TY - THES A1 - Cicova, Zdenka T1 - Characterization of a novel putative factor involved in host adaptation in Trypanosoma brucei T1 - Charakterisierung einer neuen Komponente für die Wirtsanpassung in Trypanosoma brucei N2 - Trypanosomes are masters of adaptation to different host environments during their complex life cycle. Large-scale proteomic approaches provide information on changes at the cellular level in a systematic way. However, a detailed work on single components is necessary to understand the adaptation mechanisms on a molecular level. Here we have performed a detailed characterization of a bloodstream form (BSF) stage-specific putative flagellar host adaptation factor (Tb927.11.2400) identified previously in a SILAC-based comparative proteome study. Tb927.11.2400 shares 38% amino acid identity with TbFlabarin (Tb927.11.2410), a procyclic form (PCF) stage specific flagellar BAR domain protein. We named Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) and demonstrate that it is a result of a gene duplication event, which occurred in African trypanosomes. TbFlabarinL is not essential for growth of the parasites under cell culture conditions and it is dispensable for developmental differentiation from BSF to the PCF in vitro. We generated a TbFlabarinL-specific antibody and showed that it localizes in the flagellum. The co-immunoprecipitation experiment together with a biochemical cell fractionation indicated a dual association of TbFlabarinL with the flagellar membrane and the components of the paraflagellar rod. N2 - Trypansomen zeigen sich im Laufe ihres komplexen Lebeszyklus als Meister der Adaption an verschiedene Umweltbedingungen ihrer Wirte. Umfangreiche proteomische Analysen geben systematisch Auskunft über Änderungen auf zellulärer Ebene. Detailierte Arbeit an einzelnen Komponenten ist jedoch nötig, um die Adaptionsmechanismen auf molekularer Ebene zu verstehen. Wir haben im Rahmen dieser Arbeit eine detaillierte Charakterisierung eines stadienspezifischen mutmaßlich flagellaren Wirtsadaptionsfaktors der Blutstromform (BSF) durchgeführt (Tb927.11.2400), der zuvor in einer SILAC-basierten vergleichenden Proteomstudie idendifiziert wurde. Tb927.11.2400 teilt 38% der mit TbFlabarin (Tb927.11.2410), eines stadienspezifischen flagellaren BAR- domänen Proteins der prozyklischen Form (PCF). Wir haben Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) genannt und zeigen, dass es das Ergebnis eines Genduplikations-Ereignisses darstellt, das in afrikanischen Trypanosomen aufgetreten ist. TbFlabarinL ist nicht essentiell für das Wachstum der Parasiten unter Zellkultur-Bedingungen und entbehrlich für den Differenzierungprozess von BSF zu PCF in vitro. Wir haben einen TbFlabarinL-spezifischen Antikörper entwickelt und zeigen, dass er in der Flagelle lokalisiert. Das Co-immunoprezipitations-Experiment deutet zusammen mit einer biochemischen Zellfraktionierung darauf hin, dass TbFlabarinL mit der flagellaren Membran und Komponenten der paraflagellaren Stab binär assoziiert ist. KW - Trypanosoma brucei KW - Wirt KW - Anpassung KW - stage specific regulation KW - Geißel KW - flagellum KW - Flabarin Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142462 ER - TY - JOUR A1 - Cicova, Zdenka A1 - Dejung, Mario A1 - Skalicky, Tomas A1 - Eisenhuth, Nicole A1 - Hanselmann, Steffen A1 - Morriswood, Brooke A1 - Figueiredo, Luisa M. A1 - Butter, Falk A1 - Janzen, Christian J. T1 - Two flagellar BAR domain proteins in Trypanosoma brucei with stage-specific regulation JF - Scientific Reports N2 - Trypanosomes are masters of adaptation to different host environments during their complex life cycle. Large-scale proteomic approaches provide information on changes at the cellular level, and in a systematic way. However, detailed work on single components is necessary to understand the adaptation mechanisms on a molecular level. Here, we have performed a detailed characterization of a bloodstream form (BSF) stage-specific putative flagellar host adaptation factor Tb927.11.2400, identified previously in a SILAC-based comparative proteome study. Tb927.11.2400 shares 38% amino acid identity with TbFlabarin (Tb927.11.2410), a procyclic form (PCF) stage-specific flagellar BAR domain protein. We named Tb927.11.2400 TbFlabarin-like (TbFlabarinL), and demonstrate that it originates from a gene duplication event, which occurred in the African trypanosomes. TbFlabarinL is not essential for the growth of the parasites under cell culture conditions and it is dispensable for developmental differentiation from BSF to the PCF in vitro. We generated TbFlabarinL-specific antibodies, and showed that it localizes in the flagellum. Co-immunoprecipitation experiments together with a biochemical cell fractionation suggest a dual association of TbFlabarinL with the flagellar membrane and the components of the paraflagellar rod. KW - parasite biology KW - protein translocation KW - Trypanosoma brucei Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181021 VL - 6 ER - TY - JOUR A1 - Kramer, Susanne A1 - Piper, Sophie A1 - Estevez, Antonio A1 - Carrington, Mark T1 - Polycistronic trypanosome mRNAs are a target for the exosome JF - Molecular and Biochemical Parasitology N2 - Eukaryotic cells have several mRNA quality control checkpoints to avoid the production of aberrant proteins. Intron-containing mRNAs are actively degraded by the nuclear exosome, prevented from nuclear exit and, if these systems fail, degraded by the cytoplasmic NMD machinery. Trypanosomes have only two introns. However, they process mRNA5 from long polycistronic precursors by trans-splicing and polycistronic mRNA molecules frequently arise from any missed splice site. Here, we show that RNAi depletion of the trypanosome exosome, but