TY - THES A1 - Pfister, Heiko T1 - Wegener'sche Granulomatose T1 - Wegener's granulomatosis N2 - Die Wegener'sche Granulomatose (WG) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich typischerweise als chronische Entzündung des oberen Respirationstraktes, Vaskulitis und Glomerulonephritis manifestiert. WG gehört zur Gruppe der sog. “pauci-immunen” Vaskulitiden, die mit Anti-Neutrophilen-Antikörpern (ANCA, anti neutrophil cytoplasmic antibody) assoziiert sind. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz lassen sich ANCA im Serum der meisten WG-Patienten nachweisen. Die mit WG assoziierten sog. “klassischen” ANCA (c-ANCA) erkennen spezifisch Konformationsepitope der Serinprotease Proteinase 3 (PR3), die in den azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert wird. Die enge Korrelation PR3-spezifischer Antikörperspiegel mit dem Krankheitsverlauf läßt vermuten, daß sie bei der Pathogenese eine zentrale Rolle spielen könnten. Diese Hypothese wird von Daten aus in vitro Experimenten gestützt: werden Zytokin-stimulierte neutrophile Granulozyten mit Patientenserum oder isolierten c-ANCA inkubiert, erfolgt eine Aktivierung der Neutrophilen, die sich durch Degranulation und Freisetzung von Sauerstoffradikalen äußert. c-ANCA können so indirekt - aber vermutlich auch direkt - zur Endothelschädigung beitragen. Jedoch konnte bisher kein direkter Beweis des pathogenen Potentials von c-ANCA am Tiermodell erbracht werden. Um die Wirkung von c-ANCA an einem Mausmodell zu testen, war zunächst ein murines Maus-PR3- (mPR3) spezifisches Antiserum notwendig. Da humane c-ANCA nicht mit mPR3 kreuzreagieren, wurde für die Immunisierung von PR3/Neutrophilen-Elastase (NE)-defizienten Mäusen ein mPR3-Zymogen rekombinant in E. coli als Einschlußkörpermaterial (IB, inclusion bodies) hergestellt. Nach Renaturierung des IB-Materials in vitro wurde mit der Dipeptidylaminopeptidase Cathepsin C das N-terminale Propeptid abgespalten. Das gewonnene Enzym besaß die für PR3 und NE spezifische katalytische Aktivität, die durch den physiologischen Inhibitor humaner PR3, a1-Antitrypsin, inhibiert werden konnte. Es ist daher anzunehmen, daß das gewonnene rekombinante Material die korrekte Konformation durch Renaturierung in vitro erhalten hatte. Um nun die pathologische Wirkung von Anti-rmPR3-Antikörpern zu testen, wurden PR3/NE-defiziente Mäuse mit dem rekombinanten Zymogen (pro-rmPR3) oder der N-terminal prozessierten Form (rmPR3) immunisiert. Die Spezifität der gewonnenen Antiseren wurde durch Festphasenimmunoassay, Western Blotting und indirekte Immunfluoreszenzfärbung überprüft. Weiterhin konnte fluoreszenzzytometrisch die Bindung von Anti-mPR3-IgG an die Plasmamembran Zytokin-stimulierter Granulozyten nachgewiesen werden. Die hergestellten Antiseren erfüllten somit die für c-ANCA-positive Seren von WG-Patienten typischen Eigenschaften hinsichtlich der Antigenspezifität. Wenn c-ANCA alleine hinreichend für die Induktion der für WG charakteristischen Symptome sind, sollte der Antiserumtransfer auf Wildtyp-Mäuse WG-ähnliche Symptome in den Rezipienten hervorrufen. Nach wiederholter intravenöser Injektion von Serum pro-rmPR3-immunisierter Mäuse ließ sich ein signifikanter Antikörperspiegel bei Verdünnungen von 1:2000 über den gesamten Behandlungszeitraum von 10 Wochen in den Rezipienten nachweisen. Der anschließende histologische Befund von Niere und Lunge ergab jedoch keine pathologischen Veränderungen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß c-ANCA alleine keine Krankheitssymptome hervorrufen. In dem gegenwärtigen Modell für c-ANCA-vermittelte Vaskulitis entfaltet sich die pathogene Wirkung von c-ANCA vor allem dann, wenn neutrophile Granulozyten zusätzlich durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF alpha) stimuliert werden. Erst die Stimulation der Granulozyten ermöglicht die Bindung von c-ANCA an die Plasmamembran und deren anschließende Aktivierung. Deshalb wurde dieses Modell, das vorwiegend aus Ergebnissen von Experimenten in vitro abgeleitet ist, auf ein lokales Entzündungsmodell der Maus übertragen: Durch wiederholte Injektion von TNF alpha in die Haut wurde eine leichte Entzündungsreaktion ausgelöst. Diese Entzündungsreaktion ließ sich schließlich durch intravenöse Verabreichung von pro-rmPR3- oder rmPR3-Antiserum verstärken. Dieser Befund ist ein wichtiger Beweis für die verbreitete Ansicht, daß c-ANCA nicht nur ein Epihänomen der WG darstellen, sondern selbst ein pathogenes Potential besitzen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Serinproteasen NE und PR3 an der Entstehung inflammatorischer Prozesse untersucht. Im Hinblick auf die bei der Pathogenese der WG beteiligten Mechanismen könnten PR3 und NE eine wichtige Rolle spielen. PR3 und NE können Proteine der extrazellulären Matrix abbauen, Apoptose in Endothelzellen induzieren und sind an der Regulation entzündlicher Prozesse über verschiedene Wirkmechanismen beteiligt. Um quantitative Unterschiede bei Entzündungsreaktionen zwischen NE/PR3-defizienten Mäusen und kongenen Wildtyp-Tieren zu untersuchen, wurde als Modell einer Typ III Hypersensitivitätsreaktion eine lokale passive Arthus-Reaktion induziert. Wildtyp-Mäuse entwickelten dabei eine deutlich stärkere lokale Entzündung als NE/PR3-defiziente Mäuse. Weitere Studien sind nötig um die Frage zu klären, ob eine der beiden Serinproteasen alleine oder in Kooperation mit der anderen diesen Phänotyp hervorruft. Für einen direkten synergistischen Effekt sprechen indes die Ergebnisse eines in vitro Experiments mit pro-rmPR3 und humaner NE: Bei Inkubation von pro-rmPR3 mit hNE wurde eine Spaltung des Proenzyms beobachtet, die mit einer Verstärkung der enzymatischen Bruttoaktivität einherging. Die physiologische Relevanz dieser Beobachtung muß allerdings noch geklärt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen im Einklang mit den neuesten Erkenntnissen über die Rolle der PR3 bei der Wegener’schen Granulomatose: PR3 dürfte sowohl aufgrund pleiotroper Effekte auf entzündliche Reaktionen als auch wegen seiner lytischen Eigenschaften zur Gewebeschädigung beitragen. Darüberhinaus konnte eine pathogene Wirkung von mPR3-spezifischen Antikörpern in der Maus nachgewiesen werden. N2 - Wegener's granulomatosis (WG) is an autoimmune disorder typically characterized by chronic inflammmation of the upper respiratory tract, vasculitis and glomerulonephritis. WG belongs to the group of anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody (ANCA) associated vasculitides with no or very few immune complex deposits (“pauci-immune”) in affected organs. “Classic” ANCA (c-ANCA) that produce a cytoplasmic staining pattern on neutrophils are a specific seromarker for this disease entity. They recognize conformational epitopes of proteinase 3 (PR3) from azurophil granules of neutrophil granulocytes. The correlation of PR3-specific antibody titers and disease course suggests that they are an important pathogenic factor for this autoimmune disease. The hypothesis is supported by in vitro experiments demonstrating an interaction of c-ANCA with cytokine primed neutrophils resulting in full activation manifested by degranulation and respiratory burst. It has been shown that c-ANCA can also directly induce the loss of endothelial barrier functions. However, direct evidence for the pathogenic potential of c-ANCA in vivo has not been published yet. The central aim of this study is to clarify the role of c-ANCA in WG. Since antibodies directed against human PR3 do not crossreact with the murine homolog, mPR3-specific antibodies were necessary to provide direct proof for c-ANCA mediated tisssue damage in a murine disease model. Hence, sufficient amounts of recombinant murine PR3 (mPR3) were necessary to generate mPR3 specific murine antibodies. Several attempts have been made to produce recombinant PR3 in prokaryotic and eukaryotic host systems. But conformational epitopes recognized by c-ANCA are not well preserved on recombinant PR3 derived from E. coli, P. pastoris, or baculovirus-infected insect cells described in the literature so far. While recombinant human PR3 expressed in eukaryotes is well recognized by c-ANCA, the yield of both active human and murine PR3 generated in eukaryotic expression systems is very low. To obtain sufficient amounts of correctly folded recombinant murine proteinase 3 (rmPR3) for multiple immunizations of PR3/NE-deficient mice, rmPR3 was produced as inclusion body material in E. coli as a catalytically inactive precursor molecule. After in vitro refolding the N-terminal propeptide was removed by limited proteolysis with the dipeptidylaminopeptidase cathepsin C yielding catalytically active enzyme. Due to its catalytic activity that could be inhibited by the physiologic inhibitor of human PR3, α1-antitrypsin, but not by secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI), the recombinant material was assumed to harbour the correct conformation after refolding. To test, if anti-rmPR3 antibodies were sufficient to induce symptoms characteristic for WG, anti-PR3 antiserum was generated by immunization of PR3/neutrophil elastase (NE)-deficient mice with recombinant, refolded mPR3 or its zymogen. Specificity of the obtained sera was confirmed by ELISA, Western Blotting and indirect immunofluorescence. Moreover, antisera bound to the membranes of primed murine neutrophils as determined by flow cytometry. The generated antisera thus fulfilled the criteria defining c-ANCA positive sera of WG patients with respect to antigen specificity. If anti-PR3 antibodies are sufficient to induce symptoms characteristic for WG, transfer of antiserum to wildtype mice should induce vasculitis and/or glomerulonephritis. By repetitive intravenous injection of antiserum from immunized mice a persisting antibody titer was generated in naïve wild type mice over a treatment period of 10 weeks. Lung and kidney of these mice were analyzed histologically but neither granuloma or vasculitis were found in the lungs nor glomerulonephritis or vasculitis was observed in the kidneys. This result suggests that c-ANCA alone are not sufficient to induce WG symptoms in the mouse. Our initial observations were not surprising since the current hypothetical concept of c-ANCA-induced vasculitis implies that a primary inflammatory stimulus provided by cytokines like TNF alpha is required for the target antigen to be expressed on the plasma membrane of neutrophils. Exposure of the target antigen enables the binding of c-ANCA and subsequently triggers neutrophil activation. Consequently, this model, that was primarily deduced from in vitro experiments, was adapted to a model of local inflammation in the mouse: A mild inflammation was induced by repetitive local injection of TNF alpha into the skin. This inflammatory reaction increased significantly in the presence of rmPR3-antibodies. Our experimental data thus confirm the current concept that ascribes a pathogenic potential to c-ANCA. A second aspect adressed in this work is the contribution of the two neutrophil serine proteases NE and PR3 to the generation of inflammatory processes. With respect to the mechanisms involved in the pathogenesis of WG, NE and PR3 may be of particular importance due to their ability to degrade extracellular matrix proteins, induction of apoptosis in endothelial cells, and the regulation of inflammatory processes by a variety of mechanisms. A local reverse passive Arthus reaction (RPA) was chosen as a model of a type III hypersensitivity reaction to reveal quantitative differences of inflammation in PR3/NE-deficient mice and congenic wild type mice. Wild type mice reacted significantly stronger than PR3/NE-deficient mice as determined by examination of local edema and hemorrhage intensity. It remains to be determined if the observed phenotype in vivo reveals a concerted effect of both serine proteases or if deficiency of one of the proteases alone accounts already for this phenotype. Experimental data presented in this work are consistent with the hypothesis