TY  - THES
A1  - Freiherr von Rotenhan, Stefan
T1  - Herstellung und Charakterisierung von anti-CD40- und anti-41BB-Fusionsproteinen mit PDL1-abhängiger agonistischer Aktivität
T1  - Production and characterization of anti-CD40 and anti-41BB fusion proteins with PDL1-dependent agonistic activity
N2  - In this work, bispecific antibodies were produced by coupling TNFR-specific antibodies with checkpoint inhibitors, tested for their functionality and compared with each other. This combination should enable a targeted TNFR activation in tumor tissue, where a high PDL1 expression is frequent and therefore the formation of oligomeric transactivating (TNFSF3-TNFRSF3)2 complexes should only occur there by binding to PDL1-expressing cells. These receptor-ligand complexes are a prerequisite for the agonistic activity of the antibodies.
N2  - In dieser Arbeit wurden bispezifische Antikörper durch Kopplung von TNFR-spezifischen Antikörpern mit Checkpoint-Inhibitoren hergestellt, auf ihre Funktionalität getestet und miteinander verglichen. Diese Kombination sollte eine gezielte TNFR-Aktivierung im Tumorgewebe ermöglichen, wo eine hohe PDL1-Expression häufig ist und daher die Bildung oligomerer transaktivierender (TNFSF3-TNFRSF3)2-Komplexe nur dort durch Bindung an PDL1-exprimierende Zellen erfolgen sollte. Diese Rezeptor-Liganden-Komplexe sind eine Voraussetzung für die agonistische Aktivität der Antikörper.
KW  - Immun-Checkpoint
KW  - Antigen CD40
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
KW  - Immuntherapie
KW  - Monoklonaler bispezifischer Antikörper
KW  - Biotechnologie
KW  - Spezifisch
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288794
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nelke, Johannes
T1  - Entwicklung multi‐funktioneller TNFRSF Rezeptorspezifischer Antikörper‐Fusionsproteine mit FcγR‐unabhängiger Aktivität
T1  - Development of multi‐functional TNFRSF receptor‐specific antibody fusion proteins with FcγR‐independent activity
N2  - Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen.
N2  - Antibodies that target a clinically relevant group of receptors within the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), including CD40 and CD95 (Fas/Apo-1), also require binding to Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit a strong agonistic activity. This FcγR dependency largely relies on the mere cellular anchoring through the antibody's Fc domain and does not involve the engagement of FcγR signaling. The aim of this doctoral thesis was to elicit agonistic activity from αCD40 and αCD95 antibodies in a myeloma cell anchoring-controlled FcγR-independent manner. For this purpose, various antibody variants (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) against the TNFRSF members CD40 and CD95 were genetically fused to a single-chain-encoded B-cell activating factor (scBaff) trimer as a C-terminal myeloma-specific anchoring domain substituting for Fc domain-mediated FcγR binding. These bispecific antibody-scBaff fusion proteins were evaluated in binding studies and functional assays using tumor cell lines expressing one or more of the three receptors of Baff: BaffR, transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA). Cellular binding studies showed that the binding properties of the different domains within the fusion proteins remained fully intact in the antibody-scBaff fusion proteins. In co-culture assays of CD40- and CD95-responsive cells with BaffR, BCMA or TACI expressing anchoring cells, the antibody fusion proteins displayed strong agonism while only minor receptor stimulation was observed in co-cultures with cells without expression of Baff-interacting receptors. Thus, the herein presented αCD40 and αCD95 antibody fusion proteins display myeloma cell-dependent activity and promise reduced systemic side effects compared to conventional CD40 and CD95 agonists.
KW  - Antigen CD40
KW  - Monoklonaler bispezifischer Antikörper
KW  - Antigen CD95
KW  - Immunreaktion
KW  - B-Zell-Lymphom
KW  - BCMA
KW  - FcgR
KW  - Antikörper
KW  - bispezifisch
KW  - Antibody
KW  - bispecific
KW  - Multiple Myeloma
KW  - Baff
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279855
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ulrich, Jakob Johannes
T1  - Checkpoint inhibierende anti-TNFRSF Rezeptor Antikörper-Fusionsproteine
T1  - Checkpoint inhibiting anti-TNFRSF receptor antibody fusion proteins
N2  - Es sollten Checkpoint inhibierende anti-TNFRSF Rezeptor Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert werden. Die agonistische Aktivität TNFR-spezifischer Antikörper wird maßgeblich durch eine Immobilisation über Fcγ-Rezeptoren beeinflusst. In dieser Arbeit erfolgte die Immobilisation der Antikörper-Fusionsproteine über den PD-L1. In funktionellen Assays konnte eine Aktivitätssteigerung der TNFR-spezifischen Domänen mittels PD-L1 vermittelter Immobilisation gezeigt werden.
