaubt. Die Zeitgang-BERA ermöglicht unter Bildung solcher auditorischer steady-state Potentiale (ASSR) die Überprüfung mehrerer Pegelstufen.Für ein FAEP-basierendes Hörscreening werden Reize mit breitem Frequenzspektrum verwendet, die große Antwortamplituden hervorrufen und große Teile der Kochlea, den Hörnerv und REgionen des Hirnstammes überprüfen. Der WüChirp2005-Reiz ist ein breitbandiger Reiz, bei dem im Gegensatz zum üblich verwendeten Klick die Laufzeitverzögerung der Wanderwellen, die zu einer nicht-synchronen Summenantwort führt, ausgeglichen wurde. Vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Einsatz solcher optimierter Reize in Stufenreizen für die Zeitgang-BERA. ZUm direkten Vergleich erfolgen Messdurchgänge mit Klick-Stufenreizen. Untersucht wurden gesunde Neugeborene im Rahmen des universellen Neugeborenen-Hörscreenings der Universitäts-HNO-Klinik Würzburg unter Verwendung des Screeninggerätes MB 11 (MAICO Diagnostic GmbH, Berlin).Einer ersten Untersuchungsgruppe wurden Stufenreize bestehend aus vier aufeinanderfolgenden Reizen ansteigender Pegelwerte (30,40,50,60 dBnHL; Stufenreize I). Die Stufenreize der zweiten Gruppe entsprechen in ihrem Aufbau dem klassischen Zeitgangreiz nach Finkenzeller mit sechs Reizen (10,20,30,40,50,60dBnHL; Stufenreize II).Daraus resultieren unterschiedliche zeitliche Abstände zwischen der Einzelreizen (Stufenreize I: 10,81ms; Stufenreize II: 5ms). Bei den Einzelreizen handelt es sich in einer ersten Messungun normale Klicks (Klick-Stufenreize I bzw.II), in einer Zweiten werden WüChirp2005-Reize (WüChirp2005-Stufenreize I bzw. II) verwendet. Die Laufzeitkorrektur erfolgte nach dem linearen Kochlea-Modell von de Boer und der Frequenz-Transformation nach Greenwood. Der Spektralgehalt beider Einzelreizformen ist identisch (135 Hz bis 8kHz). Bei den Stufenreizen I führte der Einsatz von WüChirp2005-Reizen zu signifikant größeren Wellen V gegenüber Klick-Reizen. Bei der im Neugeborenen-Hörscreening relevanten Pegelstufe 40 dBnHL waren bei 20 der 76 durchgeführten Messungen ausschließlich unter Darbietung der neuen Reize evozierte Potentiale nachzuweisen. Es konnte so u.a. gezeigt werden, dass WÜChirp2005-Reize die Spezifität der Screeningmethode erhöhen kann. Nach der Auswertung und Diskussion der Amplituden der evozierten Potentiale werden die Latenzen der evozierten Wellen V untersucht. N2 - Methods for optimizing auditory brainstem responses (ABR)-based hearing-screeningmethods are based on optimizing the signal-to-noise-ratio by maximize the evoked potential.Large answers can be detected fast and definitely by averaving procedures and lead to increased specifity and sensitivity and also reduce the duration of examination. An appendage to optimize the stimulus methodology is the high-rate-technique. The "Zeitgang"-BERA leads so to auditory steady-state-potentials (ASSP)and makes a chek of several volume levels in only one measurement possible. For a ABR-based hearing-screening are stimuli with large frequency spectrum used wich evoke large amplitudes and chek wide parts of the cochlea, the hearing nerv and also regions of the brainstem. The WüChirp2005-stimulus is a large frequency spectrum signal,in which the delay of the travelling wave in the inner ear is compensated. In contrast to the normal click-stimulus this optimized chirp-signal should lead to larger answer potentials, because they appear much higher synchronisied. This study deals with a combination of WüChirp2005-signals in stimuli for the Zeitgang-BERA. For direct comparison there were accomplished measurements with click-step-stimuli.Measured were healthy newborns which took part in the universal hearing-screening programm in Würzburg. Used was the screening instrument MB11 (MAICO Diagnostics, Berlin). The step-stimuli of a first group are made of four chained stimuli with increasing volume levels (30,40,50,60dBnHL; step-stimuli I). The step-stimuli of a second group accord to the classical Time-step-stimulus (Zeitgang)-signal of Finkenzeller with six signals (10,20,30,40,50,60dBnHL).That results in different time intervals between the several signals (step-stimulus I: 10,81ms; step-stimuli II: 5ms). The step-stimuli are composed in a first measurement of clicks (click-step-stimuli I and II), each newborn was then measured with WüChirp2005-step-stimuli (I and II). The delay of the traveling wave was corrected by cochlea models from de Boer and Greenwood. The frequency spectrum of both click and chirps were identical (135 Hz-8kHz). The results of the step-stimuli of the first group showed significant larger evoked waves V compared to the click-step-stimuli. At 40 dBnHL, which is relevant for hearing screening, answers were in 20 of 76 measurements only after presentation the new, delay-corrected signals were verified, but not after presentation click-step-stimuli. It was able to show that WüChirp2005-signals are able to increase the specitifity of the ABR-screening method. After discussion the amplitudes of the evoked potentials, the study includes also a discussion of the wave V-latencies. KW - Laufzeit KW - Elektrophysiologie KW - Basilarmembran KW - Reihenuntersuchung KW - Screening KW - Frühe akustisch evozierte Potentiale FAEP KW - BERA KW - Auditorische steady-state Potentiale ASSP KW - Neugeborenen-Hörscreening KW - laufzeitkorrigiert KW - Brainstem-Evoked-Response-Audiometry BERA KW - Auditory brainstem responses AER KW - Auditory steady-state responses ASSR KW - newborn hearing-screening Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38650 ER - TY - THES A1 - Guan, Chonglin T1 - Functional and genetic dissection of mechanosensory organs of \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Funktionelle und genetische Analyse von mmechanosensorischen Organe in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - In Drosophila larvae and adults, chordotonal organs (chos) are highly versatile mechanosensors that are essential for proprioception, touch sensation and hearing. Chos share molecular, anatomical and functional properties with the inner ear hair cells of mammals. These multiple similarities make chos powerful models for the molecular study of mechanosensation. In the present study, I have developed a preparation to directly record from the sensory neurons of larval chos (from the lateral chos or lch5) and managed to correlate defined mechanical inputs with the corresponding electrical outputs. The findings of this setup are described in several case studies. (1) The basal functional lch5 parameters, including the time course of response during continuous mechanical stimulation and the recovery time between successive bouts of stimulation, was characterized. (2) The calcium-independent receptor of α-latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), an Adhesion class G protein-coupled receptor (aGPCR), is identified as a modulator of the mechanical signals perceived by lch5 neurons. The results indicate