TY - THES A1 - Schreiber, Benjamin T1 - Selective and enhanced fluorescence by biocompatible nanocoatings to monitor G-protein-coupled receptor dynamics T1 - Selektive und verstärkte Fluoreszenz durch biokompatible Nanobeschichtungen zur Untersuchung von G-protein-gekoppelten Rezeptoren und ihrer Dynamik N2 - Fluorescence microscopy has become one of the most important techniques for the imaging of biological cells and tissue, since the technique allows for selective labeling with fluorescent molecules and is highly suitable for low-light applications down to the single molecule regime. The methodological requirements are well-defined for studying membrane receptors within a highly localized nanometer-thin membrane. For example, G-protein-coupled receptors (GPCRs) are an extensively studied class of membrane receptors that represent one of the most important pharmaceutical targets. Ligand binding and GPCR activation dynamics are suspected to take place at the millisecond scale and may even be far faster. Thus, techniques that are fast, selective, and live-cell compatible are required to monitor GPCR dynamics. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) are methods of choice to monitor the dynamics of GPCRs selectively within the cell membrane. Despite the remarkable success of these modalities, there are limitations. Most importantly, inhomogeneous illumination can induce imaging artifacts, rendering spectroscopic evaluation difficult. Background signal due to scattering processes or imperfect labeling can hamper the signal-to-noise, thus limiting image contrast and acquisition speed. Careful consideration of the internal physiology is required for FRET sensor design, so that ligand binding and cell compatibility are well-preserved despite the fluorescence labeling procedures. This limitation of labeling positions leads to very low signal changes in FRET-based GPCR analysis. In addition, microscopy of these systems becomes even more challenging in single molecule or low-light applications where the accuracy and temporal resolution may become dramatically low. Fluorescent labels should therefore be brighter, protected from photobleaching, and as small as possible to avoid interference with the binding kinetics. The development of new fluorescent molecules and labeling methods is an ongoing process. However, a complete characterization of new labels and sensors takes time. So far, the perfect dye system for GPCR studies has not been found, even though there is high demand. Thus, this thesis explores and applies a different approach based on improved illumination schemes for TIRF-M as well as metal-coated coverslips to enhance fluorescence and FRET efficiency. First, it is demonstrated that a 360° illumination scheme reduces typical TIRF artifacts and produces a much more homogenously illuminated field of view. Second, membrane imaging and FRET spectroscopy are improved by metal coatings that are used to modulate the fluorescent properties of common fluorescent dyes. Computer simulation methods are used to understand the underlying photophysics and to design the coatings. Third, this thesis explores the operational regime and limitations of plasmonic approaches with high sectioning capabilities. The findings are summarized by three publications that are presented in the results section of this work. In addition, the theory of fluorescence and FRET is explained, with particular attention to its emission modulations in the vicinity of metal-dielectric layers. Details of the instrumentation, computer simulations, and cell culture are described in the method section. The work concludes with a discussion of the findings within the framework of recent technological developments as well as perspectives and suggestions for future approaches complete the presented work. N2 - Die Fluoreszenzmikroskopie ist zu einer der wichtigsten Techniken für die Bildgebung biologischer Zellen und Gewebe geworden, da die Technik eine selektive Markierung mit fluoreszierenden Molekülen ermöglicht und sich hervorragend für Anwendungen bei schwachem Licht bis hin zum Einzelmolekül-Regime eignet. Die methodischen Anforderungen sind gut definiert, um Membranrezeptoren innerhalb einer stark lokalisierten nanometerdünnen Membran zu untersuchen. Zum Beispiel sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine ausführlich untersuchte Klasse von Membranrezeptoren, weil diese wichtige pharmazeutische Ziele darstellen. Es wird vermutet, dass die Ligandenbindungs- und GPCR-Aktivierungsdynamiken im Millisekundenbereich stattfinden und sogar viel schneller sein können. Daher sind Techniken erforderlich, die schnell, selektiv und lebend-Zell kompatibel sind, um die GPCR-Dynamik zu aufzunehmen. