TY  - THES
A1  - Herold, Marco
T1  - Der C-Terminus des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1 reguliert Stabilität und Funktionalität des Proteins
T1  - The C-erminus of the antiapoptotic Bcl-2 family member A1 regulates stability and function of the protein
N2  - Die Stimulation von Lymphozyten durch alleinige Quervernetzung ihrer Antigenrezeptoren führt in Abhängigkeit von der Signalstärke zur Induktion von Apoptose. Dieser Prozess spielt im Rahmen der negativen Selektion von B-Zellen eine wichtige Rolle und kann am Beispiel von WEHI 231 Zellen, einer murinen Lymphomzelllinie modellhaft nachempfunden werden. Die Quervernetzung des B-Zellrezeptors (BZR) in WEHI 231 Zellen führt in Abhängigkeit von der Prozessierung der mitochondrialen Caspase 9 zu Apoptose. Dies kann durch Überexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 verhindert werden. Interessanterweise besitzt A1 im Gegensatz zu Fast allen anderen Bcl-2 Proteinen keinen C-terminalen Bereich, der das Protein in intrazelluläre Membranen wie Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum verankert. Ob und gegebenenfalls welche Bedeutung das C-terminale Ende für das Protein und dessen Funktion hat wurde in dieser Arbeit untersucht. Eine C-terminale Deletionsmutante wies im Vergleich zum Wildtyp eine höhere Proteinstabilität auf. Die Fusion der letzten 35 Aminosäuren von A1 an eine enzymatisch inaktive Form von Caspase 3 führte zu einem sehr instabilen chimären Protein. Somit scheint der C-Terminus von A1 sowohl notwendig als auch hinreichend für die kurze Halbwertszeit des Proteins zu sein. Die meisten kurzlebigen Proteine werden über den proteasomalen Signalweg degradiert. Dies scheint auch für A1 zu gelten, da seine Halbwertszeit durch den Einsatz eines Proteasomeninhibitors verlängert wurde. In Koexpressionsstudien konnte zudem eine Ubiquitylierung von A1 beobachtet werden, welche bei der stabileren A1 Mutante stark reduziert war. A1 ist jedoch nicht immer instabil. In Anwesenheit des „BH3-only“ Proteins Bim, das A1 direkt binden kann, wird die Halbwertszeit von A1 enorm erhöht. Die antiapoptotische Funktion von A1 scheint sich jedoch nicht nur auf die Neutralisation durch bloße Bindung zu beschränken, da die Deletionsmutante trotz vergleichbarer Interaktion mit Bim einen sehr viel geringeren Schutz gegen Etoposid vermittelter Apoptose verlieh. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das antiapoptotische Bcl-2 Familienmitglied A1 eine sehr kurze Halbwertszeit besitzt und das der C-Terminus nicht nur die Stabilität sondern auch die antiapoptotische Schutzfunktion für das Protein vermittelt.
N2  - The strong stimulation of lymphocytes through their antigen receptors leads to the induction of apoptosis unless a costimulatory signal is provided. This process plays an important role in the negative selection of B-lymphocytes and can be mimicked in the immature murine lymphoma cell line WEHI 231. Engagement of the B-cell receptor (BCR) on WEHI 231 cells leads to apoptosis via a pathway that requires the processing of mitochondria-dependent caspase 9. This can be prevented by overexpression of the antiapoptotic Bcl-2 family member A1. In contrast to most Bcl-2 proteins, A1 does not contain a C-terminal region which recruits it to intracellular membranes of the mitochondria or endoplasmatic reticulum. The aim of this thesis was to investigate the function of the A1 C-terminus. Deleting the C-terminus increased the stability of A1 whereas fusing the last 35 amino acids of A1 onto an enzymatically-inactive caspase 3 mutant leads to a highly unstable chimeric protein. It therefore appears that the C-terminus is responsible for A1´s short half-life. Most short-lived proteins are degraded via the proteasomal pathway. It is likely A1 is also degraded via the proteasomal pathway, since its half-life was increased in the presence of a proteasomal inhibitor. Furthermore, coexpression studies showed a strong ubiquitylation of A1, which was greatly reduced in the stable truncated variant of A1. However, A1 is not always unstable. In the presence of the ”BH3-only“ protein Bim, a direct interaction partner of A1, the half-life of A1 was strongly increased. The antiapoptotic function of A1 can not just be mediated by the binding and neutralising of proapoptotic partners such as Bim because the C-terminal deletion mutant, which can also interact with Bim, fails to protect cells from etoposide-induced apoptosis. Taken together these results show that the Bcl-2 family member A1 has a very short half life and that the C-terminus is not only responsible for its rapid turnover but also for the antiapoptotic function of the protein.