that dCIRL/Latrophilin is required for the perception of external and internal mechanical stimuli and shapes the sensitivity of neuronal mechanosensation. (3) By combining this setup with optogenetics, I have confirmed that dCIRL modulates lch5 neuronal activity at the level of their receptor current (sensory encoding) rather than their ability to generate action potentials. (4) dCIRL´s structural properties (e.g. ectodomain length) are essential for the mechanosensitive properties of chordotonal neurons. (5) The versatility of chos also provides an opportunity to study multimodalities at multiple levels. In this context, I performed an experiment to directly record neuronal activities at different temperatures. The results show that both spontaneous and mechanically evoked activity increase in proportion to temperature, suggesting that dCIRL is not required for thermosensation in chos. These findings, from the development of an assay of sound/vibration sensation, to neuronal signal processing, to molecular aspects of mechanosensory transduction, have provided the first insights into the mechanosensitivity of dCIRL. In addition to the functional screening of peripheral sensory neurons, another electrophysiological approach was applied in the central nervous system: dCIRL may impact the excitability of the motor neurons in the ventral nerve cord (VNC). In the second part of my work, whole-cell patch clamp recordings of motor neuron somata demonstrated that action potential firing in the dCirl\(^K\)\(^O\) did not differ from control samples, indicating comparable membrane excitability. N2 - In Drosophila Larven, sowie in adulten Tieren, sind die Chordotonalorgane (Chos) sehr vielseitige Mechanosensoren und von wesentlicher Bedeutung für die Propriozeption, das Tastgefühl und die auditive Wahrnehmung. Chos teilen molekulare, anatomische und funktionelle Eigenschaften mit Innenohrhaarzellen der Säugetiere und machen sie somit zu leistungsstarken Modellen um molekulare Mechanismen der Mechanosensorik zu untersuchen. In der vorliegenden Studie habe ich ein Präparat entwickelt, um direkt von sensorischen Neuronen der larvalen Chos (von lateralen Chos oder lch5) abzuleiten und definierte mechanische Eingänge mit den korrelierenden elektrischen Ausgängen zu verbinden. Im Folgenden sind die Ergebnisse dieses experimentellen Setups zusammengefasst. (1) Die basalen funktionellen Parameter von lch5 insbesondere der Zeitverlauf der Reaktion während kontinuierlicher mechanischer Stimulation und die Erholungszeit zwischen aufeinanderfolgenden Stimulationen wurden bestimmt. (2) Der Calcium-unabhängige Rezeptor von α-Latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), ein Adhäsion Klasse G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) wurde als Modulator der von Ich5 Neuronen perzipierten mechanischen Signale identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass dCIRL/Latrophilin für die Wahrnehmung der externen und internen mechanischen Reize erforderlich ist und die Empfindlichkeit neuronaler Mechanosensorik modelliert. (3) Mit Hilfe optogenetischer Werkzeuge konnte ich bestätigen, dass dCIRL die Aktivität von lch5 Neuronen auf Ebene des Rezeptorstroms (sensorische Kodierung) und nicht der Generierung von Aktionspotentialen moduliert. (4) Die strukturellen Eigenschaften von dCIRL (z.B. Ektodomänenlänge) sind wesentlich für die mechanosensitiven Eigenschaften von Chos. (5) Die Vielseitigkeit der Chos bietet des Weiteren die Möglichkeit, Multimodalitäten auf mehreren Ebenen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde die neuronale Aktivität der Chos bei verschiedenen Temperaturen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass sich sowohl spontane als auch mechanisch evozierte Aktivität im Verhältnis zur Temperatur erhöhen, was darauf hindeutet, dass dCIRL keine Rolle in der Temperaturwahrnehmung spielt. Diese Erkenntnisse, von der Entwicklung des Präparats der Ton/Vibrations Wahrnehmung, über die neuronalen Signalverarbeitung bis hin zu molekularen Aspekten der Mechanotransduktion, haben erste Einblicke in die Mechanosensitivität von dCIRL gewährt. Neben der funktionellen Charakterisierung peripherer sensorischer Neurone wurde ein weiterer elektrophysiologischer Ansatz im larvalen Zentralnervensystem gewählt, um zu untersuchen, ob sich dCIRL auf die Erregbarkeit motorischer Nervenzellen im Strickleiternervensystem (VNC) auswirkt. Im zweiten Teil meiner Arbeit wird mit Hilfe des whole-cell-patch-clamp-Verfahrens gezeigt, dass die Aktionspotentialfrequenz in Motoneuronen von dCirl\(^K\)\(^O\) Mutanten ähnlich derer von Kontrolltieren ist, d.h. ihre Membranerregbarkeit ist vergleichbar. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Mechanosensation KW - Adhesion-GPCR KW - Electrophysiology KW - Mechanorezeptor KW - Elektrophysiologie KW - Chordontonal organ Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146220 ER - TY - THES A1 - Grotemeyer, Alexander T1 - Characterisation and application of new optogenetic tools in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Charakterisierung und Anwendung neuer optogenetischer Werkzeuge in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the ‘classical’ Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions. N2 - Seit dem Channelrhodopsine das erste Mal beschrieben und erfolgreich in lebende Tiere eingebracht wurden (Nagel et al., 2003 und 2005), kam es zu einem beträchtlichen Fortschritt in diesem interessanten Gebiet der Neurowissenschaften. In der nachfolgenden Zeit wurden viele verschiedene optogenetische Werkzeuge beschrieben und zur Bearbeitung neurowissenschaftlicher Fragestellungen angewandt. Des Weiteren haben neben dem „klassischen“ Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein im Wesentlichen Kation selektiver Kanal, auch modifizierte ChR2 Abkömmlinge, Anion selektive Kanäle und Licht sensitive metabotrope Proteine, die opotogenetische Werkzeugkiste erweitert. Dennoch greifen die meisten Wissenschaftler trotz der Vielfalt an optogenetischen Werkzeugen meist noch zu Channelrhodopsin-2, da seine Wirkungseigenschaften sehr gut erforscht sind. In der nachfolgenden Arbeit wird ein weiterentwickeltes Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), beschrieben. Aufgrund seiner vielfältigen Eigenschaften stellt es ein vielversprechendes Werkzeug dar, vor allem für zukünftige neurowissenschaftliche Forschungsarbeiten. Hierbei wurde ChR2XXM eingesetzt, um zu untersuchen welche Auswirkungen das Fehlen von Latrophilin im Chordotonal Organ von Drosophilalarven hat. Schließlich wurde noch die Funktionalität von GtACR an der neuromuskulären Endplatte der Drosophila überprüft. Für die umfassende Charakterisierung wurden elektrophysiologische und verhaltensbasierte Experimente an Larven durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass ChR2XXM aufgrund einer erhöhten Affinität zu dem Chromophore Retinal, im Vergleich zu ChR2 ein besseres zelluläres Expressionsmuster, eine bessere zeitliche Auflösung und eine erheblich höhere Lichtsensitiviät aufweist. Durch den Einsatz von ChR2XXM konnte, aufgrund der hohen Lichtsensitiviät, mit nur minimalen Nebeneffekten, wie z.B. mögliche Wärmeaktivierung des Chordotonalorgans, der Einfluss von Latrophilin (dCIRL) auf die Signaltransmission im Chordotonalorgan, aufgeklärt werden. Ferner führte eine optogenetische, in vivo, Aktivierung des Chordotonalorgans zu Verhaltensänderungen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass GtACR1 zwar effektiv motoneuronale Erregung inhibieren kann, dies aber von unerwarteten Nebeneffekten begleitet wird. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass weitere Forschung und Verbesserungen im Bereich der optogenetischen Werkzeuge sehr wertvoll und notwendig ist, um Wissenschaftlern zu erlauben das am besten geeignetste optogenetische Werkzeug für ihre wissenschaftlichen Fragestellungen auswählen zu können. KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin-2 KW - optogenetics KW - Drosophila melanogaster KW - Channelrhodopsin KW - Electrophysiology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178793 ER - TY - THES A1 - Frenz, Silke T1 - Generierung und Evaluation von Mausmodellen für die auditorische Neuropathie T1 - Generation and evaluation of mouse models of auditory neuropathy N2 - Der Hörsinn ist für uns Menschen von entscheidender Bedeutung, um mit der Umwelt kommunizieren zu können. Hörstörungen werden dabei in sensorineurale Erkrankungen der neuronalen Strukturen und nicht-sensorineurale Schallleitungsschwerhörigkeiten unterschieden. In der vorliegenden Studie sollte es darum gehen zu untersuchen, inwiefern ein neues konditionelles Mausmodell, die Brn3.1 IRES Cre Maus, und ein bestehendes Mausmodell, die pmn-Maus, sich eignen, um die Erkrankung der auditorischen Neuropathie nachzubilden. Die Brn3.1 IRES Cre Maus wurde zur Evaluation der Expression von Cre-Rekombinase unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors mit gefloxten Reporter-Mauslinien verkreuzt. Die pmn-Maus ist ein anerkanntes Modell einer Motoneuronerkrankung, hatte aber in vorherigen Untersuchungen erhöhte Hörschwellen gezeigt. Alle verwendeten Mauslinien wurden mittels ABR und DPOAE frequenzspezifisch untersucht, um die Funktion der Haarzellen im Corti´schen Organ zu evaluieren. Bei der pmn-Linie wurden die audiologischen Untersuchungen wöchentlich zwischen P21 und P35 durchgeführt. Zusätzlich wurde das Corti´sche Organ zu diesen Zeitpunkten morphologisch untersucht. Es zeigte sich, dass alle verwendeten Mauslinien unauffällige Hörschwellen verglichen zur Backgroundlinie C57BL/6 hatten sowie DPOAE-Antworten zeigten. Die Verkreuzung der Brn3.1 IRES Cre Linie mit den beiden Reporterlinien zeigte eine nachweisbare Cre-Rekombinase-Expression unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors nur an den postnatalen Tagen P14 und P21. Diese Expression erfolgte mosaikartig in den äußeren Haarzellen. Mit Hilfe einer RT-PCR wurde eine Diskrepanz zwischen Genotyp und Expression des Reporterproteins im Gewebe festgestellt. Dies ließ vermuten, dass die Expression von Cre-Rekombinase durch gene silencing Prozesse unterdrückt wurde und Brn3.1 als Promotor nicht leistungsstark genug war, um eine Cre-Rekombinase-Expression steuern zu können. Die pmn-Linie zeigte in ABR-Untersuchungen bereits zum Zeitpunkt P21 erhöhte Hörschwellen in allen untersuchten Frequenzen im Vergleich zum Wildtyp. DPOAE-Antworten waren in der pmn-Linie nur bedingt auslösbar. Es zeigte sich in der morphologischen Evaluation ein Verlust von äußeren Haarzellen über die gesamte Länge des Corti´schen Organes. Durch einen TUNEL-Assay konnte das Absterben dieser Zellen durch apoptotische Vorgänge nachgewiesen werden. Der pmn-Phänotyp entsteht durch eine Mutation im TBCE Gen. Dieses Gen kodiert für ein Protein, welches einen stabilisierenden Einfluss auf die Organisation der Mikrotubuli hat. Die TBCE-Verteilung im Corti´schen Organ zeigte, dass dieses hauptsächlich in den äußeren Haarzellen und inneren Stützzellen exprimiert wird und damit wahrscheinlich einen bedeutenden Einfluss auf die Erhaltung der Haarzellen hat. Eine Analyse des Hörnervs zeigte einen Verlust von Mikrotubuli. Neben diesen in vivo Untersuchungen sollte außerdem eine gliazellfreie Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen etabliert werden. Hierfür wurden mehrere Faktoren einer Primärzellkultur in Bezug auf ihren Einfluss auf die Gesamtzellzahl, den prozentualen Neuronanteil und die Axonlänge der Neurone untersucht. Das Medium, die Beschichtung des Zellkulturgefäßes, die Gabe von Neurotrophinen/Zytokinen und der Einsatz eines Zytostatikums wurden separat untersucht. Es zeigte sich, dass das Medium, die Beschichtung und Neurotrophin-/Zytokingabe hauptsächlich einen Einfluss auf das axonale Längenwachstum von Neuronen haben. Den Prozentsatz der Neurone beeinflusste nur der Einsatz des Zytostatikums Cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) signifikant. Die Ergebnisse wurden auch im Zusammenhang mit der reellen Neuronanzahl in Kultur gesehen. Es ergab sich weiterhin eine Präferenz für DMEM- über NB-Medium sowie für zusätzliche Lamininbeschichtung, für den Einsatz des Zytokins LIF gegenüber den neurotrophen Faktoren BDNF und NT-3 und die Gabe des Zytostatikums AraC ab Tag 2 nach Ausplattierung in einer Konzentration von 5-10 µM. Ein kombinatorischer Einsatz dieser Präferenzen spiegelte in Summe die Ergebnisse der Versuchsreihen Neurotrophine/Zytokin und AraC wieder. Der Anteil der Neurone in der Kultur konnte im Durchschnitt auf 10-12 % gesteigert werden. Eine Verschiebung des Glia-/Neuronenanteils zugunsten letzterer ist vermutlich nur durch den Einsatz weiterer Faktoren oder anderer Methoden möglich. Die untersuchten Mausmodelle zeigten auf Grund der Untersuchungsergebnisse nur teilweise Ähnlichkeiten mit der Erkrankung der auditorischen Neuropathie. Die Erkenntnisse zur pmn-Mauslinie über das frequenzspezifische Hörvermögen und die morphologische Degeneration im Corti´schen Organ im altersabhängigen Verlauf können aber hilfreich sein, um neben der motorischen auch die sensorische Degeneration dieser Pathologie besser zu verstehen. Zudem konnten auch umfassende Erkenntnisse für die Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen der Maus in Bezug auf verschiedene Variablen erhalten werden. N2 - As one of the five senses the aural sense is the most essential part for human interactions and communication. Disturbances of this sense are differentiated into non-sensorineural disorders with a disturbed sound transmission, and sensorineural ones, which affect the neural structures of the ear. The actual study was focused on the question if a newly generated mouse model, the Brn3.1 IRES Cre mouse, and an established line, the pmn-mouse, were suitable to simulate the pathology of auditory neuropathy. The Brn3.1 IRES Cre mouse was crossbred with flox reporter