TY  - THES
A1  - Höhn, Marie
T1  - Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
T1  - Alteration of the tumor immune environment in murine mamma carcinomas by inhibition of collagen synthesis
N2  - Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
N2  - The mamma carcinoma is a desmoplastic tumor which shows an accumulation of fibrotic tissue and of extracellular matrix (ECM). This highly dense ECM acts as a physical and signaling-mediated barrier reducing the efficacy of various therapeutic approaches. One of the main components of the ECM is collagen. The rigid structure can be loosened by drugs which inhibit collagen synthesis and maturation. This potentially leads to improved infiltration with nutrients and a better access for immune cells. These are absolutely necessary for the effectiveness of the immune therapy that has been established as a promising alternative approach in the last years in addition to the classical cancer therapy options. In this dissertation murine mamma carcinomas of the 4T1-tumor cell line were treated with collagen inhibitors, with the aim to destabilize the rigid ECM and analyze following changes of the immune environment.
The drugs, that were used, inhibit at different stages collagen synthesis and maturation: βAPN as a LOX(L)-inhibitor, 1,4-DPCA as a P4HA-inhibitor and Minoxidil as a LH-inhibitor. The treatment led to an accumulation of different kinds of immune cells which shows the improved infiltration. Furthermore, malignant pathways concerning angiogenesis, hypoxia, invasiveness, metastasis, and immunosuppression are reduced. Tumor suppressive immune responses are enhanced.
Moreover, we could ascertain a reduced tumor growth and microvessel density after treatment.
All in all, the tumors show, because of the changed quantity and constellation of immune cells, a stronger immune stimulating function. This embodies the promising potential of the usage of collagen inhibitors as an additional treatment to immune therapy to facilitate its efficacy, which has to be examined by further studies.
KW  - Brustkrebs
KW  - Kollagen
KW  - Immunsystem
KW  - Inhibition
KW  - Tumor
KW  - Tumorimmunumgebung
KW  - Kollageninhibition
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284929
ER  - 
TY  - THES
A1  - Graf, Dominic
T1  - Surface and active site modification of proteins with organometallic markers and inhibitors
T1  - Modifikation von Proteinen an der Oberfläche und im aktiven Zentrum durch organometallische Marker und Inhibitoren
N2  - After implementing a reliable mass spectrometry based kinetic study the indole conjugation with different organometallic indoles led to questions about the electronical and sterical influences on reactivity. The substitution pattern of the ferrocene functionalized indoles at the six-membered ring determines the electron density on the C3 atom, which reacts with the formed Schiff base. Since the experimental results showed the exact opposite trend, covalent docking studies were performed elucidating the importance of surface interactions. These studies were in harmony with the experimental results and determined lysine 33 as most preferable conjugation site as well as substitution in 6-position as most favourable pattern. The amine motif in compounds 6, 7 and 8 proofed to be easily fragmented by the ESI method used. The amide linker in 10 remains intact but shows a lower conversion. Those two inherent characteristics are however preferable for well-defined and site-specific bioconjugation. The synthesis and evaluation of piano stool complex derivatives with manganese and rhenium metal centre 15, 16, 18 and 22 gave additional guidance by the interpretation of applicable structural motifs. The electron-withdrawing carbonyl groups lead to the hindrance of fulvene formation and thus to no fragmentation as seen with the ferrocene group. The total conversion is low compared to 8, only 22 shows a good enough conversion to mainly monoconjugate of 45% and a possible radio-labelling application as 99mTc analogue. As consequence manganese complexes with a stable facial tricarbonyl unit and a tridentate chelator with 4-, 5- and 6-substituted aminomethylindole conjugated through an amide bond were synthesized and consecutively evaluated. The resulting organometallic indole derivatives 29, 30 and 31 all showed a total conversion around 40% similar to 16, but at the same time a rate constant in the range of 10-4 s-1 like the organic indole. Besides the similar conversion, the rate constants followed the trend of the 6-substituted derivative as fastest and then 5- and 4- substituted derivative with decreasing reactivity. For underlining the usage as technetium label for the best out of the series 31, a rhenium analogue was prepared. The resulting compound 32 was especially interesting, because the conversion was even higher than the 70% of 8 with a total of 88%. Additionally, the rate constant was a tenfold higher as well. This rendered compound 32 as best possible 99mTc analogue for further application as radio-label. After the success of 32 and realizing the sterical benefits resulting from the flexible tridentate ligand-system, substitution at the five-membered ring was explored. The complexes 33, 34 and 35 are based on indole-2-carboxylic acid and with the difference of the length of the alkyl spacer between amide and complex to probe for the influence and sterical hindrance, but all three derivatives showed no conjugation which excludes functionalization in 2-position. As the C3 is used for the actual bioconjugation, the last possible derivatization was realized on the indole-N1 by using 1-(3-bromopropyl)indole as building block during the synthesis of the ligand-system. The corresponding manganese 36 and rhenium 37 complexes both showed similar properties of a moderate conversion like 22 and a rate constant in the range of 10-5 s-1. In conclusion the rhenium complex 32 with the 6-substitution pattern at the tridentate indole-bearing ligand remains the most promising structure.
The here developed liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay for the determination of inhibitory activity of drug candidates against the 3CLpro of the sever acute respiratory syndrome coronavirus type 2 was successfully implemented and especially designed to give, due to the available absorption spectra and corresponding mass traces, further insight in the otherwise through fluorescence resonance energy transfer-based assays neglected influences on the inhibition results. Starting with a literature-known quinolone containing covalent inhibitor 42 an N1-methylated derivative 43 and their analogues 44 and 45 in which the benzoic acid was exchanged for ferrocene carboxylic acid were synthesized. The inhibition of 3CLpro was evaluated by the concentration of initial 15mer peptide left after incubation and for that purpose the for 280 nm defined molar attenuation coefficient of (26.41±0.59) L*mol-1*cm-1 determined and used. The results showed a reaction of DL dithiothreitol with the less stable benzoic acid esters leading to a moderate inhibitory effect. The methylation in N1-position showed an increase in stability. The methylated and with ferrocene carboxylic acid functionalized derivative showed a complete inhibition during the timeframe of the assay. In search of a fluorescent and therefore traceable inhibitor, 4 hydroxycoumarin was used to synthesize the analogue with benzoic acid 49 and ferrocene carboxylic acid 50. Both derivatives were less stable than their analogues but exhibited the same trend of a more stable ferrocene-derived compound, which exerted a higher inhibition as well. After preparing and testing the model thioester 53 and showing an inactivation of the established inhibitor ebselen, it was concluded that the reaction with DL dithiothreitol reduces the concentration of active intact inhibitor and therefore decreases the inhibition rate during the assay. The next step was proofing the reducing agent as non-essential for the fast assay conducted in a timeframe of 5 min to circumvent the negative influence of DL dithiothreitol. By excluding every inhibition-altering part, the resulting method is the perfect tool for precise statements in relation of inhibitory activity. Then the inhibition assay was repeated for ebselen and the best out of the here introduced organometallic inhibitors 45. Both give equivalent results of a complete inhibition during the measurement. The implemented liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay has many advantages over the fluorescence resonance energy transfer-based assays in which all the information and insight accumulated by the evaluation of uv/vis traces and mass spectra are not available leading to wrong or deviating results regarding the inhibitory capacity of inhibitor candidates.
N2  - Nach der erfolgreichen Implementierung einer auf Massenspektrometrie basierenden Methode, um kinetische Studien über die Indolkonjugation durchzuführen, kamen Fragen über die elektronischen und sterischen Einflüsse auf die Reaktivität auf. Das Substitutionsmuster der Ferrocen-funktionalisierten Indole am sechsgliedrigen Ring bestimmt die Elektronendichte am C3-Atom, welches wiederum mit der zuvor entstandenen Schiffbase reagiert. Da die experimentellen Daten einen der Elektronendichte entgegengesetzten Trend aufwiesen, wurden Docking-Studien durchgeführt, um die Einflüsse der Wechselwirkungen mit der Proteinoberfläche näher zu beleuchten. Diese entsprachen den experimentellen Werten und zeigten, dass Lysin 33 die bevorzugte Konjugationsstelle ist und dass die Substitution in 6-Position die energetisch günstigste darstellt. Das sekundäre Amin der Verbindungen 6, 7 und 8 wurde unter den ESI-Bedingungen leicht fragmentiert. Die Amid-Bindung von 10 dagegen bleibt intakt und ein langsamerer Umsatz, welcher für einen wohl definierten Umsatz sorgt, wurde beobachtet. Die Synthese und Evaluation der Halbsandwich-Komplexe 15, 16, 18 und 22 gab zusätzlichen Aufschluss über die strukturellen Einflüsse. Die elektronenziehenden Carbonyle behindern die Bildung der Fulvene, welche für die Ferrocen-Derivate beobachtet worden war. Der Gesamtumsatz ist vergleichsweise gering und nur Substanz 22 zeigt eine annehmbare Konversion von 45% an Monokonjugat auf, welches sie wiederum für den Einsatz als 99mTc-Analog qualifiziert. Als direkte Konsequenz wurden Mangankomplexe mit einer stabilen facialen Tricarbonyl-Einheit und einem Indol beinhaltenden tridentaten Liganden synthetisiert. Dies wurde für die 4-, 5- und 6-Substitution durchgeführt um die Komplexe 29, 30 und 31 zu erhalten. Alle drei zeigten eine Konversion von ungefähr 40% und lagen mit einer Ratenkonstante von 10-4 s-1 in dem Bereich des organischen Indols. Die Ratenkonstanten folgten hingegen wiederum dem Trend der begünstigten 6-Position, gefolgt von der 5- und dann 4-Position. Um einen Verglich zu einer analogen Technetium-Verbindung zu ziehen wurde der beste Komplex 31 als Rhenium-Analog 32 hergestellt. Dies wies den bisher höchsten Gesamtumsatz von 88% auf, welches die Konversion von 70% der Verbindung 8 überschritt. Dadurch qualifizierte sich Verbindung 32 als beste Option für eine Umsetzung als Radiomarker. Nach den Erkenntnissen über die begünstigte Sterik der flexiblen tridendaten Liganden wurde versucht den Erfolg auf den Fünfring zu übertragen. Eine auf Indol-2-säure basierende Reihe an Komplexen (33,34,35) mit unterschiedlich langen Alkyl-Ketten zwischen Indol und Metallkomplex sollte Aufschluss über den sterischen Anspruch geben, allerdings war keine Konjugation für alle drei Derivate zu beobachten. Als Konsequenz wurde die 2-Position für weitere Funktionalisierung nicht weiter berücksichtigt. Die letzte verbliebene Stelle war das Indol-amin selbst, welche durch den Einsatz von 1-(3-bromopropyl)indol bei der Ligandensynthese erfolgreich alkyliert wurde. Der resultierende Mangan- 36 und Rhenium-Komplex 37 zeigten eine mit 22 vergleichbare moderate Konversion und um eine Größenordnung kleinere Ratenkonstante. Durch diese Erkenntnisse verblieb der Rhenium-Komplex 32 weiterhin der beste Kandidat für eine Umsetzung als radioaktiver Marker.
Der hier beschriebene liquid chromatography coupled mass spectrometry basierte Assay für die Bestimmung der Inhibitions-Wirkung gegenüber der 3CLpro des sever acute respiratory syndrome coronavirus type 2 wurde erfolgreich etabliert. Durch die zusätzlichen Absorptions , sowie Massenspektren wurden weitere Informationen gewonnen, welche in den oft angewendeten Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer Assays vernachlässigt werden und zu Verfälschungen der Inhibitionsergebnisse führen. Ausgehend von dem literaturbekannten kovalenten Inhibitor 42 wurde ein N1-methyliertes Derivat 43 hergestellt. Durch den Austausch von Benzoesäure durch Ferrocensäure wurden die Analoge 44 und 45 erhalten. Die Restkonzentration des 15mer Substrats nach der Inkubation wurde als Maß der Inhibition herangezogen. Hierfür wurde der molare Extinktionskoeffizient bei 280 nm mit (26.41±0.59) L*mol-1*cm-1 bestimmt. Die Methylierung führte zu einer erhöhten Stabilität. Der Wirkstoffkandidat 45 zeigte außerdem eine vollständige Inhibition im Rahmen des durchgeführten Assays. 4-Hydroxycoumarin wurde verwendet, um die fluoreszenten Analoga 49 und 50 herzustellen. Beide waren instabiler, wobei das Ferrocen-Derivat wie zuvor eine erhöhte Inhibition aufzeigte. Nach der Synthese und Auswertung des Assays für eine Thioester Modellverbindung 53 und einer nachgewiesenen Inaktivierung des etablierten Inhibitors Ebselen wurden die Nebenreaktionen mit DL-Dithiothreitol als Ursache für einen Konzentrationsabfall der aktiven und intakten Inhibitoren und infolgedessen verringerte Inhibition angenommen. Als nächstes wurde bewiesen, dass der Zusatz eines Reduktionsmittels wie keinen Einfluss auf die Enzymaktivität während des kurzen Assays hat. So wurden alle Einflüsse auf die Inhibitionswirkung ausgeschlossen und der nun makellose Assay für Ebselen und den hier vorgestellten neuartigen organometallischen Inhibitor 45 wiederholt, welche beide eine vollständige Inhibition aufwiesen.
KW  - Inhibition
KW  - SARS-CoV-2
KW  - Covalent inhibitors
KW  - Surface modification
KW  - Indole conjugation
KW  - LCMS- based kinetic studies
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287424
ER  - 
TY  - THES
A1  - Maimari, Theopisti
T1  - The influence of N-terminal peptides of G-protein coupled receptor kinase (GRK) 2, 3 and 5 on β-adrenergic signaling
T1  - Der Einfluss von N-terminalen Peptiden der G-Protein gekoppelten Rezeptorkinasen (GRK) 2, 3 und 5 in der β-adrenergen Signaltransduktion
N2  - G protein coupled receptor kinases (GRK) phosphorylate and thereby desensitize G protein coupled receptors (GPCR) including β-adrenergic receptors (βAR), which are critical regulators of cardiac function. We identified the Raf kinase inhibitor protein (RKIP) as an endogenous inhibitor of GRK2 that leads to increased cardiac contractility via βAR activation. RKIP binds to the N-terminus (aa1-185) of GRK2, which is important for the GRK2/receptor interaction. Thereby it interferes with the GRK2/receptor interaction without interference with cytosolic GRK2 target activation. In this project, the RKIP/GRK interface was investigated to develop strategies that simulate the effects of RKIP on βAR. 
RKIP binding to different isoforms of GRK expressed in the heart was analyzed by protein interaction assays using full-length and N-termini of GRK2, GRK3 and GRK5: 1-53, 54-185 and 1-185. Co-immunoprecipitation (Co-IPs) and pull-down assays revealed that RKIP binds to the peptides of GRK2 and GRK3 but not to the ones of GRK5, which suggests the existence of several binding sites of RKIP within the N-termini of GRK2 and GRK3. To analyze whether the peptides of GRK2 and GRK3 are able to simulate the RKIP mediated interference of the GRK2/receptor interaction, we analyzed the β2-AR phosphorylation in the absence and presence of the peptides. Interestingly, N-termini (aa1-185) of GRK2 and GRK3 reduced β2AR phosphorylation to a comparable extent as RKIP. In line with reduced receptor phosphorylation, the peptides also reduced isoproterenol-stimulated receptor internalization as shown by [3H] CGP-12177 radioligand binding assay and fluorescence microscopy compared to control cells. Subsequently, these peptides increased downstream signaling of β2AR, i.e. the phosphorylation of the PKA substrate phosducin. In an attempt to elucidate the mechanism behind the observed effects, Co-IPs were performed in order to investigate whether the peptides bind directly to the β2-AR and block its phosphorylation by GRK2. Indeed, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 could bind the receptor, suggesting that this way GRK2 is prevented from inhibiting the receptor. To investigate the physiological effect of GRK2 1-185, GRK3 1-185 and GRK5 1-185, their effect on neonatal mouse cardiomyocyte contractility and hypertrophy was analyzed. After long-term isoproterenol stimulation, in the presence of GRK2 1 185 and GRK3 1-185 the cross-sectional area of the cardiomyocytes showed no significant increase in comparison to the unstimulated control cells. In addition, upon isoproterenol stimulation, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 increased the beat rate in cardiomyocytes, mimicking RKIP while the base impedance, an indicator of viability, remained stable.
The N-termini (1-185) of GRK2 and GRK3 simulated RKIP’s function and had a significant influence on β2AR phosphorylation, on its downstream signaling and internalization, could bind β2-AR, increased beat rate and did not significantly induce hypertrophy, suggesting that they may serve as a model for the generation of new and more specific targeting strategies for GRK mediated receptor regulation.
N2  - G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRK) phosphorylieren und desensitisieren G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR), einschließlich β-adrenerge Rezeptoren (βAR), welche wichtige Regulatoren der Herzfunktion sind. Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) ist ein endogener Inhibitor von GRK2, der zur Aktivierung von βAR führt und dadurch zur Steigerung der Herzkontraktilität. RKIP bindet N-terminal (1-185) an GRK2; der GRK2 N-Terminus ist wichtig für die GRK2/Rezeptor Interaktion. Durch diese Bindung wird GRK2 inhibiert und derer Interaktion mit den Rezeptor gestört, allerdings bleiben die zytosolische GRK2 Substrate unbeeinflusst. In diesem Projekt wurde die Interaktion zwischen RKIP und GRK untersucht, um neue Targeting Strategien zu entwickeln, die die positiven Effekte von RKIP auf βAR Signalwege simulieren.
Die Bindung von RKIP an verschiedene, im Herzen lokalisierte GRK-Isoformen wurde über protein interaction assays untersucht:  mit GRK2, GRK3 und GRK5 und mit deren N-terminalen Peptiden  1-53, 54-185, 1-185. Die Co-Immunopräzipitationen (Co-IPs) und die pull-down Versuche haben gezeigt, dass RKIP sowohl GRK2 und GRK3 als auch deren N-Termini bindet, GRK5 und dessen N-termini hingegen nicht. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass sich mehrere RKIP Bindungsstellen an dem GRK2 N-Terminus befinden. Um zu analysieren, ob die GRK2- und GRK3-Peptide eine ähnliche Wirkung wie RKIP auf die Interaktion von GRK2 und Rezeptor aufweisen, wurde die Rezeptorphosphorylierung ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass GRK2 1-185 und GRK3 1-185 die Phosphorylierung des βAR reduzieren können. Radioligandbindungsassays mit [3H] CGP-12177 und Fluoreszenzmikroskopie zeigten zudem, dass GRK2 1-185 und GRK3 1-185 auch die Internalisierungsrate des βAR senken können. Anschließend hatten GRK2 1-185 und GRK3 1-185 einen positiven Effekt auf einem βAR downstream Signalmolekül. Hierbei handelte es sich um die Phosphorylierung von Phosducin, was ein PKA-Substrat ist. Um die Wirkungsweise der N-termini zu erläutern, wurde untersucht, ob diese direkt den β2AR binden und somit die GRK2 vermittelte Phosphorylierung hindern. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass GRK2 1-185 und GRK3  1- 185 den β2AR binden und dementsprechend einen Einfluss auf die Phosphorylierung haben. Des Weiteren, wurden die Effekte der Peptide auf  Kontraktilität und Hypertrophie in neonatalen Mauskardiomyozyten analysiert. In Anwesenheit von GRK2 1-185 und GRK3 1-185 war die Querschnittsfläche der Mauskardiomyozyten nicht signifikant größer im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollzellen.  Außerdem wurde eine signifikante Erhöhung der Kontraktilität in den Mauskardiomyozyten mit GRK2 1-185 und GRK3 1-185 beobachtet.  
Insgesamt, konnten GRK2 1-185 und GRK3 1-185 RKIPs Funktion simulieren: sie hatten einen signifikanten Effekt auf β2AR-Phosphorylierung, Internalisierung und downstream Signaling. Zudem konnten sie die Kontraktilität erhöhen und hatten keinen Einfluss auf Hypertrophie. Somit könnten sie als Prototyp für die Entwicklung neuer Targeting Strategien für die GRK-vermittelte Rezeptor Regulation, genutzt werden.
KW  - G protein-coupled receptor kinase
KW  - Raf kinase inhibitor protein
KW  - Inhibition
KW  - Heart failure
KW  - Peptides
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199322
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schäfer, Florian
T1  - Kontraktionsverhalten neonataler Rattenkardiomyozyten bei Überexpression phosphorylierungsdefizienter RKIP Mutanten S51/S52
T1  - Contractility of neonatal rat cardiomyocytes after overexpression of phosphorylation-deficient RKIP mutants S51 /S52
N2  - Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als natürlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von RKIP die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten erhöht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und –aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgeführt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP überexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP überexprimiert wurde, eine signifikant höhere Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp überexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erhöhte Calciumfreisetzung während der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme während der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilität untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V überexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminosäureposition 51 bzw. Aminosäureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilität möglich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminosäureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden.
N2  - By phosphorylation, GRK2 inactivates cardiac ß-adrenoreceptors and thereby reduces the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. As a natural inhibitor of GRK2, RKIP influences cell signaling when ß-adrenoreceptors are stimulated. The presented research shows that an overexpression of RKIP increases the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. The number of spontaneous contractions occurring before and after stimulation with isoproterenol was recorded and a temporal analysis of calcium release and uptake after electrical stimulation was performed. In the unstimulated state, neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed wild-type RKIP showed no significant differences in terms of spontaneous contractions compared with the control group. After stimulation with isoproterenol, neonatal rat cardiomyocytes in which wild-type RKIP was overexpressed showed a significantly higher number of occurring spontaneous contractions. 
Neonatal rat cardiomyocytes overexpressing wild-type RKIP showed an increased calcium release during systole and an accelerated calcium reuptake during diastole.
The RKIP mutants RKIPS51V and RKIPS52V were examined regarding their contractility. Neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed RKIPS51V and RKIPS52V showed no significant differences compared to the control group in terms of spontaneous contractions or calcium cycling. Since phosphorylation at amino acid position 51 or amino acid position 52 could also be possible without direct effect on contractility, an in vitro kinase assay focusing on PKA and PKC was performed.
In the presented work, apart from phosphorylation at S153, no further phosphorylation of RKIP by PKC or PKA could be observed.
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Raf-Kinasen
KW  - Inhibition
KW  - Beta-Rezeptor
KW  - beta-adrenerge Signalwege
KW  - phopohrylierungsdefizient
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213747
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wettstein, Lars
T1  - Elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren zur Steuerung von Kristallitgröße und biologischer Reaktion
T1  - Brushite coatings  on titanium by electrochemical deposition in the presence of crystallization inhibitors to control of crystallite size and biological reaction
N2  - Es erfolgte eine elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren. Dabei wurden die Kristallisationsinhibitoren Zitronensäure, treta-Natriumdiphosphat-Decahydrat und Phytinsäure verwendet und die entstandenen Schichten mit denen ohne Inhibitorzugabe verglichen. Um das Ausmaß der Inhibierung zu verifizieren, wurde die Masse aller Schichten gemessen, welche für die Inhibition mit Zitronensäure und Phytinsäure abnahm und für Natriumdiphosphat zunahm. Die kristallographische Zusammensetzung der mit und ohne Inhibierung abgeschiedenen Schichten wurde mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie bestimmt und zeigte, dass sich reine Bruschitschichten mit unterschiedlichem amorphem Anteil abschieden. Die daraus entstandenen Werte lieferten zugleich die Informationen über die einzelnen Kristallitgrößen innerhalb der Schichten. Über den Einfluss der Inhibitoren auf die Schichtmorphologie gaben rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen weiteren Aufschluss. Die Inhibition verursachte teils mit Rissen durchzogene Schichten, deren Kristallformationen sich von Standardelektrolyt unterschieden. Ausgewählte Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen desinfiziert bzw. sterilisiert und nachfolgend erneut gewogen und mittels Röntgendiffraktogrammetrie und Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Nach der Desinfektion entstanden reine Bruschitschichten, die an Masse verloren aber trotzdem die typischen Kristallformationen zeigten. Die Sterilisation führte zur Umwandlung von Bruschit in Monetit und Hydroxylapatit. Des Weiteren wurde die biologische Reaktion der Schichten auf humane fötale Osteoblasten-Zelllinien zur Überprüfung der Zellverträglichkeit ermittelt. Die entstandenen Ergebnisse waren nicht verwertbar und enthielt sehr hohe Standardabweichungen.
N2  - Brushite coatings  were deposited on titanium by electrochemical deposition in the presence of various crystallization inhibitors such as citric acid, treta-sodium diphosphate decahydrate and phytic acid.  The resulting layers were compared with those without inhibitor addition.  To verify the extent of inhibition, the mass of all layers was measured, which decreased for inhibition with citric acid and phytic acid and increased for sodium diphosphate. The crystallographic composition of the layers deposited with and without inhibition was determined by X-ray diffraction and showed pure brushite caotings with different amorphous content. The resulting values also provided information about the individual crystallite sizes within the layers. Scanning electron microscope images provided further information about the influence of the inhibitors of the layer morphology. The inhibition caused layers partly interspersed with cracks, whose crystal formations differed from the standard electrolyte. Selected samples were disinfected or sterilized under various conditions and subsequently reweighed and analyzed by X-ray diffraction and scanning electron microscopy. After disinfection, pure brushite caotings were formed, which lost mass but still showed the typical crystal formations. Sterilization led to the transformation of brushite into monetite and hydroxyapatite. Furthermore, the biological response of the layers to human fetal osteoblast cell lines was determined to test cell compatibility. The results obtained were not usable and contained very high standard deviations.
KW  - Elektrochemische Abscheidung
KW  - Bruschitbeschichtung
KW  - Inhibition
KW  - electrochemical deposition
KW  - brushite coating
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217502
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heilos, Anna
T1  - Mechanistic Insights into the Inhibition of Cathepsin B and Rhodesain with Low-Molecular Inhibitors
T1  - Mechanistische Untersuchungen zur Inhibition von Cathepsin B und Rhodesain mit niedermolekularen Inhibitoren
N2  - Cysteine proteases play a crucial role in medical chemistry concerning various fields reaching from more common ailments like cancer and hepatitis to less noted tropical diseases, namely the so-called African Sleeping Sickness (Human Arfican Trypanosomiasis). Detailed knowledge about the catalytic function of these systems is highly desirable for drug research in the respective areas. In this work, the inhibition mechanisms of the two cysteine proteases cathepsin B and rhodesain with respectively one low-molecular inhibitor class were investigated in detail, using computational methods. In order to sufficiently describe macromolecular systems, molecular mechanics based methods (MM) and quantum mechanical based method (QM), as well as hybrid methods (QM/MM) combining those two approaches, were applied. 
For Cathespin B, carbamate-based molecules were investigated as potential inhibitors for the cysteine protease. The results indicate, that water-bridged proton-transfer reactions play a crucial role for the inhibition. The energetically most favoured pathway (according to the calculations) includes an elimination reaction following an E1cB mechanism with a subsequent carbamylation of the active site amino acid cysteine. 
Nitroalkene derivatives were investigated as inhibitors for rhodesain. The investigation of structurally similar inhibitors showed, that even small steric differences can crucially influence the inhibition potential of the components. Furthermore, the impact of a fluorination of the nitroalkene inhibitors on the inhibition mechanism was investigated. According to experimental data measured from the working group of professor Schirmeister in Mainz, fluorinated nitroalkenes show – in contrast to the unfluorinated compounds – a time dependent inhibition efficiency. The calculations of the systems indicate, that the fluorination impacts the non-covalent interactions of the inhibitors with the enzymatic environment of the enzyme which results in a different inhibition behaviour.
N2  - Cysteinproteasen spielen eine wichtige Rolle in der medizinischen Chemie. Nicht nur im Bereich bekannterer Krankheiten wie Krebs oder Hepatitis, sondern auch bezüglich weniger verbreiteter, tropischer Krankheiten wie der sogenannten afrikanischen Schlafkrankheit (Afrikanische Trypanosomiasis) haben diese Enzyme eine große Bedeutung. Im Bereich der Wirkstofffindung ist ein detailliertes Wissen über die katalytische Funktion der an einer Krankheit beteiligten Enzyme unabdingbar .In der vorliegenden Arbeit wurden die Inhibitionsmechanismen der beiden Cysteinproteasen Cathepsin B und Rhodesain in Verbindung mit zwei niedermolekularen Inhibitorklassen anhand theoretischer Berechnungen untersucht. Um die makromolekularen Systeme ausreichend genau beschreiben zu können, wurden neben molekularmechanischen (MM) und quantenmechanischen (QM) Ansätzen auch Hybridmethoden verwendet, welche beide Ansätze (QM/MM) verbinden.
Für Cathepsin B wurden Carbamat-basierte Moleküle als potenzielle Inhibitoren der Cysteinprotease untersucht. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass wasser-verbrückte Protonentransferreaktionen eine entscheidende Rolle für die Inhibition spielen. Der laut den Rechnungen energetisch günstigste Mechanismus beinhaltet eine Eliminierungsreaktion nach einem E1cB Mechanismus gefolgt von der Carbamylierung der Aminosäure Cystein in der aktiven Tasche des Enzyms.
Nitroalken-Derivate wurden als potenzielle Rhodesain Inhibitoren untersucht. Der Vergleich strukturell ähnlicher Verbindungen weist darauf hin, dass schon kleine sterische Veränderungen einen großen Einfluss auf das Inhibitionspotenzial der Nitroalkene haben können. Außerdem wurde der Einfluss einer Fluorierung der Inhibitoren anhand von Berechnungen untersucht. Messungen der Arbeitsgruppe von Prof. Schirmeister in Mainz zu fluorierten und unfluorierten Nitroalkenen zeigen, dass die fluorierten Verbindungen ein zeitabhängiges Inhibitionspotenzial in Rhodesain aufweisen. Die Berechnungen der Systeme deuten darauf hin, dass die Fluorierung die nicht-kovalenten Wechselwirkungen der Inhibitoren mit der enzymatischen Umgebung des Systems beeinflussen, was zu einem unterschiedlichen Inhibitionsverhalten führt.
KW  - Cysteinproteasen
KW  - Inhibitor
KW  - Mechanismus
KW  - Berechnung
KW  - Inhibition
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178228
ER  - 
TY  - THES
A1  - Quenzer, Anne
T1  - Der antiproliferative Effekt des Multidrug resistance-Protein 1 (MRP1)-Inhibitors  Reversan und der Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin an kolorektalen Karzinomzellen bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen
T1  - Antiproliferative effects of multidrug resistance protein 1 (MRP1) inhibitor Reversan and lactate dehydrogenase (LDH) inhibitors Natriumoxamat and Galloflavin in human colorectal cells exposed to oxygen levels characteristic for tumor oxygenation
N2  - Ziel der vorliegenden Arbeit waren pharmakologische Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt der beiden Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin sowie des MRP1-Inhibitors Reversan einzeln und in Kombination bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen in vitro zu untersuchen. Zusätzlich wurde der antiproliferative Effekt der drei Inhibitoren mit dem antiproliferativen Effekt von 5-FU verglichen.