KW  - Apoptosis
KW  - B-Lymphozyten-Rezeptor
KW  - Inhibitorproteine
KW  - Apoptose
KW  - antiapoptotisches Bcl-2 Familienmitglied A1
KW  - apoptosis
KW  - antiapoptotic Bcl-2 family member A1
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14459
ER  - 
TY  - THES
A1  - Knöferle, Johanna Maria
T1  - Die Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose und die Reaktivierung von HIV in chronisch-infizierten Zellen durch bakterielle CpG-ODN-Sequenzen
T1  - The influence of antioxidants on apoptosis and the reactivation of HIV in chronical infected cells through bacterial CpG-ODN sequences
N2  - Der erste Teil der vorliegenden Arbeit befasste sich mit der Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose. Dabei sollte vor allem die Abhängigkeit der Apoptosereaktion von der verwendeten Zellinie geprüft werden. Zwei verschiedene Zellmodelle kamen zum Einsatz, A3.01 T-Zelllymphoblasten und E6-1 Jurkat-Zellen. Als Antioxidantien wurden das natürlich vorkommende N-Acetylzystein und das synthetische Antioxidans BHA ausgewählt. Die Zellen wurden mit CD95L stimuliert, und mit den entsprechenden Antioxidantien behandelt. Nach der Inkubation wurden sie mit AnnexinV und 7AAD gefärbt. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, 7AAD an den Nukleus. Die Zellen wurden im Durchflusszytomter analysiert. Zellen, die nur Annexin V positiv waren, wurden als apoptotisch gezählt, während Zellen die für AnnexinV und 7AAD positiv waren (also einen Membranstörungen aufwiesen) als nekrotisch betrachtet wurden. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich schließen, dass die Apoptose in verschiedenen Zelllinien über unterschiedliche Signalwege vermittelt wird. A3.01 Zellen waren bereits für die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodes unter Caspaseinhibition bekannt. BHA konnte diesen nekrose-ähnlichen Zelltod verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass BHA nach Apoptoseinduktion ohne Caspaseinhibitoren eine stärkere Apoptose induziert als ein CD95-Ligand alleine. Dieselbe Reaktion konnte bei peripheren Blutmonozyten (PBMC) beobachtet werden. Bei E6-1 Jurkat-Zellen, die nach Inhibition der Caspase keinen nekrotischen Zelltod erleiden, kam es nach der Behandlung mit BHA und CD95 zu einer Abnahme der Apoptose. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die verwendeten Zellinien unterschiedlichen Zelltypen angehören: A3.01 Zellen und PBMC könnten den Typ 1 Zellen zugeordnet werden, die für die Durchführung der Apoptose auf Caspasen angewiesen sind, E6-1 Zellen könnten Typ 2 Zellen verkörpern, die zusätzlich noch auf mitochondriale Stimulation angewiesen sind, um apoptotisch zu werden. Diese mitochondriale Stimulation könnte durch BHA verhindert werden und so bei E6-1 Jurkat-Zellen Apoptose verhindern. NAC hingegen zeigte in der vorliegenden Arbeit einen anti-apoptotischen Effekt sowohl bei der A3.01 Zelllinie, als auch bei E6-1 Jurkat-Zellen. Hieraus könnte geschlussfolgert werden, dass NAC bereits zu einem früheren Zeitpunkt in den Ablauf der Apoptose eingreift. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Reaktivierung von HIV in der chronisch-infizierten T-Zelllinie ACH-2 durch bakterielle CpG-Sequenzen. Auch hier wurden die Zellen mithilfe der Durchflußzytometrie analysiert. Die HIV-Replikationsrate wurde quantitativ mit einem p24-Antikörper gemessen. Es wurde gezeigt, dass CpG-Motive in dieser Zellinie in vitro eine Reaktivierung der HIV-Replikation bewirken. Dieser Effekt wurde nicht durch die PTO-Modifikation der CpG-ODN hervorgerufen, sondern war spezifisch für die CpG-Sequenzen. Eine Behandlung mit ODNs ohne CpG-Sequenzen führte nicht zu einer Induktion der HIV-Replikation in ACH-2-Zellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die verwendeten Cpg-Sequenzen die latent-infizierte T-Zellinie ACH-2 nicht aktivieren, sondern nur die Virusreplikation