TY - THES A1 - Rombach [geb. Grosso], Franziska T1 - Der Interaktionsrezeptor des Masernvirus auf hämatopoetischen Zellen T1 - The Measles Virus´ Interaction Receptor on Hematopoietic Cells N2 - Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen begünstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der hämatopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfläche induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellulären Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2). In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberflächenmolekül CD43 ist auf hämatopoetischen Zellen ubiquitär exprimiert und reguliert in T-Zellen deren Überleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adhäsion. P2X3 wird in hämatopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erwähnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zusätzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an primären und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren. Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. Während die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation primärer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und primären T-Zellen signifikant erhöht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen. In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im hämatopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, könnte ein vielversprechender Kandidat für eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verfügbar ist. N2 - Measles virus (MV) infection induces a severe and long-lasting immunosuppression in patients resulting in infections through opportunistic pathogens. T cell paralysis is a major contributor to MV induced immunosuppression. This can be achieved through contact of a viral glycoprotein complex with an uncharacterized receptor X on the surface of hematopoietic cells. Contact-mediated downregulation of Akt-kinase phosphorylation, inhibition of proliferation and activation the neutral spingomyelinase 2 (NSM2) are key characteristics of T cell inhibition in vitro. Using a kinetic phosphoproteomic approach, two potential interaction receptor candidates were identified: CD43 and P2X3 receptor. The highly glycosylated surface protein CD43 is ubiquitously expressed on hematopoietic cells and is known to regulate T cell survival, proliferation, activation, migration and adhesion. The expression of P2X3 in this compartment is low and its functional importance unknown. It is widely expressed in neuronal cells where it is a major effector in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Using the CRISPR/Cas9 method both candidates were knocked down singly or combined in Jurkat T cells. Cells were then tested for the MV modulated parameters mentioned above upon MV challenge. In addition to that, iso- and allosteric functional inhibitors for P2X3 were employed on primary and Jurkat T cells to determine its role in calcium influx and proliferation after T cell receptor stimulation. The knockdown of both CD43 and P2X3 significantly decreased MV effects on all analyzed parameters (Akt-kinase phosphorylation, proliferation, NSM2 activation) indicating that both proteins play a major role in MV-induced T cell suppression. While isosteric inhibition of receptor P2X3 had no effect, its allosteric inhibition prior to stimulation increased proliferation of primary T cells almost twofold and significantly increased Ca2+ influx in Jurkat cells and primary T cells. In contrast, genetic depletion of P2X3 significantly reduced calcium influx after stimulation as compared to wildtype cells. In this study two important mediators of MV induced T cell suppression were identified. Amongst those, P2X3 whose expression, regulation and functional importance in the hematopoietic compartment has not been investigated yet, may represent a promising candidate for anti-viral therapy due to the existence of a clinically tested inhibitor. KW - Masernvirus KW - Immunsuppression KW - JURKAT-Zelle KW - T-Zellen KW - Interaktionsrezeptor KW - T-Lymphozyt Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-353394 ER - TY - THES A1 - Lehnert, Jonathan T1 - Einfluss von Osteopontin auf Foxp3-negative konventionelle und Foxp3-positive regulatorische CD4-positive T-Zellen der Maus T1 - Effect of Osteopontin on CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T-cells and