Das Konzept zu dieser Arbeit basiert auf Gemeinsamkeiten zwischen LDH und MRP1 in malignen Zellen. Eine ist, dass beide Moleküle von zahlreichen Tumoren überexprimiert werden. Weiter sind beide an der Ausbildung von Chemoresistenz beteiligt und beide werden auch in Hypoxie exprimiert. Zudem wird das für die Funktion von MRP1 notwendige ATP in malignen Zellen hauptsächlich mit der hyperaktiven Glykoloyse gebildet, deren Stoffumsatz auch von der LDH-Aktivität abhängig ist. Eine kombinierte Inhibition beider Zielstrukturen scheint somit geeignet zu sein, um die Proliferation maligner Zellen gezielt zu hemmen. Da in großen Teilen solider Tumoren hypoxische bzw. anoxische Bedingungen vorherrschen, wurde die Wirksamkeit der drei Inhibitoren auch bei 5 % und 1 % Sauerstoff, die als tumorphysiologisch gelten, untersucht.

Die wichtigsten Ergebnisse aus dieser Arbeit sind, dass die beiden LDH-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin und der MRP1-Inhibitor Reversan einen antiproliferativen Effekt bei kolorektalen Karzinomzellen auslösen, der auch für tumorphysiologische Sauerstoffkonzentrationen nachzuweisen war. So verringerte sich durch Natriumoxamat bzw. Galloflavin der Anteil vitaler Zellen um bis zu 45 % und durch Reversan um bis zu 60 % bei 5 % und 1 % Sauerstoff im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.

Auch unterschiedliche Kombination aus Natriumoxamat, Galloflavin und Reversan führten zu einer Steigerung des antiproliferativen Effektes, der auch immer bei tumorphysiologischen Konzentrationen nachzuweisen war. Den stärksten antiproli-ferativen Effekt wies die Dreifachkombination aus Galloflavin, Natriumoxamat und Reversan auf. So verringerte sich der Anteil vitaler Zellen bei 1 % Sauerstoff durch diese Kombination auf bis zu 28 % bei vier der fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. Die Dreifachkombination wies einen gleichstarken bzw. stärkeren antiproliferativen Effekt auf als das Chemotherapeutikum 5-FU und zwar ebenfalls bei 5 % und 1 % Sauerstoff.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum antiproliferativen Effekt von Natriumoxamat, Galloflavin (beides LDH-Inhibitoren) und Reversan (MRP1-Inhibitor) in vitro lassen den Schluss zu, dass das Konzept der Arbeit, einen antiproliferativen Effekt auch bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen zu induzieren, grundsätzlich bestätigt wurde. Auch löste die gemeinsame Hemmung von LDH und MRP1 einen teilweise stärkeren antiproliferativen Effekt aus als 5-FU. Weitere Untersuchungen sind aber ohne Frage nötig, um die molekularen Interaktion zwischen LDH und MRP1 sowie ihrer Inhibition im Detail zu verstehen.
N2  - The aim of the present study was to investigate the antiproliferative effect of the two lactate dehydrogenase (LDH) inhibitors sodium oxamate and galloflavin and the MRP1 inhibitor reversan at different oxygen concentrations in vitro. The inhibitors were used individually and in combination. In addition, the antiproliferative effect of the three inhibitors was compared with the antiproliferative effect of 5-FU.

The concept of this study is based on similarities between LDH and MRP1 in malignant cells: their overexpression by numerous tumors; their contribution to chemoresistance and their expression in hypoxia. In addition, the ATP necessary for the function of MRP1 is mainly formed in malignant cells by an increased turnover of the hyperactive glycolysis, which also depends on the LDH activity. Thus, a combined inhibition of both targets appears to inhibit tumor cell proliferation effectively. Since hypoxic or anoxic conditions prevail in large parts of solid tumors, the efficacy of the three inhibitors was also investigated at 5% and 1% oxygen, which are considered to be physiological for solid tumors.

The most important results of the study are that both sodium oxamate and galloflavin, as well as reversan trigger an antiproliferative effect in colorectal carcinoma cells, even in the presence of tumor physiological oxygen concentrations. For example, the pro-portion of viable cells decreased up to 45% with sodium oxamate or galloflavin and up to 60% with reversan, even at 5% and 1% oxygen compared to untreated control cells.

Different combinations of sodium oxamate, galloflavin and reversan resulted in en-hanced antiproliferative effects, which were also demonstrated at tumor physiological oxygen concentrations. The strongest antiproliferative effects were observed with the triple combination of galloflavin, sodium oxamate and reversan. In this combination, the proportion of viable cells decreased to 28% at 1% oxygenation in four of the five colorectal carcinoma cell lines. The triple combination caused an antiproliferative effect that was equal to or even more potent than the antiproliferative effect of the chemotherapeutic agent 5-FU also at 5% and 1% oxygen.