anstoßen. Versuche mit humanen nicht-infizierten PBMCs zeigten, dass CD3-positive Zellen, ähnlich wie ACH-2-Zellen, durch CpG-ODNs nicht aktiviert werden, CD3-negative PBMCs dagegen konnten durch die Behandlung mit CpG-ODNs aktiviert werden. Die Reaktivierung von HIV konnte durch die Inhibition verschiedener Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich beeinflusst werden. Die NFkB-Inhibtoren CAPE und SN50 und der ERK-MAP-Kinase-Inhibtor UO126 verhinderten die durch CpG-ODNs induzierte HIV-Replikation in ACH-2 Zellen nicht. Unter dem Einfluss von CAPE wurde sogar ein geringfügiger Anstieg der Virusreplikation beobachtet. Dieser Effekt ist wahrscheinlich aber durch die intrinsische Aktivität von CAPE erklärbar. Die Frage nach den distalen Faktoren in den aktivierten Signalwegen muss also unbeantwortet bleiben. Könnten die in dieser Arbeit in vitro beobachteten spezifischen Effekte der CpG-ODNs in vivo bei HIV-positiven Patienten ausgelöst werden, so wäre das ein Schritt mehr in Richtung der vollständigen Eliminierung des Virus aus dem infizierten Organismus. Durch diese Methode könnten die Virusreservoirs in ruhenden T-Zellen, Makrophagen und dentritischen Zellen reaktiviert werden und wären so einer effizienten Therapie mit HAART zugänglich. Als nächster Schritt in diesem Bereich der Forschung sollten deswegen Versuche zu der Wirkung von CpG-Sequenzen auf chronisch-infizierte Zellen HIV-positiver Patienten unternommen werden, um die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ex vivo zu untersuchen.
N2  - The aim of the first part of this study was to elucidate the influence of antioxidants on apoptosis in the T-cell lines A3.01 and E6-1 (Jurkat cells). To differentiate between organic and synthetic antiocxidants, either NAC or BHA was used. Cells were stimulated with CD95L, treated with antioxidants, immunostained with Annexin-V/7AAD and measured with FACS analyzes. Cells positive for AnnexinV only were counted as apoptotic, whereas cells positive for AnnexinV and 7AAD were seen as necrotic. We showed, that BHA acts differentiatly in A3.01 and Jurkat cells. While Jurkat cells reacted on treatment with BHA with decreased apoptosis, it enhanced apoptotic cell death in A3.01 cells. The same results were observed in PBMCs. NAC in contrast inhibited apoptosis in A3.01 cells as well as in E6-1 cells. These findings support the evidence of different pathways of apoptosis in each cell type. The second part of the study focused on the activation of HIV in chronical infected cells through bacterial CpG-ODN sequences. Therefore, a chronical infected T-cell line, ACH-2 cells was used. HIV replication was measured via p24-immunostaining and FACS analyzes. We could show, that the effect of CpG-ODNs was specific for CpG-sequences: treatment with ODNs lacking the CpG-Sequences could not stimulate HIV replication. Further on, treatment with CpG-ODNs does not activate ACH-2 cells whereas HIV replication was enhanced. Similar to these findings, studies with CD3-positive PBMCs showed no activation upon treatment with CpG-ODNs. CpG-ODN induced virus replication could not be inhibited through treatment with NFkB-inhibitors CAPE and SN50, nor through treatment with MAPKinase inhibitors. Therefore, the downstream pathway of CpG-ODN induced activation of virus replication remains unknown.
KW  - Antioxidantien
KW  - Apoptose
KW  - HIV
KW  - CpG-ODN
KW  - chronisch-infizierte Zellen
KW  - antioxidants
KW  - apoptosis
KW  - HIV
KW  - CpG-ODN
KW  - chronical-infected cells
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22984
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kuß, Andreas
T1  - Untersuchungen zur CD40 induzierten Expression von A1 in B-Lymphozyten der Maus
T1  - Investigations concerning the CD40 induced expression of A1 in murine B lymphocytes
N2  - Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung.