CD4+ CD25- Foxp3- conventional T-cells N2 - In dieser Arbeit wurde der Einfluss des Zytokins OPN speziell auf CD4+ CD25+ Foxp3+- regulatorische bzw. CD4+ CD25- Foxp3-- konventionelle T-Zellen mithilfe v.a. durchflusszytometrischer Daten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes OPN die Supprimierbarkeit von konventionellen T-Zellen aus OPN-Knock-out-Tieren durch regulatorische T-Zellen aus Wildtyp- oder OPN-KO-Tieren erhöht. Die Supprimierbarkeit von wildtypischen Tconv-Zellen wird durch OPN jedoch nicht beeinflusst. N2 - The effect of OPN on CD4+ CD25+ Foxp3+- Trag and CD4+ CD25- Foxp3- Tconv-cells was analyzed through FACS-analysis. It could be shown that OPN increases the suppression of Tconv from OPN-knock-out mice through Treg from WT or knock-out mice. KW - OPN KW - T-cells KW - Osteopontin KW - Treg KW - Tconv KW - T-Zellen Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199460 ER - TY - THES A1 - Brackmann, Heike T1 - Funktionelle Lücken zytotoxischer T-Zellen im Laufe einer HIV Infektion - Untersuchung der Zytokinproduktion und diverser Effektorfunktionen CD8+ T-Lymphozyten bei HIV-Infizierten in unterschiedlichen Stadien der Erkrankung T1 - Impaired function of cytotoxic T-cells in course of HIV-infection-analysis of cytokine production and divers effektor functions of CD8+ T-cells in HIV-infekted persons different stages of disease N2 - Zytotoxische CD8+ T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle in der Immunantwort gegen HIV-1. Trotz allem kommt es jedoch im Verlauf der Infektion bei den meisten Betroffenen zum Anstieg der Viruslast und Abfall der CD4 Zellzahl, obwohl auch in diesem fortgeschrittenen Stadium der Infektion virusspezifische CD8+ T-Zellantworten mittels INF-γ-Produktion nachgewiesen werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, weitere funktionelle und phänotypische Merkmale von CD8+ T-Zellen zu untersuchen, um eine mögliche Ursache für die im Verlauf der Infektion ineffizient werdende Immunantwort zu finden. Einen statistisch signifikanten Unterschied der INF-γ Produktion CD8+ T-Zellen zwischen Progressors und Controllers ließ sich mittels INF-γ Elispot bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen. Es ist also davon auszugehen, dass CD8+-T-Zellen im fortgeschrittenen, chronischen Stadium der Infektion funktionelle Lücken aufweisen, die sich nicht durch INF-basierte Untersuchungsmethoden nachweisen lassen. Anhand intrazellulärer Zytokinfärbung ließ sich unabhängig vom Schweregrad der Infektion eine erhaltene Produktion der Zytokine INFγ und TNFα, nicht hingegen eine Produktion von IL-2 nachweisen. Bei der Untersuchung HIV spezifischer CD8+ T-Zellen mit Hilfe von Tetramerfärbungen zeigte sich in Bezug auf den Aktivierungsgrad, gemessen an der CD38-Expression, ein deutlicher Unterschied zwischen Progressors und Controllers, der innerhalb der HIV-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zur gesamten CD8+ T-Zellpopulation noch ausgeprägter zu erkennen war. Hier gab es eine signifikante positive Korrelation zur Viruslast und eine signifikante negative Korrelation zur CD4-Zellzahl der HIV-Infizierten. Anhand des Aktivierungsmarkers HLA-DR ließ sich dieser Unterschied nicht nachweisen. Im Bezug auf die Proliferationsfähigkeit, Apoptoseempfindlichkeit und lytische Funktion HIV-spezifischer Zellen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Progressors und Controllers ausgemacht werden. Schlüsse für die Gesamtheit der HIV-spezifischen Zellen eines HIV-Infizierten kann man natürlich nicht ziehen. Man darf nicht außer Acht lassen, dass uns lediglich eine begrenzte Anzahl von Epitopen bei den durchgeführten Untersuchungen zur Verfügung stand. Es wurde jedoch deutlich, dass es feine Unterschiede und Trends zu geben scheint, die eine gezielte weiterführende Untersuchung erfordern. Weiterhin ist auch zu bedenken, dass möglicherweise andere Faktoren, als die von uns untersuchten, für den unterschiedlichen Krankheitsverlauf verantwortlich sein können. Welche Faktoren nun tatsächlich die Ursache sind dafür, dass das menschliche Immunsystem gegen das HI-Virus in der Regel früher oder später verliert, bleibt weiterhin offen. Sehr wahrscheinlich handelt es sich hierbei um das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen. Die gezielte Untersuchung HIV-spezifischer Zellen ist bei der weiteren Erforschung der genauen Zusammenhänge