The results of this study on the antiproliferative effect of sodium oxamate, galloflavin (both LDH inhibitors) and reversan (MRP1 inhibitor) in vitro seems to confirm the aim of the study, which was to induce an antiproliferative effect even in tumor physiologi-cal oxygen concentrations. In part, the combined inhibition of LDH and MRP1 caused a stronger antiproliferative effect than 5-FU. However, further investigations are neces-sary to comprehend the molecular interaction between LDH and MRP1 as well as its inhibition in detail.
KW  - Lactatdehydrogenase
KW  - 5-FU
KW  - Multidrug-Resistance-Related Proteine
KW  - Inhibition
KW  - Metabolismus
KW  - Tumorzellen
KW  - Tumormetabolismus
KW  - Chemoresistenz
KW  - tumorspezifische Therapie
KW  - Intratumorale Heterogenität
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156051
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmid, Evelyn
T1  - Effekte des Raf Kinase Inhibitor Proteins (RKIP) auf  β-adrenerge Signalwege, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz
T1  - Effects of the Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) on β-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure
N2  - Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz.
Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen.
Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann.
Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden.
Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert.
N2  - The Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is a kinase regulator with a preference for the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) in the heart. The mechanism is a direct interaction of GRK2 and RKIP, which is triggered by a PKC-mediated phosphorylation at serine 153 of RKIP. By binding the GRK2, RKIP prevents the GRK2-mediated GPCR-phosphorylation and, thus, desensitisation of GPCR. As a result, inhibition of GRK2-activity positively affects the responsiveness of cardiac G protein-coupled receptors (GPCR). The GPCR primarly responsible for the regulation of the cardiac contractility are the \textbeta-adrenergic receptors (\textbeta AR). Previous work proved an interrelation of RKIP-expression and contractile response of cardiomyocytes and set a basis for the subject of this thesis, dealing with the effects of RKIP-expression on beta-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure.
The work describes the impact of RKIP on \textbeta-adrenergic signaling in more detail. An important feature of the inhibitory function of RKIP on GRK2 is a specificity for receptor targets (\textbeta AR) with no, or only minor, impact on the cytosolic targets of the GRK2. RKIP also increases \textbeta-adrenergic signalling. This appears in neonatal cardiac myocytes through an increased cAMP-generation, PKA-activity, contractile action and relaxation velocity after \textbeta-adrenergic stimulation. Similarly, RKIP-transgenic mice, with heart specific RKIP-expression, showed higher PKA and CaMKII-activities as well as, a positive inotropy. Analysis of the calcium cycling in these cardiomyocytes provided an explanation for the hypercontractile phenotype: an enhanced calcium reuptake into the sarcoplasmatic reticulum (SR), the resulting higher calcium load of the SR and an increased calcium amplitude in the cytosol during the systole cause the augmented contractile force. Furthermore, it could be ruled out, that two inward rectifying channels - L-type calcium channnel and Ryanodin Receptor 2 contribute to the positve inotropy in RKIP-transgenic mice. 
Besides, the RKIP-expression had additional protective effects in heart failure development, which were investigated by desease models. Hypertrophy was induced by chronic \textbeta-adrenergic stimulation and heart failure by induction of pressure overload. Under these conditions, RKIP could reduce the development of interstitial fibrosis and the expression of associated marker genes. The occurence of arrhythmias, in particular ectopic beats, was assessed by the analysis of \textit{in vivo} ECG-traces. Rated by the number of ectopic beats RKIP-transgenic mice were also protected against the induction of arrhythmia.
The analysis of RKIP-expression in \textbeta AR subtype-KOs (\textbeta\textsubscript{1}KO, \textbeta\textsubscript{2}KO) could relate the different effects of RKIP to the signalling pathways of either \textbeta\textsubscript{1}AR or \textbeta\textsubscript{2}AR. As a result, RKIP effects the positive inotropy through signals of the \textbeta\textsubscript{1}AR and the protection against heart failure-related remodelling processes and arrhythmia through signals of the \textbeta\textsubscript{2}AR. Additionally a major importance could be assigned to the G\textalpha\textsubscript{i} coupling of the \textbeta\textsubscript{2}AR. This capacity of the \textbeta\textsubscript{2}AR can counteract potentially maladaptive signalling of the \textbeta\textsubscript{1}AR. A monitored growth of cardiomyocytes of RKIP-transgenic mice was assessed in greater depth using different markers to differentiate physiological from pathological hypertrophy. Thereby the occurring hypertrophy was characterised as physiological and compensatory.
Taken together, these results point towards a balanced activation of both \textbeta AR. They influence each other through downstream signals and are protected from desensitisation and loss of \textbeta-adrenergic responsivness through inhibition of the GRK2 by RKIP. To validate the therapeutic potential of this mode of action, an AAV9-mediated gene therapy was conducted. In this setting, RKIP was able to prevent, or strongly reduce the most prominent changes during heart failure development. Among these are the decline of the left ventricular function, dilation of the left ventricle, development of a pulmonary congestion, interstitial fibrosis and the expression of heart failure associated genes. Moreover, the consequences of RKIP deletion, which are reflected in an accelerated and deteriorated heart failure development, could be reversed by the reexpression of RKIP.
This work shows, that RKIP induces an even activation of \textbeta-adrenergic signalling, which results in a positive inotropy with concomitant protective effects. RKIPs mode of action represents a strategy and bears the possibilty to enhance cardiac contractility in the failing heart by stimulation of both \textbeta AR, which is contrary to the common belief.
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Raf-Kinasen
KW  - Inhibition
KW  - Kinase signaling
KW  - Beta-Rezeptor
KW  - beta-adrenerge Signalwege
KW  - Protein
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142486
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Elisabeth
T1  - Pan-Raf-Inhibition als neue therapeutische Strategie im Multiplen Myelom
T1  - Pan-Raf-Inhibition as a new therapeutical strategy in Multiple Myeloma
N2  - Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antikörper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, hämatopoetischer und Niereninsuffizienz äußert. Verbesserte Therapieansätze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einführung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) führten zu einer Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit, für die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum Überleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum Überleben der MM Zellen beiträgt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. Während die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das Überleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abhängigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in primären MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 führte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen führte, bestätigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker für die Pan-Raf-Aktivität dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls führte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivität mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der primären MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, könnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabhängie Qualität als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung möglicher MEK/ERK-unabhängiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei führte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. Für eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abhängigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abhängigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verstärkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in primären Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiemöglichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verstärkt werden kann.
N2  - Multiple Myeloma (MM) is a malignant disease which is characterized by monoclonal expansion of terminally differentiated, antibody-producing B-lymphocytes (plasma cells) and results mostly in bone lesions, haematopoietic and renal insufficiency. Improved therapeutic approaches like high-dose melphalan chemotherapy followed by autologous stem-cell transplantation and the introduction of new pharmacological compounds (proteasome inhibitors, cereblon-binding Thalidomide derivates) increased the mean survival time. Nevertheless, the disease remains incurable for most of the patients. Therefore, the exploration of new potential therapeutical targets based on pathobiologic insights becomes vital. One approach to improve the understanding of the pathogenesis is to analyze functionally, molecularly and genetically the signaling network in MM. In the context of this concept, it was discovered, that growth-regulating pathways are activated or deregulated in MM cells and contribute to tumor survival and proliferation. Our working group could already proof that oncogenic Ras is crucial for cell survival. Since Ras itself does not yet represent a druggable target, therapeutical approaches should aim at other functional parts of the pathway. While blocking of MEK1/2 has no influence on MM cell survival, early reports of our working group showed that inhibiting Raf induced apoptosis. For this reason I investigated the role of Raf-dependent signaling in order to evaluate a new therapeutic approach. This was based on the hypothesis that Raf kinases act as important effectors for the apoptotic effects of oncogenic Ras. As a first step, I could prove, that all three Raf isoforms (A-, B- and C-Raf) are activated in human MM cell lines and in primary MM cells. By using of shRNA-mediated, isoform-specific Raf knockdown experiments I could reveal that only the simultaneous knockdown of all three isoforms, i.e. a Pan-Raf knockdown, led to de-phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2. Also pharmacological Raf inhibition showed that only Pan-Raf blockage decreases the phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2 and thereby confirmed the knockdown experiment. These experiments also proved that the MEK/ERK module is a strong surrogate and biomarker for Pan-Raf activity. Contrary to inhibiting the MEK/ERK module the inhibition of Pan-Raf activity by shRNAs or pharmacological inhibitors led on to a strong induction of apoptosis in the tested cell lines and in the majority of primary cells. Since the response to Pan-Raf inhibition did not correlate with Ras mutational status, the Raf kinases could probably represent a Ras-independent therapeutical target of high quality. In order to decode possible MEK/ERK-independent effector mechanisms I compared the mRNA-based gene expression profiles of INA-6 cells after pharmacological inhibition of Pan-Raf or MEK. Pan-Raf inhibition led to the regulation of a greater number of genes, taking into account that the character of the regulated genes also varied. This included genes with functions relevant for tumors like regulation of proliferation, cell cycle and apoptosis. For one of these groups, the PI3K-dependent, mTOR-associated genes, I could show the regulation on the level of the proteins: phosporylation of mTOR, p70S6K, Rb and AKT as well es the expression of cyclinD1 and PDK1 decreased after Pan-Raf inhibition, but not after MEK inhibition. This result suggests a co regulation of the PI3K-dependent signal transduction by Raf kinases. In summary, this thesis presents a rationale for Pan-Raf inhibition as a new therapeutical option, which can be enhanced by combination with PI3K/AKT-inhibition.
KW  - Plasmozytom
KW  - Raf-Kinasen
KW  - Inhibition
KW  - Multiples Myelom
KW  - Pan-Raf-Inhibition
KW  - Behandlungsoption
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124666
ER  - 
TY  - THES
A1  - Graver, Shannon
T1  - Molecular and cellular cross talk between angiogenic, immune and DNA mismatch repair pathways
T1  - Molekulare und zellulare Interaktion zwischen Angiogenese, DNA Fehlerreparatur (Mismatch Repair) und Immunologischen Signalwegen
N2  - VEGF is a main driver of tumor angiogenesis, playing an important role not only in the formation of new blood vessels, but also acts as a factor for cell migration, proliferation, survival and apoptosis. Angiogenesis is a universal function shared by most solid tumors and its inhibition was thought to have the potential to work across a broad patient population. Clinical evidence has shown that inhibiting pathological angiogenesis only works in a subset of patients and the identification of those patients is an important step towards personalized cancer care. The first approved antiangiogenic therapy was bevacizumab (Avastin®), a monoclonal antibody targeting VEGF in solid tumors including CRC, BC, NSCLC, RCC and others.

In addition to endothelial cells, VEGF receptors are present on a number of different cell types including tumor cells, monocytes and macrophages. The work presented in this thesis looked at the in vitro cellular changes in tumor cells and leukocytes in response to the inhibition of VEGF signaling with the use of bevacizumab. In the initial experiments, VEGF was induced by hypoxia in tumor cells to evaluate changes in survival, proliferation, migration and changes in gene or protein expression. There was a minimal direct response of VEGF inhibition in tumor cells that could be attributed to bevacizumab treatment, with minor variations in some of the cell lines screened but no uniform or specific response noted. 

MMR deficiency often results in microsatellite instability (MSI) in tumors, as opposed to microsatellite stable (MSS) tumors, and accounts for up to 15% of colorectal carcinomas (CRCs). It has been suggested in clinical data that MMR deficient tumors responded better to bevacizumab regimens, therefore further research used isogenic paired CRC tumor cell lines (MMR deficient and proficient). Furthermore, a DNA damaging agent was added to the treatment regimen, the topoisomerase inhibitor SN-38 (the active metabolite of irinotecan). Inhibiting VEGF using bevacizumab significantly inhibited the ability of MMR deficient tumor cells to form anchor dependent colonies, however conversely, bevacizumab treatment before damaging cells with SN-38, showed a significant increase in colony numbers. Moreover, VEGF inhibition by bevacizumab pretreatment also significantly increased the mutation fraction in MMR deficient cells as measured by transiently transfecting a dinucleotide repeat construct, suggesting VEGF signaling may have an intrinsic role in MMR deficient cells. A number of pathways were analyzed in addition to changes in gene expression profiles resulting in the identification of JNK as a possible VEGF targeted pathway. JUN expression was also reduced in these conditions reinforcing this hypothesis, however the intricate molecular mechanisms remain to be elucidated.

In order to remain focused on the clinical application of the findings, it was noted that some cytokines were differentially regulated by bevacizumab between MMR proficient and deficient cells. Treatment regimens employed in vitro attempted to mimic the clinical setting by inducing DNA damage, then allowing cells to recover with or without VEGF using bevacizumab treatment. Inflammatory cytokines, CCL7 and CCL8, were found to have higher expression in the MMR deficient cell line with bevacizumab after DNA damage, therefore the cross talk via tumor derived factors to myeloid cells was analyzed. Gene expression changes in monocytes induced by tumor conditioned media showed CCL18 to be a bevacizumab regulated gene by MMR deficient cells and less so in MMR proficient cells. CCL18 has been described as a prognostic marker in gastric, colorectal and ovarian cancers, however the significance is dependent on tumor type. CCL18 primarily exerts its function on the adaptive immune system to trigger a TH2 response in T cells, but is also described to increase non-specific phagocytosis. The results of this study did show an increase in the phagocytic activity of macrophages in the presence of bevacizumab that was significantly more apparent in MMR deficient cells. Furthermore, after DNA damage MMR deficient cells treated with bevacizumab released a cytokine mix that induced monocyte migration in a bevacizumab dependent manner, showing a functional response with the combination of MMR deficiency and bevacizumab. In summary, the work in this thesis has shown evidence of immune cell modulation that is specific to MMR deficient tumor cells that may translate into a marker for the administration of bevacizumab in a clinical setting.
VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch  für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung  der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. 
VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die  keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. 
Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher  wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab  die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten.
In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen  Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren.  Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte.
N2  - VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch  für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung  der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. 
VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die  keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. 
Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher  wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab  die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten.
In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen  Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren.  Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte.
KW  - Angiogenesis
KW  - Immune
KW  - DNA Mismatch repair
KW  - Vascular endothelial Growth Factor
KW  - Inhibition
KW  - Angiogenese
KW  - Mismatch
KW  - DNS-Reparatur
KW  - Phagozytose
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108302
ER  - 
TY  - THES
A1  - Völker, Michael
T1  - Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung neuer In-vitro-Methoden zur Untersuchung des Fremdstoffmetabolismus und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme
T1  - Development, characterisation and application of new in-vitro-methods for the investigation of xenobiotic metabolism and the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes
N2  - Arzneistoffe werden nach ihrer Applikation durch verschiedene fremdstoff-metabolisierende Enzyme des Organismus biochemisch verändert. Durch eine Hemmung dieser Enzyme, z. B. durch Grapefruitsaft oder einen gleichzeitig eingenommenen Arzneistoff, kann es insbesondere bei Arzneistoffen mit geringer therapeutischer Breite, wie z. B. Theophyllin oder Phenprocoumon, zu gefährlichen Nebenwirkungen kommen. Besonders gefährdet sind multimorbide Patienten, die eine Therapie mit einer Vielzahl von Arzneimitteln erhalten. Um den Metabolismus von neuen Wirkstoffen und deren Interaktionspotential zu untersuchen, werden u. a. In-vitro-Experimente mit Zellfraktionen oder einzelnen Enzymen durchgeführt. Bei Inhibitionsassays wird der Einfluss von Arzneistoffen auf die Umsetzung eines Testsubstrates untersucht. Ein Großteil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Entwicklung von Methoden, mit denen die Inhibition wichtiger fremd-stoffmetabolisierender Enzyme, wie Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme), Glutathion-S-Transferasen (GSTs) und Carboxylesterasen (CES), untersucht werden kann. Dabei wurde auch eine Charakterisierung der Testsubstrate vorgenommen. Darüber hinaus wurden die Bioaktivierung von Clopidogrel und die Bildung von reaktiven Metaboliten untersucht.

Aufgrund aktueller Diskussionen über die Interaktion zwischen Clopidogrel und Omeprazol wurde in dieser Arbeit die Bioaktivierung von Clopidogrel mit Hilfe von LC/MS/MS-Analysen und rekombinanten CYP-Enzymen sowie humanen Lebermikrosomen untersucht. Aufgrund der Instabilität des aktiven Metaboliten wurde in den inkubierten Proben eine Derivatisierung mit Dimedon durchgeführt. Die Untersuchungen zeigten, dass die Umwandlung zum 2-Oxo-Clopidogrel durch mehrere CYP-Enzyme erfolgt. Neben CYP2C19 sind CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 beteiligt. Anhand von selektiven Inhibitoren konnte CYP3A4 für die Bildung des aktiven Metaboliten aus 2-Oxo-Clopidogrel identifiziert werden. Neben der Biotransformation durch CYP-Enzyme wird hauptsächlich der Carbonsäureester des Clopidogrels hydrolysiert. Untersuchungen mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterasen zeigen, dass die Esterhydrolyse durch CES1 katalysiert wird. Des Weiteren wurde der Metabolismus von Omeprazol untersucht. Es stellte sich heraus, dass die 5-Hydroxylierung und die 5-O-Demethylierung hauptsächlich durch CYP2C19 und CYP2D6 erfolgen. Dabei besitzt Omeprazol die höchste Affinität zu CYP2C19. Die Bildung von Omeprazolsulfon wird hingegen nur durch CYP3A4 katalysiert. Mit Hilfe etablierter CYP-Inhibitionsassays wurde der Einfluss von Clopidogrel und Omeprazol auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Durch Clopidogrel wurden CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) und CYP1A2 (IC50 = 2.8 µM) gehemmt. Omeprazol inhibiert v. a. CYP2C19 (IC50 = 2 µM) und CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Im Folgenden wurde auch der Einfluss von Omeprazol auf die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel untersucht. Die Bioaktivierung wurde allerdings erst bei einer Omeprazol-Konzentration von mehr als 10 µM beeinflusst. Am stärksten wurde dabei CYP2C19 (IC50 ca. 100 µM) gehemmt. Aufgrund der recht schwachen Inhibition von CYP2C19 durch Omeprazol und der Tatsache, dass mehrere CYP-Enzyme die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel katalysieren, lässt sich der Wirkungsverlust von Clopidogrel bei einer gleichzeitigen Einnahme von Omeprazol anhand der Ergebnisse der In-vitro-Versuche nicht durch eine Hemmung von CYP2C19 erklären.

Eine bisher nur wenig bei In-vitro-Interaktionsstudien untersuchte Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Carboxylesterasen (CES), die v. a. bei der Bioaktivierung von Esterprodrugs eine wichtige Rolle spielen. Für die Entwicklung von Inhibitionsassays wurden zunächst verschiedene Modellsubstrate ausgewählt. Nach Inkubation dieser Substrate mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterase-Enzymen wurden die Metaboliten mit Hilfe einer HPLC/UV-Analyse quantifiziert. Es zeigte sich, dass Methyl-4-nitrobenzoat und Mycophenolatmofetil selektiv durch CES1 hydrolysiert werden. Die Hydrolyse von Phenylacetat, p-Nitrophenylacetat und 4-Methylumbelliferylacetat wurde durch alle verwendeten Enzyme katalysiert. Darüber hinaus konnte eine Hydrolyse der aus Boswellia-Arten (Weihrauch) stammenden 3-O-Acetyl-11-keto--boswelliasäure durch CES2 beobachtet werden. Aufgrund der bei den meisten Modellsubstraten auftretenden Instabilität im Inkubationspuffer war eine Korrektur mit Hilfe von Blindproben erforderlich. Die Hydrolyse konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und durch die Zugabe von Essigsäure zur Stopplösung verlangsamt werden. Anschließend wurde die Beeinflussung der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat durch Pflanzenextrakte untersucht. Es zeigte sich, dass zahlreiche Extrakte die Esterasen aus der humanen Leber hemmten und die Aktivität bei einer Extraktkonzentration von 25-50 µg/ml weit unterhalb von 50 % lag. Die Inhibition von CES durch Pflanzenextrakte stellt daher ein bisher unbekanntes Risiko für Arzneimittelinteraktionen dar.

Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme) sind die wichtigste Gruppe fremdstoff-metabolisierender Enzyme. Zur Untersuchung der Beeinflussung dieser Enzyme durch neue Wirkstoffe werden daher standardmäßig In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Von der Food and Drug Administration (FDA) wurden daher für jedes CYP-Enzym verschiedene Arzneistoffe als Testsubstrate vorgeschlagen. Zusätzlich kommen bei solchen Untersuchungen Modellsubstrate zum Einsatz, deren Metaboliten fluoreszieren und die somit für ein Hochdurchsatz-Screening mit Hilfe von Mikrotiterplatten verwendet werden können. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Modellsubstanzen (Cumarin- und Harman-Derivate) auf ihre Eignung als Substrate für CYP-Inhibitionsassays untersucht. Nach der Entwicklung von Methoden zur Detektion der Metaboliten, die durch LC/MS/MS-Analysen oder durch HPLC/Fluoreszenzanalysen erfolgte, wurden die CYP-Enzyme identifiziert, die an der Umsetzung der Substrate beteiligt sind und mit Hilfe von CYP-Enzymen und humanen Lebermikrosomen wurden die Km-Werte der Substrate bestimmt. Die Untersuchungen zur Stabilität der CYP-Enzyme über 60 min zeigten, dass diese bei 37 °C stark an Aktivität verlieren, insbesondere CYP1A2. Für eine maximale Umsetzungsgeschwindigkeit war eine NADPH-Konzentration von 1 mM ausreichend. Die Untersuchung von 14 Standardsubstraten ergab, dass die Mehrheit selektiv durch das entsprechende CYP-Enzym umgesetzt wird. Die Amodiaquin-N-deethylierung, die Tolbutamidhydroxylierung, die Chlorzoxazon-6-hydroxylierung und die 4-Nitrophenol-2-hydroxylierung wurden durch mehrere CYP-Enzyme katalysiert. Als Positivkontrollen für die Inhibitionsassays und zur Identifizierung der am Metabolismus beteiligten CYP-Enzyme werden von der FDA verschiedene Inhibitoren vorgeschlagen. Da nicht zu allen Inhibitoren Daten über deren Isoenzymselektivität vorliegen, wurde mit Hilfe der Assays die inhibitorische Aktivität von zwölf Inhibitoren auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Alle Inhibitoren hemmten das jeweilige angegebene CYP-Enzym. Bei Furafyllin (CYP1A2), Tranylcypromin (CYP2A6), Clopidogrel (CYP2B6), Montelukast (CYP2C8), Sulfaphenazol (CYP2C9), Chinidin (CYP2D6) und Ketoconazol (CYP3A4) konnte eine Konzentration ermittelt werden, bei der nur ein CYP-Enzym gehemmt wird. Für Quercetin, Nootkaton, Diethyldithiocarbamat, Sertralin und Ticlopidin wurde eine Inhibition mehrerer CYP-Enzyme festgestellt. Mit Hilfe der CYP-Inhibitionsassays wurden Extrakte lebertoxischer Arzneipflanzen, wie z. B. Tussilago farfara (Huflattich) oder Chelidonium majus (Schöllkraut), untersucht. Alle Extrakte hemmten konzentrationsabhängig die CYP-Enzyme, am stärksten die Enzyme der Subfamilie CYP2C.