N2  - Engagement of the antigen receptor on murine immature B lymphocytes leads to growth arrest followed by apoptosis. Concomitant signalling through CD40 rescues the cells from apoptosis and sustains proliferation. It is shown here, that in primary murine B cells crosslinking of CD40 stimulates the expression of A1, an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family. CD40 dependent stimulation of A1 was confirmed in WEHI 231 cells, an immature B cell lymphoma line. WEHI 231 cells were transduced with A1 and a chimeric selection marker comprising the enhanced yellow fluorescent protein and the zeocin resistance protein via recombinant replicationdefective retroviruses. Expression of A1 and marker proteins was coupled through an internal ribosomal entry site. A1 transduced WEHI 231 cells showed a significantly enhanced survival rate after engagement of the antigen receptor whereas constitutive expression of A1 did not abrogate c-myc downregulation and activity-loss of a NFkB-dependent luciferase reporter, both of which were induced by BCR-crosslinking. Expression of inducible cMyc-ER in A1 transduced cells did not restore proliferation in these populations. In contrast, upon induction cMyc-ER itself caused growth arrest and apoptosis of these cells despite the presence of A1. Studies of functional properties of A1 revealed that it was able to suppress BCR-induced degradation of the caspase substrate PARP as well as activation of Caspase 7. The generation of reactive oxigen species, a further consequence of BCR signalling, was also significantly reduced by A1. Taken together these result suggest that upstream of A1 the CD40 signal is divided into two major components, one of which is responsible for the upkeep of proliferation whereas the other secures cell survival. It seems that for the latter A1 is of major importance.
KW  - Apoptosis
KW  - B-Lymphozyt
KW  - Proteasen
KW  - CD40
KW  - Bcl-2
KW  - Unreife B-Zelle
KW  - Apoptose
KW  - Wachstumsstopp
KW  - Caspasen
KW  - CD40
KW  - bcl-2
KW  - Immature B cell
KW  - Apoptosis
KW  - Growth Arrest
KW  - Caspases
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1669
ER  - 
TY  - THES
A1  - Langer, Manuel
T1  - Analyse der Instabilität und Funktionalität des Anti-Apoptose-Proteins A1
T1  - Analysis of instability and function of the anti- apoptotic protein A1
N2  - Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erfüllt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilität und anti-apoptotische Funktion von A1 wird über den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch für den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminosäuren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilität und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gewählt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, während eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht möglich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in Stärke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es müssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein für den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilität als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anhängt und das Protein damit für den proteasomalen Abbau markiert.
N2  - Apoptosis is a certain kind of programmed cell death and plays an important role in many physiological processes. Pathological dysregulation of apoptosis is involved in the development of a number of diseases. The Bcl-2 family members and with it the anti-apoptotic family member A1 are important regulators of apoptosis by regulating the integrity of the mitochondria. A1 is a very unstable protein, its stability is regulated by the ubiquitin/proteasome pathway. Based on published work, the hypothesis was set up, that a so far unknown ubiquitin-E3-ligase binds to the C-terminal end of A1, attaches ubiquitin chains to lysine residues and thereby marks the protein for proteasomal degradation. The ubiquitinylation and the molecular mechanisms behind the instability and the anti-apoptotic capacity of A1 should be further characterized by mutating the lysine residues of the protein. For this paper altogether 11 mutants of the A1 protein were cloned. The 11 lysine residues of A1 were replaced in groups with arginine residues (K-A1 mutants). Arginine was chosen to keep the charge at that position in the protein but to inhibit ubiquitylation at this position. The experiments indicate that all or at least most of the lysine residues of the A1 protein can be ubiquitinylated, because no significant differences in ubiquitinylation of the K-A1 mutants compared to A1 wildtype protein could be observed. Thus, no specific lysine residues have to be necessarily ubiquitinylated to destabilize the A1 protein, but ubiquitinylation of different lysine residues can mark the protein for proteasomal degradation. Furthermore, the loss of certain lysines showed no significant influence on the anti-apoptotic capacity of A1. Altogether, the results support the hypothesis, that a so far unknown ubiquitin-E3-ligase attaches ubiquitin to most if not all lysine residues and thereby regulates the stability and the anti-apoptotic capacity of the protein.