unerlässlich. KW - HIV KW - HIV-Infektion KW - Cytokine KW - Interferon KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Interleukin 2 KW - T-Zellen KW - zytotoxische T-Zellen KW - bcl-2 KW - CD38 KW - CD57 KW - apoptosis KW - replikative senescence Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40066 ER - TY - THES A1 - Abt, Marion T1 - Interaktion von Masernviren mit Dendritischen Zellen : Untersuchungen zur Rezeptorbenutzung, Regulation der Chemotaxis und T-Zellkommunikation T1 - Measles Virus and Dendritic Cells: Investigation of Receptor Usage, Chemotaxis and T-Cell Communication N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von MV auf die Expression und Nutzung verschiedener Rezeptoren auf Dendritischen Zellen (DC) untersucht. Dazu wurden DC in vitro aus Monozyten gewonnen und mit IL- 4 und GM-CSF ausdifferenziert. In der Arbeit wurden das Wildtypvirus WTF und der Vakzinestamm ED eingesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Expression der Chemokinrezeptoren 5 (CCR5) und 7 (CCR7) auf MV-infizierten DC-Kulturen sowie das Migrationsverhalten der DC untersucht. Die Expression von CCR5 ist abhängig vom Reifungszustand der DC. Während unreife DC CCR5 exprimieren, verringert sich die Expression im Zuge der Ausreifung, während die Expression von CCR7 induziert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die MV-Infektion einer DC-Kultur die Expression von CCR5 nicht beeinflusst, obwohl die Expression anderer charakteristischer Reifungsmarker erhöht wird. Weiterhin konnte die Expression von CCR7 durch eine Infektion der DC-Kulturen mit MV nicht induziert werden. Die Ergebnisse der durchgeführten durchflusszytometrischen Analysen zur Rezeptorexpression wurden in Chemotaxis-Assays eingehender untersucht. DC aus MV-infizierten Kulturen zeigten trotz anhaltender CCR5-Expression nur eine geringe Migration in Richtung des CCR5-Liganden CCL-3. Aufgrund der fehlenden CCR7- Expression konnte erwartungsgemäß keine Migration der eingesetzten DC gegenüber dem CCR7-Liganden CCL-19 beobachtet werden. Weiterhin konnten Unterschiede im induzierten Chemokinmuster in MV-infizierten DCKulturen im Vergleich zu LPS-ausgereiften oder mit einer Mockpräparation behandelten DC nachgewiesen werden. Kurz nach der Infektion konnte in MVinfizierten DC-Kulturen eine reduzierte Menge CXCL-8 und CCL-20 sowohl auf mRNA Ebene als auch auf Proteinebene detektiert werden. In weiteren Experimenten konnte eine verminderte Migration von T-Zellen auf Zusammenfassung 152 Zellkulturüberstände aus infizierten DC-Kulturen im Vergleich zu Überständen aus LPS-behandelten DC-Kulturen festgestellt werden. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit konnte MV als Ligand für das DCspezifische Oberflächenmolekül DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule (ICAM)-3 grabbing non-integrin) identifiziert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass beide verwendeten Virusstämme an DC-SIGN binden können, DC-SIGN jedoch keinen Eintrittsrezeptor für MV darstellt. Weitere Analysen zeigten, dass DC-SIGN die Infektion, besonders bei geringen Viruskonzentrationen, verstärkt. In erster Linie zeigt die MV-Infektion unreifer DC die Bedeutung von DC-SIGN als Bindungsrezeptor für MV. Die hohe Expression von DC-SIGN auf unreifen DC ermöglicht eine effiziente effektive Infektion dieser Zellen. Auf reifen DC ist der Einfluss von DC-SIGN auf die Effektivität der Infektion der DC deutlich verringert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Kontaktzeiten zwischen DC und TZellen in dreidimensionalen Kollagenmatrices untersucht. Dabei wurde eine in etwa doppelt so lange Kontaktzeit zwischen MV-infizierten DC und durch Oxidative Mitogenese veränderten T-Zellen gegenüber LPS-behandelten DC bzw. MV-infizierten und nicht-modifizierten T-Zellen festgestellt. In den parallel durchgeführten Proliferationstests wurde eine reduzierte Proliferation der TZellen beobachtet, die mit MV-infizierten DC kokultiviert wurden. Im Gegensatz zu den kürzeren Kontakten zwischen LPS-behandelten DC und modifizierten TZellen waren die Kontakte zwischen MV-infizierten DC und modifizierten TZellen nicht-stimulatorisch. N2 - This study investigates the influence of measles virus (MV) on the expression and usage of different receptors on dendritic cells (DC) was investigated. For this dendritic cells were generated in vitro by culturing