N2  - Checkpoint inhibiting anti-TNFRSF receptor antibody fusion proteins should be prepared and characterized. The agonistic activity of TNFR-specific antibodies is significantly influenced by immobilization via Fcγ receptors. In this work, immobilization of the antibody fusion proteins was performed via the PD-L1. Functional assays revealed an increase in activity of TNFR-specific domains using PD-L1-mediated immobilization.
KW  - Monoklonaler Antikörper
KW  - Monoklonaler bispezifischer Antikörper
KW  - Antigen CD137
KW  - Antigen CD40
KW  - CD40 agonist
KW  - 4-1BB agonist
KW  - Checkpoint-Inhibitor
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241568
ER  - 
TY  - THES
A1  - Carmona Arana, José Antonio
T1  - Regulation Tumornekrosefaktor (TNF) Rezeptor assoziierter Signalwege durch das Adapterprotein TRAF1
T1  - Regulation of tumor necrosis receptor (TNF) associated pathways through the adapter protein TRAF1
N2  - TWEAK ist ein zu der TNF-Superfamilie (Tumor Necrosis Factor) zugehöriges Zytokin, welches in Form löslicher und membranständiger Moleküle vorkommt. Beide Formen des Liganden können an den Rezeptor (Fn14) binden. Viele verschiedene intrazelluläre Signalwege werden durch den Fn14 aktiviert, beispielweise Erk1/2, JNK, Jun und STAT3, vor allem jedoch das NFkB. Lösliches und membranständiges TWEAK zeigen eine ähnliche Aktivierungseffizienz bezüglich des alternativen NFkB-Signalwegs, wohingegen membranständiges TWEAK weit besser als lösliches TWEAK den klassischen NFkB-Signalweg aktiviert. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die TWEAK-vermittelte Induzierbarkeit von verschiedenen Zielgenen des NFkB-Systems untersucht. Lösliches TWEAK zeigte einen weit schwächeren aktivierenden Effekt auf den klassischen NFkB-Signalweg als TNF, das ein sehr guter Aktivator des klassischen NFkB-Systems ist (Abb. 5, 6). Nichtsdestotrotz war TWEAK imstande eine stärkere TRAF1-Induktion als TNF herbeizuführen (Abbildung 7, 8). TRAF1 ist ein durch NFkB-System stark reguliertes Gen. Um posttranskriptionelle TRAF1-Modifikationen als Ursache für die unerwartet gute TRAF1-Induktion durch lösliches TWEAK auszuschließen, wurde die TRAF1-Expression nach Proteasom- und Caspasen-Inhibition untersucht (Abbildung 9). Dies ergab keinen Hinweis auf einen Einfluss dieser Prozessen auf der TRAF1-Expression.
Mittels des IKK2-spezifischen Inhibitor TPCA-1 wurde die TWEAK-vermittelte TRAF1-Induktion Zelltyp-abhängig gehemmt, wohingegen die TNF-vermittelte Induktion von TRAF1 in allen Zelllinien vollständig inhibiert wurde (Abbildung 13). Versuche mit dem NEDD8-aktivierenden Enzym (NAE) Inhibitor MLN4924, resultierten in einer totalen Inhibition der TRAF1-Expression in allen TWEAK- und TNF-stimulierten Zellen (Abbildung 14). Diese Befunde sprechen dafür, dass bei der TWEAK-vermittelten TRAF1-Expression beide Zweige des NFkB-Signalwegs Zelltyp-abhängig beteiligt sind. 