KW  - Apoptosis
KW  - Ubiquitin-Protein-Ligase
KW  - Apoptose
KW  - anti- apoptotisches Bcl-2 Familienmitglied A1
KW  - Ubiquitin- Proteasomen- Weg
KW  - apoptosis
KW  - anti- apoptotic Bcl-2 family member A1
KW  - ubiquitin- proteasome- pathway
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50119
ER  - 
TY  - THES
A1  - Meisenzahl, Christina
T1  - Regulation der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase durch Interferon in retinalen Pigmentepithelzellen
T1  - Regulation of metalloproteinases stromelysin and collagenase by interferons in retinal pigment epithelial cells
N2  - Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.
N2  - Ophtalmological diseases that imply degeneration or hereditary dystrophia of retina often lead to blindness and form a crucial problem in ophtalmology. Apoptotic cell death was identified as origin for cell loss. Actually, the linkage between genetic mutation and loss of cellular functionality as well as the signal transduction pathways leading to apoptosis remained unclear. Settled in the research of molecular genetic origins for apoptosis in human retina, this thesis investigates if the metalloproteinases stromelysin and collagenase are product of the human pigment epithelial cell-line ARPE-19 and if the genetic expression of these metalloproteinases can be stimulated by treatment with human interferons. Detection was performed at mRNA-Level using northern-blot-analysis with digoxigenin-marked antisense-RNA formed by in-vitro transcription and RT-PCR. Due to their epithelial morphology and rapid proliferation ARPE-19 cells were used as a model. Human fibroblasts and glioma cells formed controls. In ARPE-19 cells, northern-blot-analysis could not detect the metalloproteinase collagenase. The approach to augment a probably extremely low amount of mRNA by interferon-alpha/gamma-stimulation of the retinal pigment epithelial cells led to negative result as well. When investigating stromelysin-1, the more sensitive method of RT-PCR was utilized. Using this technique, stromelysin-1 was detected in control cells, but not in ARPE-19 cells. We assume that ARPE-19 cells did not immortalize during its passages in cell culture, but switched off a certain number of genes implying the investigated metalloproteinases collagenase and stromelysin, or maybe the cell line does not comprise the complete identical chromosomal set of an originary pigment epithelial cell. The loss of differentiated attributes during multiple passages is a known phenomenon in cell culture research. Obviously, the cultured ARPE-19 cell is highly reduced in transcriptional activity, omitting the transcription of the metalloproteinases stromelysin and collagenase.
KW  - Maus
KW  - Coronaviren
KW  - Genexpression
KW  - Apoptose
KW  - Metalloproteinase
KW  - retinales Pigmentepithel
KW  - Interferon
KW  - Stromelysin
KW  - Collagenase
KW  - Apoptosis
KW  - metalloproteinase
KW  - retinal pigment epithelium
KW  - interferon
KW  - stromelysin
KW  - collagenase
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180452
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stocker, Hartmut
T1  - Untersuchungen zum Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion
T1  - Investigation of the pathomechanism of the destruction of CD4+ T-lymphocytes in the course of HIV-infection
N2  - Der Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion ist bisher ungeklärt. Diese Arbeit zeigt, dass primäre, HIV-uninfizierte CD4+ Zellen in Kontakt mit HIV-infizierten Zellen zugrundegehen. Zur Aufklärung des Mechanismus dieses Zelltodes wurden einzelne Schritte der Zellfusion zwischen infizierten und uninfizierten Zellen mit Antikörpern und Peptiden blockiert, und die Auswirkung dieser Blockade auf den Zelltod bestimmt. Dabei zeigte sich dass die Blockade jedes Schritts der Fusion von nicht-infizierten und infizierten Zellen den Zelltod der uninfizierten Zellen verhindert. Weiter wurde gezeigt, dass im Verlauf des Zelluntergangs Apoptose auftritt, diese aber für den Zellverlust keine notwendige Voraussetzung ist.