monocytes in the presence of IL-4 and GM-CSF. The wildtype virus WTF and the vaccine virus ED were used for the experiments. The first part of the study analyses the expression of Chemokine receptor 5 (CCR5) and CCR7 as well as functional consequences for the migration of MVinfected DC-cultures. The expression of CCR5 depends on the maturation state of DC; expression of CCR5 on immature DC is downregulated during maturation, while expression of CCR7 is upregulated. This study shows that the expression of CCR5 on DC is not influenced by MV-infection, although other characteristic maturation markers are upregulated. In addition, the expression of CCR7 could not be detected on DC after infection with MV. Chemotaxis assays were used to investigate the results of the flowcytometric analysis in more detail. Despite constant CCR5 expression DC of MV-infected cultures showed impaired migration towards the CCR5 ligand CCL-3. Migration towards the CCR7 ligand CCL-19 could not be detected due to the lack of CCR7 expression. Additionally, differences in the chemokine expression pattern between MV-infected and LPS- or mock-treated DC were observed. Short term infection of DC-cultures resulted in reduced mRNA and protein production of CXCL-8 and CCL-20 in DC infected with MV compared to LPS- or mock-treated cells. The migration of T-cells towards supernatants of MV-infected DC was, as well, impaired in comparison to migration towards supernatants of LPS-treated DC. In the second part of this study identified MV as a ligand for the DC-specific surface molecule DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion Summary 154 molecule (ICAM)-3 grabbing non-integrin). The work shows that both viruses (ED and WTF) bind to DC-SIGN, whereas uptake and replication of the virus was not supported by DC-SIGN alone. This study could show that the expression of DC-SIGN efficiently enhances the infection of different cells, especially at low virus titers. In particular, the infection of immature DC is supported by DC-SIGN. The high expression level of DC-SIGN on immature DC enhances the efficient infection of these cells. For the infection of immature DC DC-SIGN functions as an enhancement factor, whereas the infection of mature DC is less influenced by DC-SIGN. The third part of this study shows preliminary data of DC/T-cell interactions. Contact duration between both cell types were analysed in three-dimensional collagen matrices by time-lapsed videomicroscopy. The results show that interactions between MV-infected DC and modified T-cells are twice as long as those of not-infected dendritic cells. In parallel the proliferation of contacted T-cells was analysed. The T-cells contacted with MV-infected DC showed impaired proliferation in comparison with T-cells contacted with LPS-treated DC. These results show that the observed short-lived contacts between LPS-treated DC and modified T-cells are more efficient as the longer contacts between MVinfected DC and modified T-cells. KW - Dendritische Zelle KW - Masernvirus KW - Masern KW - Dendritische Zellen KW - Chemotaxis KW - T-Zellen KW - DC-SIGN KW - measles KW - dendritic cells KW - chemotaxis KW - t-cells KW - DC-SIGN Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19706 ER - TY - THES A1 - Beyersdorf, Niklas T1 - Phänotyp und Funktion KLRG1-exprimierender Lymphozyten der Maus T1 - Phenotype and function of KLRG1-expressing lymphocytes of the mouse N2 - Die Reifung, Differenzierung und Funktion von Lymphozyten wird maßgeblich von aktivierenden und inhibitorischen Zelloberflächenrezeptoren reguliert. "Killer cell Lectin-like receptor G1" (KLRG1) ist ein Typ-II-Transmembranprotein, dessen Expression auf Subpopulationen von T-Lymphozyten und Natürlichen Killerzellen beschränkt ist. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die differentielle Expression und mögliche Funktion von KLRG1 auf diesen Zellen im Maussystem zu charakterisieren. Mit Hilfe zellbiologischer Untersuchungsmethoden konnte gezeigt werden, dass die KLRG1-Expressionsfrequenz mit dem Reifegrad der Zellen korreliert. Frühere Beobachtungen, wonach KLRG1 durch Erkennung eigener Klasse-I-Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) über inhibitorische Rezeptoren der Ly49-Familie induziert wird, konnten auf klassische Klasse-I-Moleküle und neue Ly49-Familienmitglieder ausgeweitet werden. Ferner belegen Daten dieser Arbeit, dass reife NK-Zellen die KLRG1-Expressionsfrequenz in verschiedenen lymphoiden Organen dem Klasse-I-Niveau der umgebenden Zellen anpassen können und dass T- und B-Lymphozyten möglicherweise eine zentrale Rolle hierbei spielen. Somit stellt KLRG1 einen NK-Zellrezeptor dar, dessen Expression durch Ly49-Rezeptorengagement dynamisch reguliert wird. Es ist möglich, dass KLRG1 kompensatorische (ko-)inhibitorische Eigenschaften besitzt, die für die Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz von NK-Zellen von Bedeutung sind. Unter den CD8-T-Zellen identifiziert ein polyklonales abT-Zellrezeptorrepertoire und die Expression von CD8 als ab-Heterodimer den 2-3%igen Anteil an KLRG1+ Zellen als konventionelle T-Zellen thymischen Ursprungs. Umfangreiche phänotypische und funktionelle Analysen ergaben, dass KLRG1-exprimierende CD8-Zellen sich aus ca. 20% proinflammatorischer Effektorzellen und ca. 80% Gedächtniszellen zusammensetzen. Aufgrund von Daten der Arbeitsgruppe Pircher scheint das Zellteilungsvermögen letzterer ausgeschöpft zu sein. Demzufolge markiert KLRG1 eine neue Subpopulation von CD8-T-Zellen, der sowohl Effektorzellen, als auch "replikativ seneszente" Gedächtniszellen angehören. Abschließende Untersuchungen ergaben, dass KLRG1 interessanterweise auch von 1-2% der CD4+ T-Zellen exprimiert wird und dass die KLRG1+ CD4-T-Zellen zum Großteil CD25 koexprimieren. Funktionelle Anschlußexperimente zeigten, dass es sich bei diesen Zellen um regulatorische T-Zellen handelt. Zusammenfassend kennzeichnet KLRG1-Expression eine Subpopulationen von NK-Zellen, die körpereigene Zellen über Klasse-I erkennen können, eine Untergruppe von Effektor- und seneszenten CD8-T-Zellen sowie neuartige regulatorische CD4-T-Zellen. N2 - The maturation, differentiation and function of lymphocytes is crucially regulated by activating and inhibitory cell surface receptors. "Killer cell lectin-like receptor G1" (KLRG1) is a type-II transmembrane protein, which is expressed on subpopulations of T cells and Natural Killer cells. The aim of this work was to characterise the differential expression and possible function of KLRG1 on these cells in the mouse. Cell biological assays revealed that the expression frequency of KLRG1 and the maturity of the cells are positively correlated. The earlier finding that KLRG1 expression is induced after recognition of self class I molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC) by inhibitory receptors of the Ly49 family could be extended to classical class I molecules and to novel members of the Ly49 family. Moreover, the data contained in this work provide evidence that mature NK cells are capable of adapting KLRG1 expression frequencies to the level of class I expression on surrounding cells in the respective lymphoid organ and that T and B lymphocytes probably play a central role in this process. KLRG1 expression on NK cells, thus, is subject to dynamic regulation via engagement of Ly49 receptors. Moreover, it is possible that KLRG1 is endowed with compensatory (co-)inhibitory properties which are important for maintaining self-tolerance of NK cells. Among CD8 T cells it is the polyclonal ab T cell receptor repertoire and the expression of CD8 as an ab heterodimer which indicates thymic origin of the 2-3% KLRG1+ cells. Extensive phenotypical and functional analyses revealed that KLRG1-expressing CD8 cells are a mixture of about 20% pro-inflammatory effector cells and about 80% memory cells. According to data generated in the group of Hanspeter Pircher the latter have lost the potential to undergo further cell divisions. Therefore, KLRG1 is a marker for a novel subpopulation of CD8 T cells consisting of, both, effector cells and "senescent" memory cells. In final experiments, KLRG1 expression was detected on 1-2% of CD4+ T cells with the majority of KLRG1+ CD4 T cells co-expressing CD25. Subsequent functional studies revealed that these cells are regulatory T cells. In summary, KLRG1 expression marks a subpopulation of NK cells, which are capable of recognising other cells via class I molecules, a subset of effector and senescent CD8 T cells as wells as novel regulatory CD4 T cells. KW - NK-Zellen KW - T-Zellen KW - inhibitorische Rezeptoren KW - KLRG1 KW - NK cells KW - T cells KW - inhibitory receptors KW - KLRG1 Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17550 ER -