mouse lines to evaluate the expression of Cre recombinase under the activity of the Brn3.1 promotor. The pmn-mouse is the existing murine model of a motoneuron disease, but showed elevated hearing thresholds in previous studies. All used lines were audiologically tested at different frequencies using ABR and DPOAE to evaluate the functional status of the hair cells in the organ of Corti. These evaluations were done in the pmn-line weekly from P21 to P35. At those time points the organ of Corti was also evaluated morphologically. The study showed that all used mouse lines showed normal hearing thresholds compared to the background line C57BL/6 and displayed DPOAE answers. In F1 offspring of Brn3.1 IRES Cre crossbred with the LacZ reporter line Cre recombinase expression under Brn3.1 promotor activity was observed at P14 and P21. Expression was mosaic-like in outer hair cells and limited to the aforementioned time points. Using RT-PCR is was possible to show a discrepancy between genotype and expression of the reporter protein in the tissue. It was assumed, that expression of Cre recombinase was suppressed by gene silencing processes and Brn3.1 was not potent enough to drive sufficient Cre recombinase expression. The audiological evaluation of the pmn-line showed already at P21 elevated hearing thresholds compared to wildtype mice. DPOAE answers could be elicited only in certain frequencies in pmn-mice. Morphological analysis showed a loss of outer hair cells spanning the whole length of the organ of Corti at all phases. A TUNEL assay showed that the hair cells died by apoptosis. The pmn-phenotype is characterized by a mutation in the TBCE gene, a protein responsible for organization of microtubules. A distribution analysis showed that TBCE in the organ of Corti was mainly expressed in the outer hair cells as well as the inner pillar cells and thus likely influences the maintenance of these structures. The auditory nerves of the pmn-mice also displayed some loss of microtubules. Additionally to the in vivo evaluation, it was tried to establish a glial cell free culture of dissociated spiral ganglia neurons. Therefore several factors of a primary cell culture were evaluated concerning their influence on overall cell number, percentage of neurons and neuritic outgrowth. To establish a glial cell free culture of dissociated spiral ganglia neurons, the variables media, coating, neurotrophins/cytokines and use of a cytostatic were evaluated separately. While the first three mentioned mainly influenced the neurite outgrowth in culture, the last one increased the percentage of neurons. The results were checked against the real number of neurons in culture. The results yielded a preference for DMEM over NB medium, as well as for additional laminin coating, the use of the cytokine LIF over the neurotrophins BDNF and NT-3 and the application of the cytostatic cytosine-β-D-arabinofuranosid at a concentration of 5-10 µM from day 2 after plating. Combining these preferences yielded similar results to those of the test series of neurotrophins/cytokines and cytostatic. The percentage of neurons in culture could be increased to an average of 10-12 %. A shift of the glial cell/neuron percentage in favor of the latter seems to need the addition of further factors or the use of other methods. The results showed, that the mouse lines evaluated in this study did not resemble pathologies fully comparable to those of auditory neuropathy. However, further information on the pmn-mouse line concerning frequency-specific hearing thresholds and morphologic degeneration in the organ of Corti in a time dependent manner could be gathered. This may be helpful to better understand sensory next to motor neuron degeneration in this pathology. Furthermore comprehensive results could be gained for the culture of dissociated spiral ganglia neurons concerning different variables. KW - Audiologie KW - Neuropathologie KW - Elektrophysiologie KW - Sinneszelle KW - Auditorische Neuropathie KW - Haarzelle KW - Corti-Organ KW - transgenes Modell KW - sensorische Neurone KW - Transgener Organismus KW - Maus KW - Tiermodell Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177101 ER - TY - THES A1 - Ehmann, Nadine T1 - Linking the active zone ultrastructure to function in Drosophila T1 - Struktur-Funktions-Beziehungen an der aktiven Zone in Drosophila N2 - Accurate information transfer between neurons governs proper brain function. At chemical synapses, communication is mediated via neurotransmitter release from specialized presynaptic intercellular contact sites, so called active zones. Their molecular composition constitutes a precisely arranged framework that sets the stage for synaptic communication. Active zones contain a variety of proteins that deliver the speed, accuracy and plasticity inherent to neurotransmission. Though, how the molecular arrangement of these proteins influences active zone output is still ambiguous. Elucidating the nanoscopic organization of AZs has been hindered by the diffraction-limited resolution of conventional light microscopy, which is insufficient to resolve the active zone architecture on the nanometer scale. Recently, super-resolution techniques entered the field of neuroscience, which yield the capacity to bridge the gap in resolution between light and electron microscopy without losing molecular specificity. Here, localization microscopy methods are of special interest, as they can potentially deliver quantitative information about molecular distributions, even giving absolute numbers of proteins present within cellular nanodomains. This thesis puts forward an approach based on conventional immunohistochemistry to quantify endogenous protein organizations in situ by employing direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Focussing on Bruchpilot (Brp) as a major component of Drosophila active zones, the results show that the cytomatrix at the active zone is composed of units, which comprise on average ~137 Brp molecules, most of which are arranged in approximately 15 heptameric clusters. To test for a quantitative relationship between active zone ultrastructure and synaptic output, Drosophila mutants and electrophysiology were employed. The findings indicate that the precise spatial arrangement of Brp reflects properties of short-term plasticity and distinguishes distinct mechanistic causes of synaptic depression. Moreover, functional diversification could be connected to a heretofore unrecognized ultrastructural gradient along a Drosophila motor neuron. N2 - Kommunikation zwischen Nervenzellen ist von grundlegender Bedeutung für die Hirnfunktion. An chemischen Synapsen findet diese an hoch spezialisierten interzellulären Kontaktstellen statt, den aktiven Zonen, welche die Voraussetzung für präzise Neurotransmission schaffen und somit die synaptische Kommunikation gewährleisten. In aktiven Zonen befindet sich eine Vielzahl von Proteinen dicht