TY - THES A1 - Plank, Christina T1 - Untersuchung von Dihydroisochinolinonderivaten als mögliche Inhibitoren von Hsc70 T1 - Analyzing dihydroisoquinolinone derivatives as potential inhibitors of Hsc70 N2 - Einhergehend mit einer steigenden Lebenserwartung nimmt auch die Zahl der am Multiplen Myelom Erkrankten zu. Bis dato gibt es nur wenige Therapieansätze dieser selten vorkommenden Blutkrebserkrankung. Im Zusammenhang mit der Entstehung des Multiplen Myeloms stehen vor allem zwei bedeutende Hitzeschockproteine: Hsp90 und Hsp70. Beide haben die Aufgabe, Zellen vor Apoptose zu schützen. In proliferierenden Plasmazellen ist eine Überexpression an Hsp90 zu beobachten. Entwickelte Inhibitoren führten zwar zu einer verminderten Hsp90-Aktivität, allerdings wurde diese durch eine vermehrte Expression von Hsp70 kompensiert, weshalb Myelomzellen weiterhin proliferierten. Aus diesem Grund bietet sich Hsp70 als weiterer Angriffspunkt in der Therapierung des Multiplen Myeloms an. Die bislang entwickelten Inhibitoren binden entweder an die Nukleotid- oder Substratbindedomäne. Da beide Stellen unspezifisch sind, wurden durch virtuelles Screening potenzielle Inhibitoren für Hsp70 identifiziert, welche in vitro und in vivo tatsächlich Effekte hinsichtlich der Herunterregulierung von Hsp70 zeigten. Ob die entwickelten Substanzen jedoch direkt an Hsp70 binden, war die Fragestellung der vorliegenden Arbeit. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern die entwickelten Inhibitoren an Hsp70 binden und dieses inhibieren. Die humane Hsp70-Familie besitzt sechzehn Mitglieder, die alle ähnliche Aufgaben und Strukturmerkmale aufweisen. Für die durchgeführten Versuche wurde die Hsp70-Isoform Hsc70 verwendet. In einem Protein-Ligand-Assay konnte gezeigt werden, dass die meisten Verbindungen durch Aggregatbildung zu einer Inhibition von Hsc70 führten. Durch Zugabe von Detergenz konnten die gebildeten Aggregate aufgebrochen und so der Inhibitionseffekt aufgehoben bzw. deutlich reduziert werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die in Zell- und Mausversuchen beobachteten Effekte vermutlich nicht auf eine direkte Inhibition von Hsc70 zurückzuführen sind. Ob diese Effekte nun ebenfalls auf Aggregatbildung beruhen oder aber ein anderes Protein als das vermutete Hsc70 inhibiert wird, was über eine Signalkaskade zur Inhibition von Hsc70 führt, wäre eine interessante Fragestellung für weitere Untersuchungen. Da sowohl in NMR-Versuchen als auch dem durchgeführten Protein-Ligand-Assay gezeigt werden konnte, dass die vormals als potenzielle Inhibitoren entwickelten Verbindungen nur schwach aktiv sind, wurde durch Fragment-basierte Ansätze eine andere Bindestelle für mögliche Inhibitoren identifiziert. Hierbei konnte N-Acetyl-D-Glucosamin in der Nukleotidbindedomäne von Hsc70 detektiert werden. Hieraus könnten sich neue Ansätze zur Entwicklung neuartiger in silico entwickelter Hsc70-Inhibitoren ergeben. Ausgangspunkt für die Docking-Studien zur Entwicklung neuer Hsp70-Inhibitoren war die Kristallstruktur von bHsc70 ED 1-554, einer trunkierten Doppelmutante des nativen Hsc70. Bis dato ist diese 554 Aminosäuren umfassende Mutante die einzige Hsc70-Variante von der die Zweidomänenstruktur kristallisiert werden konnte. Für dieses Konstrukt wurde zunächst ein optimiertes Aufreinigungsprotokoll entwickelt, um dann Kristallisationsversuche mit ausgewählten AH-Verbindungen, die in den Docking-Studien entwickelt wurden, durchzuführen. Hierbei konnte jedoch keine Bindung festgestellt werden. Die Kristallisation mit Ver-155008, einem bekannten Hsc70-Inhibitor, führte jedoch zur ersten Zweidomänenstruktur von Hsc70 mit gebundenem Ver-155008. Neben der obigen Fragestellung wurde außerdem untersucht, wie funktional aktiv das trunkierte Hsc70-Konstrukts ist. Hier zeigte sich, dass aufgrund des fehlenden C-Terminus zwar eine geringe Aktivität von 30 % im Vergleich zur Volllänge zu beobachten war. Für eine nahezu vollständige Rückfaltungsaktivität ist aber der C-Terminus essentiell. Weiterhin konnte in ITC-Versuchen der Kd-Wert von Ver-155008 an die