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) und internale Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF-M) sind Methoden der Wahl, um die Dynamik von GPCRs selektiv innerhalb der Zellmembran zu untersuchen. Trotz des bemerkenswerten Erfolgs dieser Modalitäten gibt es Einschränkungen. Am wichtigsten ist, dass eine inhomogene Beleuchtung Artefakte erzeugen kann, welche die spektroskopische Auswertung erschweren. Hintergrundsignale aufgrund von Streuprozessen oder unvollständiger Markierung können das Signal-Rausch-Verhältnis beeinträchtigen und somit den Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit begrenzen. Eine sorgfältige Berücksichtigung der internen Physiologie ist für das Design der FRET-Sensoren ist erforderlich, so dass die Ligandenbindung und die Zellkompatibilität trotz der Fluoreszenzmarkierungsverfahren nicht gestört werden. Diese Einschränkung der Markierungspositionen führt zu sehr geringen Signalkontrast in der FRET-basierten GPCR-Analyse. Darüber hinaus wird die Mikroskopie dieser Systeme bei Einzelmolekül- oder Schwachlichtanwendungen, bei denen die Genauigkeit und die zeitliche Auflösung dramatisch niedrig werden können, noch schwieriger. Fluoreszierende Marker sollten daher heller, vor Photobleichung geschützt und so klein wie möglich sein, um Störungen mit der Rezeptorkinetik zu vermeiden. Die Entwicklung neuer fluoreszierender Moleküle und Markierungsmethoden ist ein fortlaufender Prozess. Eine vollständige Charakterisierung neuer Marker und Sensoren benötigt jedoch Zeit. Bis jetzt wurde das perfekte Farbstoffsystem für GPCR-Studien noch nicht gefunden, auch wenn es eine hohe Nachfrage dafür gibt. Daher wird ein anderer Ansatz auf der Grundlage verbesserter Beleuchtungsschemata für TIRF-M sowie metallbeschichtete Deckgläser zur Verbesserung der Fluoreszenz- und FRET-Effizienz untersucht. Zunächst wird gezeigt, dass ein 360 ° Beleuchtung typische TIRF-Artefakte reduziert und ein wesentlich homogeneres Bildausleuchtung erzeugt. Zweitens wurde durch die Modulation der Fluoreszenzeigenschaften gängiger Fluoreszenzfarbstoffe die Membranbildgebung und FRET-Spektroskopie verbessert. Computersimulationsmethoden werden verwendet, um die zugrundeliegende Photophysik zu verstehen und zielgerichtet Beschichtungen zu entwerfen. Drittens wurden das operationelle Regime und die Grenzen von plasmonischen Ansätzen mit noch höheren Signalselektiverung untersucht. Die Ergebnisse sind in drei Publikationen zusammengefasst, die im Ergebnisteil dieser Arbeit vorgestellt werden. Darüber hinaus wird die Theorie der Fluoreszenz und des FRET unter besonderer Berücksichtigung ihrer Emissionsmodulationen in der Nähe von Metall-Dielektrikum-Schichten erläutert. Details der Instrumentierung, Computersimulationen und Zellkultur werden im Abschnitt Methoden beschrieben. Die Arbeit schließt mit einer Diskussion der Ergebnisse im Rahmen der jüngsten technologischen Entwicklungen sowie mit Perspektiven und Vorschlägen für zukünftige Ansätze, die die vorliegende Arbeit abrunden. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Fluorescence KW - Microscopy KW - Plasmonic KW - Fluorescence Resonance Energy Transfer KW - G Protein-Coupled Receptors KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluorescence Microscopy Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173923 ER - TY - THES A1 - Chowdhury, Suvagata Roy T1 - The Role of MicroRNAs in \(Chlamydia\) Infection T1 - Die Rolle von MicroRNAs in der Chlamydien-Infektion N2 - The obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis is the causative agent of trachoma related blindness and the sexually transmitted pelvic inflammatory disease. Being an obligate intracellular pathogen, C. trachomatis has an intricate dependency on the survival of the host cell. This relationship is indispensible owing to the fact that the pathogen spends a considerable fraction of its biphasic lifecycle within a cytoplasmic vacuole inside the host cell, the so-called chlamydial inclusion. The cellular apoptotic-signalling network is governed by several finely tuned regulatory cascades composed of pro- and anti-apoptotic proteins that respond to changes in the cellular homeostasis. In order to facilitate its intracellular survival, Chlamydia has been known to inhibit the premature apoptosis of the host cell via the stabilization of several host anti-apoptotic proteins such as cIAP2 and Mcl-1. While the pro- and anti-apoptotic proteins are the major regulators of the host apoptotic signalling network, a class of the small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) has increasingly gained focus as a new level of regulatory control over apoptosis. This work investigates the changes in the host miRNA expression profile post Chlamydia