Die Oligomerisierung der Liganden der TNF-Familie verstärkt oft ihre Aktivität. Oligomerisiertes TWEAK imitiert die biologische Aktivität von membranständigem TWEAK. Lösliches TWEAK wurde mit einem anti-Flag Antikörper oligomerisiert und die TRAF1-Induktion durch den alternativen NFkB-Signalweg wurde analysiert 
Oligomerisiertes TWEAK aktivierte Zelltyp-unabhängig den klassischen NFkB-Signalweg stärker als lösliches TWEAK, wohingegen kein Effekt auf die TRAF1-Induktion oder auf die Aktivierung den alternativen NFkB-Signalweg festgestellt wurde (Abbildung 11, 12). TWEAK ist imstande die TRAF2-vermittelte CD40-Induktion des klassischen NFkB-Signalwegs zu hemmen (Abbildung 16, 17). Um den Beitrag von TWEAK-Induziertem TRAF1 zur CD40-Inhibition zu herauszufinden, wurden TRAF1-stabil transfizierte 786O- und U2OS-Zellen hergestellt (Abbildung 19). Die CD40-Induzierte IkBa-Degradation und IL8/6 Produktion war in den TRAF1-Transfektanten als auch in mit löslichem TWEAK vorbehandelte Zellen stark inhibiert (Abbildung 21, 22), wobei die CD40-Expression und CD40/CD40L-Interaktion unverändert blieb (Abbildung 20). Diese Ergebnisse sprechen für einen wichtigen Beitrag des Adaptorprotein TRAF1 in der TWEAK-vermittelte Inhibition der CD40-induzierte Aktivierung des klassischen NFkB-Signalwegs.
N2  - The multifunctional cytokine TWEAK belongs to the TNF-Superfamily. As typically for the members of this family TWEAK occurs in a membrane-associated and a soluble form. Both forms of TWEAK are able to bind their cognate receptor Fn14, but they differ in their capability to activate Fn14.  The TWEAK/Fn14 axis activates various intracellular signaling pathways leading to the activation of Erk1/2, JNK, Jun or STAT3, but above all the two NFkB-pathway. A superiority of membrane TWEAK over soluble TWEAK to activate the classical NFkB pathway is well known, but both TWEAK forms show no significant difference in the activation of the non-canonical NFkB pathway. Soluble TWEAK was compared with TNF, a typical and strong inducer of classical NFkB in this work and showed a inferior ability in the production of IL8 and degradation of IkBa (Figure 5, 6) two hallmarks of the classical NFkB pathway. Nevertheless, soluble TWEAK induced more powerful than TNF the expression of TRAF1, a NFkB-controlled protein participating in the signal transduction of several inflammatory signaling pathways (Figure 7). Experiments using proteasom- and caspase-inhibitors were perfomed and showed no significant contribution of these processes to the differential TRAF1-expression by TNF and soluble TWEAK (Figure 9).
The IKK2 inhibitor TPCA-1 blocked TNF-induced TRAF1 expression in all cell lines investigated. Contrary, soluble TWEAK-induced TRAF1 expression was only inhibited by TPCA-1 in a subset of cell lines (Figure 13). Experiments blocking both NFkB pathways, performed with the NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924, revealed a total inhibition of TWEAK- and TNF-induced TRAF1 expression (Figure 14). In sum, these results suggests that both NFkB signaling pathways are able to induce TRAF1. Oligomerisation of ligands from the TNF-family often results in strong enhancement of their biological activity. Oligomerization of soluble Flag-tagged TWEAK with an anti-Flag antibody produced ligand complexes which mimics the biological features of membrane TWEAK. These complexes showed neither enhanced TRAF1 induction nor a stronger activation of the alternative NFkB pathway compared to soluble TWEAK (Figure 11). However, oligomerized Flag-TWEAK revealed a strongly increased capability to trigger the activation of the classical NFkB pathway. TWEAK-priming can inhibit TRAF2-mediated CD40-induction of the classical NFkB pathway (Figure 16, 17). In order to establish the contribution of the TWEAK-induced TRAF1 to this effect, TRAF1 stable transfectants were generated (Figure 19). CD40-induced degradation of IkBa as well as CD40-associated production of IL8/6 were strongly inhibited in TWEAK-primed cells and TRAF1 transfectants (Figure 21, 22), although expression of CD40 and CD40/CD40L interaction were not affected (Figure 20). These results indicate a contribution of the adaptor protein TRAF1 to TWEAK-mediated inhibition of CD40-induced NFkB activation.