gepackt, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Plastizität der Signaltransduktion vermitteln. Bisher ist es jedoch unklar, in welcher Weise die molekularen Organisationsprinzipien dieser Proteine die Funktion der aktiven Zone beeinflussen. Teilweise ist dies dem Auflösungsvermögen konventioneller Lichtmikroskopie geschuldet, das nicht ausreicht um die Architektur der aktiven Zone im Nanometer Bereich aufzuklären. Unlängst jedoch haben neue Methoden der hochaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie ihren Weg in die Neurowissenschaften gefunden. Diese sind in der Lage die Lücke zwischen optischer Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu schließen, ohne die Identität der Proteinspezies aus den Augen zu verlieren. Besonderes Interesse kommt hierbei sogenannten Lokalisationsmikroskopie Techniken zu. Diese können neben der Darstellung molekularer Organisationen im Idealfall sogar quantitative Informationen über die absolute Anzahl bestimmter Moleküle in subzellulären Bereichen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die auf klassischer Immunohistochemie beruht und dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) nutzt, um die endogene Proteinorganisation in situ zu quantifizieren. Fokussierend auf Brp (Bruchpilot), einem Protein an der aktiven Zone von Drosophila melanogaster, zeigen die Ergebnisse, dass die Zytomatrix an der aktiven Zone modular aufgebaut ist, wobei jedes Modul ~137 Brp Moleküle umfasst. Diese sind zum Großteil in etwa 15 Gruppen mit je 7 Untereinheiten angeordnet. Um auf einen quantitativen Zusammenhang zwischen der Ultrastruktur der aktiven Zone und ihrer Funktion zu schließen, wurden Drosophila Mutanten eingesetzt und mittels Elektrophysiologie funktionell untersucht. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass sich spezifische Eigenschaften von Kurzzeitplastizität in der präzisen Anordnung von Brp widerspiegeln, was Rückschlüsse auf verschiedene Ursprünge synaptischer Depression zulässt. Darüber hinaus beschrieben dSTORM Experimente erstmals, dass ein funktioneller Gradient entlang des Motoneurons mit der graduellen Veränderung der Anzahl von Bruchpilotmolekülen pro aktive Zone korreliert. KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Synapse KW - Drosophila KW - active zone KW - structure-function relationships KW - super-resolution microscopy KW - electrophysiology KW - Synapses KW - Microscopy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118186 ER - TY - THES A1 - Dindas, Julian T1 - Cytosolic Ca\(^2\)\(^+\), a master regulator of vacuolar ion conductance and fast auxin signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Zytosolisches Ca\(^2\)\(^+\), ein zentraler Regulator der vakuolären Ionenleitfähigkeit und der schnellen Auxin-Signaltransduktion in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Das Phytohormon Auxin erfüllt wichtige Funktionen bei der Initiierung von pflanzlichen Geweben und Organen, wie auch in der Steuerung des Wurzelwachstums im Zusammenspiel mit äußeren Reizen wie Schwerkraft, Wasser- und Nähstoffverfügbarkeit. Diese Funktionen basieren dabei vor allem auf der Auxin-abhängigen Regulation von Zellteilung und -streckung. Wichtig für letzteres ist dabei die Kontrolle des Zellturgors durch die Vakuole. Als Speicher für Nährstoffe, Metabolite und Toxine sind Vakuolen von essentieller Bedeutung. Vakuolär gespeicherte Metabolite und Ionen werden sowohl über aktive Transportprozesse, als auch passiv durch Ionenkanäle, über die vakuoläre Membran mit dem Zytoplasma ausgetauscht. In ihrer Funktion als second messenger sind Kalziumionen wichtige Regulatoren, aber auch Gegenstand vakuolärer Transportprozesse. Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration wirken nicht nur lokal, sie werden auch mit einer Signalweiterleitung über längere Distanzen in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden elektrophysiologische Methoden mit bildgebenden Methoden kombiniert um Einblicke in das Zusammenspiel zwischen zytosolischen Kalziumsignalen, vakuolärer Transportprozesse und der Auxin-Physiologie im intakten pflanzlichen Organismus zu gewinnen. Kalziumsignale sind an der Regulierung vakuolärer Ionenkanäle und Transporter beteiligt. Um dies im intakten Organismus zu untersuchen wurden im Modellsystem junger Wurzelhaare von Arabidopsis thaliana Messungen mit intrazellulären Mikroelektroden durchgeführt. Mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik konnte bestätigt werden, dass die vakuoläre Membran der limitierende elektrische Wiederstand während intravakuolärer Messungen ist und so gemessene Ionenströme in der Tat nur die Ströme über die vakuoläre Membran repräsentieren. Die bereits bekannte zeitabhängige Abnahme der vakuolären Leitfähigkeit in Einstichexperimenten konnte weiterhin mit einer einstichbedingten, transienten Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration korreliert werden. Durch intravakuoläre Spannungsklemmexperimente in Wurzelhaarzellen von Kalziumreporterpflanzen konnte dieser Zusammenhang zwischen vakuolärer Leitfähigkeit und der zytosolischen Kalziumkonzentration bestätigt werden. Die Vakuole ist jedoch nicht nur ein Empfänger zytosolischer Kalziumsignale. Da die Vakuole den größten intrazellulären Kalziumspeicher darstellt, wird seit Langem diskutiert, ob sie auch an der Erzeugung solcher Signale beteiligt ist. Dies konnte in intakten Wurzelhaarzellen bestätigt werden. Änderungen des vakuolären Membranpotentials wirkten sich auf die zytosolische Kalziumkonzentration in diesen Zellen aus. Während depolarisierende Potentiale zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration führten, bewirkte eine Hyperpolarisierung der vakuolären Membran das Gegenteil. Thermodynamische Überlegungen zum passiven und aktiven Kalziumtransport über die vakuoläre Membran legten dabei den Schluss nahe, dass die hierin beschriebenen Ergebnisse das Verhalten von vakuolären H+/Ca2+ Austauschern wiederspiegeln, deren Aktivität durch die protonenmotorische Kraft bestimmt wird. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich weiterhin heraus, dass zytosolisches Kalzium ebenso ein zentraler Regulator eines schnellen Auxin-induzierten Signalweges ist, über den der polare Transport des Hormons reguliert wird. Im gleichen Modellsystem junger Wurzelhaare konnte gezeigt werden, dass die externe Applikation von Auxin eine sehr schnelle, Auxinkonzentrations- und pH-abhängige Depolarisation des Plasmamembranpotentials zur Folge hat. Synchron zur Depolarisation des Plasmamembranpotentials wurden im Zytosol transiente Kalziumsignale registriert. Diese wurden durch einen von Auxin aktivierten Einstrom von Kalziumionen durch den Ionenkanal CNGC14 hervorgerufen. Experimente an Verlustmutanten als auch pharmakologische Experimente zeigten, dass zur Auxin-induzierten Aktivierung des Kalziumkanals die Auxin-Perzeption durch die F-box Proteine der TIR1/AFB Familie erforderlich ist. Durch Untersuchungen der Auxin-abhängigen Depolarisation wie auch des Auxin-induzierten Einstroms von Protonen in epidermale Wurzelzellen von Verlustmutanten konnte gezeigt werden, dass die sekundär aktive Aufnahme von Auxin durch das hochaffine Transportprotein AUX1 für die schnelle Depolarisation verantwortlich ist. Nicht nur die zytosolischen Kalziumsignale korrelierten mit der CNGC14 Funktion, sondern ebenso die AUX1-vermittelte Depolarisation von Wurzelhaaren. Eine unveränderte Expression von AUX1 in der cngc14 Verlustmutante legte dabei den Schluss nahe, dass die Aktivität von AUX1 posttranslational reguliert werden muss. Diese Hypothese erfuhr Unterstützung durch Experimente, in denen die Behandlung mit dem Kalziumkanalblocker Lanthan zu einer Inaktivierung von AUX1 im Wildtyp führte. Die zytosolische Beladung einzelner epidermaler Wurzelzellen mit Auxin hatte die Ausbreitung lateraler und acropetaler Kalziumwellen zur Folge. Diese korrelierten mit einer Verschiebung des Auxin-Gradienten an der Wurzelspitze und unterstützten somit eine hypothetische Kalziumabhängige Regulation des polaren Auxin Transports. Ein Model für einen schnellen, Auxin induzierten und kalziumabhängigen Signalweg wird präsentiert und dessen Bedeutung für das gravitrope Wurzelwachstum diskutiert. Da die AUX1-vermittelte Depolarisation in Abhängigkeit von der externen Phosphatkonzentration variierte, wird die Bedeutung dieses schnellen Signalwegs ebenso für die Anpassung des Wurzelhaarwachstums an eine nicht ausreichende Verfügbarkeit von Phosphat diskutiert. N2 - The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism. Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration. However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force. In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone. In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family. Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type. The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate. KW - Ackerschmalwand KW - Auxine KW - Vakuole KW - Calcium KW - Elektrophysiologie KW - Pflanzenhormone KW - Hormontransport KW - Ionenleitfähigkeit KW - Signaltransduktion KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158638 ER - TY - THES A1 - Breher, Stephanie T1 - Die kardiale Funktion von Popdc1 in der Maus: Vom Gen zum Phän T1 - The cardiac function of Popdc1 in mouse: From gene to phene N2 - Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolutionär stark konservierte Genfamilie mit präferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkanälen und anderen myozytären Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikulären Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegenüber dem ventrikulären Arbeitsmyokard erhöht, während Atrium und Sinusknoten nahezu äquivalente Expressionsdomänen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabhängig auftritt und auf Sinuspausen zurückzuführen ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminosäure umfassende, stark konservierte Popeye-Domäne aufweist. Für diese Domäne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdomänen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine für zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkanäle untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erhöht und dass die β-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verstärkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine überlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivität, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkanälen aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Phänotypen für die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie überlappende und redundante Funktionen aufweist. N2 - The Popeye domain containing (Popdc) family is a highly evolutionary conserved gene family, which shows no homology to other genes. This family shows a preferential expression in the heart and skeletal muscle. In the present study it is shown that Popdc1 protein in the heart was predominantly localized to the intercalated disc, lateral membranes and T-tubularsystem, where it was co-localized with other cardiac membrane proteins such as Cav1.2, Caveolin 3 and NCX1. The expression of Popdc1-LacZ transgene as well as Popdc1 protein was elevated in the ventricular conduction system compared to the ventricular working myocardium. In contrast, expression in atrial tissue was equivalent to the expression in the sinus node. Electrophysiological measurements in Popdc1 null mutants revealed a stressinduced and age-dependent sinus bradycardia, which was due to an increase in sinus pauses and independent of the nature of stress. Histological examinations with the help of the sinus node marker HCN4 revealed structural alterations in the inferior part of the sinus node in 8 months old Popdc1-mice. Biochemical examinations of Popdc1 showed that Popdc1 is a transmembrane protein. The N-terminus is extracellular and glycosylated, while the Cterminus is intracellular and harbours a highly conserved 150 amino acid-long Popeye domain. For this domain, a predicted homology to cyclic nucleotide binding domains was observed. Binding of cAMP and cGMP was experimentally demonstrated and thus, the Popdc proteins constitute a novel branch of the cyclic nucleotide binding protein family. Furthermore interaction of Popdc1 with the tandem pore channel TREK1 was examined. After co-injection of Popdc1 the TREK1 current was increased in Xenopus oocytes. Furthermore, β-adrenergic inhibition of TREK1 current was enhanced in the presence of Popdc1. In working myocardium, conduction tissue as well as in co-transfected Cos7 cells the two proteins showed a similar distribution. In conclusion, Popdc1 is involved in cardiac pacemaker activity, maintaining sinus node morphology and modulating ion channels that contribute to the setting of the membrane potential in cardiac myocytes. Interestingly, a highly similar phenotype was observed for the Popdc2 mouse mutant and therefore the Popdc gene family displays overlapping and redundant functions. KW - Sinusknoten KW - Genexpression KW - Elektrophysiologie KW - Popdc1 KW - Transmembranprotein KW - Sinusknotenbradykardie KW - cAMP-Bindung KW - Popdc1 KW - transmembrane protein KW - sinus bradycardia KW - cAMP binding Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37283 ER - TY - THES A1 - Bieniussa, Linda Ilse T1 - Different effects of conditional Knock-Out of Stat3 on the sensory epithelium of the Organ of Corti T1 - Unterschiedliche Auswirkungen des konditionellen Knock-Outs von Stat3 im sensorischen Epithel des Cortischen Organs N2 - Die Cochlea von Säugetieren nimmt Schall als Reaktion auf Vibrationen an frequenzabhängigen Positionen entlang des Cochlea-Kanals wahr. Die sensorischen äußeren Haarzellen, die von Stützzellen umgeben sind, wirken als Signalverstärker, indem sie ihre Zelllänge verändern können. Dies wird als Elektromotilität bezeichnet. Um eine korrekte elektrische