Als In-vitro-Substrate für CYP-Inhibitionsassays werden aufgrund ihrer starken Fluoreszenz häufig Cumarin-Derivate eingesetzt. In dieser Arbeit wurden daher 18 O-alkylierte bzw. O-benzylierte Derivate von 7-Hydroxycumarin, 7-Hydroxy-4-methylcumarin und 7-Hydroxy-4-trifluormethylcumarin synthetisiert und die Umsetzung durch verschiedene CYP-Enzyme mit Hilfe der zuvor optimierten LC/LC/Fluoreszenz-basierten Assays untersucht. An der O-Desalkylierung der Cumarin-Derivate waren hauptsächlich CYP1A2, CYP2B6 und im geringeren Ausmaß CYP2C19, CYP2D6 und CYP2E1 beteiligt. Die höchste Affinität besaßen die Substrate zu CYP1A2. Debenzylierungen wurden neben CYP1A2 hauptsächlich durch CYP3A4 katalysiert. Die höchsten Umsetzungsgeschwindigkeiten wurden für die Debenzylierung von 7-Benzyloxy-4-methylcumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) und 7-Benzyloxy-4-trifluormethylcumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min) beobachtet. Für 7-Methoxy-4-trifluormethylcumarin (MFC) war die Umsetzungs¬geschwindigkeit für die O-Demethylierung mit CYP1A2 und CYP2B6 im Vergleich zu CYP2C9 deutlich höher. MFC und 7-Ethoxy-4-trifluormethylcumarin (EFC) eignen sich daher v. a. für Inhibitionsuntersuchungen von CYP2B6. Bei den untersuchten 7 Alkyloxycumarinen handelt es sich in allen Fällen nicht um selektive CYP-Substrate. Sie können demnach nicht für Inhibitionsuntersuchungen mit humanen Lebermikrosomen verwendet werden. Ein Einsatz für Simultanbestimmungen der Hemmung mehrerer CYP-Enzyme in einem Versuch (Cocktail-Assay) ist aus diesem Grund ebenfalls nicht möglich. Durch LC/MS-Analysen nach Inkubation der Cumarin-Derivate mit humanen Lebermikrosomen zeigte sich, dass neben den entsprechenden O Desalkylmetaboliten mehrere Hydroxymetaboliten entstehen und der O Desalkylmetabolit insbesondere bei Derivaten mit längeren Alkylsubstituenten nicht der Hauptmetabolit ist.

Ein Ziel der Arbeitsgruppe ist es zudem, neue In-vitro-Substrate zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen mit besseren enzymkinetischen und analytischen Eigenschaften zu entwickeln. Grundstruktur hierfür ist das -Carbolin, da -Carbolin-Derivate eine starke Fluoreszenz aufweisen. Von dem Naturstoff Harmin ist bekannt, dass dieser durch CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6 O-demethyliert wird. Durch Modifizierung der Harman-Struktur sollte die CYP-Isoenzymselektivität für die O-Dealkylierung gesteigert werden und Substrate für weitere CYP-Enzyme erhalten werden. Hierfür wurden in der Arbeitsgruppe u. a. 2-Benzyl-7-benzyloxyharman (BBH), 2-Benzyl-7-methoxyharman (BMH), 7-Methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harman (MCBH) und 2-Methyl-7-methoxyharman (MMH) hergestellt. In dieser Arbeit wurden LC/LC/Fluoreszenz- und LC/MS/MS-Methoden zur Quantifizierung der aus diesen Derivaten entstehenden O-Desalkylmetaboliten entwickelt und die Substrate charakterisiert. Die Einführung von Benzylsubstituenten an der phenolischen Hydroxylgruppe von Harmol (BBH) führte zum Metabolismus durch CYP3A4 und die Substitution mit einem Carboxybenzylrest am Indolstickstoff (MCBH) verstärkte die Selektivität zu den Enzymen der Subfamilie 2C. Durch die Methylierung des Pyridin-Stickstoffs des Harmins (MMH) wurde ein selektives Substrat für CYP2D6 erhalten, weshalb bei dieser Substanz auch humane Lebermikrosomen verwendet werden können. Durch die im Vergleich zu anderen CYP2D6-Substraten erhaltene hohe Umsetzungsgeschwindigkeit lässt sich die Proteinkonzentration minimieren. Für die überwiegend an der O-Dealkylierung der Substrate beteiligten CYP-Enzyme wurden die Km-Werte ermittelt. Bei der Untersuchung von verschiedenen CYP-Inhibitoren zeigte sich, dass mit diesen Substraten vergleichbare IC50-Werte, wie mit den Standardsubstraten, erhalten werden. Die Harman-Derivate können daher zur Untersuchung der Inhibition wichtiger CYP-Enzyme eingesetzt werden und bieten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Fluoreszenz-Substraten. Durch die Einstellung des pH-Wertes im Anschluss an die Inkubation lassen sich die Metaboliten ebenfalls fluorimetrisch in der Mikrotiterplatte detektieren und können für ein Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Allerdings müssen die Fluoreszenzeigenschaften weiter verbessert werden, um eine kontinuierliche Bestimmung während der Inkubation zu ermöglichen.

In der pharmazeutischen Industrie besteht ein großes Interesse an der Detektion von reaktiven Metaboliten, um eine potentielle Lebertoxizität von neuen Wirkstoffen vorhersagen zu können. Hierfür werden die Testsubstanzen mit humanen Lebermikrosomen inkubiert und die reaktiven Metaboliten mit Glutathion abgefangen. Zur Optimierung der LC/MS/MS-Analysen wurde in dieser Arbeit die Fragmentierung solcher Addukte anhand von Standardsubstanzen untersucht. Bei allen untersuchten Glutathion-Addukten trat eine Abspaltung der Pyroglutaminsäure bei positiver Polarität mit einer vergleichbaren Signalintensität auf, weshalb eine Detektion dieses Fragmentes durch einen Neutral-Loss-Scan am besten geeignet erschien. Mit Hilfe der Screening-Methode wurden zuerst Arzneistoffe untersucht, von denen reaktive Metaboliten bekannt sind. Für die Bioaktivierung von Clozapin konnten CYP1A2, CYP2D6 und CYP3A4 identifiziert werden, während die Toxifizierung von Paracetamol hauptsächlich durch CYP1A2 und CYP3A4 erfolgte. Auffällig war, dass mit steigender Paracetamolkonzentration keine Sättigung der Umsetzung auftrat. Durchgeführte Molekülveränderungen am Glutathion, wie die Einführung eines Dansylrestes oder eines Biotins, führten zu keiner deutlichen Verbesserung der Detektion der reaktiven Metaboliten. Darüber hinaus zeigte sich, dass bei den markierten GSH-Derivaten die Umsetzung durch GSTs erheblich reduziert ist. Mit der Screening-Methode wurden allerdings viele falsch positive Signale erhalten, so dass diese nicht für eine Untersuchung von Extrakten lebertoxischer Pflanzen eingesetzt werden konnte. Für eine eindeutige und schnelle Identifizierung der Signale als Glutathion-Addukte ist daher die hochauflösende Massenspektrometrie erforderlich.

Eine weitere Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Glutathion-S-Transferasen (GSTs), über deren Inhibition durch Arzneistoffe und Pflanzenextrakte in der Literatur nur wenige Daten vorliegen. Zur Entwicklung von Inhibitionsassays wurden die in der Literatur beschriebenen Substrate 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, 4 Nitrochinolin-N-oxid, 1,2-Dichlor-4-nitrobenzol und 4-Nitrobenzylchlorid verwendet. Die Detektion der Metaboliten erfolgte im Gegensatz zu der häufig eingesetzten Photometrie mit Hilfe der HPLC/UV- bzw. einer LC/MS/MS-Analyse. Für die Kalibrierung wurden zunächst die entsprechenden Glutathionkonjugate aus den Substraten synthetisiert. Bei den durchgeführten diskontinuierlichen Assays stellte die häufig auftretende nichtenzymatische Reaktion der Substrate mit Glutathion ein Problem dar. Durch die Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und der Senkung der Inkubationstemperatur von 37 °C auf 25 °C konnte die nichtenzymatische Reaktion während der Inkubation erheblich verlangsamt werden. Die nichtenzymatische Reaktion nach der Inkubation konnte durch Zugabe von Oxidationsmitteln gestoppt werden. Von den getesteten humanen Lebersubzell¬fraktionen besaß die cytosolische Fraktion bei allen Substraten die höchste Aktivität. Im Rahmen der Assayentwicklung wurde die Glutathion-, die Proteinkonzentration und die Inkubationszeit optimiert. Es wurden die Km- und Vmax-Werte für die Umsetzung der Substrate ermittelt. Als Positivkontrolle diente das ebenfalls synthetisierte Glutathionkonjugat der Etacrynsäure, für das die IC50-Werte mit jedem Substrat bestimmt wurden. Dabei konnte ein Einfluss des pH-Wertes des Inkubationspuffers und der Inkubationstemperatur auf die gemessene inhibitorische Aktivität beobachtet werden. Anschließend wurde ein Screening von Arzneistoffen, ausgewählten Naturstoffen und etwa 50 Pflanzenextrakten auf eine Inhibition der GSTs in humanem Lebercytosol mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, das am schnellsten von allen Substraten umgesetzt wurde, durchgeführt. Von den getesteten Naturstoffen fiel eine ausgeprägte Hemmung durch Biflavonoide auf. Nahezu alle untersuchten Pflanzenextrakte hemmten die GSTs. Eine starke Inhibition der GSTs zeigten Extrakte aus Cinnamomum cassia (Zimt), die sich als nicht-kompetitiv herausstellte. Weiterhin wurde eine starke Hemmung der Extrakte gerbstoffhaltiger Pflanzen, wie z. B. Hamamelis virginiana (virginische Zaubernuss) oder Krameria triandra (Ratanhia), beobachtet. Hier resultierten IC50-Werte zwischen 5 und 30 µg/ml. Ein Vergleich verschiedener Methoden zur Detektion des Metaboliten 2,4 Dinitrophenyl-S-glutathion zeigte, dass die Photometrie für die Untersuchung der Inhibition von Pflanzenextrakten aufgrund der Störung durch die Pflanzenmatrix ungeeignet ist. Mit Hilfe der verwendeten HPLC/UV- sowie der LC/MS/MS-Analyse konnte der Metabolit selektiv erfasst werden und reproduzierbare Ergebnisse für die Inhibition der GSTs durch Pflanzenextrakte erzielt werden.

Neben den GSTs wurde auch die Beeinflussung der Glutathionreduktase (GR) in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurde ein HPLC-basierter Assay entwickelt, bei dem das reduzierte Glutathion mit 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) derivatisiert und das entstandene gemischte Disulfid aus Glutathion und 5-Thio-2-nitrobenzoesäure quantifiziert wurde. Zur Untersuchung der Inhibition durch Pflanzenextrakte wurde humanes Lebercytosol verwendet, das von allen humanen Lebersubzellfraktionen die höchste Aktivität besaß. Im Vergleich zu den GSTs wurde die GR durch die überwiegende Zahl der ausgewählten Pflanzenextrakte kaum gehemmt. Eine nennenswerte Inhibition der GR konnte nur bei Extrakten von Juglans regia (Walnuss) beobachtet werden.

Fazit
In dieser Arbeit wurden eine Reihe von In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen und weiteren fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, wie CES oder GSTs, entwickelt. Aufgrund der dabei angewendeten selektiven HPLC-basierten Quantifizierung der Metaboliten durch UV-, Fluoreszenz- oder MS-Detektion können mit diesen Methoden auch Proben mit komplexer Matrix untersucht werden. Für alle Assays wurden die Inkubationsbedingungen optimiert und die enzymkinetischen Parameter vieler Substrate ermittelt. Darüber hinaus wurden wichtige Erkenntnisse über die Isoenzymselektivität dieser Substrate gewonnen. Die Eignung der Assays wurde anhand von Standardinhibitoren bewiesen. Schließlich wurde die inhibitorische Aktivität von zahlreichen Pflanzenextrakten bestimmt, deren Auswirkung auf fremdstoffmetabolisierende Enzyme bisher unbekannt war. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können für die Untersuchung des Metabolismus von Arzneistoffen und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme, die für eine Zulassung neuer Wirkstoffe erforderlich ist, routinemäßig eingesetzt werden.
N2  - Drugs are biochemically transformed by different xenobiotic metabolising enzymes after their application to humans. The inhibition of these enzymes, e. g. by grapefruit juice or a coadministrated drug, especially drugs with a small therapeutic range, for example theophylline or phenprocoumon, can result in serious side effects. Especially endangered are multimorbid patients, who get a therapy with multiple drugs. To examine the metabolism of new therapeutic agents and their potential for interactions, in-vitro-experiments will be done with tissue fractions or individual enzymes. In inhibition assays the influence of the drug on the transformation of the test substrate will be investigated. A major part of this work deals with the development of methods to test the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes, like cytochrome P450 enzymes (CYP enzymes), glutathione S-transferases (GSTs) and carboxylesterases (CES). Thereby, a characterisation of the test substrates was performed. In addition the bioactivation of clopidogrel and the formation of reactive metabolites were investigated.

Due to current discussions about the interaction between clopidogrel and omeprazole, the bioactivation of clopidogrel was investigated by LC/MS/MS analysis and recombinant CYP enzymes or human liver microsomes. Because of the instability of the active metabolite a derivatisation of the incubated samples with dimedone were carried out. The investigation shows, that the transformation to 2 oxo-clopidogrel is catalysed by several CYP enzymes. Beside CYP2C19, the enzymes CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 are involved. With selective inhibitors CYP3A4 could be identified for the formation of the active metabolite from 2-oxo-clopidogrel. In addition to the biotransformation by CYP enzymes the carboxylic acid ester of clopidogrel is mainly hydrolysed. Incubations with human tissue fractions and recombinant carboxylesterases shows, that the hydrolysis of the ester is catalysed by CES1. Furthermore the metabolism of omeprazole was investigated. The results show, that the 5-hydroxylation and the 5-O-demethylation mainly is carried out by CYP2C19 and CYP2D6. Thereby omeprazole has the highest affinity to CYP2C19. In contrast, the formation of omeprazole sulfone is catalysed especially by CYP3A4. With the aid of established inhibition assays for CYP enzymes the influence of clopidogrel and omeprazole on nine different CYP enzymes was investigated. Clopidogrel inhibits CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) and CYP3A4 (IC50 = 2.8 µM). Omeprazole inhibits especially CYP2C19 (IC50 = 2 µM) and CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Subsequent, the influence of omeprazole on the formation of 2-oxo-clopidogrel was also investigated. However, the bioactivation of clopidogrel was decreased by concentrations of omeprazole higher than 10 µM. Here mostly CYP2C19 was inhibited with an IC50 value of about 100 µM. Due to the poor inhibition of CYP2C19 caused by omeprazole and the fact, that several CYP enzymes catalyse the formation of 2-oxo-clopidogrel, the loss of the pharmacological effect of clopidogrel during the simultaneous intake of omeprazole can not be explained with the inhibition of CYP2C19.

A previously insufficient investigated class of xenobiotic metabolising enzymes are carboxylesterases (CES) which especially play an important role in the bioactivation of ester prodrugs. For the development of inhibition assays different artificial substrates were selected. After the incubation with human tissue fractions and recombinant carboxylesterases the metabolites were quantified via HPLC/UV-analysis. It was demonstrated that methyl 4-nitrobenzoate and mycophenolate mofetil are selectively hydrolysed by CES1. The hydrolysis of phenyl acetate, p nitrophenyl acetate and 4-methylumbelliferyl acetate was catalysed by all enzymes used. Furthermore the hydrolysis of 3-O-acetyl-11-keto--boswellic acid, which can be isolated from various Boswellia species, by CES2 was obtained. Because of the instability of the most artificial substrates in the incubation buffer, a correction with a blank value was necessary. A decrease of the pH value of the incubation buffer from 7.4 to 6.5 and the addition of acetic acid to the termination solvent retards the hydrolysis. Afterwards the influence of the inhibitory activities of plant extracts on the hydrolysis of p-nitrophenyl acetate was investigated. The results shows, that numerous plant extracts inhibits esterases of the human liver and the activity with an extract concentration of 25-50 µg/ml is widely below 50 percent. Thus the inhibition of CES caused by plant extracts is until now an unknown risk of drug interactions.

Cytochrome P450 enzymes (CYP enzymes) are the most important class of xenobiotic metabolising enzymes. To investigate the influence of these enzymes due to new active substances standardised in vitro interaction studies will be performed. Thus the Food and Drug Administration (FDA) has suggested several drugs as test substrates for each CYP isoform. Additional artificial substrates are used in such studies. The metabolites of these substrates are fluorescent and therefore they are suitable for high-throughput screening analysis in multiwell plates. In this work, a series of artificial substrate (derivatives of coumarin and harmane) were investigated to their applicability as substrates for CYP inhibition assays. After the development of methods to detect the metabolites, which was done by LC/MS/MS- or HPLC/fluorescence analysis, the CYP isoforms for the transformation of the substrates were identified. With the aid of CYP enzymes and human liver microsomes the Km values were determined. The stability testing of the CYP enzymes during 60 min shows, that they strongly lose their activity at 37 °C, especially CYP1A2. For the maximum reaction velocity, a NADPH concentration of 1 mM was sufficient. The investigation of 14 standard substrates shows, that the majority was metabolised by a single CYP enzyme. The amodiaquine N-deethylation, the tolbutamide hydroxylation, the chlorzoxazone 6-hydroxylation and the 4 nitrophenole 2-hydroxylation were catalysed by several CYP isoforms. As positive control of the inhibition assays and for the identification of the CYP enzymes, which are involved in the metabolism, the FDA has also proposed several inhibitors. For many inhibitors there are no data of the selectivity to the CYP isoforms published. Therefore the inhibitory activity of 12 inhibitors with 9 different CYP enzymes by the established assays was investigated. All inhibitors inhibited the previously described CYP enzymes. For furafylline (CYP1A2), tranylcypromine (CYP2A6), clopidogrel (CYP2B6), montelukast (CYP2C8), sulfaphenazole (CYP2C9), quinidine (CYP2D6) and ketoconazole (CYP3A4) a concentration was found, which inhibited only one CYP enzyme. For quercetin, nootkatone, diethyldithiocarbamic acid, sertraline and ticlopidine an inhibition of several CYP enzymes was discovered. With the CYP inhibition assays liver toxic plant extracts of e. g. Tussilago farfara (coughwort) or Chelidonium majus (celandine) were investigated. All extracts inhibited the CYP enzymes concentration dependent, most intensive the enzymes of subfamily CYP2C.

Coumarin derivatives are often used as in vitro substrates for CYP inhibition assays because of their high fluorescence. In this work 18 O-alkylated and O-benzylated derivatives of 7-hydroxycoumarin, 7-hydroxy-4-methylcoumarin and 7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarin were synthesised and the transformation due to several CYP enzymes was investigated with primarily optimised LC/LC/fluorescence-based assays. On the O-dealkylation of coumarin derivatives CYP1A2, CYP2B6 were mainly participated and to a lower extent CYP2C19, CYP2D6 and CYP2E1. The highest affinity had the substrates to CYP1A2. Debenzylations were catalysed mainly by CYP1A2 and CYP3A4. The highest reaction velocities were observed for the debenzylation of 7-benzyloxy-4-methylcoumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) and 7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min). For 7-methoxy-4-trifluoromethylcoumarin (MFC) the conversion rate for the O-demethylation with CYP1A2 and CYP2B6 in comparison with CYP2C9 was explicitly higher. So MFC and 7-ethoxy-4-trifluoromethylcoumarin (EFC) are suitable substrates especially for CYP2B6. All analysed 7-alkyloxycoumarin derivatives are no selective substrates. Thus they cannot be used for inhibition studies with human liver microsomes. Also their application for the simultaneous determination of the inhibition of several CYP enzymes in one sample (cocktail assay) is not possible. The LC/MS-based analysis after the incubation of the coumarin derivatives showed, that beside the O dealkylated metabolites several hydroxylated metabolites are formed. In many cases the O-dealkylated metabolite is not the main metabolite, especially by derivatives with longer alkyl chains.