KW  - Antigen CD40
KW  - TWEAK
KW  - CD40
KW  - NFKB
KW  - TRAF1
KW  - TNF
KW  - TRAF2
KW  - IL8
KW  - cIAP
KW  - Sleeping Beauty
KW  - TPCA1
KW  - Nuklearfaktor Kappa B
KW  - Signalkette
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128735
ER  - 
TY  - THES
A1  - Aumüller, Ruth Inge
T1  - CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine
T1  - CD40-restricted activation of TRAIL-death receptors by bifunctional recombinant proteins
N2  - Der Ligand TRAIL wurde 1997 aufgrund seiner hohen Sequenzhomolgie ge-genüber dem TNFL CD95L entdeckt (28 %). Allerdings besitzt TRAIL, anders als die Liganden CD95L und TNF, die bemerkenswerte Eigenschaft vor allem in veränderten Zellen Apoptose zu induzieren, während gesunde Zellen davor bewahrt werden. Die TRAIL-induzierte Apoptose wird durch die apoptoseinduzierenden Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 vermittelt. Allerdings bindet und aktiviert lösliches TRAIL hauptsächlich den Todesrezeptor TRAILR1, während membrangebundes TRAIL sowohl TRAILR1 als auch TRAILR2 gut aktiviert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Bioaktivität löslicher TNFL zu steigern. Hierzu zählen z.B.: Stabilisierung der trimeren Molekülanordnung über die TNC-Domäne, Oligomerisierung des Flag-getaggten Liganden mithilfe des monoklonalen Antikörpers M2, sowie Generierung einer artifiziellen, antigenabhängigen Membranständigkeit. In dieser Arbeit wurde der Oberflächenrezeptor CD40 zur Immobilisierung des generierten Fusionsproteins scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL genutzt. In verschieden Experimenten konnten mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL in CD40-exprimierenden Zellen starke Apoptoseinduktion ermittelt werden. Charakteris-tische Kennzeichen und Spaltprodukte der Apoptose konnten ausschließlich in CD40-positiven Tumorzellen detektiert werden. Dabei wurde in allen Versuchen die für die Apoptoseinduktion benötigte Konzentration des Konstrukts mithilfe des Proteinsyntheseinhibitors CHX um das 10- bis 100-fache verringert. Es konnte auch gezeigt werden, dass in CD40-positiven Zellen, nach Stimulation mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL, nicht-apoptotische Signalwege verstärkt aktiviert werden. Dies war auf die agonistische Aktivität des monoklonalen Antikörperfragments scFv:CD40 zurückzuführen. Die Antikörperdomäne war folglich nicht nur zur effizienten Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren mittels Immobilisierung fähig, sondern konnte zusätzlich zur Stimulation des Immunsystems genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der lösliche, schwach aktive Ligand TRAIL mittels Oberflächenimmobilisierung über Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen in einen hochaktiven Liganden mit lokal begrenzter Toxizität überführt werden kann.
Mithilfe dieses Fusionsproteins ist es somit möglich die selektive Toxizität von TRAIL durch Steigerung seiner Aktivität effizient zu nutzen. Zusätzlich kann durch die Antigenbindung der Wirkungsbereich weiter eingegrenzt werden (CD40-positive Tumoren), wodurch unerwünschte Nebenwirkungen reduziert oder sogar ausgeschaltet werden können. Das in Tumoren oft heruntergefahrene Immunsystem kann CD40-abhängig stimuliert werden, um somit auch Tumorzellen in apoptoseresistenten Stadien zu eliminieren. Basierend auf diesen Ergebnissen können in der Zukunft weitere Studien zur Therapie von TRAIL-resistenten, CD40-exprimierenden Tumoren fortgeführt werden.
N2  - TRAIL has been characterized in 1997 based on its high sequence homology towards the TNFL CD95L (28 %). Differing from the ligands CD95L and TNF, TRAIL has the remarkable quality to induce apoptosis in tumor cells, while healthy cells are protected from apoptosis. In this case apoptosis is accomplished by the death receptors TRAILR1 and TRAILR2. However soluble TRAIL binds and activates primarily the death receptor TRAILR1, while membrane-bound TRAIL activates well both TRAILR1 and TRAILR2. In recent years different methods have been generated to raise the bioactivity of soluble TRAIL. To these belong for example: stabilization of the trimeric molecule structure with the TNC-domain, oligomerization of the ligand with the monoclonal antibody M2, generation of an artificial antigen-restricted membrane-bound form. In this work we made use of the surface receptor CD40 for immobilization of the generated fusion protein scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL. 