Übertragung bei mechanischen Kräften zu gewährleisten, ist ein gewisser Widerstand des sensorischen Epithels eine Voraussetzung für die fehlerfreie Weiterleitung von Hörinformationen. Dieser Widerstand wird durch Mikrotubuli und deren posttranslationalen Modifikationen in den Stützzellen des sensorischen Epithels der Cochlea gewährleistet. Stat3 ist ein Transkriptionsfaktor, der an verschiedenen Phosphorylierungsstellen, sowie je nach Zelltyp und aktiviertem Signalweg an vielen zellulären Prozessen wie Differenzierung, Entzündung, Zellüberleben und Mikrotubuli-Dynamik beteiligt ist. Während Stat3 ein breites Spektrum an intrazellulären Funktionen hat, stellte sich die Frage, wie und ob Stat3 in den Zellen des Cortischen Organ einen Einfluss auf den Hörprozess hat. Um dies zu testen, wurde das Cre/loxp-System verwendet, um Stat3 in den äußeren Haarzellen oder den Stützzellen entweder vor oder nach Hörbeginn von Mäusen konditional auszuschalten. Um das Hörvermögen zu erfassen, wurden DPOAE- und ABR-Messungen durchgeführt, während molekulare und morphologische Untersuchungen mittels Sequenzierung und Immunhistochemie durchgeführt wurden. Eine konditioneller Knock-Out von Stat3 vor und nach dem Beginn des Hörens in äußeren Haarzellen führt zu leichten Hörschäden, während Synapsen, Nervenfasern und Mitochondrien nicht betroffen waren. Die Analyse der Sequenzierung von äußeren Haarzellen aus Mäusen mit konditionellem Knock-Out vor dem Beginn des Hörens ergab eine Störung der zellulären Homöostase und der extrazellulären Signale. Ein konditioneller Knock-Out von Stat3 in den äußeren Haarzellen nach Beginn des Hörens führte zu einem früh-entzündlichen Signalweg mit erhöhter Zytokinproduktion und der Hochregulierung des NF-κB-Wegs. In den Stützzellen führte ein kondioneller Knock-Out von Stat3 nur nach dem Beginn des Hörens zu einer Hörbeeinträchtigung. Synapsen, Nervensoma und -fasern waren jedoch von einem konditionellen Knock-Out von Stat3 in Stützzellen nicht betroffen. Dennoch war die detyronisierte Modifikation der Mikrotubuli verändert, was zu einer Instabilität der Stützzellen, insbesondere der Phalangealfortsätze, führte, was wiederum zu einer Instabilität des Epithels während des Hörvorgangs führte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein konditioneller Knock-Out von Stat3 in Zellen des Cortischen Organs zu einer Hörstörung führte. Während ein konditioneller Knock-Out in äußeren Haarzellen eine erhöhte Zytokinproduktion zur Folge hatte, verloren die Stützzellen ihre Zellstabilität aufgrund einer verminderten detyronisierten Modifikation der Mikrotubuli. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Stat3 ein wichtiges Protein für die Hörleistung ist. Es sind jedoch weitere Untersuchungen des molekularen Mechanismus erforderlich, um die Rolle von Stat3 in den Zellen des Corti-Organs zu verstehen. N2 - The mammalian cochlea detects sound in response to vibration at frequency-dependent positions along the cochlea duct. The sensory outer hair cells, which are surrounded by supporting cells, act as a signal amplifier by changing their cell length. This is called electromotility. To ensure correct electrical transmission during mechanical forces, a certain resistance of the sensory epithelium is a prerequisite for correct transduction of auditory information. This resistance is managed by microtubules and its posttranslational modification in the supporting cells of the sensory epithelium of the cochlea. Stat3 is a transcription factor, with its different phosphorylation sites, is involved in many cellular processes like differentiation, inflammation, cell survival and microtubule dynamics, depending on cell type and activated pathway. While Stat3 has a wide range of intracellular roles, the question arose, how and if Stat3 is involved in cells of the organ of Corti to ensure a correct hearing. To test this, Cre/loxp system were used to perform conditional Knock-Out (cKO) of Stat3 in outer hair cells or supporting cells either before hearing onset or after hearing onset. Hearing performances included DPOAE and ABR measurements, while molecular were performed by sequencing. Additionally, morphological examination was used by immunohistochemistry and electron microscopy. A cKO of Stat3 before and after hearing onset in outer hair cells leads to hearing impairments, whereas synapses, nerve fibers and mitochondria were not affected. Bulk sequencing analyzation of outer hair cells out of cKO mice before hearing onset resulted in a disturbance of cellular homeostasis and extracellular signals. A cKO of Stat3 in the outer hair cells after hearing onset resulted in inflammatory signaling pathway with increased cytokine production and upregulation of NF-kb pathway. In supporting cells, cKO of Stat3 only after hearing onset resulted in a hearing impairment. However, synapses, nerve soma and fibers were not affected of a cKO of Stat3 in supporting cells. Nevertheless, detyronisated modification of microtubules were altered, which can lead to an instability of supporting cells during hearing. In conclusion, Stat3 likely interact in a cell-specific and function-specific manner in cells of the organ of Corti. While a cKO in outer hair cells resulted in increased cytokine production, supporting cells altered its stability due to decreased detyronisated modification of microtubules. Together the results indicated that Stat3 is an important protein for hearing performances. However, additional investigations of the molecular mechanism are needed to understand the role of Stat3 in the cells of the organ of Corti. KW - Audiologie KW - Corti-Organ KW - Transgener Organismus KW - Sinneszelle KW - Elektrophysiologie KW - Stat3 KW - Mikrotubuli KW - conditional Knockout KW - hearing KW - Organ of Corti KW - Mikrotubulus Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351434 ER - TY - THES A1 - Araragi, Naozumi T1 - Electrophysiological investigation of two animal models for emotional disorders - serotonin transporter knockout mice and tryptophan hydroxylase 2 knockout mice T1 - Elektrophysiologische Untersuchung bei zwei Tiermodellen für emotionale Störungen - Serotonin Transporter knockout Mäuse und Tryptophan Hydroxylase 2 knockout Mäuse N2 - Serotonin (5-HT) has been implicated in the regulation of emotions as well as in its pathological states, such as anxiety disorders and depression. Mice with targeted deletion of genes encoding various mediators of central serotonergic neurotransmission therefore provides a powerful tool in understanding contributions of such mediators to homeostatic mechanisms as well as to the development of human emotional disorders. Within this thesis a battery of electrophysiological recordings were conducted in the dorsal raphe nucleus (DRN) and the hippocampus of two murine knockout lines with deficient serotonergic systems. Serotonin transporter knockout mice (5-Htt KO), which lack protein responsible for reuptake