verwendete Mutante ermittelt werden, der dem bereits bekannten Kd von Ver-155008 an das native Hsc70 ähnlich ist. N2 - Coming along with an increasing life span, the number of multiple myeloma incidences permanently increases. By now, there is no possibility to cure this rare blood cancer disease. In multiple myeloma, there are two major proteins playing a crucial role in its development: Hsp70 and Hsp90. Both prevent cells from apoptosis. In proliferating plasma cells, Hsp90 is overexpressed. Inhibitors for Hsp90, however, led to an overexpression of Hsp70. Therefore, Hsp70 seems to be an attractive target in multiple myeloma. Developed Hsp70 inhibitors are likely to bind either to the nucleotide or substrate binding domain. Since both domains are likely unspecific, new inhibitors were designed by virtual screening which indeed showed inhibition effects on Hsp70 in vitro and in vivo. Nevertheless, the question had to be answered whether these compounds directly bind to Hsp70 or if the expression of Hsp70 is downregulated through a signal cascade in the cell. In this thesis, it was analyzed whether and how in silico designed and in cell-based assays active compounds inhibit Hsp70. The human Hsp70 family comprises 16 members which have similar structures and functions in the cell. For all conducted experiments, Hsp70 isoform 8, also known as Hsc70, was used. In a protein-ligand assay, it was shown that the compounds inhibit Hsc70 due to aggregate formation. Upon the addition of detergent, aggregates were broken down and the inhibition effect was reversed. Therefore the effects that have been observed in cell and mouse experiments are most likely not due to a direct inhibition of Hsc70. Whether these effects are due to aggregate formation or whether another protein was inhibited which then led to a downregulation of Hsc70 via a signal cascade, is a challenging question for further studies. Since it was shown both in protein-ligand assays and NMR experiments that the favored compounds were only weakly active, fragment-based screening was used to find a new core structure for further design studies. N-acetyl-D-glucosamine was found to bind to the NBD of Hsc70 which now might serve as a starting point for the development of novel Hsp70 inhibitors. For all docking studies that have been conducted to develop novel Hsc70 inhibitors, the crystal structure of bHsc70 ED 1-554 was used, which is a truncated and double-mutated version of the native Hsc70. This construct has been the only crystal structure so far of which the two-domain structure of Hsc70 has been determined. For this construct a purification protocol was optimized to use bHsc70 ED 1-554 for crystallization experiments to determine the binding of the in silico developed AH compounds. Although no binding of these compounds could be observed, the two-domain structure of bHsc70 ED 1-554 with bound Ver-155008, a known Hsc70 inhibitor, could be determined. Besides, the activity of this truncated Hsc70 double-mutant was analyzed. Due to the lacking C terminus, which is important for the interaction with client proteins, a reduced activity of about 30 % was observed. Nevertheless, in ITC experiments the Kd value of the binding of Ver-155008 to bHsc70 ED 1-554 showed that the affinity is similar to that of native Hsc70. KW - Hitzeschockproteine KW - Dihydroisochinolinderivate KW - Hsc70 KW - Inhibitor KW - Multiples Myelom KW - Dihydroisochinolinonderivate Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162655 ER - TY - THES A1 - Plank, Christina T1 - Somatische Befunde und kognitive Leistungen von "Heavy Usern" mit anorektischen und bulimischen Essstörungen T1 - Somatic findings and cognitive performance of “heavy users” with anorectic and bulimic eating disorders N2 - Ziel: Das Ziel der explorativen Studie war es, erwachsene Patientinnen mit restriktiver bzw. bulimischer Anorexie oder Bulimie mit einer starken Inanspruchnahme von stationären Versorgungsleistungen, sogenannte Heavy User (HU), die eine vollstationäre Behandlung in der Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg erhalten haben, zu beschreiben, soziodemographische sowie erkrankungsbezogene somatische und kognitive Charakteristika darzustellen und die Ergebnisse mit einer Kontrollgruppe aus Patientinnen mit dem gleichen Störungsbild, aber einer geringeren Inanspruchnahme medizinischer Versorgungsangebote, den Nicht-Heavy Usern (NHU), zu vergleichen. Teilnehmer und Methode: 23 anorektische bzw. bulimische Heavy User-Patientinnen, die sich im Zeitraum der Datenerhebung (1997-2008) zum mindestens dritten Mal in einer stationären Therapie aufgrund ihrer Essstörung befanden, und eine Vergleichsgruppe von 13 Nicht-Heavy User-Patientinnen mit höchstens einem stationären Voraufenthalt wurden in dieser Studie untersucht. Allgemein- und neurologischer Status sowie die Laborparameter zum Aufnahmezeitpunkt und die Auswertungen der kranialen CTs bzw. MRTs sowie der kognitiven Testverfahren zu Beginn der Therapie und vor der Entlassung wurden analysiert und miteinander verglichen. Ergebnisse und Schlußfolgerung: Die anorektischen und bulimischen Heavy User weisen viele auffällige somatische Befunde, von der Norm abweichende Laborparameter sowie im Falle der anorektischen Heavy User eine häufig bestehende Hirnatrophie auf. Darüber hinaus zeigen sie eine Reihe von kognitiven Defiziten in verschiedenen Bereichen. Am stärksten davon betroffen sind die restriktiv anorektischen Heavy User. Die Ausprägungen der untersuchten pathologischen Befunde unterscheiden sich jedoch nicht signifikant von denen der Nicht-Heavy User. Spezifische Eigenschaften der Heavy User, die es zulassen, sie von einem Nicht-Heavy User abzugrenzen, wurden nicht gefunden. Weitere Studien sind notwendig, um andere typische Merkmale der Heavy User zu eruieren, damit sie möglichst frühzeitig identifiziert und ihnen für sie geeignetere alternative Behandlungsmöglichkeiten angeboten werden können. N2 - Objective: The objective of this explorative study was to describe female adult patients with restricting- respectively purging-type anorexia nervosa or bulimia nervosa with a high use of hospital services, so called heavy users, who received full inpatient treatment in the Clinics and Polyclinics for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy of the University Hospital of Würzburg, to show sociodemographic and disease-related somatic and cognitive characteristics and to compare the results with a control group of female patients with the same disorder, but a reduced demand of healthcare offerings, the non-heavy users. Patients and Methods: 23 anorectic respectively bulimic female heavy user patients, who were for at least the third time in inpatient treatment due to their eating disorder, and a comparison group of 13 female non-heavy user patients with a maximum of one inpatient prior stay were studied. General and neurological status, as well as the laboratory parameters at the time of exposure and the evaluation of the cranial CTs or MRTs plus the cognitive test methods at the beginning of the therapy and before discharge were analysed and compared with each other. Results and Conclusion: The anorectic and bulimic heavy users show a lot of noticeable somatic findings, laboratory parameters deviating from the norm and in case of the anorectic heavy users an often existing atrophy of the brain. Furthermore they present a series of cognitive deficits in various sectors. The most affected are the heavy users with restricting-type anorexia nervosa. The manifestations of the examined pathological findings are not significantly different from those of the non-heavy users. Specific characteristics of the heavy users which permit to differentiate them from a non-heavy user were not found. Further studies are necessary, to determine other typical features of heavy users, in order to identify them as early as possible and offer them more suitable alternative treatment options. KW - Essstörungen KW - Anorexia nervosa KW - Bulimia nervosa KW - heavy user KW - somatische Befunde KW - kognitive Leistungen Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154113 ER -