infection using a high throughput miRNA deep sequencing approach. Several miRNAs previously associated with the modulation for apoptotic signalling were differentially expressed upon Chlamydia infection in human endothelial cells. Of the differentially regulated miRNAs, miR-30c-5p was of particular interest since it had been previously shown to target the tumor suppressor protein p53. Our lab and others have previously demonstrated that Chlamydia can downregulate the levels of p53 by promoting its proteasomal degradation. This work demonstrates that Chlamydia infection promotes p53 downregulation by increasing the abundance of miR-30c-5p and a successful infection cycle is hindered by a loss of miR-30c-5p. Over the last decade, dedicated research aimed towards a better understanding of apoptotic stimuli has greatly improved our grasp on the subject. While extrinsic stress, deprivation of survival signals and DNA damage are regarded as major proponents of apoptotic induction, a significant responsibility lies with the mitochondrial network of the cell. Mitochondrial function and dynamics are crucial to cell fate determination and dysregulation of either is decisive for cell survival and pathogenesis of several diseases. The ability of the mitochondrial network to perform its essential tasks that include ATP synthesis, anti-oxidant defense, and calcium homeostasis amongst numerous other processes critical to cellular equilibrium is tied closely to the fission and fusion of individual mitochondrial fragments. It is, thus, 8 unsurprising that mitochondrial dynamics is closely linked to apoptosis. In fact, many of the proteins involved regulation of mitochondrial dynamics are also involved in apoptotic signalling. The mitochondrial fission regulator, Drp1 has previously been shown to be transcriptionally regulated by p53 and is negatively affected by a miR- 30c mediated inhibition of p53. Our investigation reveals a significant alteration in the mitochondrial dynamics of Chlamydia infected cells affected by the loss of Drp1. We show that loss of Drp1 upon chlamydial infection is mediated by the miR-30c-5p induced depletion of p53 and results in a hyper-fused architecture of the mitochondrial network. While it is widely accepted that Chlamydia depends on the host cell metabolism for its intracellular growth and development, the role of mitochondria in an infected cell, particularly with respect to its dynamic nature, has not been thoroughly investigated. This work attempts to illustrate the dependence of Chlamydia on miR-30c-5p induced changes in the mitochondrial architecture and highlight the importance of these modulations for chlamydial growth and development. N2 - Das Gram-negative Humanpathogen Chlamydia trachomatis versursacht das Trachom, eine ansteckende follikuläre Bindehautentzündung, die letztlich zur Erblindung Infizierter führt, sowie sexuell übertragbare Entzündungen im Urogenitaltrakt. C. trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Bakterium mit einem biphasischen Lebenszyklus, der in einer spezialisierten Vakuole innerhalb des Wirtszellzytoplasmas durchlaufen wird, der sogenannten Chlamydien-Inklusion. C. trachomatis ist daher davon abhängig, dass die infizierte Wirtszelle überlebt, bis die Entwicklung des Erregers abgeschlossen ist und moduliert dazu das apoptotische Signalnetzwerk der Wirtszelle. Dieses besteht aus mehreren fein aufeinander abgestimmten regulatorischen Kaskaden aus pro- und anti- apoptotischen Proteinen, die normalerweise auf Veränderungen in der zellulären Homöostase reagieren und als Folge den programmierten Zelltod einleiten können. Es ist jedoch bekannt, dass Chlamydia die Apoptose der Wirtszelle durch Stabilisierung mehrerer anti-apoptotischer Wirtsproteine wie cIAP2 und Mcl-1 inhibiert. Während pro- und anti-apoptotische Proteine Hauptregulatoren des Apoptosesignalnetzwerks darstellen, wurde kürzlich eine neue Ebene der Apoptose- Regulation identifiziert, die durch kleine, nicht-kodierende microRNAs (miRNAs) gesteuert wird. In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich die Veränderungen in dem miRNA Expressionsprofil von Wirtszellen nach einer Chlamydieninfektion. Mittels miRNA deep sequencing wurden dabei mehrere miRNAs identifiziert, die abhängig von der Infektion mit Chlamydia differentiell in menschlichen Endothelzellen exprimiert werden und deren Funktion mit der Modulation der Apoptose-Signalwege assoziiert sind. Dabei war miR-30c-5p von besonderem Interesse, da deren molekulares target das Tumorsuppressorprotein p53 ist. Unter anderem durch unser Labor wurde dabei bereits gezeigt, dass Chlamydia den Proteasom-vermittelten Abbau von p53 fördert und somit die Menge des Proteins in der Wirtszelle depletieren kann. In