that PR3 and NE may directly interact: When recombinant mPR3 was incubated with hNE, a cleavage of rmPR3 was observed that is apparently associated with changes in enzymatic activity. The physiologic relevance of this finding has to be defined in further studies. In summary, this work adds to the current understanding of the role of PR3 in WG: PR3 is not only the relevant autoantigen whose interaction with c-ANCA contributes to the fatal outcome of the disease but also contributes together with neutrophil elastase to tissue damage by its lytic activity and pleiotropic effects on inflammatory reactions. KW - Granuloma gangraenescens KW - Leukozytenelastase KW - Autoantikörper KW - Neutrophiler Granulozyt KW - Wegener'sche Granulomatose KW - Proteinase 3 KW - Serinprotease KW - vasculitis KW - ANCA KW - rekombinante Proteinexpression KW - Autoimmunität KW - Wegener's granulomatosis KW - Proteinase 3 KW - serine protease KW - vasculitis KW - ANCA KW - recombinant protein expression KW - autoimmunity Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3133 ER - TY - THES A1 - Feuchtenberger, Martin T1 - Etablierung einer Fluoreszenz-Multiplex-Polymerase-Ketten-Reaktion zur semiquantitativen und qualitativen Analyse des V H-Repertoires in humanen B-Lymphozyten T1 - Semiquantitative and qualitative assessment of VH-repertoire in human b-lymphocytes by FMPCR N2 - Mit der VH-Fluoreszenz-Multiplex-PCR steht ein neuartiges Screeningverfahren zur semiquantitativen und qualitativen Analyse der VH-Familienverteilung der schweren Kette des Immunglobulinmoleküls in humanen B-Lymphozyten zur Verfügung. In zwei Multiplex-PCRs werden IgH Produkte der sechs häufigsten VH-Familien mit familienspezifischen und fluoreszenzmarkierten Primern (FAM, HEX, NED und ROX) amplifiziert. Die Auftrennung der Produkte erfolgt durch Elektrophorese in einem ABI Prism 377 Sequencer. In verschiedenen Experimenten konnte die hohe Spezifität und Sensitivität der Methode, sowie die gute Reproduzierbarkeit, Reliabilität und Validität der Daten gezeigt werden. Die Analyse des VH-Repertoires gesunder Individuen (n=10) zeigte eine vergleichbare und zugleich charakteristische Häufigkeitsverteilung der VH-Familien unter den Probanden, wie sie auch schon in anderen Studien beschrieben wurde. Die gewonnen Daten wurden ferner durch Sequenzierung von Produkten im Anschluss an eine Single-Cell PCR validiert. Mittels FMPCR konnte darüber hinaus die Existenz monoklonaler B-Lymphozyten bei Patienten mit CLL nachgewiesen werden. Erste Befunde bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen zeigten in Einzelfällen ein stark restringiertes B-Zellrepertoire. Die familienspezifische Markierung der Primer mit Fluoreszenzfarbstoffen erlaubt folglich neben der Abschätzung der Häufigkeitsverteilung der VH-Familien auch eine Aussage über die klonale Zusammensetzung des peripheren B-Lymphozytenpools sowie im Falle eines klonalen Peaks die unmittelbare Zuordnung zu einer der sechs VH-Familien. Die FMPCR stellt ein schnell und einfach durchzuführendes, aber zugleich reliables Screeningverfahren zur Analyse des humanen VH-Repertoires bei Erkrankungen mit einer dominierenden Rolle von B-Lymphozyten dar. Dadurch wird es erstmals möglich sein, größere Kollektive von Patienten mit Autoimmunerkrankungen bezüglich eines krankheitsspezifischen Repertoires zu untersuchen. N2 - We established a new tool to perform semiquantitative and qualitative screening for V(H) gene usage frequency during IgH rearrangements in human B-lymphocytes. In two separate multiplex PCRs, the rearranged VDJ regions were amplified with V(H) family-specific primers labeled with different fluorescent dyes (FAM, HEX, NED, or ROX). The relative amount of each of the particular V(H) family products and their ratios were determined by fragment analysis on a ABI PRISM 377 sequencer. We verified that the fluorescent multiplex PCR (FMPCR) shows high specificity and sensitivity, acceptable reproducibility and reliability. Data obtained were well in agreement with results revealed by sequencing following single-cell PCR. Ten healthy volunteers showed a comparable semiquantitative V(H) family distribution. The FMPCR also correctly detected a monoclonal peak in a CLL patient. Thus, labeling primers with various fluorescent dyes allows for an assessment of V(H) family usage and an immediate determination of the involved V(H) gene family if any clonal peaks are present. This method provides a quick, easy, and reliable tool for V(H) repertoire screening of larger populations of patients suffering from diseases with changes in the V(H) repertoire allowing for selection of cases worth a more detailed and cumbersome sequence analysis later on. KW - B-Lymphozyt KW - FMPCR KW - VH-Repertoire KW - Autoimmunität KW - B-lymphocyte KW - FMPCR KW - VH-repertoire KW - autoimmunity Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8426 ER - TY - THES A1 - Dotterweich, Barbara T1 - Untersuchungen zur Pathogenität von Antikörpern bei der Epidermolysis bullosa acquisita N2 - Erstellung eines Tiermodells für die EBA mittels passiven Transfers von Kaninchenantikörpern gegen Typ VII Kollagen in Mäuse. Immunologische Untersuchungen der EBA im Modell. N2 - To study the pathogenic relevance of antibodies specific to type VII collagen in vivo, we generated and characterized rabbit antibodies specific to a murine form of this antigen and passively transferred them into BALB/c mice. Immune rabbit IgG bound to the lamina densa of murine skin and immunoblotted type VII collagen. Mice injected with purified IgG specific to type VII collagen, in contrast to control mice, developed subepidermal skin blisters, reproducing the human disease at the clinical, histological, electron microscopical, and immunopathological levels. KW - EBA KW - Autoimmunität KW - Tiermodell KW - passiver Transfer KW - EBA KW - passive transfer of antibodies Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20707 ER - TY - THES A1 - Morbach, Henner T1 - Analyse der Immunglobulinrepertoire-Veränderungen in B Zellen von Kindern mit Autoimmunerkrankungen T1 - Analysis of changes in the immunoglobulin repertoire in B cells from children with autoimmune diseases N2 - B Zellen sind die zellulären Träger einer gegen Infektionserreger gerichteten, humoralen und protektiven Immunität. In der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und in der Aufrechterhaltung von chronischen Entzündungen scheint diesen Zellen eine entscheidende Rolle zuzukommen. In dieser Arbeit wurden in B Zellen von Patienten mit rheumatischen Erkrankungen molekulare Mechanismen untersucht, die es der B Zelle außerhalb des Knochenmarkes erlauben, ihre Rezeptorspezifität zu verändern. Ein solcher Vorgang könnte Verschiebungen des Immunglobulinrepertoires in Richtung Autoreaktivität erklären. N2 - B cells represent the cellular basis for humoral protective immunity. These cells seem to play an important role in the induction of autoimmune diseases as well as in the amplification of chronic inflammation. This work analysed molecular mechanisms in B cells of patients with rheumatic diseases, which might enable these cells to alter their B cell receptor specificity outside the bone marrow. This process might explain changes in the immunoglobulin repertoire towards autoreactivity. KW - Rheumatismus KW - Autoimmunität KW - B-Lymphozyten-Rezeptor KW - Rheumatism KW - Autoimmunity KW - B Cell Receptor Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25356 ER - TY - THES A1 - Tischner, Denise T1 - Mechanistische Untersuchungen zur Therapie von Multipler Sklerose am Beispiel der Experimentellen Autoimmunen Encephalomyelitis T1 - Investigation of therapy strategies of multiple sclerosis by using Experimental Autoimmune Encephalomyelitis N2 - No abstract available KW - Autoimmunität KW - Immunsystem KW - Multiple Sklerose KW - Glucocorticosteroide KW - Tiermodell KW - regulatorische T Zelle KW - CD28 KW - Antigentherapie KW - EAE KW - Superagonist KW - regulatory T cell KW - CD28 KW - antigen therapy KW - EAE KW - superagonist Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25258 ER - TY - THES A1 - Herrero-González, Josep E. T1 - Pathogenic relevance of autoantibodies to type XVII collagen from pemphigoid gestationis patients T1 - Untersuchungen zur Pathogenität von Autoantikörpern gegen Typ XVII Kollagen von Patienten mit Pemphigoid gestationis N2 - Pemphigoid gestationis (PG) and bullous pemphigoid (BP) are subepidermal autoimmune blistering diseases characterized by self-reactive T and B cells specific for the transmembrane hemidesmosomal protein type XVII collagen/BP180. Major T and B cell epitopes are located within the immunodominant 16th non-collagenous domain A (NC16A) of type XVII collagen. It has been suggested that pathogenically relevant autoantibodies also bind to this immunodominant region. The aim of this study was to map the epitopes targeted by blister-inducing human autoantibodies. For this purpose, we used an in vitro model of autoantibody-induced leucocyte-dependent dermal-epidermal separation. In contrast to the majority of patients with BP (7 of 10), preadsorption against a recombinant form of the NC16A region abolished the blister-inducing potential of autoantibodies from all PG patients tested (n=5). Using overlapping synthetic peptides, we demonstrate that PG autoantibodies bind to 2 defined epitopes within the NC16A region (aa 500-514 and aa 511-523). Preadsorption using an affinity matrix containing these two epitopes completely abolished dermal-epidermal separation induced by PG autoantibodies (in 8 of 9 patients). These findings provide new insights into the pathogenesis of pemphigoid diseases and should prove helpful for the development of an antigen-specific immunoadsorption therapy in PG. N2 - Pemphigoid gestationis (PG) und bullöses Pemphigoid (BP) sind subepidermal Blasen bildende Autoimmundermatosen, die durch autoreaktive T- und B-Zellen gegen das hemidesmosomale Transmembranprotein Kollagen Typ XVII / BP180 gekennzeichnet sind. Die Haupt T- und B-Zell Epitope liegen in der immundominanten, nicht-kollagenösen 16. Domäne A (NC16A) des Kollagen Typ XVII. Man ging davon aus, dass auch die pathogenen Autoantikörper gegen diese immundominante Region gerichtet sind. Das Ziel dieser Studie war es, die pathogenetisch relevanten Epitope beim PG zu kartieren. Hierfür wurde ein in vitro-Modell eingesetzt, in dem Autoantikörper Leukozyten-abhängig eine dermo-epidermale Spaltbildung induzieren. Im Gegensatz zu einem Großteil der Patienten mit BP (7 von 10) führte die Präadsorption gegen eine rekombinante Form der NC16A-Region zum Verlust des Blasen induzierenden Potentials aller untersuchten PG-Seren (n=5). Mithilfe überlappender synthetischer Peptide konnten wir zeigen, dass die Autoantikörper im Serum von PG Patienten an zwei definierte Epitope innerhalb der NC16A-Region (aa 500-514 und aa 511-523) binden. Die Präadsorption gegen eine Affinitätsmatrix, an die diese 2 Epitope gebunden waren, führte zum Verlust der dermo-epidermalen Spaltbildung durch PG-Autoantikörper (in 8 von 9 Patienten). Diese Ergebnisse geben weitere Einblicke in die Pathogenese der Pemphigoid-Erkrankungen und dürften zur Entwicklung Antigen-spezifischer Immunadsorptionstherapien des PG beitragen. KW - Autoimmunität KW - Autoantikörper KW - typ XVII Collagen KW - Blasen bildende Autoimmundermatosen KW - Pemphigoid gestationis KW - Autoimmunity KW - autoantibodies KW - type XVII collagen KW - autoimmune blistering diseases KW - pemphigoid gestationis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22329 ER - TY - THES A1 - Steigerwald, Jutta T1 - Der NK-Zellrezeptor NKG2D als Zielstruktur für eine Antikörper-basierte therapeutische Immunmodulation T1 - The NK cell receptor NKG2D as target structure for antibody-based therapeutic immune modulation N2 - Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen ermöglicht, infizierte oder transformierte körpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Zöliakie und RA zu führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antikörper gegen hNKG2D für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antikörper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Domäne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Domänen verknüpft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivität identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese führte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminosäuren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivität wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinität und inhibitorischen Aktivität nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinitätsmaturierung des E1VLV71KVH Antikörpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in fünf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollständige IgG1/lambda-Antikörper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivität, sowie ihrer Stabilität und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antikörper wiesen nach der Affinitätsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich höheres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantikörper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegenüber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilität. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorgänge der Antikörper in die NK-Zelle beobachtet werden. Für ein besseres Verständnis NKG2D-abhängiger Regulationsvorgänge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Ergänzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen ermöglichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antikörper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antikörper eine ambivalente Funktionalität aufweisen. In Lösung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors über an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antikörper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivität scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antikörper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antikörper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antikörper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren. N2 - The natural killer group 2, member D protein (NKG2D) is an activating receptor on NK- and CD8+ T-cells, which enables them to identify and eliminate infected and transformed somatic cells. However, a dysfunction of this receptor on immune cells may lead to the development of autoimmune diseases like type I diabetes, celiac disease, and rheumatoid arthritis. In this doctoral thesis, a human antibody with anti-hNKG2D specificity was developed which could be of clinical relevance for the treatment of autoimmune diseases. Based on the sequences of heavy (VH) and light chain (VL) of the two murine monoclonal antibodies 6H7 and 6E5A7 which specifically bind to hNKG2D and block the interaction between NKG2D-ligand and receptor, scFv-phage-libraries were prepared. These libraries were used in the following selection process by phage-display and the humanization of the murine scFv was achieved by guided selection-technology. The VH domain of the parental scFv was first combined with a human VL-repertoire and the two resulting human light chains were then joined to a repertoire of human VH-domains. Because no recombinant human scFv with hNKG2D binding activity could be identified by this technique a stepwise humanization process of the VH framework-region (FR) had to be performed while retaining the murine CDR-domains. This procedure resulted in the human scFv E1VLV71KVH which in addition to the murine CDRs merely contained three amino acids of murine origin in the FR. The biological activity of the E1VLV71KVH was analyzed in different in vitro-systems after conversion of the scFv fragment into the completely human IgG1/lambda antibody format. The results of these experiments revealed a noticeable loss of affinity and neutralizing function of the antibody after humanization and thus demonstrated the need for affinity maturation. Therefore, a sequential randomization of the CDR3 domains of E1VL and V71KVH was performed which resulted in five different anti-hNKG2D scFv fragments with high affinity. Two of these human constructs, B1VLB6VH and E4VLG10VH, were produced as fully human IgG1/ antibodies and examined in vitro with regard to their activating and neutralizing activity as well as their stability and internalization effects by NK cells. After affinity maturation, both antibodies exhibited more potent inhibitory activity at IC50 values of 3,4x 10-2 µg/ml compared to the original murine antibody (3,3 µg/ml) and showed a high rigidity to impact of heat and serum proteases. Internalization events of the antibodies by NK cells could be observed by fluorescence microscopic analysis. For a better understanding of NKG2D-dependent regulation processes and the identification of NKG2D-specific target genes, the expression profile of ULBP-1Fc stimulated human NK cells was determined using microarray technology. The microarray data were validated on both RNA- and protein-level using RT-qPCR, FACS, ELISA and CBA, and the following biological NKG2D-specific markers could be established: CRTAM, TNFalpha, IFNgamma and GM-CSF. In addition to the execution of 51Cr-release studies in two different in vitro cell culture systems these markers provided the basis for the characterization of the neutralizing and activating capacity of the human antibodies B1VLB6VH and E4VLG10VH. The findings of all these experiments indicated that the human anti-hNKG2D antibodies exhibit an ambivalent functionality: In solution the antibodies have the ability to inhibit NKG2D-specific CRTAM-Expression, cytolytic activity and cytokine release. However, cross-linking of NKG2D-receptor via plate-bound human anti-hNKG2D antibodies results in the induction of a cytolytic response and cytokine secretion by human NK cells. Due to the bifunctional activity of these two antibodies a therapeutic use in human autoimmune diseases does not seem to be feasible yet. Taken together, this thesis has provided the basis for the conversion of a human hNKG2D neutralizing antibody with high affinity into a more suitable antibody format (scFv, Fab or F(ab)2). KW - Antikörper KW - Autoimmunität KW - Immunmodulation KW - Natürliche Killerzelle KW - NKG2D KW - Phagen-Display KW - Humanisierung KW - NKG2D KW - NK cell KW - human IgG1 KW - phage display KW - autoimmune disease Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33446 ER - TY - THES A1 - Brandl, Carolin T1 - Molekulare Mechanismen und zelluläre Kooperationen tolerogener Dendritischer Zellen bei der Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis T1 - Molecular mechanism and cellular cooperations of tolerogenic dendritic cells in the experimental autoimmune enzephalomyelitis N2 - Aus Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe war bekannt, dass Mäuse durch Injektion von tolerogenen, TNF-gereiften und MOG-beladenen DZ vor EAE geschützt werden können. Eines der Ziele dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das koinhibitorische Molekül B7-H1 auf der Oberfläche der DZ einen Einfluss auf das tolerogene Potential der DZ hat. Dazu wurden B7-H1-defiziente DZ generiert, mit TNF gereift, mit MOG-Peptid beladen und intravenös in Mäuse injiziert, bevor die EAE induziert wurde. Es zeigte sich, dass diese DZ die Tiere sogar noch besser vor der Krankheit schützen konnten als die WT DZ. Die Injektion der B7-H1-/- DZ bewirkte eine verstärkte Produktion von IL-10 and IL-13 nach Restimulation der Milz-Zellen in vitro und eine erhöhte Menge von protektiven Serum-Zytokinen (IL-4 und IL-13), welche von NKT-Zellen produziert wurden. Versuche mit CD1d-/- und Jα281-/- Mäusen haben ergeben, dass diese Zytokine von Typ II NKT-Zellen produziert wurden. Weitere Versuche mit Typ I und II NKT-Zell-Linien haben bestätigt, dass nur die Typ II NKT-Zellen von einem endogenen CD1d-Ligand der DZ stimuliert werden können. Außerdem wird dies über B7-H1 reguliert, da die NKT-Zell-Reaktion in Abwesenheit von B7-H1 stärker ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass neben den NKT-Zellen MZ B-Zellen nötig sind, um die Mäuse vor der EAE-Entwicklung zu schützen. Versuche mit CD22-/- Mäusen, welche eine Reduktion in der MZ B-Zell-Population zeigen, haben ergeben, dass in Abwesenheit von MZ B-Zellen keine EAE-Protektion mehr möglich ist. In dieser Arbeit wurde auch der Effekt von Glykolipid-Antigenen, welche einen Großteil der Myelinscheide des ZNS ausmachen, auf DZ untersucht. Ausgewählte Lipide führen zu einer Reifung der DZ, welche sich in der verstärkten MHC II- und CD86-Expression, jedoch nicht in der Produktion von Zytokinen äußert. Außerdem sind diese Lipid-gereiften DZ in der Lage T-Zellen zu stimulieren. Als letzter Punkt wurde in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen Masern-Virus-Infektionen und EAE untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine cerebrale Masern-Infektion zusammen mit einer EAE-Induktion einen dramatischen Effekt auf die Tiere hat. Für diese Versuche wurde ein Maus-Modell einer persistierenden Masern-Infektion im Gehirn verwendet. Diese Tiere leben nach der Virus-Behandlung ohne Symptome. Nach der EAE-Induktion starben diese Tiere jedoch bereits wenige Tage später aufgrund einer MOG-Peptid-spezifischen Reaktion. N2 - From previous studies in our group it was known that tolerogenic, TNF-matured and MOG-loaded DC could protect mice from developing EAE. One issue of this thesis was to investigate the effect of the co-inhibitory molecule B7-H1 on the tolerogenic potential of the DC. Therefore B7-H1-deficient DC were generated, matured with TNF, loaded with MOG peptide and injected intravenously before inducing EAE. It could be shown that the B7-H1-/- DC were even better in protecting mice from EAE. The injection of B7-H1-/- DC induced an increased production of IL-10 and IL-13 after restimulation of splenic cells in vitro and an increased amount of the protective serum-cytokines (IL-4 and IL-13) which were produced by NKT cells. Experiments with CD1d-/- and Jα281-/- mice showed that these cytokines were produced by Type II NKT cells. Futher experiments with Type I and II NKT cell lines confirmed that only Type II NKT cells could be stimulated by an endogenous CD1d-Ligand on the DC. Futhermore this mechanism is regulated by B7-H1 because the NKT cell reaction is stronger in the absence of B7-H1. This study also showed that besides the NKT cells the MZ B cells are necessary to protect mice from EAE. Experiments with CD22-/- mice which have a reduction in MZ B cells showed that EAE protection in the absence of MZ B cells is not possible. Another issue of this work was to study the effect of glycolipid antigens on DC. These lipids are a major part of the myelin sheath of the CNS. Some lipids induce DC maturation which is indicated by an increased MHC II and CD86 expression but not by cytokine production. Futhermore these lipid-matured DC are able to stimulate T cells. The last point of this study was to investigate the connection between measles virus infections and EAE. It could be shown that a cerebral measles infection together with EAE has an dramatic effect on the mice. For these experiments the mouse model of an persistant measles infection in the brain was used. These animals live without symptoms after treatment with the virus alone but after EAE induction these mice died rapidly because of an MOG specific reaction. KW - Encephalomyelitis KW - Dendritische Zelle KW - Immuntoleranz KW - Autoimmunität KW - dendritic cell KW - tolerance KW - autoimmunity Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49380 ER - TY - THES A1 - Eujen, Heike Carola T1 - Blockade der Antigenerkennung als therapeutische Strategie in einem CD8+ T-Zell vermittelten Mausmodell der Multiplen Sklerose T1 - Interference with Recognition of a Neo-Autoantigen as Therapeutic Strategy in a CD8+ T Cell Mediated Mouse Model of Multiple Sclerosis N2 - Die Multiple Sklerose (MS) ist eine schwere, momentan noch unheilbare Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems, die weltweit ca. 1 Mio. Menschen betrifft. Da die zur Zeit verfügbaren, anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Therapieformen lediglich krankheitsverzögernd wirken, ist es Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen, Möglichkeiten zur spezifischen Interferenz mit bei der MS ablaufenden Pathomechanismen zu ergründen und im Tiermodell zu testen. Das von uns für diese Arbeit verwendete Mausmodell einer CD8+ T-Zell vermittelten Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) trägt dabei neuen Erkenntnissen Rechnung, die zeigen, dass zytotoxische T-Lymphozyten bei der Pathogenese der humanen MS von entscheidender Bedeutung sind. Es handelt sich um doppelt transgene Nachkommen von Mäusen, die das Modell-Antigen Ovalbumin (OVA) unter der Kontrolle eines Oligodendrozyten (ODC-)-spezifischen MBP-Promotors im ZNS exprimieren, und Mäusen, die Ovalbumin-spezifische CD8+ T-Zellen besitzen (OT-I Zellen). Es kommt in diesem Modell zur Autoantigenerkennung durch die CD8+ T-Zellen mit konsekutiver Ausbildung einer fulminanten, letal verlaufenden EAE. Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, die therapeutische Potenz des monoklonalen Antikörpers 25-D1.16 zu evaluieren, der gegen das Autoantigen Ovalbumin in Kombination mit einem MHC-I-Molekül gerichtet ist. Mit Hilfe von FACS-Analysen und Fluoreszenz-Mikroskopie konnten wir zunächst bestätigen, dass 25-D1.16 spezifisch den Komplex aus dem Peptid SIINFEKL (antigenes Epitop von Ovalbumin) gebunden an ein MHC-I-Molekül (H-2Kb) erkennt. In nachfolgenden in vitro Versuchen wurde der Einfluss des Antikörpers auf Aktivierung und Proliferation von durch SIINFEKL:MHC-I-Komplex stimulierten OT-I Zellen untersucht. Es wurden hierfür Zellproliferation (Proliferations-Assays), Expression des Oberflächenmoleküls CD69 (FACS-Analysen) sowie IFN-γ-Sekretion (ELISA) gemessen. In Gegenwart von 25-D1.16 zeigte sich durchweg eine hochsignifikante Reduktion der jeweiligen Proliferations-/Aktivierungsmarker. Wir konnten somit in vitro zeigen, dass der gegen das Autoantigen Ovalbumin/H-2Kb gerichtete, monoklonale Antikörper 25-D1.16 kompetitiv die Aktivierung und Proliferation entsprechender T-Lymphozyten inhibieren kann. Um diese Daten in vivo zu validieren und die pathogenetische Relevanz zu überprüfen, haben wir ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Mäusen verschiedene Dosen von 25-D1.16 vor Auftreten erster EAE-Symptome einmalig intraperitoneal verabreicht. Anschließend wurde der Krankheitsverlauf klinisch beurteilt. Im EAE-Stadium 4 ohne Besserungstendenz oder bei Versuchsende wurden außerdem histologische Schnitte des Zentralnervensystems angefertigt, gefärbt (H.E., CD3, Mac-3, Luxol Fast Blue/PAS) und mit unbehandelten Tieren verglichen. Ein Teil der ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Tiere blieb nach Applikation des Antikörpers völlig gesund, während bei einem anderen Teil der Ausbruch der EAE zwar nicht vollständig verhindert, ihr Schweregrad aber deutlich gemildert wurde. Der Effekt der Antikörpertherapie war jedoch nicht nur klinisch, sondern auch histopathologisch überzeugend. So zeigte das Zentralnervensystem erfolgreich therapierter Mäuse eine weitgehend bis vollständig intakte Gewebsarchitektur (H.E.-Färbung) mit im Vergleich zu unbehandelten Mäusen drastisch reduzierter OT-I Zell- und Makrophagen/Mikroglia-Infiltration (Immunhistochemie CD3 und Mac-3). In der Luxol Fast Blue/PAS-Färbung fanden sich keinerlei Entmarkungsherde sondern durchgängig myelinisierte Axone. Es gelang uns somit durch hohe Antikörperdosen (500 μg pro ODC-OVA/OT-I doppelt transgener Maus) bei 83 % der behandelten Versuchstiere den Ausbruch der EAE ganz zu verhindern bzw. deren Verlauf deutlich abzumildern. Zusammenfassend beschreiben wir hier erstmals die antigen-spezifische Therapie einer CD8+ T-Zell mediierten EAE mittels eines gegen Peptid:MHC-I-Komplex gerichteten, monoklonalen Antikörpers. Durch Interferenz mit der Erkennung des Autoantigens durch die CD8+ T-Zellen waren wir in vivo in der Lage, den Pathomechanismus der EAE zu inhibieren. Hieraus ergibt sich ein vielversprechendes Behandlungskonzept für die Therapie der Multiplen Sklerose am Menschen. N2 - Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS) of presumed autoimmune origin, which affects around 1 million people worldwide. To date, anti-inflammatory and immunomodulatory therapies in clinical use can slow disease progression but are not curative and have considerable adverse effects. For this reason, researchers have begun to focus on developing antigen-specific treatment options, thereby avoiding generalized immunosuppression. Recently, the importance of CD8+ T cells in the pathogenesis of multiple sclerosis has begun to emerge. Here we employ a mouse model of CD8+ T cell mediated experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), in which the neo-self antigen ovalbumin (OVA) expressed by oligodendrocytes (ODC) is targeted by CD8+ T cells with transgenic T cell receptors (OT-I cells). In this animal model of ODC-OVA/OT-I double transgenic mice, recognition of the autoantigen by CD8+ T cells leads to fulminant, lethal EAE. A possible strategy to block organ-specific CD8+ T cell mediated inflammation is the interference with antigen recognition by a monoclonal antibody (mAb) specific for the complex composed of the immunodominant peptide and an MHC class I molecule. We therefore tested the therapeutic potency of the mAb 25-D1.16 which binds to the the OVA-8/MHC I complex, in our ODC-OVA/OT-I mouse model. Using flow cytometry and fluorescence microscopy, we confirmed that 25-D1.16 specifically recognizes the peptide SIINFEKL (antigenic epitope of ovalbumin) presented by H-2Kb, the murine homologue of the human MHC class I molecule. With in vitro experiments we addressed the ability of 25-D1.16 to inhibit activation and proliferation of OT-I cells stimulated by SIINFEKL:MHC I complexes. Cell proliferation (radioactive proliferation assays), expression of the early activation marker CD69 on the cell surface (flow cytometry) and IFN-γ secretion (ELISA) were measured. In the presence of 25-D1.16 we saw a highly significant reduction of the respective markers of activation/proliferation. We were thus able to show that the mAb 25-D1.16 recognizing OVA-8/H-2Kb is able to competitively inhibit the response of CD8+ T cells specific for the same peptide/MHC class I complex. To validate these findings in vivo and to study their pathogenic relevance, ODC-OVA/OT-I double transgenic mice were treated with different doses of 25-D1.16. For each mouse, a single dose was injected into the peritoneum prior to EAE onset. On a daily basis, mice were then scored for clinical symptoms of disease (scale 0 – 5). At the end of the experiment, histological and immunohistochemical analysis was performed on sections of brain and spinal cord and was compared to untreated animals. We observed a dose-dependent reduction of EAE severity after injection of 25-D1.16. At low doses (100 μg per mouse), the disease course was indistinguishable from that of untreated ODC-OVA/OT-1 double transgenic mice, whereas at 500 μg 10/12 animals survived. About half of them either showed no or only mild symptoms, while the others experienced full recovery after transient exacerbation. An intermediate phenotype was observed at 200 μg per mouse. Corresponding to the clinical results, the antibody’s effect on the extent of CNS damage was also convincing. Histopathological comparison of mice that recovered under 25-D1.16 therapy showed a virtually intact tissue architecture with only mild residual vacuolization (HE staining), less influx of T cells, as well as reduced microglia/macrophage activation (CD3 and Mac-3 immune histology). Luxol Fast Blue/PAS stained CNS sections showed remyelinated axons while extensive inflammation and myelin destruction is seen in double transgenic mice without 25-D1.16 therapy. In summary, treatment with high doses of 25-D1.16 (500 μg per mouse) saved 83% of the tested animals from lethal EAE, either preventing the development of or attenuating disease symptoms. For the first time, we here describe an antigen specific therapy of CD8+ T cell mediated EAE using a monoclonal antibody binding to peptide/MHC I complexes. By interference with recognition of the autoantigen by CD8+ T cells we were able to inhibit the onset of disease in vivo. Although there are anticipated problems in translating the present results into treatment of MS patients, they might offer a promising concept for future selective immunotherapy in human multiple sclerosis. KW - Multiple Sklerose KW - Antigen KW - Blockade KW - Tiermodell KW - Therapie KW - Autoimmunität KW - EAE KW - CD8 T-Zellen KW - spezifisch KW - zytotoxisch KW - Antigenerkennung KW - multiple sclerosis KW - EAE KW - CD8 T cell KW - antigen-specific KW - autoimmunity KW - therapy Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52052 ER - TY - THES A1 - Suffa, Nadine T1 - Untersuchung des B-Zell Immunglobulinrepertoires bei Juveniler Idiopathischer Arthritis im Hinblick auf Selektion und Klonalität T1 - Analysis of the b-cell immunoglobulin repertoire in juvenile idiopathic arthritis with regard to selection and clonality N2 - Die Juvenile Idiopathische Arthritis ist eine der häufigsten Ursachen von Gelenkbeschwerden im Kindesalter. Die Pathogenese der Erkrankung ist bisher wenig verstanden. Da sich jedoch bei einigen Subtypen der JIA Antinukleäre Antikörper (ANA) nachweisen lassen, liegt eine Beteiligung von B-Lymphozyten nahe. Mittels einer Kombination aus phänotypischer Zuordnung bestimmter B-Zell Differenzierungsstadien sowie Einzelzellsortierung, Amplifikation und Sequenzierung des rearrangierten Immunglobulingens individueller B-Zellen wurde der Frage nach klonaler Verwandschaft unterschiedlich differenzierter B-Zell Stadien und Selektion innerhalb des Gelenkes nachgegangen. N2 - Juvenile idiopathic arthritis is one of the most common reasons for joint problems in childhood. Still the pathogenesis is rarely understood. Since antinuclear antibodies can be found in some subtypes of JIA, an involvement of b-cells can be suggested. By combining phenotypical assignment of specific b-cell subsets and single cell sorting, amplification and sequencing of the rearranged immunoglobulin-gene of individual b-cells, indication for clonal relationship of different b-cell subsets and selection in the joints was examined. KW - Juvenile chronische Arthritis KW - Lymphozyt KW - Autoimmunität KW - Kappa-Kette KW - Schwere Kette KW - Rheumatismus KW - Immunglobuline KW - Klonalität KW - Selektion KW - JIA KW - clonality KW - selection KW - juvenile idiopathic arthritis KW - rheumatism KW - b-cells Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51375 ER - TY - THES A1 - Oberländer, Uwe T1 - Untersuchung der immunstimulatorischen Effekte von Neuromelanin (NM) auf dendritische Zellen und deren Bedeutung in der Pathogenese von Morbus Parkinson T1 - Investigation of immunostimulatory effects of Neuromelanin on dendritic cells and relevance for Parkinsons disease N2 - Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein. N2 - Background: The degeneration of neuromelanin (NM)-containing dopaminergic cells in the substantia nigra (SN) and a resulting reduction in striatal dopamine is a key feature in Parkinsons´s Disease (PD). Increased anti-melanin antibodies in sera of Parkinson patients had been shown recently, suggesting that NM may act as an autoantigen in PD. In this work it was asserted that NM is being recognized by dendritic cells (DCs), the major cell type for inducing T- and B-cell responses in vivo. This recognition of NM by DCs is a prerequisite to trigger an autoimmune response directed against NM-associated structures. Methods: Murine dendritic cells (mDC), generated from bone marrow, were treated with NM of SN from human subjects or with synthetic dopamine