N2  - The pathomechanism of the destruction of T-helpercells in the course of HIV-infections is still a matter of debate. The objective of this study was to investigate whether uninfected CD4+ primary PBMC are killed when getting in contact with HIV-infected primary PBMC. The destruction of uninfected primary CD4+ cells in contact with HIV-infected cells of ENF-expressing cells was shown with different techniques. Furthermore the individual steps of cell fusion were inhibited using antibodies and peptides directed against CD4, gp120 and gp41. Any block in the fusion process let to an inhibition of cell death indicating that the death of uninfected T-helpercells is a consequence of cell cell fusion. It was also shown that apoptosis can be observed during this cell lysis, however the inhibition of apoptosis did not lead to an inhibition of cell death.
KW  - HIV
KW  - T-Helferzellen
KW  - Apoptose
KW  - Nekrose
KW  - Bystander
KW  - HIV
KW  - T-Helpercells
KW  - Apoptosis
KW  - Necrosis
KW  - Bystander
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12052
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thorwarth, Wolf Michael
T1  - Kombinierte Leber- Dünndarmtransplantation
T1  - Combined Liver- Small Bowel Transplantation
N2  - Nach Transplantation moduliert die Leber nicht nur die Immunantwort des Empfängers gegenüber ihr selbst, sondern übt auch auf mittransplantierte Organe einen protektiven Effekt aus. Dieses Phänomen wurde in der vorliegenden Arbeit an dem hoch immunogenen Dünndarm untersucht. Diese Studie war dabei nicht nur unter immunologischen Gesichtspunkten von Bedeutung. So stellt die simultane Leber- / Dünndarmtransplantation für Patienten, die an einer Leberzirrhose infolge eines Kurzdarmsyndrom leiden, eine erfolgversprechende Therapieoption dar. Zur experimentellen Analyse dieser speziellen Transplantationsform existierte aber in der Ratte bisher kein vergleichbares Modell. In der vorliegenden Arbeit wird daher erstmalig ein Modell etabliert, in dem – orientiert an den Verhältnissen beim Menschen – Leber (arterialisiert) und Dünndarm simultan und orthotop transplantiert werden. Mittels kurzfristiger Immunsuppression wurde bei allogener Transplantation hier nicht nur Akzeptanz sondern Toleranz erreicht und mittels Indikator-Herz- und Hauttransplantation überprüft. Die dazu benötigte immunsuppressive Dosis unterschritt dabei die für eine erfolgreiche isolierte Dünndarmtransplantation notwendige Immunsuppression erheblich. Dieser Toleranzentwicklung geht eine zeitlich begrenzte Abstoßungsreaktion voraus. Die daran beteiligten zellulären Mechanismen wurden durch sequentielle Immunhistologie dargestellt. Während dieser Abstoßung sammeln sich überdurchschnittlich viele apoptotische T-Lymphozyten, hauptsächlich CD8+ Zellen, im Lebertransplantat, nicht aber im transplantierten Dünndarm an. Dieses Phänomen konnte mittels einer neu etablierten Doppelfärbung dargestellt werden. Apoptoseinduktion in alloreaktiven T-Zellen könnte einer der Mechanismen sein, die den immunsuppressiven Effekt des Lebertransplantates erklären und den gleichzeitig transplantierten Dünndarm vor seiner Abstoßung bewahren.
N2  - Following transplantation, the liver modifies not only the immune response of the recipient towards herself but also protects a co-transplanted organ against rejection. Using a rat transplantation model and performing combined liver-/ small bowel transplantation, this phenomenon was investigated in this study. Currently, the simultaneous transplantation of those two organs is the only available treatment for patients with liver cirrhosis after short bowel syndrome. Up until now, no sufficient experimental animal model representing this specific situation was existing. In our study we were able to establish for the first time such a model – where liver and small bowel are transplanted simultaneously and into orthotopic positions. By using short term immunosuppression allogeneic transplantation we were able to achieve not only acceptance but tolerance to the grafts. This was proven by indicator heart and skin transplantation. The necessary dosage of immunosuppressive agents was significantly lower then the dosage used in isolated small bowel transplantation. Previous to tolerance, a limited rejection crisis took place. This process was analysed by immunohistological staining of the involved cell populations. During this rejection crisis we found an accumulation of apoptotic lymphocytes (mainly CD8+) in the transplanted liver but not in the simultaneously transplanted small bowel. This phenomenon was further analysed with a newly established double staining method. The induction of apoptotic cell death in alloreactive T-cells within the liver graft could be a possible mechanism explaining the immunoprotective effect of the liver transplant towards the simultaneously transplanted small bowel.