An aim of our group is the development of new in vitro substrates for the investigation of the inhibition of CYP enzymes with improved kinetic and analytical properties. The basic structure is -carboline, because -carboline derivatives show a strong fluorescence. It is known about the natural product harmine, that it will be O demethylated by CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 and CYP2D6. Due to modifications of the harmane structure, the CYP isoform selectivity for the O-dealkylation should increase and substrates should receive for further CYP enzymes. For this, our working group synthesised e. g. 2-benzyl-7-benzyloxyharmane (BBH), 2-benzyl-7-methoxyharmane (BMH), 7-methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harmane (MCBH) and 2 methyl-7-methoxyharmane (MMH). In this work LC/LC/fluorescence- and LC/MS/MS methods were developed for quantification of the generated O dealkylated metabolites. The introduction of a benzyl residue at the phenolic hydroxyl group of harmol (BBH) caused a metabolism due to CYP3A4. The substitution with a carboxybenzyl residue on the indole nitrogen (MCBH) increased the selectivity to the subfamily CYP2C. With the methylation of the pyridine nitrogen a selective substrate for CYP2D6 was obtained. So this substrate is usable with human liver microsomes. Due to the high reaction velocity of MMH in comparison with other substrates of CYP2D6, the concentration of the protein can be minimized. The Km values of the CYP enzymes, which predominantly catalysed the O dealkylation of the harmane derivatives, were determined. The investigation of several CYP inhibitors showed, that with the new substrates comparable IC50 values to the standardised substrates were received. The harmane derivatives are suitable for the detection of the inhibition of important CYP enzymes. They are alternative substrates to the previously existing fluorescent substrates. With an adjustment of the pH value after incubation, the metabolites can be fluorimetrically detected in multiwell plates. So they are usable for high throughput screening. However, the fluorescence properties have to be improved for a continuous determination of the metabolite during the incubation.

The pharmaceutical industry is interested in the detection of reactive metabolites to predict a potential liver toxicity of new drug candidates. For this purpose the test compounds will be incubated with human liver microsomes and the reactive metabolites will be trapped with glutathione. To optimise the LC/MS/MS analysis, the fragmentation of such adducts was investigated with standard substances. At positive polarity, all glutathione adducts showed a loss of pyroglutamic acid with comparable peak intensity. Therefore the detection of this fragment with a neutral loss scan is most practicable. With the aid of the screening method first drugs were investigated from which reactive metabolites are known. CYP1A2, CYP2D6 and CYP3A4 were identified for the bioactivation of clozapine. The toxification of acetaminophen is mainly catalysed by CYP1A2 and CYP3A4. Conspicuous was the fact, that there was no saturation of the reaction velocity with increasing concentration of acetaminophen. Changes of the glutathione molecule like the introduction of a dansyl or a biotin residue do not seriously improve the detection of the reactive metabolites. Also it was shown, that the reaction of the labelled glutathione derivatives by GSTs is significantly reduced. With the developed screening methods many false positive signals were observed. So this method was not applicable for the investigation of extracts from liver toxic plants. For a definite and fast identification of signals as glutathione adducts the high resolution mass spectrometry is required.

Another class of xenobiotic metabolising enzymes are glutathione S-transferases (GSTs). About their inhibition caused by drugs and plant extracts only a few information can be found in the literature. For the development of inhibition assays well known substrates like 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, 4-nitroquinoline N-oxide, 1,2 dichloro-4-nitrobenzene and 4-nitrobenzyl chloride were used. The metabolites were quantified by HPLC/UV- and LC/MS/MS analysis in contrast to the often used photometry. For the calibration of the methods first the appropriate glutathione conjugates were synthesised from the substrates. A problem of the discontinuous assays was the often arising non enzymatic reaction of the substrates with glutathione. With a decrease of the pH value of the incubation buffer from 7.4 to 6.5 and the reduction of incubation temperature from 37 °C to 25 °C the velocity of the non enzymatic reaction extensively slows down. The non enzymatic reaction in the samples after incubation could stopped by the addition of oxidants. For all substrates the cytosolic fraction showed the highest activity of all tested human liver tissue fractions. During the development of the assays the glutathione concentration, the protein concentration and the incubation time were optimised. The Km and Vmax values for the conversion of the substrates were determined. The also synthesised glutathione conjugate of ethacrynic acid was used as positive control, for that the IC50 values were determined with every substrate. Thereby the pH value of the incubation buffer and the incubation temperature influence the measured inhibitory activity. Following drugs, selected natural products and about 50 plant extracts were screened for the inhibition of GSTs with human liver cytosol and 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, that was conjugated with the highest conversion rate of all substrates. Of the natural products the distinctive inhibition of biflavonoids was noticeable. Nearly all tested plant extracts inhibits GSTs. A strong inhibition of the GSTs showed extracts from Cinnamomum cassia (cinnamomum), which is non-competitive. Furthermore an important inhibition caused by extracts from e. g. Hamamelis virginiana (witch hazel) or Krameria triandra (ratanhia) were observed. Here IC50 values between 5 and 30 µg/ml were obtained. A comparison of different methods for the detection of the metabolite 2,4-dinitrophenyl-S-glutathione demonstrated, that photometry is not suitable for the investigation of the inhibition by plant extracts because of the interference caused by the plant matrix. With HPLC/UV- and the LC/MS/MS methods the metabolite could selectively be determined and reproducible results for the inhibition of GSTs by plant extracts were obtained.

Besides GSTs the influence of glutathione reductase (GR) was also investigated in this work. An HPLC-based assay was developed, where the reduced glutathione has been derivatised with 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) and the resulted mixed disulfide of glutathione and 5-thio-2-nitrobenzoic acid has been quantified. For the examination of the inhibition by plant extracts, human liver cytosol was applied, which has the highest activity of all human liver tissue fractions. In comparison with GSTs, the GR was hardly inhibited by most of the selected plant extracts. A notable inhibition could only be obtained by extracts of Juglans regia (walnut).

Conclusion
In this work, many in vitro methods for the investigation of the inhibition of CYP enzymes and further xenobiotic metabolising enzymes like CES or GSTs were developed. On the basis of the selective HPLC-based quantification with UV-, fluorescence- or MS detection, samples with a complex matrix can be measured. For all assays the conditions for incubation were optimised and the kinetic parameters of many substrates were determined. In addition important information about the selectivity of isoenzymes was received. The suitability of the developed assays was demonstrated with standard inhibitors. Finally, the inhibitory activity of numerous plant extracts were determined, which effect on xenobiotic metabolising enzymes was previously unknown. The developed methods in this work are routinely applicable for the investigation of drug metabolism and the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes, which are required for the marketing authorization.
KW  - Cytochrom-P450-Enzyme, Carboxylesterasen, Glutathion-S-Transferasen
KW  - In-vitro-Assays
KW  - HPLC/UV-, HPLC/Fluoreszenz-, LC/MS/MS-Analyse
KW  - ß-Carbolinalkaloide, 7-Alkyloxycumarine, Clopidogrel, Paracetamol
KW  - Pflanzenextrakte
KW  - cytochrome P450 enzymes, carboxylesterases, glutathione S-transferases
KW  - in-vitro-assays
KW  - HPLC/UV, HPLC/fluorescence, LC/MS/MS analysis
KW  - ß-carboline alkaloids, 7-alkyloxycoumarins, clopidogrel, acetaminophen
KW  - plant extracts
KW  - Xenobiotikum
KW  - Stoffwechsel
KW  - Biotransformation
KW  - Inhibition
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99434
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schiebel, Johannes
T1  - Structure-Based Drug Design on Enzymes of the Fatty Acid Biosynthesis Pathway
T1  - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign an Enzymen der Fettsäurebiosynthese
N2  - Während die Wirkung der meisten gebräuchlichen Antibiotika auf einer Beeinträchtigung wichtiger bakterieller Prozesse beruht, wirken manche Substanzen durch die Störung der Zellmembran-Struktur. Da Fettsäuren ein essentieller Bestandteil von Membran-Phospholipiden sind, stellt die bakterielle Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) einen relativ wenig erforschten, aber dennoch vielversprechenden Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Antibiotika dar. Das wichtige Antituberkulotikum Isoniazid blockiert die mykobakterielle Fettsäurebiosynthese und ruft dadurch morphologische Änderungen sowie letztlich die Lyse des Bakteriums hervor. Eine wichtige Erkenntnis war, dass Isoniazid den letzten Schritt des FAS-II Elongationszyklus inhibiert, der durch die Enoyl-ACP Reduktase katalysiert wird. Darauf aufbauend wurden mehrere Programme ins Leben gerufen, die sich zum Ziel gesetzt hatten, neue Moleküle zu entwickeln, welche dieses Protein verschiedener Pathogene hemmen. Die S. aureus Enoyl-ACP Reduktase (saFabI) ist von besonders großem Interesse, da drei vielversprechende Inhibitoren dieses Proteins entwickelt werden konnten, die momentan in klinischen Studien eingehend untersucht werden. Trotz dieser Erfolgsaussichten waren zum Zeitpunkt, als die vorliegenden Arbeiten aufgenommen wurden, keine Kristallstrukturen von saFabI öffentlich verfügbar. Daher war es eines der Hauptziele dieser Doktorarbeit, auf der Basis von kristallographischen Experimenten atomar aufgelöste Modelle für dieses wichtige Protein zu erzeugen. Durch die Entwicklung einer verlässlichen Methode zur Kristallisation von saFabI im Komplex mit NADP+ und Diphenylether-Inhibitoren konnten Kristallstrukturen von 17 verschiedenen ternären Komplexen gelöst werden. Weitere kristallographische Experimente ergaben zwei apo-Strukturen sowie zwei Strukturen von saFabI im Komplex mit NADPH und 2-Pyridon-Inhibitoren. Basierend auf der nun bekannten saFabI-Struktur konnten Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt werden, um zusätzliche Erkenntnisse über die Flexibilität dieses Proteins zu erhalten. Die so gewonnenen Informationen über die Struktur und Beweglichkeit des Enzyms dienten in Folge als ideale Grundlage dafür, den Erkennungsprozess von Substrat und Inhibitor zu verstehen. Besonders bemerkenswert dabei ist, dass die verschiedenen saFabI Kristallstrukturen Momentaufnahmen entlang der Reaktionskoordinate der Ligandenbindung und des Hydrid-Transfers repräsentieren. Dabei verschließt der so genannte Substratbindungsloop das aktive Zentrum des Enzyms allmählich. Die außergewöhnlich hohe Mobilität von saFabI konnte durch molekulardynamische Simulationen bestätigt werden. Dies legt nahe, dass die beobachteten Änderungen der Konformation tatsächlich an der Aufnahme und Umsetzung des Substrates beteiligt sind. Eine Kette von Wassermolekülen zwischen dem aktiven Zentrum und einer wassergefüllten Kavität im Inneren des Tetramers scheint für die Beweglichkeit des Substratbindungsloops und somit für die katalysierte Reaktion von entscheidender Bedeutung zu sein. Außerdem wurde die erstaunliche Beobachtung gemacht, dass der adaptive Substratbindungsprozess mit einem Dimer-Tetramer Übergang gekoppelt ist, welcher die beobachtete positive Kooperativität der Ligandenbindung erklären kann. Alles in allem weist saFabI im Vergleich zu FabI Proteinen aus anderen Organismen mehrere außergewöhnliche Eigenschaften auf, die für die Synthese von verzweigten Fettsäuren nötig sein könnten, welche wiederum für die Überlebensfähigkeit von S. aureus im Wirt von Bedeutung sind. Diese Erkenntnis könnte erklären, warum S. aureus selbst bei Anwesenheit von exogenen Fettsäuren von FAS-II Inhibitoren abgetötet werden kann. Somit können die gewonnenen atomaren saFabI Modelle einen entscheidenden Beitrag zur Entwicklung neuer Hemmstoffe dieses validierten Angriffszieles leisten. Tatsächlich konnten die neuen Strukturen genutzt werden, um die Bindungsstärken sowie die Verweilzeiten verschiedener saFabI Inhibitoren molekular zu erklären. Die Struktur von saFabI im Komplex mit dem 2-Pyridon Inhibitor CG400549 hingegen enthüllte spezifische Wechselwirkungen in der geweiteten Bindetasche des S. aureus Enzyms, welche das geringe Aktivitätsspektrum dieses derzeit klinisch erprobten Inhibitors erklären. Diese Studien schaffen somit eine ideale Voraussetzung für die Entwicklung neuer wirksamer saFabI Inhibitoren, was am Beispiel des 4-Pyridons PT166 belegt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten außerdem die Strukturen des Enzyms KasA im Komplex mit mehreren Derivaten des Naturstoffs Thiolactomycin gelöst werden.
N2  - Whereas most currently used antibiotics act by interfering with essential bacterial processes, a smaller group of antibacterials disturbs the integrity of the cell membrane. Since fatty acids are a vital component of membrane phospholipids, the type-II fatty acid biosynthesis pathway (FAS-II) of bacteria constitutes a promising drug target. The front-line anti-tuberculosis prodrug isoniazid blocks the FAS-II pathway in M. tuberculosis thereby leading to morphological changes and finally to cell lysis. When it became evident that the enoyl-ACP reductase in the FAS-II pathway is the target of the activated isoniazid, several programs were initiated to develop novel inhibitors directed against this protein in different pathogens. The S. aureus enoyl-ACP reductase (saFabI) is of particular interest since three promising drug candidates inhibiting this homologue have reached clinical trials. However, despite these prospects, no crystal structures of saFabI were publicly available at the time the present work was initiated. Thus, one major goal of this thesis was the generation of high-resolution atomic models by means of X-ray crystallography. The development of a highly reproducible approach to co-crystallize saFabI in complex with NADP+ and diphenyl ether-based inhibitors led to crystal structures of 17 different ternary complexes. Additional crystallographic experiments permitted the view into two apo-structures and two atomic models of saFabI in complex with NADPH and 2-pyridone inhibitors. Based on the established saFabI structure, molecular dynamics (MD) simulations were performed to improve our understanding of the conformational mobility of this protein. Taken together, these investigations of the saFabI structure and its flexibility served as an ideal platform to address important questions surrounding substrate and inhibitor recognition by this enzyme. Intriguingly, our saFabI structures provide several vastly different snapshots along the reaction coordinate of ligand binding and hydride transfer, including the closure of the flexible substrate binding loop (SBL). The extraordinary mobility of saFabI was confirmed by MD simulations suggesting that conformational motions indeed play a pivotal role during substrate delivery and turnover. A water chain linking the active site with a water-basin inside the homo-tetrameric enzyme was found likely to be crucial for the closure and opening of the SBL and, thus, for the catalyzed reaction. Notably, the induced-fit ligand binding process involves a dimer-tetramer transition, which could be related to the observed positive cooperativity of cofactor and substrate binding. Overall, saFabI displays several unique characteristics compared to FabI proteins from other organisms that might be necessary for the synthesis of branched-chain fatty acids, which in turn are required for S. aureus fitness in vivo. This finding may explain why S. aureus is sensitive to FAS-II inhibitors even in the presence of exogenous fatty acids. Accordingly, saFabI remains a valid drug target and our structures can be used as a molecular basis for rational drug design efforts. In fact, binding affinity trends of diphenyl ether inhibitors and, more importantly, the correlated residence times could be rationalized at the molecular level. Furthermore, the structure of saFabI in complex with the 2-pyridone inhibitor CG400549 revealed unique interactions in the wider binding crevice of saFabI compared to other FabI homologues explaining the narrow activity spectrum of this clinical candidate with proven human efficacy. In summary, these studies provide an ideal platform for the development of new, effective saFabI inhibitors as exemplified by the promising 4-pyridone PT166. In the context of this dissertation, crystal structures of the condensing enzyme KasA in complex with several analogs of the naturally occurring inhibitor thiolactomycin have been solved.
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Kristallstruktur
KW  - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase
KW  - Fettsäurebiosynthese
KW  - Enoyl-Reduktase
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - fatty acid biosynthesis
KW  - enoyl reductase
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Fettsäurestoffwechsel
KW  - Inhibition
KW  - Wirkstoff
KW  - Lipide
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69239
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schwab, Steffen
T1  - Die Rolle regulatorischer T-Zellen bei der Masernviruspathogenese
T1  - The role of regulatory T-cells in measles virus pathogenesis
N2  - Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich stören, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verfügt nicht nur über vielfältige Mechanismen der Immunsuppression, während einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivität von Tregs beeinflussen könnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine präferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen können sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivität von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer präferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt während der frühen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt ursächlich für die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn während einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind nötig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die frühe IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erhöhte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergründen müssen.
N2  - Treg are supposed to keep the balance throughout the immune system. Infection, activation and induction of Treg by pathogens can interrupt with this balance. Immunosuppression autoimmunity and viral persistence can result from this interference. MV does not only cause immunosuppression during infection by multifaceted mechanisms, but also effects circumstances known to interfere with the frequency and activity of Treg. Due to the expression of maturity markers on the surface of Trn a preferential infection of this cell population by MV seems possible. MV-infection can involve both, acute MV-encephalitis, an autoimmune disease, and the virus persistence SSPE. It was not investigated until now, if thous complications are associated to specific aberrations in the frequency and activity of Treg. In this paper it was demonstrated that CD150, which is both a maturity marker and a MV-receptor, is expressed on unstimulated Trn. Due to this expression the Trn are infected preferentially and non productively in vitro leading to apoptosis. Ex vivo a noticeable depletion effect was detected during the early acute MV-encephalitis. This effect did not accure after vaccination of a healthy proband, and the challenge of an immunised monkey. Mitogenic manipulation of Trn in model organisms during MV-infection could give advice, if this depletion effect is causal to MV-Encephalitis or rather a concomitant effect. Depletion of Trn can also arise in the presence of SSPE, but this seems not to interfere with the progression of disease. By contrast there is presumable an interrelation of SSPE with the induction of Tregs. In MV-stimulated probes from SSPE-patients the median IL-10 expression was significantly higher than in controls. Probes from seropositive healthy donators were used to identify the IL-10 expressing cells. During the first hours after MV-stimulation IL-10 was mainly expressed by induced Treg. Subsequent investigations are necessary to enhance the evidence and to determine if induced Treg also dominate the early IL-10 expression after MV-stimulation in patient probes. To give a resume you could claim that there are significant interrelations between MV-encephalitis respectively SSPE and Treg. If a depletion of Trn is necessary for the development of MV-encephalitis and if increased levels of IL-10 expression are required for the formation of SSPE has to be examined in further experiments.
KW  - Masern
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Pathogenese
KW  - Immunsuppression
KW  - Inhibition
KW  - Encephalitis
KW  - Interleukin 2
KW  - Interleukin 10
KW  - Antigen CD25
KW  - Persistenz
KW  - FoxP3
KW  - induzierte regulatorische T-Zellen
KW  - natürliche regulatorische T-Zellen
KW  - SSPE
KW  - FoxP3
KW  - SSPE
KW  - regulatory T-cells
KW  - immunsuppression
KW  - encephalitis
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72979
ER  - 
TY  - THES
A1  - Melber, Makito Bernhard
T1  - Impulsivität und Antworthemmung bei adulter Aufmerksamkeitsdefizit- und Hyperaktivitätsstörung (ADHS)
T1  - Impulsivity and response inhibition in adult attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)
N2  - Ziel der vorliegenden, experimentellen Arbeit war die Untersuchung der Persönlichkeitseigenschaft der Impulsivität bei adulten Patienten mit ADHS und vergleichbaren Versuchspersonen. Da die Ätiopathogenese erhöhter Impulsivität bei Patienten mit ADHS bislang ungeklärt ist, eine Beeinflussung des dopaminergen Systems durch vorausgehende Studien allerdings nahe liegt, wurden die verwendeten Impulsivitätsmessungen zusätzlich bezüglich einer möglichen Beeinflussung durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus analysiert. Die Untersuchung beinhaltet mit 71 adulten Patienten mit ADHS und 54 gesunden Kontrollpersonen, die nach Alter, Geschlecht, IQ, Kopfumfang und Händigkeit vergleichbar waren, eine der aktuell größten Stichproben adulter Patienten mit ADHS. Während einer Stoppsignal-Aufgabe zur Erfassung der Antworthemmungsfähigkeit als Korrelat der Impulsivität wurden die Verhaltensdaten der Stichproben sowie die hirnphysiologischen Veränderungen mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie aufgezeichnet und ausgewertet. Die erhobenen experimentellen Daten wurden anschließend mit selbstbewerteter Impulsivität des I7-Impulsivitätsfragebogens nach Eysenck verglichen und auf mögliche Zusammenhänge überprüft. Zudem wurden die beobachteten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf einen möglichen Einfluss durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus untersucht. Auf der Verhaltensebene zeigten Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen sowohl für die SSRZ als auch für die Go-RZ signifikant langsamere Reaktionszeiten. Im Vergleich der funktionellen Daten konnten für Patienten mit ADHS während der erfolgreichen Stopp-Trials signifikant bzw. tendenziell verminderte Aktivierungen im Bereich des IFC und DLPFC in beiden Hemisphären festgestellt werden. Die Untersuchung der selbstbewerteten Impulsivität anhand des I7-Fragebogens ergab ebenfalls einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Stichproben. Bezüglich der Zusammenhänge zwischen den einzelnen Impulsivitätsmessungen konnten für Patienten mit ADHS signifikant bzw. tendenziell negative Zusammenhänge zwischen SSRZ und Oxygenierung im rechten IFC sowie zwischen SSRZ bzw. Go-RZ und I7-Impulsivitätswerten festgestellt werden. In der Untersuchung des Einflusses durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus ergab sich ein sehr heterogenes Bild, in dem sich keine eindeutig systematischen Genotyp- oder Interaktionseffekte zeigten. Während die beobachteten Befunde auf Verhaltensebene auf eine generelle Verlangsamung adulter Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen hindeuten, könnte das verminderte Aktivierungsmuster im Bereich des IFC und DLPFC während der erfolgreichen Stopp-Trials bei Patienten mit ADHS möglicherweise das zugrundeliegende funktionelle Korrelat zu den beobachteten Reaktionsunterschieden zwischen den beiden Stichproben darstellen. Obwohl Patienten mit ADHS im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufgrund ihrer erhöhten Impulsivität defizitär erscheinen, deuten die Befunde bezüglich des Zusammenhangs zwischen selbstbewerteter und experimentell erhobener Impulsivität innerhalb der Patientengruppe einen möglichen Vorteil erhöhter I7-Impulsivitätswerte für die Reaktionsfähigkeit in der Stoppsignal-Aufgabe an. Bezüglich der Beeinflussung der erhobenen Daten durch den Val158Met-COMT-Polymorphismus lassen sich anhand der Befunde dieser Arbeit keine klaren Schlussfolgerungen ziehen.
N2  - The aim of this study was to investigate impulsivity in adult patients with Attention Deficit-/Hyperactivity Disorder (ADHD) and healthy controls, on the one hand self-rated impulsivity operationalized by the I7 questionnaire of Eysenck and on the other the executive function response inhibition as an objective correlate of impulsivity operationalized by a stop signal task. During the stop signal task the changes of oxygenated (O2Hb) and desoxygenated haemoglobin (HHb) in prefrontal cortical areas were recorded by functional near-infrared spectroscopy (fNIRS). Because the pathophysiology of ADHD seems to involve alterations in the dopaminergic neurotransmitter system, this study also investigated the possible influence of the catechol-O-methyltransferase (COMT) Val158Met polymorphism, which modulates the degradation of prefrontal dopamine. Compared to the healthy controls, patients with ADHD showed both SSRT as well as Go-RT significantly slower reaction times during the stop signal task and significantly higher values for impulsivity and empathy in the I7 questionnaire. They also showed significantly reduced increases in O2Hb in bilateral IFC for successful stop trials and a statistical trend for a reduced increase in bilateral DLPFC. For patients with ADHD the investigation of the relationship between behavioral data and self-rated impulsivity showed a significant negative association, concerning the relationship of behavioral data and functional brain data a significant negative association between SSRT and the right IFC. The investigation of the influence of the COMT Val158Met polymorphism showed no systematic genotype or interaction effects.
KW  - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom
KW  - Kandidatengen
KW  - NIR-Spektroskopie
KW  - Präfrontaler Cortex
KW  - Impulsivität
KW  - Dopamin
KW  - Erwachsener
KW  - Inhibition
KW  - Polymo
KW  - ADHS
KW  - fNIRS
KW  - Antworthemmung
KW  - Stoppsignal
KW  - Val158Met-COMT-Polymorphismus
KW  - ADHD
KW  - fNIRS
KW  - response inhibition
KW  - stop signal
KW  - COMT Val 158Met Polymorphism
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78862
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Wedel, Steffen
A1  - Hudak, Lukasz
A1  - Seibel, Jens-Michael
A1  - Makarevic, Jasmina
A1  - Juengel, Eva
A1  - Tsaur, Igor
A1  - Waaga-Gasser, Ana
A1  - Haferkamp, Axel
A1  - Blaheta, Roman A.
T1  - Molecular targeting of prostate cancer cells by a triple drug combination down-regulates integrin driven adhesion processes, delays cell cycle progression and interferes with the cdk-cyclin axis
JF  - BMC Cancer
N2  - Background: 
Single drug use has not achieved satisfactory results in the treatment of prostate cancer, despite application of increasingly widespread targeted therapeutics. In the present study, the combined impact of the mammalian target of rapamycin (mTOR)-inhibitor RAD001, the dual EGFr and VGEFr tyrosine kinase inhibitor AEE788 and the histone deacetylase (HDAC)-inhibitor valproic acid (VPA) on prostate cancer growth and adhesion in vitro was investigated. 