melanin (DAM) after both melanins were tested free of endotoxin contamination. Phagocytosis was documented with confocal microscopy. The expression of MHC II and CD86 was analyzed by flow cytometry. Concentrations of inflammatory cytokines TNF- and interleukin IL-6 were determined by ELISA. Finally the function of activated mDCs was tested by allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR). Results: NM was phagocytized effectively by mDCs, which subsequently developed a mature phenotype (CD86high/MHC IIhigh). In addition, NM-activated mDCs secreted the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-. Finally, they potently triggered T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction, showing that mDC activation was functional to induce a primary T cell response. On the contrary, DAM, which lacks the protein and lipid components of NM but mimics the dopamine-melanin backbone of NM, had only very little effect on mDC phenotype and function. Discussion: NM is recognized by DCs in vitro and triggers their maturation. If this process occurs in vivo, it would allow DCs to transport and present SN antigens to the adaptive immune system, thus leading to autoimmmunity in susceptible individuals. This finding offers a rationale for an autoimmune-based pathomechanism of PD with NM as the initial trigger. KW - Parkinson-Krankheit KW - Melanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinson KW - Neuromelanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinsons Disease KW - Neuromelanin KW - dendritic cells KW - Autoimmunity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73684 ER - TY - THES A1 - Dreykluft, Angela T1 - The PD-1/B7-H1 Pathway in a Transgenic Mouse Model for Spontaneous Autoimmune Neuroinflammation: Immunological Studies on Devic B7-H1-/- Mice T1 - Der PD-1/B7-H1 Signalweg in einem transgenen Mausmodell für spontane autoimmune Neuroinflammation: Immunologische Studien an Devic B7-H1-/- Mäusen N2 - Multiple sclerosis is an autoimmune disease of the central nervous system characterized by inflammatory, demyelinating lesions and neuronal death. Formerly regarded as a variant of MS, neuromyelitis optica (NMO)/Devic’s disease is now recognized as a distinct neurological disorder exhibiting characteristic inflammatory and demyelinated foci in the optic nerves and the spinal cord sparing the brain. With the introduction of the double-transgenic “Devic mouse” model featuring spontaneous, adjuvant-free incidence of autoimmune neuroinflammation due to the interaction of transgenic MOG-specific T and B cells, a promising tool was found for the analysis of factors triggering or preventing autoimmunity. The co-inhibitory molecule B7-H1 has been proposed to contribute to the maintenance of peripheral tolerance and to confine autoimmune inflammatory damage via the PD-1/B7-H1 pathway. Compared to Devic B7-H1+/+ mice, Devic B7-H1-/- mice developed clinical symptoms with a remarkably higher incidence rate and faster kinetics emphasized by deteriorated disease courses and a nearly quadrupled mortality rate. Remarkably enlarged immune-cell accumulation in the CNS of Devic B7-H1-/- mice, in particular of activated MOG-specific CD4+ T cells, correlated with the more severe clinical features. Our studies showed that the CNS not only was the major site of myelin-specific CD4+ T-cell activation but also that B7-H1 expression within the target organ significantly influenced T-cell activation and differentiation levels. Analysis at disease maximum revealed augmented accumulation of MOG-specific CD4+ T cells in the peripheral lymphoid organs of Devic B7-H1-/- mice partly due to increased T-cell proliferation rates. Transgenic MOG-specific B cells of Devic B7-H1-/- mice activated MOG-specific CD4+ T cells more efficiently than B cells of Devic B7-H1+/+ mice. This observation indicated a relevant immune-modulating role of B7-H1 on APCs (antigen-presenting cells) in this mouse model. We also assumed altered thymic selection processes to be involved in increased peripheral CD4+ T-cell numbers of Devic B7-H1-/- mice as we found more thymocytes expressing the transgenic MOG-specific T-cell receptor (TCR). Moreover, preliminary in vitro experiments hinted on an enhanced survival of TCRMOG-transgenic CD4+ T cells of Devic B7-H1-/- mice; a mechanism that might as well have led to higher peripheral T-cell accumulation. Elevated levels of MOG-specific CD4+ T cells in the periphery of Devic B7-H1-/- mice could have entailed the higher quantities in the CNS. However, mechanisms such as CNS-specific proliferation and/or apoptosis/survival could also have contributed. This should be addressed in future investigations. Judging from in vitro migration assays and adoptive transfer experiments on RAG-1-/- recipient mice, migratory behavior of MOG-specific CD4+ T cells of Devic B7-H1+/+ and Devic B7-H1-/- mice seemed not to differ. However, enhanced expression of the transmigration-relevant integrin LFA-1 on CD4+ T cells in young symptom-free Devic B7-H1-/- mice might hint on temporally differently pronounced transmigration capacities during the disease course. Moreover, we attributed the earlier conversion of CD4+ T cells into Th1 effector cells in Devic B7-H1-/- mice during the initiation phase to the lack of co-inhibitory signaling via PD-1/B7-H1 possibly leading to an accelerated disease onset. Full blown autoimmune inflammatory processes could have masked these slight effects of B7-H1 in the clinical phase. Accordingly, at peak of the disease, Th1 and Th17 effector functions of peripheral CD4+ T cells were comparable in both mouse groups. Moreover, judging from titers of MOG-specific IgG1 and IgM antibodies, alterations in humoral immunity were not detected. Therefore, clinical differences could not be explained by altered T-cell or B-cell effector functions at disease maximum. B7-H1 rather seemed to take inhibitory effect in the periphery during the initiation phase only and consistently within the target organ by parenchymal expression. Our observations indicate that B7-H1 plays a relevant role in the regulation of T-cell responses in this mouse model for spontaneous CNS autoimmunity. By exerting immune-modulating effects in the preclinical as well as the clinical phase of the disease, B7-H1 contributed to the confinement of the immunopathological tissue damage in Devic B7-H1+/+ mice mirrored by later disease onsets and lower disease scores. As a model for spontaneous autoimmunity featuring a close to 100 % incidence rate, the Devic B7-H1-/- mouse may prove instrumental in clarifying disease-triggering and -limiting factors and in validating novel therapeutic approaches in the field of autoimmune neuroinflammation, in particular the human Devic’s disease. N2 - Multiple Sklerose ist eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems, die durch entzündliche, demyelinisierende Läsionen und neuronalen Tod gekennzeichnet ist. Einst als Variante der MS betrachtet, gilt die Neuromyelitis optica (NMO) / Devic-Krankheit heute als eigenständige neurologische Erkrankung, bei der charakteristische Läsionen in den Sehnerven und im Rückenmark jedoch nicht im Gehirn auftreten. Mit der Einführung des doppelt-transgenen "Devic Maus"-Modells, bei dem es zur spontanen, Adjuvans-freien Inzidenz von autoimmuner Neuroinflammation durch Expression transgener MOG-spezifischer T- und B-Zellen kommt, wurde ein vielversprechendes Werkzeug für die Analyse von Faktoren gefunden, die Autoimmunität auslösen bzw. hemmen können. Das ko-inhibitorische Molekül B7-H1 trägt über den PD-1/B7-H1 Signalweg vermeintlich zur Aufrechterhaltung peripherer Toleranz bei. Devic B7-H1-/ - Mäuse entwickelten im Vergleich zu Devic B7-H1+/ + Mäusen Symptome, die mit deutlich höherer Inzidenz und schnellerer Kinetik einhergingen, unterstrichen von verstärkten Krankheitsverläufen und einer nahezu vervierfachten Sterblichkeit. Die verstärkte Akkumulierung von Immunzellen im ZNS, insbesondere von aktivierten MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen, korrelierte mit den schwerwiegenderen klinischen Merkmalen. Unsere Untersuchungen zeigten nicht nur, dass die Aktivierung von myelin-spezifischen CD4+ T-Zellen hauptsächlich im ZNS stattfand, sondern auch, dass im Zielorgan exprimiertes B7-H1 maßgeblich den T-Zell-Aktivierungs- und -Differenzierungsgrad beeinflusste. Analysen am Krankheitsmaximum zeigten eine verstärkte Akkumulierung von MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen in den Lymphorganen von Devic B7-H1-/- Mäusen, die wir teils auf erhöhte T-Zell-Proliferation zurückzuführten. Transgene MOG-spezifische B-Zellen der Devic B7-H1-/- Mäuse aktivierten effizienter als B-Zellen der Devic B7-H1+/+ Mäuse MOG-spezifische CD4+ T-Zellen. Dies deutet auf eine wichtige immunmodulierende Rolle von B7-H1 auf Antigen-präsentierenden Zellen in diesem Mausmodell hin. Veränderte Selektionsprozesse im Thymus trugen wohlmöglich zu den höheren CD4+ T-Zellzahlen in der Peripherie bei. Vorläufige in vitro Experimente deuteten auf ein verbessertes Überleben von TCRMOG-transgenen CD4+ T-Zellen aus Devic B7-H1-/- Mäusen hin. Eine erhöhte Anzahl von peripheren MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen könnte zu den größeren Mengen im ZNS von Devic B7-H1-/- Mäusen geführt haben. Jedoch sind zusätzliche Mechanismen wie ZNS-spezifische Proliferation und/oder Apoptose bzw. Überleben denkbar. Dies sollte in zukünftigen Untersuchungen genauer analysiert werden. Anhand von in vitro-Migrationsassays und Adoptiver Transfer-Experimenten in RAG-1-/- Mäusen schlossen wir, dass das Migrationsverhalten von MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen von Devic B7-H1-/- Mäusen nicht verändert war. Allerdings deutet die verstärkte Expression des transmigrationsrelevanten Intergins LFA-1 auf CD4+ T-Zellen in jungen, symptomfreien Devic B7-H1-/- Mäusen auf im Krankheitsverlauf zeitlich verschieden ausgeprägte Transmigrationskapazitäten hin. Die frühere Differenzierung von peripheren CD4+ T-Zellen in Th1-Effektorzellen in Devic B7-H1-/- Mäusen während der Initiationsphase schrieben wir der fehlenden inhibierenden Wirkung des PD-1/B7-H1 Signalwegs zu, was den früheren Krankheitsbeginn bedingt haben könnte. Stark ausgeprägte autoimmune Entzündungsreaktionen am Krankheitsmaximum maskierten jedoch wahrscheinlich diese schwachen Effekte von B7-H1. Dies wurde durch die Tatsache untermauert, dass am Krankheitsmaximum Th1- und Th17-Effektorfunktionen von peripheren CD4+ T-Zellen in beiden Mausgruppen vergleichbar ausgeprägt waren. Des Weiteren bestanden am Krankheitsmaximum keine Unterschiede in der humoralen Immunität. Die beobachteten klinischen Unterschiede waren demnach nicht durch veränderte periphere T-Zell- oder B-Zell-Effektorfunktionen in dieser Krankheitsphase erklärbar. Vielmehr scheint B7-H1 in der Peripherie ausschließlich während der Initiationsphase der Krankheit und fortwährend im Zielorgan durch seine parenchymale Expression immuninhibierend zu wirken. Unsere Beobachtungen zeigen, dass B7-H1 eine relevante Rolle bei der Immunregulierung im vorliegenden Mausmodell für spontane ZNS-Autoimmunität spielt. Durch immunmodulierende Effekte in der präklinischen sowie der klinischen Phase der Krankheit trug B7-H1 zu der Begrenzung der immunpathologischen Gewebeschädigung in Devic B7-H1+/+ Mäusen bei, sichtbar an einem späteren Krankheitsbeginn und leichteren -verlauf. Als Tiermodell für spontane ZNS-Autoimmunität mit nahezu 100 %iger Inzidenz könnte sich die Devic B7-H1-/- Maus als hilfreich bei der Klärung krankheitsauslösender und -limitierender Faktoren erweisen sowie bei der Validierung neuer therapeutischer Ansätze im Bereich der autoimmunen Neuroinflammation, insbesondere der Devic-Krankheit im Menschen. KW - Autoimmunität KW - Zentralnervensystem KW - Neuroinflammation KW - B7-H1 KW - Ko-inhibitorischer Signalweg KW - Devic Maus KW - autoimmunity KW - neuroinflammation KW - B7-H1 KW - co-inhibitory signalling KW - Devic mice KW - Maus KW - Entzündung KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83288 ER - TY - THES A1 - Werner, Christian T1 - Effect of autoantibodies targeting amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 on synaptic transmission of GABAergic neurons T1 - Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin oder Glutamatdecarboxylase 65 auf synaptische Transmission GABAerger Neurone N2 - The number of newly detected autoantibodies (AB) targeting synaptic proteins in neurological disorders of the central nervous system (CNS) is steadily increasing. Direct interactions of AB with their target antigens have been shown in first studies but the exact pathomecha-nisms for most of the already discovered AB are still unclear. The present study investigates pathophysiological mechanisms of AB-fractions that are associated with the enigmatic CNS disease Stiff person syndrome (SPS) and target the synaptically located proteins amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 (GAD65). In the first part of the project, effects of AB to the presynaptic endocytic protein amphiphysin were investigated. Ultrastructural investigations of spinal cord presynaptic boutons in an es-tablished in-vivo passive-transfer model after intrathecal application of human anti-amphiphysin AB showed a defect of endocytosis. This defect was apparent at high synaptic activity and was characterized by reduction of the synaptic vesicle pool, clathrin coated vesi-cles (CCVs), and endosome like structures (ELS) in comparison to controls. Molecular inves-tigation of presynaptic boutons in cultured murine hippocampal neurons with dSTORM microscopy after pretreatment with AB to amphiphysin revealed that marker proteins involved in vesicle exocytosis (synaptobrevin 2 and synaptobrevin 7) had an altered expression in GA-BAergic presynapses. Endophilin, a direct binding partner of amphiphysin also displayed a disturbed expression pattern. Together, these results point towards an anti-amphiphysin AB-induced defective organization in GABAergic synapses and a presumably compensatory rearrangement of proteins responsible for CME. In the second part, functional consequences of SPS patient derived IgG fractions containing AB to GAD65, the rate limiting enzyme for GABA synthesis, were investigated by patch clamp electrophysiology and immunohistology. GABAergic neurotransmission at low and high activity as well as short term plasticity appeared normal but miniature synaptic potentials showed an enhanced frequency with constant amplitudes. SPS patient IgG after preabsorption of GAD65-AB using recombinant GAD65 still showed specific synaptic binding to neu-rons and brain slices supporting the hypothesis that additional, not yet characterized AB are present in patient IgG responsible for the exclusive effect on frequency of miniature potentials. In conclusion, the present thesis uncovered basal pathophysiological mechanisms underlying paraneoplastic SPS induced by AB to amphiphysin leading to disturbed presynaptic architec-ture. In idiopathic SPS, the hypothesis of a direct pathophysiological role of AB to GAD65 was not supported and additional IgG AB are suspected to induce distinct synaptic malfunction. N2 - Die Anzahl neu charakterisierter Autoantikörper (AAK) gegen synaptische Proteine bei Er-krankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist stetig wachsend. Direkte Interaktionen der AAK mit ihren Zielantigenen konnten in ersten Studien belegt werden, jedoch besteht weiterhin Unklarheit über die exakten zugrunde liegenden Pathomechanismen. In der vorliegenden Arbeit wurden pathophysiologische Mechanismen von AAK gegen die synaptisch lokalisierten Proteine Amphiphysin und Glutamatdecarboxylase 65 (GAD65) untersucht, die mit der ZNS Erkrankung Stiff Person Syndrom (SPS) assoziiert sind. Im ersten Projektteil wurden die Effekte von AAK gegen das Endozytoseprotein Amphiphysin analysiert: in einem etablierten in-vivo Tiermodell konnten nach intrathekalem passiven Transfer von AAK gegen Amphiphysin ultrastrukturelle Untersuchungen von präsynaptischen Terminalen im Rückenmark eine Störung der Endozytose aufzeigen. Dieser Defekt, der bei hoher synaptischer Aktivität eintrat, war durch eine Verminderung synaptischen Vesikelpools, Clathrin-ummantelter Vesikel und endosomähnlicher Strukturen charakterisiert. Molekulare Untersuchungen präsynaptischer Terminale kultivierter hippokampaler Zellkulturen mit dSTORM Mikroskopie zeigten, dass an der Exozytose beteiligte synaptische Vesikelproteine (Synaptobrevin 2 und Synaptobrevin 7) ein verändertes Expressionsmuster innerhalb GA-BAerger Synapsen aufweisen. Die Expression von Endophilin, einem direkten Bindungs-partner von Amphiphysin, war ebenso verändert. Zusammengefasst weisen diese Ergebnis-se auf einen Organisationsdefekt GABAerger Synapsen hin, die durch anti-Amphiphysin AAK induziert sind und eine kompensatorische Umverteilung von Endozytoseproteinen vermuten lassen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die funktionellen Effekte von SPS AAK gegen GAD65, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der GABA-Synthese, mittels Patch-Clamp Mes-sungen und Immunhistologie untersucht. Die GABAerge synaptische Übertragung bei niedri-ger als auch hoher synaptischer Aktivität sowie die synaptische Kurzzeitplastizität wurden durch die IgG Fraktionen mit GAD65-AAK nicht beeinträchtigt. Die Frequenz von GABAergen Miniaturpotentialen war jedoch bei ansonsten gleichbleibender Amplitude erhöht. SPS-Patienten-IgG zeigte allerdings auch nach Präabsorbtion von GAD65-AAK mit Hilfe von rekombinanten GAD65 eine spezifische Anfärbung neuronaler Synapsen, was die Hypothese von weiteren, funktionell wirksamen, aber noch nicht identifizierten AAK im Patienten-IgG unterstützt. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit grundlegende pathophysiologische Mechanismen aufgezeigt werden, wie pathogene Antikörper gegen Amphiphysin die Struktur präsynaptischer Boutons beeinträchtigen können. Im Falle des idiopathischen SPS konnte keine unterstützenden Befunde für die Hypothese einer direkten pathophysiologischen Rolle von GAD65 AAK erhoben werden. Nach den vorliegenden Ergebnissen wird das Vorhandensein weiterer, derzeit noch nicht beschriebener IgG AAK postuliert, die die synaptische Fehlfunktion erklären können. KW - Autoaggressionskrankheit KW - Zentralnervensystem KW - Stiff person syndrome KW - autoimmunity KW - glutamate decarboxylase 65 KW - amphiphysin KW - Synapse KW - Glutamat-Decarboxylase KW - Autoimmunität KW - Endocytose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105648 ER - TY - THES A1 - Suchanka, Julia Anne T1 - Systematischer Review nach PRISMA-Statement zu Auswirkungen der Thymektomie auf Infektionshäufigkeit, Krebsentstehung und Auftreten von Autoimmunerkrankungen beim Menschen und im Tiermodell unter besonderer Berücksichtigung der Antikörperavidität in der infektiologischen Diagnostik T1 - The impact of thymectomy on the occurrence of autoimmune diseases, cancer development and infectious diseases in humans and in animal models with special emphasis on the determination of antibody avidity in serodiagnosis of infectious diseases: a systematic review and meta-analysis N2 - Der Thymus ist das zentrale Organ der T-Zell-Reifung. T-Vorläuferzellen aus dem Knochenmark wandern in den Thymus ein und entwickeln sich dort zu naiven, nicht-autoreaktiven T-Zellen unterschiedlicher Spezifitäten, wie beispielsweise T-Helfer-Zellen oder T-Effektor-Zellen. Ab der Pubertät wird das Thymusgewebe zunehmend mit Fettgewebe durchsetzt, wodurch der funktionelle Anteil des Thymusgewebes ab-nimmt. Beim alternden Menschen wurde eine Zunahme an Infektionen, Autoimmun-krankheiten und Neoplasien festgestellt. Dies wird mit dem Begriff der Immunalte-rung beschrieben. Die Rolle der verminderten Thymusfunktion bei der Immunalte-rung ist aktuell Gegenstand vielfältiger Forschungen. In dieser Arbeit wurde mittels eines systematischen Reviews die Frage beleuchtet, ob nach Thymektomie die Rate an Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Neoplasien steigt und folglich, ob die Thymektomie ein Modell für vorzeitige Immunalterung darstellt. Zudem wurde unter-sucht, ob die Thymektomie einen Einfluss auf die zellulären Kompartimente des Im-munsystems hat. Es wurden sowohl Tierstudien als auch Humanstudien berücksich-tigt. Bei der Erstellung des Reviews wurde nach dem PRISMA-Statement vorgegangen. Die wissenschaftlichen Datenbanken PubMed und Cochrane Library wurden mittels einer zuvor festgelegten Suchstrategie nach Publikationen in deutscher und engli-scher Sprache ab dem Jahr 1975 systematisch durchsucht. Diese Suche lieferte ins-gesamt 6304 Ergebnisse. Nach weiter Selektion durch Beurteilung von Abstracts und Volltexten wurden schließlich 97 Studien in den Ergebnissteil dieser Arbeit aufge-nommen. Diese Studien wurden in Form von Datenextraktionstabellen katalogisiert und ihre interne Studienqualität anhand zuvor festgelegter Kriterien bewertet. Aufgrund der großen Heterogenität der Studiendesigns und der inhaltlichen Schwer-punkte der Studien erfolgte eine qualitative Synthese der Ergebnisse. Einzelne Stu-dien berichteten vom Auftreten opportunistischer Infektionen nach Thymektomie. Andere wiederum konnten keinen Anstieg der Infektionsrate feststellen. Die Immun-antwort auf Neoantigene bei Impfung scheint bei thymektomierten Individuen beein-flusst. Das Auftreten von diversen Autoimmunkrankheiten wurde nach Durchführung einer Thymektomie beschrieben. Einzelne Studien kommen zu dem Schluss, dass die Rate an Neoplasien nach Thymektomie nicht erhöht ist. Um wissenschaftlich hin-reichend fundierte Aussagen über diese Themenschwerpunkte treffen zu können, bedarf es jedoch zukünftig Langzeitbeobachtungsstudien an thymektomierten Indivi-duen mit nicht-thymektomierten Kontrollgruppen. Eine mathematisch-statistische Analyse wurde für den Einfluss der Thymektomie auf das zelluläre Immunsystem durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zahl der CD3+ CD4+ und CD8+ Zellen im Anteil der Gesamtlymphozyten bei thy-mektomierten Individuen im Vergleich zur nicht-thymektomierten Kontrollgruppe sta-tistisch signifikant vermindert ist. Die Ergebnisse dieses Reviews unterstützen daher die These, dass Thymektomie eine vorzeitige Immunalterung induziert. Jedoch ist weitere experimentelle Grundla-genforschung, sowie klinische Forschung an thymektomierten Individuen notwendig, um dies weiter zu untermauern. Die Antikörperavidität beschreibt die Summe der Bindungsstärke eines polyvalenten Antikörpers zu einem multivalenten Antigen. Beim ersten Kontakt des Immunsys-tems mit einem fremden Antigen ist die Avidität der Antikörper zunächst gering. Es folgt ein Vorgang, der als Reifung der Immunantwort beschrieben wird und in dessen Verlauf Antikörper mit höherer Bindungsstärke selektioniert werden. Der Stellenwert der Bestimmung der Antikörperavidität ergibt sich aus Schwachstel-len der konventionellen Serodiagnostik. So kann die Bestimmung von IgM- und IgG-Antikörpern bei Vorliegen einer Infektion Rückschlüsse zulassen, ob es sich um eine primäre oder sekundäre Infektion handelt oder ob die Infektion akut oder chronisch ist. Allerdings kann es beispielweise durch polyklonale B-Zell-Reaktivierung oder per-sistierende IgM-Antikörper auch zu unklaren Ergebnissen kommen. N2 - The thymus is known as the central place of T-cell development. Precursor T-cells are migrating out of the bone marrow into the thymus. There, they develop to naïve, non-autoreactive T-cells of different specificities like T-helper-cells or T-effector-cells. Since puberty the functional stroma of the thymus has been replaced by fat tissue and resulting in diminished functional outcome of the thymus. An increase of infec-tious diseases, autoimmune disorders as well as neoplasms is observed in elderly individuals. This phenomenon may be attributed to immunosenescence (aging of the immune system). The matter of current investigations is the role of a diminished thymic function in immunosenescence. In