With the aid of this fusion protein it is thus possible to use the selective toxicity of TRAIL efficiently by an increase of its activity. Additionally the field of action could be localized further by antigen binding (CD40-positive tumors). As a consequence undesirable side effects can be reduced or even deactivated. The shut down immune system in tumors can be stimulated CD40-dependant, so that tumor cells resistant to apoptosis are also wiped out. Based on these results future studies may be conducted to treat TRAIL-resistant, CD40-expriming tumors.
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor / Rekombinantes Protein
KW  - Tumorantigen
KW  - Antigen CD40
KW  - Apoptosis
KW  - TRAIL
KW  - CD40
KW  - Tumortherapie
KW  - Todesrezeptoren
KW  - Antikörper
KW  - TRAIL
KW  - CD40
KW  - death receptors
KW  - tumor treatment
KW  - antibody
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106813
ER  - 
TY  - THES
A1  - Strohm, Corinna Andrea
T1  - Entwicklung CD40/DC-stimulierender rekombinanter Proteine mit Tumorantigen-restringierter Aktivität
T1  - Development of CD40/DC-stimulating recombinant proteins with tumor antigen-dependent activity
N2  - Dendritische Zellen (DC) sind spezielle Antigen-präsentierende Zellen und daher oft auch in die körpereigene Bekämpfung von Tumoren involviert. Über das CD40-CD40L-System stellen sie ein Ziel in der Tumorimmuntherapieforschung dar. CD40-spezifische Antikörper bewirken jedoch aufgrund der systemischen CD40-Aktivierung schwere Nebenwirkungen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, mit Hilfe von Tumor-spezifischen scFvs (antigenbindenden Einzelkettenfragmenten) Fusionsproteine zu generieren, die ausschließlich bzw. stark bevorzugt Tumor-lokalisiert dendritische Zellen aktivieren. In dieser Arbeit wurde anhand von Kokulturen von Tumorantigen-positiven Tumorzellen mit dendritischen Zellen gezeigt, dass dies möglich ist. Das hierfür generierte Fusionsprotein anti-CD20-Flag-CD40L führte CD20-restringiert, d.h. bei gleichzeitiger Bindung von CD20-positiven Tumorzelllinien (B-Zelllinien) zu einer deutlich verstärkten Aktivierung der DC. Mit einem solchen Fusionsprotein ist nun grundsätzlich die Möglichkeit vorhanden, DCs Tumorantigen-abhängig, das heißt im Tumorgewebe selbst verstärkt zu stimulieren. Die auf diese Weise aktivierten DCs können nun aufgrund der induzierten Veränderungen (IL-12-Produktion, Hochregulation kostimulierender Moleküle) Tumor-lokalisiert eine lokale, auf den Tumor begrenzte Immunantwort auslösen. Auf diese Weise sollte es möglich werden, Nebenwirkungen einer systemischen CD40-Aktivierung zu vermeiden bzw. zu reduzieren. Zudem stellt der Einsatz von anti-CD20-Flag-CD40L möglicherweise sogar eine Option zur Behandlung maligner B-Zell-Lymphome sowie Rituximab-resistenter Lymphome dar.
N2  - Dendritic cells (DC) are special antigen presenting cells, often involved in tumor destruction of the immune system. Therefore, the CD40-CD40L-system represents an important target in tumor treatment research. However, there are severe side effects with CD40-specific antibodies because of their systemic effects. The goal of this work was to create fusion proteins with tumor specific single-chain variable fragments (scFv), which are able to activate dendritic cells only tumor located. This principle was shown to work in cocultures with tumor antigen positive tumor cells together with dendritic cells. Anti-CD20-flag-CD40L, a newly generated fusion protein causes an enhanced activation of dendritic cells when additionally ligated to CD20-positive tumorcell lines, e.g. B-cell lines. This means with this kind of protein we are able to activate DC not only in a systemic way, but local directly at the tumor. Once activated, DC are able to release an immune answer. In this way it could be possible to avoid systemic CD40-activation. Additionally, it represents an alternative treatment of malignant B-cell-lymphoms and rituximab resistent lymphoms.