Methods: 
PC-3, DU-145 and LNCaP cells were treated with RAD001, AEE788 or VPA or with a RAD-AEE-VPA combination. Tumor cell growth, cell cycle progression and cell cycle regulating proteins were then investigated by MTT-assay, flow cytometry and western blotting, respectively. Furthermore, tumor cell adhesion to vascular endothelium or to immobilized extracellular matrix proteins as well as migratory properties of the cells was evaluated, and integrin alpha and beta subtypes were analyzed. Finally, effects of drug treatment on cell signaling pathways were determined. 

Results: 
All drugs, separately applied, reduced tumor cell adhesion, migration and growth. A much stronger anticancer effect was evoked by the triple drug combination. Particularly, cdk1, 2 and 4 and cyclin B were reduced, whereas p27 was elevated. In addition, simultaneous application of RAD001, AEE788 and VPA altered the membranous, cytoplasmic and gene expression pattern of various integrin alpha and beta subtypes, reduced integrin-linked kinase (ILK) and deactivated focal adhesion kinase (FAK). Signaling analysis revealed that EGFr and the downstream target Akt, as well as p70S6k was distinctly modified in the presence of the drug combination. 

Conclusions: 
Simultaneous targeting of several key proteins in prostate cancer cells provides an advantage over targeting a single pathway. Since strong anti-tumor properties became evident with respect to cell growth and adhesion dynamics, the triple drug combination might provide progress in the treatment of advanced prostate cancer.
KW  - Growth-factor receptor
KW  - Mammalian target
KW  - Radical prostatectomy
KW  - Up-regulation
KW  - C-MYC
KW  - Pathway
KW  - Expression
KW  - Activation
KW  - Inhibition
KW  - Apoptosis
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141075
VL  - 11
IS  - 375
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dieler, Alica Christina
T1  - Investigation of variables influencing cognitive inhibition: from the behavioral to the molecular level
T1  - Untersuchung der Einflussgrößen kognitiver Unterdrückung:  Vom verhaltensorientierten zum molekularen Ansatz
N2  - The present work investigated the neural mechanisms underlying cognitive inhibition/thought suppression in Anderson’s and Green’s Think/No-Think paradigm (TNT), as well as different variables influencing these mechanisms at the cognitive, the neurophysiological, the electrophysiological and the molecular level. Neurophysiological data collected with fNIRS and fMRI have added up to the existing evidence of a fronto-hippocampal network interacting during the inhibition of unwanted thoughts. Some evidence has been presented suggesting that by means of external stimulation of the right dlPFC through iTBS thought suppression might be improved, providing further evidence for an implication of this region in the TNT. A combination of fNIRS with ERP has delivered evidence of a dissociation of early condition-independent attentional and later suppression-specific processes within the dlPFC, both contributing to suppression performance. Due to inconsistencies in the previous literature it was considered how stimulus valence would influence thought suppression by manipulating the emotional content of the to-be-suppressed stimuli. Findings of the current work regarding the ability to suppress negative word or picture stimuli have, however, been inconclusive as well. It has been hypothesized that performance in the TNT might depend on the combination of valence conditions included in the paradigm. Alternatively, it has been suggested that inconsistent findings regarding the suppression of negative stimuli or suppression at all might be due to certain personality traits and/or genetic variables, found in the present work to contribute to thought inhibition in the TNT. Rumination has been shown to be a valid predictor of thought suppression performance. Increased ruminative tendencies led to worse suppression performance which, in the present work, has been linked to less effective recruitment of the dlPFC and in turn less effective down-regulation of hippocampal activity during suppression trials. Trait anxiety has also been shown to interrupt thought suppression despite higher, however, inefficient recruitment of the dlPFC. Complementing the findings regarding ruminative tendencies and decreased thought inhibition a functional polymorphism in the KCNJ6 gene, encompassing a G-to-A transition, has been shown to disrupt thought suppression despite increased activation of the dlPFC. Through the investigation of thought suppression at different levels, the current work adds further evidence to the idea that the TNT reflects an executive control mechanism, which is sensitive to alterations in stimulus valence to some extent, neurophysiological functioning as indicated by its sensitivity to iTBS, functional modulations at the molecular level and personality traits, such as rumination and trait anxiety.
N2  - Diese Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der neuronalen Grundlagen kognitiver Inhibition /Gedankenunterdrückung in Anderson’s und Green’s ‘Think/No-Think‘ Paradigma (TNT), sowie der Erfassung verschiedener Einflussgrößen auf der kognitiven, der neurophysiologischen, der elektrophysiologischen und der molekularen Ebene. Mit fNIRS und fMRT durchgeführte neurophysiologische Studien haben die Annahme der Beteiligung eines Fronto-Hippocampalen Netzwerkes an der Unterdrückung unerwünschter Gedanken bekräftigt. Hinweise auf eine Verbesserung der Unterdrückungsleistung mittels externer Manipulation der neuronalen Aktivität durch iTBS unterstützen die Annahme einer Beteiligung des dlPFC an den Mechanismen innerhalb des TNT weiter. Durch die Kombination von fNIRS und ERP wurde eine Dissoziation zwischen frühen bedingungsunabhängigen Aufmerksamkeits- und späteren unterdrückungsspezifischen Prozessen innerhalb des dlPFC aufgezeigt. Vor dem Hintergrund widersprüchlicher Resultate bezüglich des Einflusses der Stimulus-Valenz auf die kognitive Inhibition in der vorhandenen Literatur wurde dieser Aspekt auch in der vorliegenden Arbeit berücksichtigt. Auch in dieser Arbeit aufgetretene widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Unterdrückung negativer Stimuli führten zu der Hypothese, dass die Unterdrückungsleistung in dem TNT in Abhängigkeit der Valenz der weiteren eingeschlossenen Stimuli erfolgt. Alternativ wurde eine Abhängigkeit von Persönlichkeitsmerkmalen und/oder genetischen Variablen vorgeschlagen, welche in der vorliegenden Arbeit als Einflussgrößen nachgewiesen wurden. So konnte gezeigt werden, dass die Erhebung ruminativer Tendenzen eine zuverlässige Vorhersage der Unterdrückungsleistung zulässt. Höhere ruminative Tendenzen führten zu signifikant verschlechterter Unterdrückungsleistung. Dies konnte auf eine ineffektive Rekrutierung des dlPFC gefolgt von ungenügender Aktivierungsabnahme im Hippocampus während der Gedankeninhibition zurückgeführt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass mit der Zunahme ängstlicher Persönlichkeitsmerkmale die Unterdrückungsleistung trotz erhöhter Aktivität im dlPFC abnimmt. In Ergänzung zu den Ergebnissen bezüglich ruminativer Tendenzen und gestörter kognitiver Inhibition konnte ein störender Einfluss eines funktionellen genetischen Polymorphismus im KCNJ6 Gen unter Einbeziehung einer Punktmutation (G-A Transition) nachgewiesen werden. Durch die Untersuchung der Gedankenunterdrückung auf unterschiedlichen Ebenen, konnte die vorliegende Arbeit weitere Hinweise dafür liefern, dass mit dem TNT exekutive Kontrollfunktionen abgegriffen werden, welche durch Stimulusvalenz, neurophysiologische Prozesse (durch eine die iTBS betreffende Sensitivität angezeigt), funktionelle Modulationen auf der molekularen Ebene, sowie Persönlichkeitsmerkmale wie ruminative Tendenzen und Ängstlichkeit beeinflussbar sind.
KW  - Kognitiver Prozess
KW  - Inhibition
KW  - Kognitive Inhibition
KW  - Funktionelle Bildgebung
KW  - Think/No-Think
KW  - Emotion
KW  - Bildgebendes Verfahren
KW  - Molekulare Bildgebung
KW  - Genetik
KW  - cognitive inhibition
KW  - functional imaging
KW  - think/no-think
KW  - emotion
KW  - personality traits
KW  - genomic imaging
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65955
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Alexandra
T1  - Einfluss des COMT Val<sup>108/158</sup>Met Polymorphismus auf Aktivierung und Funktion des präfrontalen Kortex
T1  - Influence of COMT Val<sup>108/158</sup>Met Polymorphism on Prefrontal Activity and Function
N2  - Der präfrontale Kortex wird im Allgemeinen mit exekutiven Funktionen in Verbindung gebracht, die unter anderem Aufmerksamkeitskontrolle, Inhibition, Arbeitsgedächtnis oder die Erkennung und Bewertung neuartiger Reize beinhalten. Für die situationsgerechte Anpassung der verschiedenen Kontrollmechanismen ist in dieser Hirnregion, wie sich in zahlreichen Studien gezeigt hat, der Neurotransmitter Dopamin entscheidend. Dieser liegt, u.a. bedingt durch den Val108/158Met-Polymorphismus der Catechol-O-Methyl-Transferase, interindividuell in verschiedenem Ausmaß vor und sollte dadurch Unterschiede in präfrontalen Funktionen zwischen einzelnen Individuen maßgeblich beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es, diesen Einfluss mittels EEG und ereigniskorrelierten Potenzialen genauer zu bestimmen und zusätzlich herauszuarbeiten, welche kognitiven Prozesse genau durch den COMT-Genotyp beeinflusst werden. 60 gesunde Probanden absolvierten hierzu unter EEG-Ableitung eine Aufgabe mit variablem Aufmerksamkeitsbedarf. Es wurde zunächst der Zusammenhang zwischen den ereigniskorrelierten Potenzialen N200 und P300 mit präfrontalen Funktionen wie Aufmerksamkeitskontrolle, Inhibition und Konfliktdetektion bzw. –verarbeitung untersucht. Zusätzlich wurden sowohl das Verhalten als auch die elektrophysiologische Aktivität zwischen den sorgfältig gematchten Genotyp-Gruppen Val/Val, Val/Met und Met/Met (je 11 Probanden) verglichen. Es zeigte sich, dass die N200 v.a. durch eine Veränderung der Aufmerksamkeitsrichtung zwischen globalen und lokalen Stimuluseigenschaften beeinflusst wurde. Die P300 wurde dagegen sowohl von der Aufmerksamkeitsrichtung als auch der Konfliktstärke (lokale im Vergleich zu globalen Stimuluseigenschaften sowie erhöhter Konflikt mit vermehrter Beanspruchung von Aufmerksamkeitsressourcen) beeinflusst. Wir konnten keine Auswirkungen der COMT-Ausprägung auf die Performanz (Korrektheit und Reaktionsgeschwindigkeit) im VAC-Test feststellen. Die hirnelektrische Aktivität (N200 und P300) unterlag dagegen einem deutlichen Einfluss des COMT-Genotyps: Met-Allel-Homozygote zeigten ein effizienteres Arbeiten - es lag eine bessere Aktivierung des Kortex (höhere P300) sowie ein geringerer Bedarf an Inhibition bei gleicher Leistung wie bei Val-Allel-Trägern vor (niedrigere N200- Amplitude). Es zeigte sich zudem bei den Met-Allel-Homozygoten kaum Variabilität der Hirnaktivierung über alle Schwierigkeitsstufen hinweg, was möglicherweise Ausdruck einer geringeren kognitiven Flexibilität im Vergleich zu Val-Allel-Trägern ist.
N2  - The prefrontal cortex is reported to be associated with executive functions such as attentional control, inhibition, working memory or recognition and evaluation of new stimuli. To the aim of appropriate adaptation of the variable control mechanisms in this brain region, the neurotransmitter dopamine is crucial, as reported in numerous studies. Due to the Val108/158Met polymorphism (amongst others) the neurotransmitter is available in a varying amount and should therefore effect prefrontal functions amongst individuals importantly. The aim of this study was to define this influence using EEG and event related potentials and to identify in addition the cognitive processes influenced by the COMT genotype. 60 healthy individuals therefore passed a variable attentional control task during the recording of an EEG. The association of the event-related potentials N200 and P300 with prefrontal functions (attentional control, inhibition and conflict detection) was analyzed. Additionally performance and electrophysiological activity of the carefully matched genotype groups Val/Val, Val/Met and Met/Met were compared. We found N200 mainly being influenced by an attentional shift between global and local stimulus characteristics - in contrast to P300, which was affected both by attentional focus and amount of conflict (local in comparison to global stimulus characteristics as well as an increased amount of conflict with a higher demand for attentional resources). We found no influence of COMT genotype on performance (reaction time and correctness) in our task whereas electric brain activity is subject to a considerable impact of the COMT genotype: Met allele homozygotes showed more efficient working expressed by a better cortical activation (higher P300) and less inhibitory demand (lower N200) for equal performance compared to Val allele carriers. Furthermore Met allele homozygotes showed only very little variability in cortical activation throughout all conditions – maybe a sign of less cognitive flexibility compared to Val allele carriers.
KW  - Catecholmethyltransferase <Catechol-0-Methyltransferase>
KW  - Aufmerksamkeit
KW  - Elektroencephalogramm
KW  - Ereigniskorreliertes Potenzial
KW  - Inhibition
KW  - präfrontal
KW  - Aufmerksamkeitskontrolle
KW  - prefrontal
KW  - attentional control
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55554
ER  - 
TY  - THES
A1  - Frank, Andreas
T1  - Untersuchungen zur Anwendbarkeit und Validität von In-vitro-Methoden bezüglich der Inhibition von Cytochrom-P450-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte
T1  - Investigations on the applicability and validity of in vitro methods with respect to the inhibition of cytochrome P450 enzymes by plant extracts
N2  - Um Arzneimittelwechselwirkungen von Arzneistoffen sowie neuen Arzneistoffkandidaten zu vermeiden, werden zur Abschätzung des Interaktionsrisikos so genannte In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Hierfür werden vor allem Mikrotiterplatten-basierte Fluoreszenz- und LC/MS-Methoden verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Anwendbarkeit und Validität dieser In-vitro-Methoden bezüglich der Inhibition von CYP-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten belegen, dass die verwendeten Fluoreszenz-Assays für Pflanzenextrakte keine validen Ergebnisse liefern und für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten nur in wenigen Fällen geeignet sind. Bei einigen untersuchten Pflanzenextrakten wurden sehr starke inhibitorische Aktivitäten gefunden, da durch Quenching des Fluoreszenzsignals falsch positive Ergebnisse vorgetäuscht wurden. Ebenso war die Inhibition bei einigen Pflanzenextrakten aufgrund einer starken Eigenfluoreszenz sehr schwach oder konnte überhaupt nicht bestimmt werden. Des Weiteren wurden als Referenzmethoden für die Bestimmung der Inhibition von CYP-Enzymen LC/MS-basierte Methoden mit Online-Festphasenextraktion verwendet, die speziell für Pflanzenextrakte entwickelt und validiert wurden. Die Ergebnisse der LC/MS-basierten CYP-Assays wurden durch die Pflanzenmatrix nicht beeinflusst, so dass diese Assays hervorragend als Referenzmethoden für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten geeignet sind. Bei sehr hohen Extraktkonzentrationen zeigten einige Pflanzenextrakte sehr starke Abweichungen der mittels LC/MS und Fluorimetrie in Mikrotiterplatten erhaltenen inhibitorischen Aktivität. Die Verwendung von niedrigen Extraktkonzentrationen führte zu einer besseren Übereinstimmung der erhaltenen Ergebnisse. D.h. vor allem bei hohen Extraktkonzentrationen sind starke Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte zu erwarten. Dennoch sind auch bei niedrigen Extraktkonzentrationen diese Effekte nicht auszuschließen. In den meisten Veröffentlichungen wurden sehr hohe Testkonzentrationen für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten verwendet, so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgrund von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten falsch positive bzw. negative Ergebnisse erhalten wurden. Untersuchungen zum Quenching haben gezeigt, dass die meisten Extrakte in den üblicherweise verwendeten Konzentrationen (ca. 10-1000 µg/ml) die Fluoreszenzintensität der Metabolite sehr stark reduzierten. Die Quenching-Effekte der Pflanzenextrakte beeinflussten das Fluoreszenzsignal aller enzymatisch gebildeten Metabolite (Cumarin-Derivate, Resorufin, Fluorescein), wobei die Quenching-Effekte bei Resorufin und Fluorescein in ihrer Stärke und Häufigkeit geringer ausfielen. Bei CYP2B6, CYP2C9 und CYP2D6 wurden in Verbindung mit Fluoreszenzsubstraten, die eine Cumarinstruktur aufweisen, sehr oft falsch negative oder gar keine Ergebnisse erhalten, weil die Eigenfluoreszenz der Extrakte die Metabolitenfluoreszenz überlagerte. Quenching-Effekte traten bei den untersuchten Pflanzenextrakten weitaus häufiger auf als eine Eigenfluoreszenz. Aufgrund dieser Tatsachen können die Mikrotiterplatten-basierten Fluoreszenz-Methoden nur eingesetzt werden, wenn vorher gezeigt wurde, dass die Pflanzenextrakte bei allen Testkonzentrationen sowie bei verschiedenen Metabolitenkonzentrationen weder Quenching- noch Eigenfluoreszenz-Effekte zeigen. Ebenso wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die bisher in Veröffentlichungen durchgeführten Kontrollinkubationen nur bedingt zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten geeignet sind. Das Auftreten und Ausmaß der Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte sind abhängig vom Inhibitor (Pflanzenextrakt), der Inhibitorkonzentration, dem Metaboliten und dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie der Metabolitenkonzentration, die durch die enzymatische Umsetzung des Substrats und der inhibitorischen Aktivität des Inhibitors bestimmt wird. Während der Inhibitor, die zu testenden Inhibitorkonzentrationen, der Metabolit sowie dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge eine feste Größe darstellen, ist die Metabolitenkonzentration je nach inhibitorischer Aktivität des Inhibitors sehr unterschiedlich. D. h. letztendlich hängt das genaue Ausmaß der Eigenfluoreszenz- und Quenching-Effekte von der inhibitorischen Aktivität der Pflanzenextrakte ab. Es konnte gezeigt werden, dass je geringer die Metabolitenkonzentration ist, desto stärker wird das Fluoreszenzsignal reduziert (Quenching) bzw. erhöht (Eigenfluoreszenz). Eine sinnvolle Kontrollinkubation zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten kann also gar nicht durchgeführt werden. Bei In-vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität ist die Metabolitenkonzentration nicht bekannt und somit der Einfluss der Effekte nicht bestimmbar.