this work, the question arises whether the number of infectious diseases, the rate of autoimmune disorders or the incidence of neoplasms is elevated after thymectomy and if thymectomy could serve as a model of premature immune aging. Moreover, it was investigated if thymectomy has any influence on the homeostasis of cellular compartments of the immune system. Ani-mal studies were considered as well as studies on humans. The review was proceeded by using the criteria of the PRISMA statement. The sci-entific databases PubMed and Cochrane library were systematically searched with a defined search strategy. Publications in English and German which were published since 1975 were processed. The search led to 6304 results. Results were screened by title and abstract and the full texts were read if appropriate. As a final point, 97 studies were included into the work. Studies were summarized in data extraction files. The internal quality of the studies was investigated by criteria which were de-fined previously. Due to a great heterogeneity in study design and study outcome, the findings of this review were reported qualitatively. Some studies reported the appearance of oppor-tunistic infections after thymectomy, while other authors could not find any increase of infectious diseases in thymectomiezed individuals. The immune response to neo-antigens in vaccination studies seemed to be affected by thymectomy. The occur-rence of several different autoimmune disorders was documented after thymectomy. Some authors conclude that the incidence of neoplasms is not affected by thymec-tomy. To draw scientifically highly established conclusions on the above mentioned emphases, there is a need of future long-term follow-up studies on thymectomized individuals compared to non-thymectomized control groups. A statistical analysis was performed on the impact of thymectomy on the T-cellular-composition of the immune system. It could be shown that the CD3+ CD4+ and CD8+ proportions of the T-lymphocytes were significantly diminished in thymecto-mized individuals compared to control groups with an intact thymus. The findings of this review support the hypothesis that thymectomy may induce premature immune aging with increased risk of autoimmunity and infectious diseases but no increased risk of cancer. Nevertheless, more basic research and longitudinal clinical investigations are needed to prove this hypothesis. Antibody avidity describes the total amount of the binding strength of a polyvalent antibody to a multivalent antigen. There are low-avidity antibodies when the immune system gets in touch with a new antigen for the first time. Then, a process takes place which is known as maturation of the humoral immune response: during this process antibodies which are strongly binding are selected by clonal hypermutation in memory B-cells. The significance of the determination of antibody avidity comes clear by looking at the weak spots of conventional serodiagnosis of infectious diseases and vaccine re-sponses. The determination of IgM and IgG antibodies can allow to draw conclusions if the patient suffers from an acute or chronic infection or if a primary or secondary infection takes place. However, it is possible that the results of these investigations are misleading due to polyclonal B-cell reactivation or long-term persistance of IgM antibodies. KW - Thymektomie KW - Avidität KW - Autoimmunität KW - Autoimmunity KW - thymectomy KW - avidity Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123349 ER - TY - THES A1 - Ferschl, Michael T1 - Untersuchung des Einflusses von Rituximab auf das Leichtkettenrepertoire bei Rheumatoider Arthritis in CD19+CD27+ B-Gedächtniszellen T1 - The influence of Rituximab on the immunoglobulin light chain repertoire of CD19+CD27+ memory B cells in rheumatoid arthritis N2 - B-Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Rheumatoiden Arthritis. Seit dem Jahr 2006 ist der Anti-CD20-Antikörper Rituximab, welcher eine passagere B-Zell-Depletion induziert, zur Therapie der Rheumatoiden Arthritis zugelassen. In dieser Arbeit wurde das variable Kappa- und Lambda-Leichtkettenrepertoire der CD19+CD27+ B-Gedächtniszellen bei einer Patientin mit aktiver Rheumatoider Arthritis vor und nach B-Zell-Depletion durch Rituximab verglichen. Hierzu wurden nach der Einzelzellsortierung von mononuklären Zellen des peripheren Blutes die Rearrangements des Kappa- und Lambda-Leichtkettenrepertoires amplifiziert, sequenziert und analysiert. Die gefundenen Daten sprechen für die Neubildung eines diversen, polyklonalen und hochmutierten Kappa- und Lambda-Leichtkettenrepertoires. Somit ist davon auszugehen, dass nach der CD20+ B-Zell-Depletion ein funktionsfähiges Repertoire entsteht, welches keine Restriktion für die Infektabwehr aufweist. N2 - B cells play an important roll in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. The anti-CD20 antibody rituximab induces a temporal B cell depletion and is approved for the therapy of rheumatoid arthritis since 2006. In this thesis a rheumatoid arthritis patient's variable kappa and lambda light chain repertoire of CD19+CD27+ memory B cells was analyzed before and after rituximab therapy. After single cell sorting of peripheral blood mononuclear cells the kappa and lambda light chain rearrangements were amplified, sequenced and analyzed. The results show the regeneration of a diverse, polyclonal and highly mutated kappa and lambda light chain repertoire. This indicates that after rituximab induced B cell depletion a functional repertoire is emerging with no signs of restriction for infect defense. KW - Rheumatoide Arthritis KW - Immunglobuline KW - B-Zelle KW - Autoimmunität KW - Rituximab KW - rheumatoid arthritis KW - immunoglobulin light chain KW - memory B cell KW - autoimmunity Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126593 ER - TY - THES A1 - Rovituso, Damiano T1 - Die Rolle der autoreaktiven B-Zellen und Autoantikörper in der Pathophysiologie der Multiplen Sklerose T1 - The role of autoreactive B cells and autoantibodies in the pathophysiology of multiple sclerosis N2 - Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste neurologische Erkrankung, die bei jungen Erwachsenen zu dauerhaften körperlichen Einschränkungen führt. Ein Kennzeichen der MS sind zeitlich und örtlich disseminierte entzündliche Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Läsionsart, die am häufigsten auftritt, ist u. a. durch Antikörperablagerungen charakterisiert. Die häufigste Verlaufsform der MS tritt in Schüben auf. Im Laufe der Erkrankung bilden sich die Symptome in der Mehrzahl der Patienten unvollständig zurück und es entwickelt sich ein chronischer Verlauf. Trotz intensiver Forschung ist die Ätiologie der MS bisher unbekannt Bis heute gibt es keine Biomarker, um den Therapieerfolg oder das Therapieversagen der MS-Basistherapeutika (Glatirameracetat und β-Interferon) zu bestimmen. Aktuelle Studien, bei denen B-Zellen depletiert wurden, zeigten eine signifikante Reduktion MS-typischer Läsionen und der Schubrate bei der schubförmigen MS. Man vermutet, dass autoreaktive B-Zellen vielfältige Aufgaben in der Pathogenese der MS übernehmen: sie produzieren Autoantikörper, präsentieren autoreaktiven T-Zellen Autoantigene und sezernieren Mediatoren, die zur Aktivierung anderer Immunzellen führen. Es ist noch unklar, welche B-Zell-Untergruppe bei der MS besondere Relevanz hat. Vor kurzem wurden B1-Zellen beim Menschen beschrieben. Eine Studie zeigte, dass die Anzahl der B1-Zellen in unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt war. Des Weiteren wurden im ZNS von chronisch erkrankten MS-Patienten B-Zell-Aggregate nachgewiesen. Diese B-Zell-Aggregate ähneln sekundären lymphatischen Organen und könnten zur Progredienz der Erkrankung beitragen. Eine ex vivo-Studie zeigte, dass die B-Zell-Aggregat-Bildung durch das Adhäsionsmolekül CEACAM1-(carcinoembryogenic antigen-related cell adhesion molecule 1) vermittelt wird. Überdies ist die Koexpression von CEACAM1 und TIM-3 (T-cell immunoglobulin- and mucin-domain containing-3) für immunerschöpfte und tolerante T-Zellen charakteristisch. Schließlich konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass ZNS-reaktive B-Zellen nur im Blut von Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom und MS-Patienten nachweisbar waren. In meiner Studie habe ich den Einfluss von MS-Basistherapeutika und einer MS-Eskalationstherapie auf die B-Zell-Untergruppen untersucht. Dabei habe ich die naive B-Zell-, B-Gedächtniszell-, B1-Zell- und Plasmablasten-Zahl von gesunden Probanden sowie unbehandelten und behandelten MS-Patienten miteinander verglichen. Die B-Zell-Untergruppen wurden durchflusszytometrisch untersucht. Die B1-Zell-Zahl war bei behandelten und unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt. In einer weiteren Studie konnte ich zeigen, dass die Anwesenheit von ZNS-reaktiven B-Zellen im Blut von glatirameracetat-behandelten MS-Patienten mit dem Therapieerfolg assoziiert war. Die ZNS-reaktiven B-Zellen wurden durch einen ZNS-Lysat-ELISPOT detektiert. Schließlich habe ich in einer dritten Studie die Expression von CEACAM1 und TIM-3 auf B-Zellen bei natalizumab-behandelten MS-Patienten durchflusszytometrisch untersucht. Im Vergleich zu gesunden Probanden zeigte sich, dass im Blut der MS-Patienten die CEACAM1+- und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B-Zell-Zahl signifikant erhöht war. Im Gegensatz dazu waren CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-T-Helferzellen signifikant erniedrigt in behandelten MS-Patienten. Meine Arbeit belegt, dass die B1-Zell-Population unabhängig von der MS-Therapie in MS-Patienten erniedrigt ist. Ungeklärt bleibt, ob diese Erniedrigung eine Folge oder eine Ursache der Erkrankung ist. B1-Zellen sind die Quelle von natürlichen Antikörpern in Mensch und Tier. Sie haben protektive Eigenschaften und sind bei der B-Zell-Toleranzinduktion beteiligt. Die protektiven Funktionen der natürlichen Antikörper könnten durch die Erniedrigung der B1-Zell-Zahl ausbleiben. Zusätzlich waren B-Zellen mit einem immunerschöpften Phänotyp im Blut von MS-Patienten erhöht. Trotz Stimulation konnte kein Phänotyp bei T-Helferzellen induziert werden, der für tolerante und immunerschöpfte T-Zellen beschrieben worden ist. In zukünftigen Studien sollte man die B1-Zell-Zahl und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B- und -T-Zell-Zahl bei Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom im Liquor und im Blut untersuchen. Damit könnte man feststellen, ob B1-Zellen aus der Peripherie bei MS-Patienten in das ZNS migrieren. Die Anwesenheit ZNS-reaktiver B-Zellen im Blut von behandelten MS-Patienten zeigte sich in meiner Arbeit als ein Marker, um den Therapieerfolg zu dokumentieren. Eine weiterführende Querschnittstudie (COPSELECT) wird ZNS-reaktive B-Zellen mittels ZNS-Lysat-ELISPOT als zukünftige Therapie-Biomarker ausführlicher untersuchen. MS-Biomarker wären für den einzelnen Betroffenen von großer Bedeutung und hätten ebenfalls gesundheitsökonomisch eine hohe Relevanz. N2 - Multiple sclerosis (MS) is the most common neurological disorder that leads to permanent disability in young adults. MS is characterized by temporally and spatially disseminated inflammatory lesions in the central nervous system (CNS). The most frequently observed pattern is associated with immunoglobulin deposition. The most common form of MS displays a relapsing-remitting course. Over time remissions are incomplete and most patients develop a chronic course of the disease. Currently, there are no biomarkers to predict therapeutic success or treatment failure of MS first-line therapies (glatiramer acetate and β-interferon). Despite intensive research, the etiology of MS is still unknown. Recent studies in which B cells were depleted, showed a significant reduction of MS-typical lesions and relapse rate in the relapsing-remitting MS. Presumably, autoreactive B cells have different roles in the pathogenesis of MS: they produce