KW  - Leber und Dünndarmtransplantation
KW  - Apoptose
KW  - Toleranz
KW  - Liver and Small Bowel Transplantation
KW  - Apoptosis
KW  - Tolerance
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2897
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wang, Dapeng
T1  - The mechanism of glucocorticoid induced murine thymocyte and peripheral T cell apoptosis
T1  - Der Mechanismus der Apoptose von Glukocorticoid-induzierten murinen Thymozyten und peripherischen T-Zellen
N2  - Glucocordicoide sind kleine lipophile Verbindungen, die viele biologische Effekte verursachen, wenn sie an den intrazellulären Glukokortikoidrezeptor (GR) binden. Dieser wandert wiederum in den Nucleus, um dort direkt oder indirekt die Transkription der Gene zu regulieren. Glukokortikoide sind der Grundstein in der Behandlung für eine Anzahl von hämatologischen bösartigen Erkrankungen, wie Leukämie, Lymphome und Myelome. In der Literatur wird beschrieben, dass Glukokortikoide über die Vermittlung von Apoptose wirken.die Wirkung. Trotz der enormen Fortschritte im Verständnis des regulierten Zelltodes, ist der genaue Mechanismus, den Glukokortikoide bei der Apoptose vermitteln, unbekannt. Die Daten, die bis jetzt erzielt wurden, deuten stark darauf hin, dass Gentransaktivierung durch den GR für den Beginn der durch Glukokortikoide verursachten Thymozytenapoptose verantwortlich ist. Außerdem wurde gezeigt, dass das multikatalytische Proteasom, einige Mitglieder der BCL2-Familie, Änderungen im Kalziumfluss sowie Caspasen eine wichtige Rolle in der Durchführungsphase des durch Glukokortikoide vermittelten Zelltodes spielen Jedoch ist die genaue Reihenfolge dieses Prozesses bisher nicht bekannt. Ein Hauptschwierigkeit der gegenwärtigen Diskussion entsteht aus der Tatsache, dass unterschiedliche Zellarten, wie Thymozyten, reife T-Zellen und Lymphomzellen verglichen werden, ohne ihre unterschiedlichen Eigenschaften und Genexpressionsprofile zu beachten. Obwohl angenommen wird, dass Glukokortikoide Apoptose über einen konservierten Mechanismus, wird dies nicht durch irgendwelche Daten unterstützt. In anderen Worten, es ist möglich, dass Apoptose in Thymozyten, reifen T-Zellen und Lymphomzellen über unterschiedliche Signalwege vermittelt wid. Wir fragten uns daher, ob ein einzelner durch Glukokoritkoide eingeleiteter Signaltransduktionsweg dafür verantwortlich ist, dass Apoptose in allen T-Lamphozytenarten eingeleitet wird, oder ob noch andere Signalwege existieren. Daher verglichen wir die Rolle des Proteasomes, verschiedener Caspasen, des lysosomalen Kompartements und anderer Faktoren in der durch Glukokortikoide induzierten Apoptose in Mausthymozyten und pepripheren T-Zellen sowie T-ALL Lymphomzellen. Unsere Entdeckungen zeigen, dass die Anfangsphase der durch Glukokortikoide induzierten Apoptose unabhängig von der Differenzierungsstadien der Zelle ist. Apoptose wird sowohl in Thymozyten als auch in reifen T-Zellen durch den GR vermittelt und ist von der Gentranskription abhängig. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die Durchführungsphase erheblich in ihren Anforderungen für eine Anzahl von Signaltransduktionskomponenten zwischen Thymozyten und peripheren T-Zellen. Während in Thymozyten das Proteasom, die Caspasen 3, 8 und 9 sowie Cathepsin B eine wichtige Rolle in durch Glukokortikoide induzierten Zelltod spielen, sind diese Faktoren für die Induktion des Zell-Todes in peripheren T- Zellen entbehrlich. Im Gegensatz dazu scheinen Änderungen in der Expression und intrazellulären Lokalisation von Mitgliedern der Bcl-2 Familie nicht zum durch Glukokortikoide induzierten Zellltod beitzutragen, egal um welchen Zelltyp es sich handelt. Wir haben beobachtet, dass eine Behandlung von Thymozyten mit Glukokortikoiden zu einer Aktivierung der lysosomalen Protease Cathepsin B führt. Dies ist ein essentieller Schritt zur Einleitung von Apoptose durch Glukortikoide und zeigt zum ersten Mal, dass der lysosomale Amplifikationsloop in diesen Prozess involviert ist. Die Analyse des durch Glukokortikoide induzierten Zelltodes in verschiedenen T-ALL Zelllinien deutet darauf hin, dass die durch Glukokortikoide induzierten Signalwege in Thymozyten und allen Lymphonzelllinien aber nicht in peripheren T Zellen übereinstimmen. Da die hoch-dosierte Glukokortikoidbehandlung eine wichtige Rolle in der Behandlung von hematologischen bösartigen Erkrankungen spielt, können unsere Beobachtungen eine Grundlage für eine neue Anti-Krebs-Stragie bilden, die darauf ausgelegt ist, spezifisch Tumorzellen zu eliminieren aber reife T-Zellen unberührt lassen.