N2  - To avoid interactions with drugs or new drug candidates, in vitro interaction studies are performed for the assessment of their drug interaction potential. For this purpose, microtiterplate-based fluorimetric and LC/MS-based methods are used. The goal of this work was to investigate the applicability and validity of the microtiterplate-based fluorescence methods with respect to the inhibition of CYP enzymes by plant extracts. The results show that the microtiterplate-based fluorimetric assays do not provide reliable results for plant extracts and that these assays are only suitable for the determination of the inhibitory activities of plant extracts in some cases. Several of the tested plant extracts showed very strong inhibitory activities. But, due to quenching effects, the extracts additionally reduced the fluorescence signals of the metabolites thereby pretending false positive results. Also, the inhibition of CYP enzymes by some plant extracts was very weak or even not determinable due to intrinsic fluorescence. Additionally, LC/MS-based methods with online solid phase extraction were developed and validated as reference methods for the determination of the inhibition of CYP enzymes. Since the results of the LC/MS-based assays were not affected by the matrix of the plant extracts, these assays are suitable reference methods for the determination of the inhibitory activities of plant extracts. At high extract concentrations some plant extracts showed strong deviations of the inhibitory activities using LC/MS- and microtiterplate-based fluorimetric assays. The use of low extract concentrations provided a good correlation of the obtained inhibitory activities. That means, especially high extract concentrations are responsible for strong quenching effects and intrinsic fluorescence thereby pretending false positive or negative results. Nevertheless, also at low extract concentrations these effects were observed. Interestingly, in most publications very high concentrations of plant extracts were used for the determination of the inhibitory activities, so that reduced or increased IC50 values were obtained due to quenching and intrinsic fluorescence. Analyses of the quenching effects showed that most extracts strongly reduced the fluorescence intensity of the metabolites at frequently used concentrations (ca. 10-1000 µg/ml). The quenching effects of the plant extracts decreased the fluorescence signal of all enzymatically produced metabolites (coumarin derivatives, resorufin and fluorescein), whereas the quenching effects for resorufin and fluorescein were much less potent and frequent. By using coumarin derivatives as substrates for CYP2B6, CYP2C9 und CYP2D6 often false negative or no results were obtained, because the intrinsic fluorescence of the extracts interfered with the metabolite fluorescence. Finally, quenching effects occurred more often than intrinsic fluorescence. Due to these facts, microtiterplate based fluorimetric methods are only useable if the plant extracts show neither quenching nor intrinsic fluorescence for all inhibitor concentrations at various metabolite concentrations. Also, analyses of this work showed that control incubations performed in recently published studies are only of limited use for the compensation of quenching effects and intrinsic fluorescence. The occurrence and the extent of quenching effects and intrinsic fluorescence depend on the inhibitor (plant extract), the inhibitor concentration, the metabolite and its excitation and emission wavelength as well as the metabolite concentration, which is determined by the inhibitory activity of the inhibitor. Whereas the inhibitor, the inhibitor concentration, the metabolite as well as its excitation and emission wavelength are constant parameters, the metabolite concentration depends on the inhibitory activity of the inhibitor. That means, the extent of quenching and intrinsic fluorescence depends mainly on the inhibitory activity of the plant extracts. Studies in this work showed that the lower the metabolite concentration the more the fluorescence signal is decreased (quenching) or increased (intrinsic fluorescence). Thus, control incubations to compensate quenching effects and intrinsic fluorescence are not valid, because the metabolite concentration is unknown and thus the influence of the effects is not determinable.
KW  - In vitro
KW  - Inhibition
KW  - Cytochrom-P450-Enzym
KW  - Fluoreszenzassay
KW  - Pflanzenextrakt
KW  - cytochrome P450 enzyme
KW  - fluorimetric assay
KW  - plant extract
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36236
ER  - 
TY  - THES
A1  - Humrich, Jan
T1  - G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine
T1  - G protein betagamma regulation by phosducin-like proteins
N2  - Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.
N2  - Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated.
KW  - G-Proteine
KW  - Membranrezeptor
KW  - Regulation
KW  - Proteinfaltung
KW  - Phosphorylierung
KW  - Zellkultur
KW  - RNS-Interferenz
KW  - Proteinkinase A
KW  - Protein-Protein-Wechselwirkung
KW  - Proteinkinase CK2
KW  - Immunoblot
KW  - Phosducin
KW  - Phosducin-like Proteine
KW  - CCT
KW  - TCP-1 alpha
KW  - Proteasom
KW  - WD 40 Repeat Proteins
KW  - Inhibition
KW  - Protein Folding
KW  - Protein Interaction
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059
ER  - 
TY  - THES
A1  - Poppe, Heiko Anton
T1  - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie
T1  - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry
N2  - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates.
N2  - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities.
KW  - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3
KW  - 5->
KW  - Proteinkinase A
KW  - Hydrolyse
KW  - Mikrokalorimetrie
KW  - Cyclo-GMP
KW  - Cyclo-GMP-Derivate
KW  - Dissoziationskonstante
KW  - Enzymkinetik
KW  - Inhibition
KW  - Cyclo-AMP
KW  - Signaltransduktion
KW  - Thrombozyt
KW  - Immunoblot
KW  - Stickst
KW  - Proteinkinase G
KW  - Adenylatcyclase
KW  - Epac
KW  - Linear Mixed Inhibition
KW  - GAF Domaine
KW  - Proteinkinase G
KW  - Adenylylcyclase
KW  - Epac
KW  - Linear mixed inhibition
KW  - Gaf domaine
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ehlis, Ann-Christine
T1  - Hirnelektrische Hypofrontalität bei schizophrenen Patienten und ihre Bedeutung für die Auswahl der neuroleptischen Medikation
T1  - Hypofrontality in schizophrenic patients and its relevance for the choice of antipsychotic medication
N2  - Hintergrund und Ziel der Untersuchung: Patienten mit schizophrenen Erkrankungen zeigen in einer Vielzahl von Untersuchungssituationen eine verminderte Funktion frontaler Hirnregionen (Hypofrontalität), die insbesondere auch den anterioren cingulären Cortex (ACC) betrifft. Verschiedene Arten antipsychotischer Medikation unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Metabolismus und Funktion des Frontalcortex, wobei es Hinweise darauf gibt, dass atypische Antipsychotika diesen Bereich des Gehirns positiv beeinflussen, während konventionelle Antipsychotika (Typika) hier nur geringe oder sogar negative Effekte zeigen. Hinsichtlich der Auswahl eines Antipsychotikums zu Beginn einer medikamentösen Behandlung gibt es bislang keine etablierten neurophysiologischen/biologischen Marker, die eine Vorhersage der Therapie-Response unter verschiedenen Arten antipsychotischer Medikation erlauben. Ziel der Studie war es daher, die Eignung der NoGo-Anteriorisierung (NGA) als Prädiktor der Therapie-Response schizophrener Patienten unter typischer bzw. atypischer Medikation zu untersuchen. Die NGA ist ein neurophysiologischer Marker, der die Funktion präfrontaler Areale einschließlich des ACC widerspiegeln soll. Unter Zuhilfenahme dieses Parameters wurde an einer Gruppe schizophrener Patienten überprüft, ob das Ausmaß der initialen Hypofrontalität eine Vorhersage der individuellen Therapie-Response erlaubt. Methoden: Es wurden 76 Patienten mit Erkrankungen aus dem schizophrenen Formenkreis zu jeweils drei Messzeitpunkten neurophysiologisch, neuropsychologisch und psychometrisch getestet. Die Baseline-Messung (t1) fand innerhalb der ersten drei Tage eines stationär-psychiatrischen Aufenthalts, die beiden Folgemessungen (t2, t3) drei bzw. sechs Wochen nach Beginn einer Therapie mit typischen (n=36) oder atypischen Antipsychotika (n=40) statt. Im Rahmen der neurophysiologischen Untersuchung führten die Patienten eine Go-NoGo-Aufgabe durch, wobei anhand der durch Go- und NoGo-Stimuli evozierten ereigniskorrelierten Potentiale individuell die NGA ermittelt wurde. Beide Behandlungsgruppen wurden aufgrund der NGA-Werte zu t1 in Patienten mit initial starker vs. schwacher Frontalhirnfunktion unterteilt (Mediansplit). Ergebnisse: Alle Patientengruppen zeigten eine signifikante Besserung der psychotischen Symptomatik im Verlauf des 6-wöchigen Untersuchungszeitraums. Außerdem hatten Atypika hypothesengemäß einen signifikant positiven Einfluss auf die Entwicklung der neuropsychologischen Testleistungen, während Typika oftmals mit einer Verschlechterung entsprechender Maße einhergingen. Atypika hatten zudem eine günstigere Wirkung auf die subjektiv erlebte Lebensqualität der Patienten. Darüber hinaus war die zu t1 erhobene NGA ein signifikanter Prädiktor der Therapie-Response. Niedrige Werte der NGA zu Beginn der Behandlung sagten dabei ein besonders gutes Ansprechen auf atypische Antipsychotika voraus, während hohe Werte der NGA zu t1 mit einer besonders deutlichen klinischen Besserung unter typischer Medikation einhergingen. Die NGA korrelierte zudem signifikant mit den neuropsychologischen Testleistungen, unterlag selbst aber keinen systematischen Veränderungen unter typischer vs. atypischer Medikation. Schlussfolgerung: Der auf der Basis früherer Untersuchungen vermutete Zusammenhang zwischen der NGA und präfrontalen Hirnfunktionen konnte anhand der vorliegenden Befunde bestätigt werden. Außerdem war aufgrund der zu Beginn einer stationär-psychiatrischen Behandlung gemessenen NGA eine signifikante Vorhersage der Therapie-Response unter typischen und atypischen Antipsychotika möglich. Die NGA könnte somit im klinischen Alltag zu einer individualisierten Entscheidungsfindung bei der Auswahl eines antipsychotischen Präparats, unter Berücksichtigung pathophysiologischer Aspekte der Erkrankung, beitragen.
N2  - Background and objective: Schizophrenic patients often exhibit functional deficits in frontal cortical areas (hypofrontality), particularly within the anterior cingulate cortex (ACC). Different classes of antipsychotic medication differ with respect to their influence on function and metabolism of the frontal cortex, with a more positive effect of atypical as compared to typical compounds. Regarding the therapeutic choice of a particular antipsychotic substance, previous research efforts have not yet been able to establish neurobiological markers that are able to predict the patients’ clinical response to different kinds of antipsychotic medication. The present study, therefore, aimed at examining the NoGo-Anteriorization (NGA) as a possible predictor of the clinical response to typical and atypical antipsychotic treatment. The NGA is a neurophysiological marker that presumably reflects activation of prefrontal cortical structures, including the ACC. For the present study, a group of schizophrenic patients was examined three times in the course of a psychiatric in-patient treatment, to confirm that prefrontal cortical function is positively influenced by atypical antipsychotics, and to explore whether the amount of hypofrontality at the beginning of treatment (quantified by means of the NGA) allows for a prediction of the clinical response to both kinds of antipsychotic medication. Methods: 76 patients with schizophrenic illnesses were examined three times each, by means of neurophysiological, neuropsychological and psychometric measures. Baseline measurements (t1) were conducted within the first three days of a psychiatric in-patient treatment, follow-up measurements (t2, t3) three and six weeks after the start of a therapy with typical (n=36) or atypical antipsychotics (n=40). For the neurophysiological examination, patients performed a Go-NoGo-task, and the individual NGA was calculated on the basis of the corresponding Go- and NoGo-ERPs (event-related potentials). Moreover, the NGA at baseline was used to subdivide both treatment groups into patients with initially strong vs. weak frontal cortical function (NGA above and below group-median, respectively). Results: On a clinical level, patients in each of the four study groups improved significantly over the course of the study period. In line with previous findings, atypical antipsychotics furthermore positively influenced neuropsychological test performance, whereas typical medication often caused a decline in test scores. Similarly, atypical compounds had a more favourable impact on the patients’ self-reported quality of life. Moreover, baseline values of the NGA significantly predicted the patients’ clinical response: Low values at t1 were associated with a particularly strong improvement under atypical medication, whereas high initial values of the NGA predicted a particularly good response to typical antipsychotics. The NGA furthermore significantly correlated with neuropsychological test scores, but did not systematically change over the course of a treatment with typical vs. atypical antipsychotics. Conclusion: The present findings confirm the putative association between the NGA and prefrontal brain functions. Furthermore, the NGA at the beginning of a psychiatric in-patient treatment significantly predicted the clinical response to typical and atypical antipsychotic treatment. Since the NGA can be easily determined in clinical routine settings, it might be a useful parameter for the development of individualised treatment strategies based on pathophysiological aspects of schizophrenic illnesses.
KW  - Schizophrenie
KW  - Präfrontaler Cortex
KW  - Gyrus cinguli
KW  - Neuroleptikum
KW  - Ereigniskorreliertes Potenzial
KW  - Inhibition
KW  - Prädiktor
KW  - Neuropsychologie
KW  - NoGo-Anteriorisierung
KW  - NGA
KW  - Continuous Performance Test
KW  - CPT
KW  - P300
KW  - Schizophrenia
KW  - Anterior cingulate
KW  - Antipsychotics
KW  - NoGo-Anteriorisation
KW  - Event-related potential
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26566
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hallhuber, Matthias
T1  - Inhibition of Nuclear Import of Calcineurin Prevents the Development of Myocardial Hypertrophy
T1  - Inhibition des nukleären Imports von Calcineurin verhindert die Entwicklung myokardialer Hypertrophie
N2  - The Calcineurin/NFAT signaling cascade is a crucial transducer of cellular function. It has recently been emerged that in addition to the transcription factor NFAT, the phosphatase Calcineurin is also translocated to the nucleus. Our traditional understanding of Calcineurin activation via sustained high Ca2+-levels was also advanced by recent findings from this working group (AG Ritter), which showed that Calcineurin is activated by proteolysis of the C-terminal autoinhibitory domain. This leads to the constitutive activation and nuclear translocation of Calcineurin. Therefore, Calcineurin is not only responsible for dephosphorylating of NFAT in the cytosol thus enabling its nuclear import, its presence in the nucleus is also significant in ensuring the full transcriptional activity of NFAT. Formation of complexes between transcription factors and DNA regulates the transcriptional process. Therefore, the time that transcription factors remain nuclear is a major determinant of transcriptional activity. The movement of proteins over ~40 kDa into and out of the nucleus is governed by the nuclear pore complex (NPC). Transcription factors and enzymes that regulate the activity of these proteins are shuttled across the nuclear envelope by proteins that recognize nuclear localization signals (NLS) and nuclear export signals (NES) within the amino acid sequence of these transcription factors. In this study, the precise mechanisms of Calcineurin nuclear import and export were identified. Additionally to the nuclear localization sequence (NLS) and the nuclear export sequence (NES) within the sequence of Calcineurin, the respective nuclear cargo proteins, responsible for nuclear import, Importin&#946;1, and for nuclear export, CRM1, were identified. Inhibition of the Calcineurin/importin interaction by a competitive peptide, called Import Blocking Peptide (IBP), which mimicked the Calcineurin NLS, prevented nuclear entry of Calcineurin. A non-inhibitory control peptide showed no effect. Using this approach, it was able to prevent the development of myocardial hypertrophy. In Angiotensin II stimulated cardiomyocytes, both the transcriptional and the translational level was suppressed. Additionally, cell size and expression of Brain natriuretic peptide (as molecular marker for hypertrophy) were significantly reduced compared untreated controls. IBP worked dose-dependent, but did not affect the Calcineurin phosphatase activity. In conclusion, Calcineurin is not only capable of dephosphorylating NFAT, thus enabling its nuclear import, its presence in the nucleus is also important for full NFAT transcriptional activity. Using IBP to prevent the nuclear import of Calcineurin is a completely new approach to prevent the development of myocardial hypertrophy.