autoantibodies, are antigen presenting cells for autoreactive T cells and secrete mediators that activate other immune cells. It is unclear, which B cell subset is particularly relevant in MS. Recently B1 cells have been described in humans. Additionally, it was observed that the number of B1 cells was significantly reduced in untreated MS patients. Furthermore, B cell aggregates were found in the CNS of patients with a progressive form of MS. These B cell aggregates resembled secondary lymphoid organs and might contribute to the progression of the disease. An ex vivo study showed that B cell aggregate formation was mediated by the cell adhesion molecule CEACAM1 (carcinoembryogenic antigen-related cell adhesion molecule 1). Moreover, it was shown that immune exhausted and tolerant T cells co-express CEACAM1 and TIM-3 (T-cell immunoglobulin- and mucin-domain containing-3). Finally, our group has demonstrated that CNS-reactive B cells were detectable only in the blood of patients with a clinically isolated syndrom (CIS) or MS. In my thesis I have investigated the influence of different MS drugs on B cell subsets in the blood. I compared the numbers of naive B cells, memory B cells, B1 cells and plasmablasts of healthy subjects as well as untreated and treated MS patients. The B cell subsets were examined by flow cytometry. B1 cell numbers was significantly decreased in treated and untreated patients with MS. Second, I was able to show that the presence of CNS-reactive B cells in the blood of glatiramer acetate-treated MS patients was associated with a positive treatment response. CNS-reactive B cells were detected by CNS-lysate-ELISPOT. Finally, I investigated the expression of CEACAM1 and TIM-3 on B cells in natalizumab-treated MS patients by flow cytometry. CEACAM1\(^+\)- and CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B cell numbers were significantly increased in the blood of MS patients. In contrast, CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-T helper cells were significantly decreased in treated MS patients. My research demonstrates that the B1 cell population is decreased in the blood of MS patients regardless of MS therapy. It remains unclear whether this reduction is a consequence or a cause of the disease. B1 cells are the source of natural antibodies in humans and animals. They have protective properties and are involved in B cell tolerance induction. The protection by natural antibodies might be missing because of the low B1 cell counts in MS. In addition, B cell counts with an exhausted phenotype were significantly increased in the blood of MS patients. However, despite stimulation T helper cells from MS patients expressed neither an exhausted nor a tolerant phenotype. Future studies should examine the B1 cell-, CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B cell and CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-T cell numbers in CIS patients in the blood and cerebrospinal fluid. It could help to determine whether B1 cells from the periphery migrate in the CNS in MS patients. The presence of CNS-reactive B cells in the blood of treated MS patients proved to be a marker in order to document the success of therapies. A study of a large cohort of patients (COPSELECT) will investigate the potential of CNS-reactive B cells by ELISPOT as MS biomarker in more detail. MS biomarkers are urgently needed to detect MS treatment responders early on and are of high socio-economic importance. KW - Multiple Sklerose KW - Autoimmunität KW - B-Zellen KW - T-Zellen KW - B-Lymphozyt Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141003 ER - TY - THES A1 - Wunsch, Marie T1 - Das enterische Nervensystem als mögliche Zielstruktur der Autoimmunreaktion in der Multiplen Sklerose T1 - The enteric nervous system is a potential autoimmune target in multiple sclerosis N2 - Bei der Multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Abhängig von der betroffenen ZNS-Region kann es zu vielfältigen Symptomen kommen. Neben neurologischen Symptomen verursacht durch ZNS-Läsionen leidet ein Großteil der MS-Patienten auch unter gastrointestinalen Funktionsstörungen. Diese gastrointestinalen Symptome wurden bisher eher auf Läsionen im Rückenmark zurückgeführt und nicht direkt in Verbindung mit der autoimmunen Ätiologie der Erkrankung gebracht. In dieser Studie wurde das enterische Nervensystem (ENS) in einem B-Zell- und Antikörper-abhängigen Mausmodell der MS untersucht. Dafür wurde der Autoimmunprozess durch Immunisierung mit MP4, einem Fusionsprotein aus dem Myelin-Basischen-Protein (MBP) und dem Proteolipid-Protein (PLP), ausgelöst. Das ZNS und ENS wurden in den unterschiedlichen Erkrankungsstadien immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch analysiert. Neben der Immunpathologie des ZNS konnte dabei eine Degeneration des ENS schon vor dem Einsetzen der ersten neurologischen Defizite nachgewiesen werden. Die ENS-Pathologie war antikörper-mediiert und ging einher mit einer verringerten gastrointestinalen Motilität sowie mit einer Gliose und Neurodegeneration des ENS. Mithilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten im ENS vier mögliche Zielstrukturen des Autoimmunprozesses identifiziert werden, was auf sog. epitope spreading hindeutet. Auch im Plasma von MS-Patienten konnten Antikörper gegen drei dieser Antigene nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigten sich in Kolon-Resektaten von MS-Patienten erste Ansätze einer Neurodegeneration und Gliose des ENS. In dieser Studie wurde zum ersten Mal ein direkter Zusammenhang zwischen der Autoimmunreaktion gegen das ZNS und einer simultanen Reaktion gegen das ENS gezeigt. Dies kann einen Paradigmenwechsel im Verständnis der Immunpathogenese der MS anstoßen und neue therapeutische und diagnostische Ansätze initiieren. N2 - Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease, in which the immune system attacks the central nervous system (CNS). Clinical symptoms and the course of the disease can vary among patients, depending on the region of the brain primarily affected. Besides the neurological symptoms caused by CNS lesions, a great amount of MS patients display functional gastrointestinal impairments. Gastrointestinal symptoms were previously explained by the presence of spinal cord lesions rather than being linked to the autoimmune pathomechanisms of the disease. Here, the enteric nervous system (ENS) was studied in a B cell- and antibody-dependent mouse model of MS, in which the myelin basic protein (MBP) - proteolipid protein (PLP) fusion protein MP4 was used to initiate the autoimmune attack. Immunohistochemistry and electron microscopy were performed at different stages of the disease. We noted that in addition to the immune pathology in the CNS itself, the ENS also showed signs of degeneration. ENS degeneration was evident prior to the manifestation of CNS lesions and to the onset of neurological deficits in mice. ENS pathology was antibody-mediated and accompanied by impaired gastrointestinal motility, ENS gliosis and neurodegeneration. Using immunoprecipitation and mass spectrometry, four autoimmune targets expressed by enteric glia and/or neurons could be identified suggesting that epitope spreading to antigens of the ENS had occurred. MS patients displayed plasma antibodies against three of the ENS autoantigens. Studying human colon resectates provided preliminary evidence for gliosis and neurodegeneration of the ENS in MS patients, which was absent in non-MS controls. Overall, this study establishes a pathomechanistic link between the well-established autoimmune attack on the CNS and a simultaneous attack on the ENS that has not been described so far. These findings can initiate a paradigm shift in the current understanding of the pathomechanism of MS with diagnostic and therapeutic implications. KW - Multiple Sklerose KW - Autoantikörper KW - Enterisches Nervensystem KW - Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis KW - Darmwandnervensystem KW - Autoimmunität Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175888 ER - TY - THES A1 - Börner, Kevin T1 - How CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells T1 - Wie CLEC16A die Funktion von Thymus-Epithelzellen beeinflusst N2 - Genomweite Assoziationsstudien haben CLEC16A als ein Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes und weitere Autoimmunerkrankungen identifiziert. Die genaue Funktion von CLEC16A bleibt jedoch ungeklärt. Studien zeigten, dass sowohl das Drosophila Ortholog ema als auch das murine Clec16a eine Rolle in Autophagie spielen. Autophagie trägt zur Beladung der MHC-Klasse-II Moleküle und somit der Antigenpräsentation bei. Darüber hinaus konnten Studien belegen, dass Autophagie zur Antigenpräsentation während der T-Zell Selektion in Thymus-Epithelzellen benötigt wird. Dies schlägt eine mögliche Funktion von CLEC16A in Thymus-Epithelzellen während der T-Zell Selektion vor. Außerdem berichteten Arbeiten, dass CLEC16A als quantitativer Trait Locus für seine Nachbargene fungiert und dass Clec16a KD in Langerhans Inseln im Pankreas die Insulinsekretion und den Glukosestoffwechsel beeinträchtigt. Dieser Arbeit vorausgehend hatten Schuster et al. eine Clec16a KD NOD Maus generiert, welche vor spontanem autoimmunem Diabetes geschützt war. Für diese Arbeit wurde vermutet, dass CLEC16A als Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes den Prozess der Autophagie in Thymus-Epithelzellen beeinträchtigt und somit Antigenpräsentation und das T-Zell Repertoire beeinflusst. Um auf der Vorarbeit von Schuster et al. aufzubauen und diese zu ergänzen, zielte diese Arbeit darauf ab, den Einfluss von CLEC16A auf Thymus-Epithelzellen zu untersuchen. Hierfür wurde ein CLEC16A KD in menschlichen Zellen mittels RNA Interferenz erzeugt und Autophagie durch Immunoblotting untersucht. Zusätzlich wurde die Entzündung im Pankreasgewebe von Clec16a KD NOD Mäusen mittels H.E. Färbung beurteilt und bewertet. Thymus-Transplanationen wurden durchgeführt, um zu sehen, ob der Einfluss von Clec16a KD T-Zell intrinsisch ist. Außerdem wurden intraperitoneale Glukosetoleranztests durchgeführt, um den Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD Mäusen zu beurteilen. Schließlich wurden mittels qPCR Expressionslevel der benachbarten Gene, wie zum Beispiel Dexi und Socs1, erhoben, um die Eigenschaften von CLEC16A als quantitativer Trait Locus einzuordnen. Gemeinsam mit den Ergebnissen von Schuster et al. kann diese Arbeit aufzeigen, dass Clec16a KD die Ausprägung von Insulitis im Pankreas reduziert und Clec16a KD NOD Mäuse vor spontanem Autoimmundiabetes schützt. Dieser Schutz vor Erkrankung wird durch beeinträchtigte Autophagie in Thymus-Epithelzellen hervorgerufen, welche die T-Zell Selektion beeinflusst und die Reaktivität von T-Zellen reduziert. Der Einfluss des Clec16a KD ist innerhalb des Thymus wirksam. Der Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD NOD Mäusen bleibt unverändert und kann deshalb als Ursache für den Schutz vor Type 1 Diabetes ausgeschlossen werden. Clec16a und Dexi zeigen ähnliche Expressionslevel auf, dennoch benötigt es weitere detaillierte Studien, um eine Beziehung zwischen den beiden Genen etablieren zu können. Letztlich konnte die Beeinträchtigung von Autophagie in menschlichen CLEC16A KD Zellen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass die Funktion von CLEC16A evolutionär konserviert ist und ein möglicher Zusammenhang zwischen CLEC16A Polymorphismen und einem erhöhten Risiko für Typ 1 Diabetes im Menschen besteht. N2 - Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes. For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus. In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human. KW - Thymus KW - Toleranz KW - Autoimmunität KW - Diabetes mellitus Typ 1 KW - Epithelzelle KW - CLEC16A KW - T cell selection KW - Antigen presentation KW - Autophagy KW - Autoimmunity KW - T Zell Selektion KW - Antigenpräsentation KW - Autophagie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200230 ER -