N2  - Glucocorticoids (GCs) are small lipophilic compounds that mediate a plethora of biological effects by binding to the intracellular glucocorticoid receptor (GR) which, in turn, translocates to the nucleus and directly or indirectly regulates gene transcription. GCs remain the cornerstone in the treatment for a number of hematological malignancies, including leukemia, lymphoma and myeloma. Extensive literature suggests that the efficacy of GCs stems from their ability to mediate apoptosis. Despite the enormous strides made in our understanding of regulated cell death, the exact mechanism by which GCs cause apoptosis is still unknown. The data obtained so far provide strong evidence that gene transactivation by the GR underlies the initiation phase of GC-induced thymocyte apoptosis. Furthermore, the multicatalytic proteasome, several members of the Bcl-2 family, changes in calcium flux as well as caspases have been identified as important players in the execution phase of GC-mediated cell death. However, the exact sequence of events in this process still remains elusive. A major problem of the current discussion arises from the fact that different cell types, such as thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells are compared without acknowledging their different characteristics and gene expression profiles. Although it is generally assumed that GCs induce apoptosis via a conserved mechanism, this is not supported by any data. In other words, it is possible that thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells may undergo cell death along different pathways. We therefore wondered whether a unique signal transduction pathway is engaged by GCs to initiate and execute cell death in all types of T lymphocytes or whether distinct pathways exist. Therefore, we compared the role of the proteasome, various caspases, the lysosomal compartment and other factors in GC-induced apoptosis of murine thymocytes and peripheral T cells as well as T-ALL lymphoma cells. Our findings show that the initiation phase of GC-induced apoptosis is similar irrespective of the differentiation state of the cell. Apoptosis in both thymocytes and peripheral T cells is mediated by the GR and depends on gene transcription. In contrast, the execution phase significantly differs between thymocyte and peripheral T cells in its requirement for a number of signal transduction components. Whilst in thymocytes, the proteasome, caspases 3, 8 and 9 as well as cathepsin B play an important role in GC-induced apoptosis, these factors are dispensable for the induction of cell death in peripheral T cells. In contrast, changes in the expression and intracellular location of Bcl-2 family members do not appear to contribute to GC-induced apoptosis in either cell type. Importantly, our observation that GC treatment of thymocytes leads to an activation of the lysosomal protease cathepsin B and that this is an essential step in the induction of cell death by GCs, is the first indication that a lysosomal amplification loop is involved in this process. Analysis of GC-induced apoptosis in several T-ALL cell lines further indicates that the signaling pathway induced by GCs in thymocytes but not in peripheral T cells is shared by all lymphoma cell-types analyzed. Given the therapeutic importance of high-dose GC-therapy for the treatment of hematological malignancies, this finding could potentially form a basis for new anti-cancer strategies in the future, which specifically target tumor cells whilst leaving peripheral T cells of patients untouched.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Apoptosis
KW  - Glucocorticosteroide
KW  - Glukocorticioid
KW  - Mechanismus
KW  - Apoptose
KW  - Thymozyten
KW  - T-zellen
KW  - glucocorticoid
KW  - mechanism
KW  - apoptosis
KW  - thymocyte
KW  - T cell
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17317
ER  -