N2  - Die Calcineurin/NFAT – Signalkaskade spielt eine wichtige Rolle innerhalb der zellulären Funkionalität. Es wurde bereits gezeigt, dass neben NFAT auch die Phosphatase Calcineurin in den Zellkern transportiert wird. Die bisherigen Vorstellungen zur Aktivierung von Calcineurin durch erhöhte intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen wurden durch aktuellste Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe (AG Ritter) neu diskutiert. Es wurde gezeigt, dass Calcineurin durch gezielte Proteolyse der autoinhibitorischen Domäne konstitutiv aktiviert werden kann und in den Zellkern transportiert wird. Calcineurin ist daher nicht nur verantwortlich für die im Zytosol stattfindende Dephosphorylierung von NFAT, sondern übernimmt auch eine wichtige Funktion im Zellkern. Die nukleäre Lokalisation von Calcineurin ist essentiell für die vollständige transkriptionelle Aktivität von NFAT. Die Komplexbildung zwischen Transkriptionsfaktoren und DNA reguliert die Transkription. Aus diesem Grund spielt die nukleäre Verweildauer diverser Transkriptionsfaktoren eine tragende Rolle. Der Transport von Proteinen (> 40 kDa) in den und aus dem Zellkern erfolgt über nukleäre Porenkomplexe, wobei die zu transportierenden Proteine mittels nukleärer Lokalisationssequenzen (NLS) / nukleärer Exportsequencen (NES) durch die entsprechenden Transportportproteine (Karyopherine) erkannt werden. In dieser Arbeit wurden die genauen Mechanismen des Imports und des Exports von Calcineurin identifiziert. Zusätzlich konnten die NLS/NES von Calcineurin und die entsprechenden Karyopherine, Importin&#946;1 für den Import bzw. CRM1 für den Export, ermittelt werden. Die Inhibition der Calcineurin/Importin Interaktion durch ein kompetitives Peptid, welches als Import Blocking Peptide (IBP) bezeichnet wurde und der NLS von Calcineurin entspricht, verhinderte den nukleären Import von Calcineurin. Durch diesen Mechanismus war es möglich, die Entwicklung kardialer Hypertrophie zu verhindern. In Angiotensin II stimulierten Kardiomyozyten konnten sowohl die transkriptionelle, als auch die translationelle Aktivität reduziert werden. Des Weiteren wurden das Zellwachstum und die Expression von BNP unterdrückt. Das Blockpeptid wirkte konzentrationsabhängig, beeinflusste aber die Phosphatase-Eigenschaft von Calcineurin nicht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Calcineurin, nicht nur verantwortlich für die Dephosphorylierung von NFAT ist, sondern die nukleäre Lokalisierung ebenfalls eine entscheidende Rolle für die volle transkriptionelle Aktivität von NFAT spielt. Die Verwendung von IBP, um den nukleären Import von Calcineurin zu verhindern, stellt ein völlig neues Konzept dar, die Entwicklung kardialer Hypertrophie zu unterdrücken.
KW  - Calcineurin
KW  - Inhibition
KW  - Blockpeptid
KW  - myokardiale Hypertrophie
KW  - Calcineurin
KW  - Inhibition
KW  - Blocking Peptide
KW  - Myocardial Hypertrophy
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23536
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gerlach, Judith
T1  - Der inhibitorische Einfluss von CD22 auf das B-Zellrezeptorsignal  nach Stimulation der B-Zelle
T1  - The Inhibitory Influence of CD22 on the B-cell Receptor Signal upon Stimulation of the B-cell
N2  - CD22 ist ein B-zellspezifisches Transmembranprotein der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie. Es übernimmt zwei unterschiedliche Aufgaben. Zum einen hat CD22 eine inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal. Nach BZR-Ligation lagert sich die Tyrosin-Phosphatase SHP-1 an die cytoplasmatische Domäne von CD22 an, wodurch SHP-1 aktiviert wird. Durch die dephosphorylierende Aktivität der Phosphatase moduliert sie das BZR-Signal. Zum anderen ist CD22 ein Adhäsionsmolekül, das in die Gruppe der Siglecs (Sialic acid-binding Ig-like lectin) gehört. Die N-terminale Ig-Domäne von CD22 weist die Bindungseigenschaften eines Lectins auf und bindet spezifisch &#61537;2,6-gekoppelte Sialinsäure. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die inhibitorische Wirkung von CD22 auf das BZR-Signal molekular zu definieren. Daher wurde das Substrat der an CD22 rekrutierten und aktivierten Phosphatase SHP-1 in vergleichenden Analysen von CD22-defizienten und Kontroll-B-Zellen nach BZR-Stimulation gesucht. Wir konnten zeigen, dass in CD22-defizienten B-Zellen nach BZR-Stimulation das Adaptermolekül SLP-65, auch BLNK oder BASH genannt, früher und stärker Tyrosin-phosphoryliert vorliegt, als in Kontroll-B-Zellen. Transfektionsexperimente mit der CD22-defizienten Plasmazytom-Zelllinie J558L&#61549;m3 wurden begonnen, um den molekularen Zusammenhang zwischen CD22, SHP-1 und SLP-65/BLNK zu bestätigen. Das in J558L&#61549;m3 Zellen ektopisch exprimierte CD22 wurde Tyrosin-phosphoryliert, und SHP-1 konnte mit CD22 co-präzipitiert werden. Jedoch war in den CD22-Transfektanten keine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK nach BZR-Stimulation im Vergleich zu untransfizierten Zellen nachweisbar. Da in unabhängigen Experimenten die Liganden-Bindung von CD22 als Voraussetzung für die inhibitorische Wirkung von CD22 deutlich wurde, etablierten wir &#61537;2,6 Sialinsäure- und CD22-positive J558L&#61549;m3 Doppeltransfektanten. Auf diesen konnte die cis-Maskierung von CD22 nachgewiesen werden. In Stimulationsexperimenten der Doppeltransfektanten wurde die reduzierte Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK in Abhängigkeit von CD22 in der Mehrzahl der Klone bestätigt. Allerdings mussten die Resultate in Frage gestellt werden, als in den meisten Klonen einer Kontrolltransfektion ebenfalls eine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK festgestellt wurde. Um den Einfluss von CD22 und SLP-65 auf das BZR-Signal zu klären, wurden CD22- und SLP-65-defiziente Mäuse gekreuzt. Durch die zusätzliche Deletion von CD22 in SLP-65-/- Mäusen konnte das Ca2+-Signal nach BZR-Stimulation wieder hergestellt werden. Jedoch zeigte die weitere Analyse der doppel-defizienten Mäuse, dass in der Regel der Phänotyp der SLP-65-defizienten Mäuse dominiert. Diese Ergebnisse verdeutlichten, dass das Adaptermolekül SLP-65/BLNK zwar ein Substrat des CD22/SHP-1 Signalweges ist, aber keine essentielle Rolle in der inhibitorischen Wirkung von CD22 übernimmt. Weiterhin wurde der Einfluss der Ligandenbindung von CD22 auf dessen intrazelluläre, inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal untersucht. Ein synthetisches Sialoside stand zur Verfügung, das hochspezifisch die Interaktion von CD22 mit dessen Liganden stört. Wurden die Zellen einer humanen B-Zelllinie in Gegenwart des Sialosids über den BZR stimuliert, konnte ein erhöhtes Ca2+-Signal gemessen werden. Dieses Resultat erinnerte an die stärkere Ca2+-Mobilisierung in CD22-defizienten B-Zellen. Entsprechend war die Tyrosin-Phosphorylierung von CD22 nach Vorbehandlung mit dem Sialosid in den humanen B-Zellen verringert, und weniger SHP-1 konnte mit CD22 co-präzipitiert werden. Mit diesen Ergebnissen wurde deutlich, dass die Adhäsionsdomäne von CD22 einen direkten, positiven Einfluss auf die intrazelluläre, inhibitorische Domäne von CD22 hat. Als Nebenprojekt wurde die Rolle von CD22 in knock-out Mäusen des transkriptionellen Co-Aktivators BOB.1/OBF.1 untersucht. Ein Entwicklungsblock im transitionalen B-Zellstadium im Knochenmark der BOB.1/OBF.1-defizienten Mäuse verursacht eine deutliche Reduktion reifer B-Zellen in der Milz. Die Analyse des Knochenmarks der BOB.1/OBF.1-defizienten Mäuse zeigte, dass ausschließlich die Expression von CD22 auf den B-Vorläufer Zellen erhöht war. Nach zusätzlicher Deletion von CD22 in BOB.1/OBF.1-/- Mäusen war nach BZR-Stimulation ein deutliches Ca2+-Signal in den doppel-defizienten B-Zellen messbar. Dieses könnte die normalisierte Anzahl transitionaler B-Zellen im Knochenmark und die gestiegene Anzahl reifer B-Zellen in der Milz der doppel-defizienten Mäuse bewirken. Allerdings waren die doppel-defizienten Mäuse, entsprechend den BOB.1/OBF.1-/- Mäusen, nicht in der Lage, eine humorale Immunantwort einzuleiten oder Keimzentren zu bilden. Die Proliferation von CD22-defizienten B-Zellen nach LPS-Stimulation verlief unabhängig von der An- oder Abwesenheit von BOB.1/OBF.1. Mit den Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Differenzierungsschwierigkeiten der BOB.1/OBF.1-defizienten B-Zellen vom BZR-Signal abhängen. Allerdings muss das Ausbleiben der Keimzentrenbildung auf einen anderen Mechanismus zurückgeführt werden.
N2  - CD22 is a B cell-specific transmembran protein of the Immunoglobulin (Ig) superfamily, which has two distinct functions. On the one hand, CD22 acts as a negative regulator of the BCR-signal. Upon BCR-ligation the tyrosine phosphatase SHP-1 associates with the cytoplasmatic tail of CD22 leading to the activation of SHP-1. The activated tyrosine phosphatase dephosphorylates signaling molecules within the BCR-signaling cascade, thereby inhibiting the BCR-signal. On the other hand, CD22 is an adhesion molecule belonging to the Siglec family (Sialic acid-binding Ig-like lectin). The N-terminal Ig-domain confers lectin function by specifically binding to &#61537;2,6-linked sialic acid. The main focus of this thesis was to molecularly define the inhibitory role of CD22 on the BCR-signal. Therefore, we looked for possible substrates of the tyrosine phosphatase SHP-1 by comparing the tyrosine phosphorylation level of proximal signaling molecules upon BCR-stimulation in CD22-deficient and control-B-cells. The adaptor protein SLP-65, also called BLNK or BASH, was earlier and stronger tyrosine-phosphorylated in CD22-deficient B-cells, compared to control-B-cells upon BCR-stimulation. Reconstitution experiments were started with the CD22-deficient plasmacytoma cell-line J558L&#61549;m3 to demonstrate the molecular correlation between CD22, SHP-1, and SLP-65/BLNK. Ectopically expressed CD22 was tyrosine-phosphorylated in transfected J558L&#61549;m3 cells and SHP-1 could be co-precipitated with CD22. However, the tyrosine-phosphorylation level of SLP-65/BLNK was unaffected or even increased in CD22-positive J558L&#61549;m3 transfectants upon stimulation. In the meantime we were able to show that the adhesion domain of CD22 has a direct influence on the inhibitory role of CD22. Therefore, plasmacytoma cells were established stably expressing &#61537;2,6 sialic acid and CD22. On those cis-masking of CD22 could be detected. The tyrosine-phosphorylation level of the adaptor molecule SLP-65/BLNK was decreased in most of the double-transfected J558L&#61549;m3 clones depending on the expression of CD22. But the obtained results had to be questioned when the tyrosine-phosphorylation of SLP-65/BLNK was also decreased in most of the clones of a control-transfection. To further analyze the mechanism of BCR-signal regulation by CD22 and SLP-65, CD22- and SLP-65-deficient mice were crossed. The additional deletion of CD22 in SLP-65-/- mice restored the Ca2+-signal in double-deficient B-cells upon BCR-stimulation. Further analysis of SLP-65xCD22-double-deficient mice revealed that the phenotype of the SLP-65-/- mice was dominant in most of the explored aspects. Therefore, we concluded that the adaptor protein SLP-65/BLNK is a substrate of the CD22/SHP-1 pathway but not crucial for mediating the inhibitory function of CD22. So far it was not known whether the ligand-binding of CD22 influences its intracellular signaling domain. To investigate this question we used a synthetic sialoside, which specifically binds to the lectin domain of CD22 and thereby interferes with the ligand-binding. When cells of a human B cell-line were stimulated with anti-IgM in the presence of this sialoside, a higher Ca2+-signal was observed, similar to the one measured in CD22-deficient B-cells. Accordingly, a lower tyrosine-phosphorylation of CD22 and less SHP-1 recruitment was demonstrated in the presence of this sialoside in those human B-cells. Thus, by interfering with the ligand binding of CD22 on the B-cell surface, we have shown that the lectin domain of CD22 has a direct, positive influence on its intracellular inhibitory domain. As a side project we investigated the role of CD22 in mice lacking the transcriptional co-activator BOB.1/OBF.1. A developmental block at the transitional B cell stage in the bone marrow of BOB.1/OBF.1-deficient mice causes a reduced number of splenic B cells. By analyzing the bone marrow of BOB.1/OBF.1-/- mice, we found that the expression of CD22 is selectively increased on B-lineage cells. Furthermore, the Ca2+-signal in BOB.1/OBF.1-deficient B-cells was restored upon BCR-stimulation, when CD22 was additionally deleted. The increased Ca2+-signal could cause the normal number of transitional B cells in the bone marrow and the increased number of mature B-cells in the spleen of BOB.1/OBF.1xCD22-double-deficient mice. Nevertheless, double-deficient animals were unable to mount humoral immune response and to form germinal centers as has been described for BOB.1/OBF.1-deficient mice. Finally, CD22-deficient B-cells proliferate independently of BOB.1/OBF.1 upon stimulation with LPS. These studies suggest that the differentiation defect of B-cells observed in BOB.1/OBF.1-/- mice is BCR-signal dependent. However, the impairment of BOB.1/OBF.1-/- B-cells to form germinal centers is caused by a different mechanism.
KW  - B-Lymphozyt
KW  - Antigen CD22
KW  - Signaltransduktion
KW  - Inhibition
KW  - CD22
KW  - B Zelle
KW  - BZR
KW  - Signaltransduktion
KW  - inhibitorisch
KW  - CD22
KW  - B-cell
KW  - BCR
KW  - signaltransduction
KW  - inhibitory
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7207
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jordan, Bruce
T1  - The identification of NRAGE
T1  - Die Identifizierung von NRAGE
N2  - The inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) have been shown to interact with a growing number of intracellular proteins and signalling pathways in order to fulfil their anti-apoptotic role. In order to investigate in detail how the avian homologue ITA interfered with both TNF induced apoptosis and the NGF mediated differentiation in PC12 cells, a two hybrid screen was performed with a PC12 library using ITA as a bait. The screen resulted in the identification of several overlapping fragments of a previously unknown gene. The complete cDNA for this gene was isolated, the analysis of which revealed a high homology with a large family of tumour antigens known as MAGE (melanoma associated antigens). This newly identified member of the MAGE family, which was later named NRAGE, exhibited some unique characteristics that suggested for the first time a role in normal cellular physiology for this protein family. MAGE proteins are usually restricted in their expression to malignant or tumour cells, however NRAGE was also expressed in terminally differentiated adult tissue. NRAGE also interacted with the human XIAP in direct two-hybrid tests. The interactions observed in yeast cells were confirmed in mammalian cell culture, employing both coimmunoprecipitation and mammalian two-hybrid methods. Moreover, the results of the coimmunoprecipitation experiments indicated that this interaction requires the RING domain. The widely studied 32D cell system was chosen to investigate the effect of NRAGE on apoptosis. NRAGE was stably transduced in 32D cells, and found to augment cell death induced by the withdrawal of Interleukin-3. One reason for this reduced cell viability in NRAGE expressing cells could be the binding of endogenous XIAP, which occurred inducibly after growth factor withdrawal. Interestingly, NRAGE was able to overcome the protection afforded to 32D cells by the exogenous expression of human Bcl-2. Thus NRAGE was identified during this research doctorate as a novel pro-apoptotic, IAP-interacting protein, able to accelerate apoptosis in a pathway independent of Bcl-2 cell protection.
N2  - Die Familie der „inhibitor of apoptosis proteins” (IAPs) interagieren mit einer wachsenden Zahl an intrazellulären Proteinen und Signaltransduktionswegen um ihre anti-apoptotische Aufgabe zu erfüllen. Es konnte gezeigt werden, dass das ITA-Homolog aus dem Huhn sowohl die durch TNF induzierte Apoptose als auch die durch NGF induzierte Differenzierung von PC12-Zellen verhindert bzw. verlangsamt. Um diese Befunde genauer zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit ein "yeast two-hybrid screen" mit ITA als "bait" (Köder) und einer cDNA-Bank aus PC12-Zellen durchgeführt. In diesem "screen" konnten verschiedene Fragmente eines bis dahin unbekannten Gens identifiziert werden. Die Untersuchung der isolierte Gesamt-cDNA ergab eine hohe Homologie mit einer Familie von Tumor-Antigenen namens MAGE (melanoma associated antigens). Im Gegensatz zu den bisher identifizierten MAGE, zeigte dieses neue Familienmitglied, welches später NRAGE genannt wurde, einige Charakteristika die das erste mal eine Rolle in der normalen zellulären Physiologie nahe legten. In einem direkten "yeast two hybrid test" konnte die Interaktion zwischen NRAGE und humanem XIAP gezeigt werden. Diese Interaktion konnte sowohl in Ko-Immunpräzipitationen als auch im sogenannten Säuger two-hybrid bestätigt werden. Desweiteren zeigten die Ko- Immunpräzipitationen, dass für die Interaktion dieser beiden Proteine die RING-Domäne von ITA benötigt wird. Um Effekte von NRAGE auf die Apotose zu untersuchen, wurde dass etablierte 32D Zellsystem verwendet. NRAGE wurde stabil in 32D-Zellen exprimiert, wodurch die Apoptoserate der Zellen, induziert durch die Kultivierung in IL-3 freiem Medium, gesteigert wurde. Ein Grund für diese erhöhte Apoptoserate, könnte in der Bindung von XIAP, welches nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren induziert wird, an NRAGE liegen. Interessanterweise war NRAGE auch fähig die protektive Wirkung von exogen exprimiertem Bcl-2 aufzuheben. Somit konnte in dieser Arbeit NRAGE als pro-apoptotisches und mit IAP interagierendes Protein beschrieben werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Verstärkung der Apoptose unabhängig von dem bekannten durch Bcl-2 bedingten anti-apoptotischen Signalweg erfolgt.
KW  - Apoptosis
KW  - Inhibition
KW  - Proteine
KW  - Molekularbiologie
KW  - IAP
KW  - NRAGE
KW  - Apoptosis
KW  - IAP
KW  - NRAGE
KW  - Apoptose
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180090
ER  - 
TY  - THES
A1  - Arndt, Petra
T1  - Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere
T1  - Cloning and functional characterization of organic cation transporters from rat kidney
N2  - Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden.
N2  - Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake.
KW  - Ratte
KW  - Niere
KW  - Kation
KW  - Stofftransport <Biologie>
KW  - Molekularbiologie
KW  - rOCT1
KW  - rOCT2
KW  - proximaler Tubulus
KW  - Niere
KW  - Sekretion
KW  - Xenopus laevis
KW  - Oozyte
KW  - Transport
KW  - Inhibition
KW  - Homologieklonierung
KW  - rOCT1
KW  - rOCT2
KW  - proximal tubule
KW  - kidney
KW  - secretion
KW  - Xenopus laevis
KW  - oocyte
KW  - transport
KW  - inhibition
KW  - homology cloning
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-793
ER  -