KW  - Antigen CD40
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Rekombinantes Protein
KW  - Tumorantigen
KW  - scFv
KW  - Rituximab
KW  - Kokultur
KW  - Tumortherapie
KW  - IL-12
KW  - CD20
KW  - dendritic cell
KW  - CD40
KW  - CD20
KW  - recombinant protein
KW  - tumor treatment
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72525
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Nicole
T1  - Entwicklung antigenabhängig aktivierbarer TNF-Ligand-Fusionsproteine
T1  - Development of antigen-dependent activatable TNF ligand fusion proteins
N2  - Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilität und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. Für die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchführung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig für deren Aktitvität sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molekül eine hohe Aktivität, die durch sekundäre Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivität konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdomäne nur geringfügig gesteigert werden. CD27L war als lösliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antikörper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivität der TNC-stabilisierten Form signifikant stärker ausgeprägt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivität konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie gehört, für die eine Stabilisierung des trimeren Moleküls und dessen Oligomerisierung nötig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabhängig eine hohe Aktivität. GITRL benötigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Moleküls durch die TNC-Domäne, um gute Aktivität zu zeigen. Im Weiteren wurden Antikörperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberflächenantigen binden. Eine starke Zelloberflächenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte für scFv-41BBL und für scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antikörperfragments eine extrazelluläre Proteinbindedomäne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erhält man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendomäne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle ermöglichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranständigen Liganden dessen Aktitvät neutralisieren können. Für CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabhängige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberflächenmolekül-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose geschützt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranständigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gestört und gleichzeitig Apoptose verstärkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabhängigen Aktivierung von TNF-Liganden könnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden können.
N2  - Trimer stability and oligomerization status of TRAIL, FasL and APRIL, three members of the TNF ligand family, critically determine their receptor activating potential. However, detailed information for the immunostimmulatory ligands CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL and GITRL regarding the importance of trimer formation, stabilization and oligomerization for ligand activity was lacking. These aspects were investigated systematically in this work. CD40L was highly active as a trimeric molecule. Secondary oligomerization and/or stabilization via the tenascin-C (TNC) trimerization domain slightly enhanced its specific activity. As soluble Flag-tagged and as hexameric Fc protein CD27L failed to bind and activate its cognate receptor CD27, even after crosslinking. However, the TNC stabilized form of CD27L induced a strong signal after oligomerization with anti-Flag antibody. Receptor signaling was only activated by oligomerized molecules of trimeric OX40L and 41BBL whereas the respective TNC fusion protein showed significant stronger activity. Stabilized GITRL trimers and hexamers already activated their receptor whereas oligomerization of GITRL just slightly enhanced the specific activity. Taken together, CD27L, OX40L and 41BBL belong to a TNF ligand family subgroup which requires oligomerization and stabilization of the trimeric molecule to ensure strong receptor activation. In contrast, CD40L and GITRL already display high oligomerization-independent activity, though the latter needs stabilization by the TNC domain. Furthermore, antibody fragment (scFv)-ligand fusion proteins targeting specific cell surface antigens were designed and analyzed. Strong cell surface antigen-selective TNF receptor activation was achieved for scFv-41BBL and scFv-OX40L whereas scFv-CD40L and scFv-GITRL already induced signaling in the absence of antigen-positive cells. scFv-CD27L lacked activity even on antigen-positive cells. Using an extracellular protein binding domain for example the ligand binding domain of a TNF receptor instead of an antibody fragment resulted in fusion proteins that on the one hand activate the TNF ligand domain and thus the corresponding receptor on target cells and on the other hand neutralize membrane ligand activity by binding. The effect of cell surface immobilization-mediated activation of these fusion proteins on cells expressing the corresponding target molecule was shown here for CD40-, RANK- and B7-2-FasL. The CD40-FasL fusion protein simultaneously blocked CD40L-CD40 interaction and induced strong apoptosis in T47D cells displaying an antiapoptotic autocrine CD40L-CD40 signaling loop. The principle of antigen-dependent activation of TNF ligands could be of use in tumor treatment due to the fact that tumor specific marker targeting leads to locally restricted receptor activation on antigen positive cells, promising a reduction in potential off target effects.
KW  - Rekombinantes Protein
KW  - Oligomerisation
KW  - Fas-Ligand
KW  - Antigen CD40
KW  - Apoptosis
KW  - Fibroblast activator protein I
KW  - Antigen CD19
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor
KW  - Trimerisation
KW  - Stabilisierung
KW  - CD27L
KW  - GITRL
KW  - OX40L
KW  - 41BBL
KW  - TRAIL
KW  - single chain
KW  - oligomerization
KW  - fusion protein
KW  - cross-linking
KW  - FAP
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36489
ER  -