der hier vorliegenden Arbeit zeige ich darüberhinaus, dass eine Chlamydia-Infektion die p53 Mengen in den Wirtszellen senkt, indem miR-30c-5p verstärkt produziert wird, während das intrazelluläre Wachstum von C. trachomatis durch den Verlust von miR- 30c-5p inhibiert wird. Zusammen mit den apoptotischen Regulationskaskaden entscheiden auch die Integrität der Mitochondrien sowie die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks über das Schicksal der Zelle. Eine Dysregulation dieser Funktionen führt zur Einleitung des Zelltods und bildet die Grundlage der Pathogenese mehrerer Krankheiten. Zu den wesentlichen Aufgaben des mitochondrialen Netzwerkes gehören, neben zahlreichen anderen, die Synthese von ATP, die Detoxifizierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies sowie die Kalziumhomöostase. Die funktionelle Integrität des mitochondrialen Netzwerks ist dabei stark von Teilungs- und Fusionsraten mitochondrialer Fragmente abhängig und diese mitochondriale Dynamik ist wiederum eng mit der Apoptose verknüpft; so sind etwa viele Proteine, welche die mitochondriale Dynamik regulieren, auch an der apoptotischen Signalgebung beteiligt. Zum Beispiel wird die Transkription des an der Mitochondrienteilung beteiligten Proteins Drp1 durch p53 reguliert und eine miR-30c-vermittelte Inhibition von p53 senkt daher die Menge an Drp1 in der Zelle. In der hier vorliegenden Arbeit demonstriere ich die signifikante Veränderung der mitochondrialen Dynamik in menschlichen Zellen nach einer Chlamydieninfektion. Die entstehende hyperkondensierte Architektur des mitochondrialen Netzwerks ist dabei auf den Verlust von Drp1 zurückzuführen, welcher durch die miR-30c-5p- induzierte Depletion von p53 vermittelt wird. Während die Abhängigkeit des intrazellulären Wachstums von Chlamydia vom Stoffwechsel der Wirtszelle weitgegen akzeptiert ist, wurde die Rolle der Mitochondrien und die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks in infizierten Zellen bisher vernachlässigt. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal die Abhängigkeit von Chlamydia auf miR- 30c-5p induzierte Veränderungen in der mitochondrialen Architektur illustriert. KW - Chlamydia KW - MicroRNAs KW - Mitochondria KW - Microscopy KW - Chlamydienkrankheit KW - miRNS KW - Mitochondrium KW - Mikroskopie Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155866 ER - TY - THES A1 - van Eeuwijk, Judith Martina Maria T1 - Studies on thrombopoiesis and spleen tyrosine kinase-mediated signaling in platelets T1 - Untersuchungen der Thrombopoese und der spleen tyrosine kinase-vermittelten Signaltransduktion in Thrombozyten N2 - In mammals, anucleate blood platelets are constantly produced by their giant bone marrow (BM) progenitors, the megakaryocytes (MKs), which originate from hematopoietic stem cells. Megakaryopoiesis and thrombopoiesis have been studied intensively, but the exact mechanisms that control platelet generation from MKs remain poorly understood. Using multiphoton intravital microscopy (MP-IVM), thrombopoiesis and proplatelet formation were analyzed in the murine BM in real-time and in vivo, identifying an important role for several proteins, including Profilin1, TRPM7 and RhoA in thrombopoiesis. Currently, it is thought that blood cell precursors, such as MKs, migrate from the endosteal niche towards the vascular niche during maturation. In contrast to this paradigm, it was shown that MKs are homogeneously distributed within the dense BM blood vessel network, leaving no space for vessel-distant niches. By combining results from in vivo MP-IVM, in situ light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) of the intact BM as well as computational simulations, surprisingly slow MK migration, limited intervascular space and a vessel-biased MK pool were revealed, contradicting the current concept of directed MK migration during thrombopoiesis. Platelets play an essential role in hemostasis and thrombosis, but also in the pathogenesis of ischemic stroke. Ischemic stroke, which is mainly caused by thromboembolic occlusion of brain arteries, is among the leading causes of death and disability worldwide with limited treatment options. The platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI is a key player in arterial thrombosis and a critical determinant of stroke outcome, making its signaling pathway an attractive target for pharmacological intervention. The spleen tyrosine kinase (Syk) is an essential signaling mediator downstream of GPVI, but also of other platelet and immune cell receptors. In this thesis, it was demonstrated that mice lacking Syk specifically in platelets are protected from arterial thrombus formation and ischemic stroke, but display unaltered hemostasis. Furthermore, it was