of 5-HT from the extracellular space and tryptophan hydroxylase 2 knockout (Tph2 KO) mice, which lack the gene encoding the neuronal 5-HT-synthesising enzyme. First, 5-HT1A receptor-mediated autoinhibition of serotonergic neuron firing in the DRN was assessed using the loose-seal cell-attached configuration. Stimulation of 5-HT1A receptors by a selective agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), showed a mild sensitisation and a marked desensitisation of these receptors in Tph2 KO and 5-Htt KO mice, respectively. While application of tryptophan, a precursor of 5-HT and a substrate of Tph2, did not cause autoinhibition in Tph2 KO mice due to the lack of endogenously produced 5-HT, data from 5-Htt KO mice as well as heterozygous mice of both KO mice lines demonstrated the presence of autoinhibitory mechanisms as normal as seen in wildtype (WT) controls. When the Tph2-dependent step in the 5-HT synthesis pathway was bypassed by application of 5-hydroxytryptophan (5-HTP), serotonergic neurons of both Tph2 KO and 5-Htt KO mice showed decrease in firing rates at lower concentrations of 5-HTP than in WT controls. Elevated responsiveness of serotonergic neurons from Tph2 KO mice correspond to mild sensitisation of 5-HT1A receptors, while responses from 5-Htt KO mice suggest that excess levels of extracellular 5-HT, created by the lack of 5-Htt, stimulates 5-HT1A receptors strong enough to overcome desensitisation of these receptors. Second, the whole-cell patch clamp recording data from serotonergic neurons in the DRN showed no differences in basic electrophysiological properties between Tph2 KO and WT mice, except lower membrane resistances of neurons from KO mice. Moreover, the whole-cell patch clamp recording from CA1 pyramidal neurons in the hippocampus of 5-Htt KO mice showed increased conductance both at a steady state and at action potential generation. Lastly, magnitude of long-term potentiation (LTP) induced by the Schaffer collateral/commissural pathway stimulation in the ventral hippocampus showed no differences among Tph2 KO, 5-Htt KO, and WT counterparts. Taken together, lack and excess of extracellular 5-HT caused sensitisation and desensitisation of autoinhibitory 5-HT1A receptors, respectively. However, this may not directly translate to the level of autoinhibitory regulation of serotonergic neuron firing when these receptors are stimulated by endogenously synthesised 5-HT. In general, KO mice studied here showed an astonishing level of resilience to genetic manipulations of the central serotonergic system, maintaining overall electrophysiological properties and normal LTP inducibility. This may further suggest existence of as-yet-unknown compensatory mechanisms buffering potential alterations induced by genetic manipulations. N2 - Serotonin (5-HT) ist an der Regulation von der Emotionen, sowie ihrer pathologischen Zustände, wie Angststörungen und Depressionen beteiligt. Mäuse denen, mittels einer zielgerichteteten Deletion von Genen, die verschiedenste Proteine involviert in der zentralen serotonergen Nerotransmission fehlen, dienen daher als ein nützliches Tiermodell, um die Rolle dieser Mediatoren bei Homöostasemechanismen und der Entwicklung emotionaler Störungen beim Menschen zu verstehen. Im Rahmen dieser Thesis wurde eine Batterie von elektrophysiologischen Ableitungen im Hippocampus sowie in der dorsalen Raphe Nucleus (DRN) zweier Knockout-Mauslinien mit einem defizienten serotonergen Systems durchgeführt. Serotonintransporter Knockout-Mäuse (5-Htt KO), denen das Protein zur Wiederaufnahme von 5-HT aus dem extrazellulären Raum fehlt und Tryptophanhydroxylase 2 Knockout-Mäuse (Tph2 KO), denen das Gen für das 5-HT-synthetisierende Enzym im Gehirn fehlt. Zunächst wurde mittels der “loose-seal cell-attached” Aufnahmemethode die Eigenhemmung der serotonergen Neuronen untersucht, die durch 5-HT1A Rezeptoren in der DRN vermittelt wird. Stimulierung der 5-HT1A Rezeptoren durch einen selektiven Agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), zeigte eine milde Sensibilisierung und eine deutliche Desensibilisierung dieser Rezeptoren in Tph2 KO bzw. in 5-Htt KO Mäusen. Während die Anwendung von Tryptophan, eine Vorstufe von 5-HT und ein Substrat der Tph2, keine Eigenhemmung, aufgrund des Mangels an endogen produziertem 5-HT, in Tph2 KO Mäusen verursachte, wiesen Daten von 5-Htt KO Mäusen sowie von heterozygoten Mäusen beider KO Mauslinien die Existenz der Eigenhemmungsmechanismen wie in den Wildtypen (WT) nach. Wurde der Tph2-abhängige Schritt im 5-HT Syntheseweg durch Anwendung von 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) umgangen, zeigten sowohl Tph2 KO als auch 5-Htt KO Mäuse eine Verminderung der serotonergen neuronalen Feuerungsrate bei niedrigeren Konzentrationen von 5-HTP im Vergleich zu den WT. Die erhöhte Reaktionsfähigkeit der serotonergen Neuronen von Tph2 KO Mäusen entsprechen der milden Sensibilisierung der 5-HT1A Rezeptoren. Stattdessen deuten die Reaktionen der serotonergen Neuronen von 5-Htt KO Mäusen darauf hin, dass das überschüssige Niveau von extrazellularem 5-HT, welches durch den Mangel an 5-Htt verursacht wird, 5-HT1A Rezeptoren stark genug stimuliert, um eine Desensibilisierung dieser Rezeptoren zu überwinden. Zweitens zeigten die Daten der whole-cell Patch Clamp Ableitung von serotonergen Neuronen im DRN keine Unterschiede in grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften zwischen Tph2 KO und WT, außer niedrigen Membranwiderständen in KO Mäusen. Darüber hinaus zeigte die whole-cell Patch Clamp Ableitungen von CA1 Pyramidenzellen im Hippocampus der 5-Htt KO Mäuse eine erhöhte Leitfähigkeit sowohl bei Ruheständen als auch bei Aktionspotentialerzeugungen. Schließlich zeigte die Stärke der Langzeitpotenzierung (long-term potentiation: LTP) durch die Stimulation der Schaffer-Kollateralen/kommissuralen Fasern im ventralen Hippocampus keine Unterschiede zwischen Tph2 KO, 5-Htt KO, und jeweiligen WT. Zusammengefasst verursachten der Mangel und der Überschuss von extrazellularen 5-HT eine Sensibilisierung bzw. Desensibilisierung der autoinhibitorischen 5-HT1A Rezeptoren. Dies kann jedoch nicht direkt in die Regulierung von serotonergen Neuronen Feuerung umgesetzt werden, wenn die 5-HT1A Rezeptoren durch endogen synthetisiertes 5-HT stimuliert werden. Im Allgemeinen zeigten die hier untersuchten KO Mäuse, ein erstaunliches Maß an Widerstandskraft, die die allgemeinen elektrophysiologischen Eigenschaften und die normale LTP Induzierbarkeit trotz genetischer Manipulationen des zentralen serotonergen Systems aufrechterhielt. Weiterhin deutet dies auf die Existenz noch unbekannter Kompensationsmechanismen hin, die diese potentiellen Veränderungen abzudämpfen scheinen. KW - Serotonin KW - Elektrophysiologie KW - Tryptophan hydroxylase 2 KW - Knockout KW - Serotonin transporter KW - Depression KW - Anxiety KW - Knockout KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83265 ER -