shown that mice treated with the novel, selective and orally bioavailable Syk inhibitor BI1002494 were protected in a model of arterial thrombosis and had smaller infarct sizes and a significantly better neurological outcome 24 h after transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO), also when BI1002494 was administered therapeutically, i.e. after ischemia. These results provide direct evidence that pharmacological Syk inhibition might become a safe therapeutic strategy. The T cell receptor  chain-associated protein kinase of 70 kDA (Zap-70) is also a spleen tyrosine kinase family member, but has a lower intrinsic activity compared to Syk and is expressed in T cells and natural killer (NK) cells, but not in platelets. Unexpectedly, arterial thrombus formation in vivo can occur independently of Syk kinase function as revealed by studies in Sykki mice, which express Zap-70 under the control of intrinsic Syk promoter elements. N2 - In Säugetieren werden kernlose Thrombozyten durch ihren riesigen Knochenmark- (KM-) Vorläuferzellen, die Megakaryozyten (MK), die von hämatopoetischen Stammzellen stammen, ständig produziert. Megakaryopoese und Thrombopoese wurden schon intensiv untersucht, aber die genauen Mechanismen, die die Thrombozytenproduktion aus MK kontrollieren, bleiben weitgehend unverstanden. Mittels Multiphotonen-Intravitalmikroskopie (MP-IVM) wurden Thrombopoese und Proplättchenbildung im murinen KM in Echtzeit in vivo untersucht. Dadurch wurde eine wichtige Rolle für die Proteine Profilin1, TRPM7 und RhoA in der Thrombopoese identifiziert. Derzeit wird angenommen, dass Blutzellvorläufer, wie MK, während der Reifung von der endostalen Nische in Richtung der Gefäßnische migrieren. Im Gegensatz zu diesem Paradigma wurde hier gezeigt, dass MK homogen innerhalb des dichten KM Blutgefäßnetzes verteilt sind, so dass kein Raum für Gefäß-ferne Nischen besteht. Durch Ergebnisse von in vivo MP-IVM, in situ Licht-Blatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) des intakten KM sowie Computersimulationen wurden eine überraschend langsame MK-Migration, ein begrenzter intervaskulärer Raum und eine asymmetrische MK-Verteilung gezeigt, was im Widerspruch zum derzeitig akzeptierten Konzept der gerichteten MK-Migration während der Thrombopoese steht. Die Thrombozyten spielen eine wesentliche Rolle nicht nur bei der Hämostase und Thrombose, sondern auch in der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Der ischämische Schlaganfall, der vor allem durch einen thromboembolischen Verschluss von Gehirnarterien verursacht wird, ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und Behinderung weltweit und die Behandlungsmöglichkeiten sind sehr eingeschränkt. Der thrombozytäre Kollagenrezeptor Glykoprotein (GP) VI ist ein wichtiger Faktor in der arteriellen Thrombose und trägt entscheidend zur Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls bei, sodass dessen Signalweg ein attraktives Ziel für pharmakologische Interventionen darstellen könnte. Die spleen tyrosine kinase (Syk) ist ein wichtiges Molekül im GPVI-Signalweg, aber auch in den Signalkaskaden von anderen Thrombozyten- und Immunzellrezeptoren. Es wurde nachgewiesen, dass Mäuse mit einer thrombozytären Syk-Defizienz, vor arterieller Thrombusbildung und ischämischem Schlaganfall geschützt sind, aber unveränderte Hämostase zeigen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Mäuse, die mit dem neuartigen, selektiven und oral bioverfügbaren Syk-Inhibitor BI1002494 behandelt wurden, geschützt sind in einem Modell der arteriellen Thrombose. Auch hatten sie kleinere Infarkte und eine deutlich bessere neurologische Funktion 24 Stunden nach der transienten Arteria cerebri media Okklusion (tMCAO), auch wenn BI1002494 therapeutisch, d.h. nach der Ischämie, verabreicht wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die pharmakologische Hemmung von Syk eine sichere therapeutische Strategie bei Schlaganfall sein könnte. Der T-Zell Rezeptor -chain-associated protein kinase of 70 kDa (Zap-70) ist auch ein spleen tyrosine kinase-Familienmitglied, hat aber eine geringere intrinsische Aktivität im Vergleich zu Syk und wird in T-Zellen und natural killer (NK) Zellen exprimiert, nicht aber in Thrombozyten. Studien in Sykki Mäusen, die unter der Kontrolle der intrinsischen Syk Promotorelemente Zap-70 exprimieren, ergaben, dass die arterielle Thrombusbildung in vivo unabhängig von der Syk-Kinasefunktion stattfinden kann. KW - Thrombose KW - Megakaryozyt KW - Thrombopoese KW - Mikroskopie KW - Hämostase KW - Thrombosis KW - Megakaryocyte KW - Hemostasis KW - Microscopy KW - Thrombopoiesis KW - Platelet KW - Ischemic stroke KW - Spleen tyrosine kinase Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142933 ER -