not of the cytoplasmic 5'-3' exoribonuclease XRNA or the NMD helicase UPF1, causes accumulation of oligocistronic mRNA5. We have also revisited the localization of the trypanosome exosome by expressing eYFP-fusion proteins of the exosome subunits RRP44 and RRP6. Both proteins are significantly enriched in the nucleus. Together with published data, our data suggest a major nuclear function of the trypanosome exosome in rRNA, snoRNA and mRNA quality control. KW - Trypanosoma brucei KW - Exosome KW - NMD KW - Polycistronic mRNA KW - trans-splicing KW - Trypanosomes Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191350 VL - 205 IS - 1-2 ER - TY - JOUR A1 - Reynolds, David A1 - Hofmeister, Brigitte T. A1 - Cliffe, Laura A1 - Alabady, Magdy A1 - Siegel, T. Nicolai A1 - Schmitz, Robert J. A1 - Sabatini, Robert T1 - Histone H3 Variant Regulates RNA Polymerase II Transcription Termination and Dual Strand Transcription of siRNA Loci in Trypanosoma brucei JF - PLoS Genetics N2 - Base J, β-D-glucosyl-hydroxymethyluracil, is a chromatin modification of thymine in the nuclear DNA of flagellated protozoa of the order Kinetoplastida. In Trypanosoma brucei, J is enriched, along with histone H3 variant (H3.V), at sites involved in RNA Polymerase (RNAP) II termination and telomeric sites involved in regulating variant surface glycoprotein gene (VSG) transcription by RNAP I. Reduction of J in T. brucei indicated a role of J in the regulation of RNAP II termination, where the loss of J at specific sites within polycistronic gene clusters led to read-through transcription and increased expression of downstream genes. We now demonstrate that the loss of H3.V leads to similar defects in RNAP II termination within gene clusters and increased expression of downstream genes. Gene derepression is intensified upon the subsequent loss of J in the H3.V knockout. mRNA-seq indicates gene derepression includes VSG genes within the silent RNAP I transcribed telomeric gene clusters, suggesting an important role for H3.V in telomeric gene repression and antigenic variation. Furthermore, the loss of H3.V at regions of overlapping transcription at the end of convergent gene clusters leads to increased nascent RNA and siRNA production. Our results suggest base J and H3.V can act independently as well as synergistically to regulate transcription termination and expression of coding and non-coding RNAs in T. brucei, depending on chromatin context (and transcribing polymerase). As such these studies provide the first direct evidence for histone H3.V negatively influencing transcription elongation to promote termination. KW - RNA polymerase KW - Trypanosoma brucei KW - histone H3 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166738 VL - 12 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Vasquez Ospina, Juan Jose T1 - Development of tools for the study of gene regulation in Trypanosoma brucei T1 - Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung der Genregulation in Trypanosoma brucei N2 - The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the causal agent of sleeping sickness and besides its epidemiological importance it has been used as model organism for the study of many aspects of cellular and molecular biology especially the post-transcriptional control of gene expression. Several studies in the last 30 years have shown the importance of mRNA processing and stability for gene regulation. In T. brucei genes are unusually arranged in polycistronic transcription units (PTUs) and a coupled process of trans-splicing and polyadenylation produces the mature mRNAs. Both processes, mRNA processing and stability, cannot completely explain the control of gene expression in the different life cycle stages analyzed in T. brucei so far. In recent years, the relevance of expression regulation at the level of translation has become evident in other eukaryotes. Therefore, in the first part of my thesis I studied the impact of translational regulation by means of a genome-wide ribosome profiling approach. My data suggest that translational efficiencies vary between life cycle stages of the parasite as well as between genes within one life cycle stage. Furthermore, using ribosome profiling I was able to identify many new putative un-annotated coding sequences and to evaluate the coding potential of upstream open reading frames (uORF). Comparing my results with previously published proteomic and RNA interference (RNAi) target sequencing (RIT-seq) datasets allowed me to validate some of the new coding sequences and to evaluate their relevance for the fitness of the parasite. In the second part of my thesis I used the transcriptomic and translatomic profiles obtained from the ribosome profiling analysis for the identification of putative non-coding RNAs (ncRNAs). These results led to the analysis of the coding potential in the regions upstream and downstream of the expressed variant surface glycoprotein (VSG), which is outlined in the third part of the results section. The region upstream of the VSG, the co-transposed region (CTR), has been implicated in an increase of the in situ switching rate upon its deletion. The ribosome profiling results indicated moderate transcription but not translation in this region. These results raised the possibility that the CTR may be transcribed into ncRNA. Therefore, in the third part of my thesis, I performed a primary characterization of the CTR-derived transcripts based on northern blotting and RACE. The results suggested the presence of a unique transcript species of about 1,200 nucleotides (nt) and polyadenylated at the 3’-end of the sequence. The deletion of the CTR sequence promoting and increase of the in situ switching rates was performed around 20 years ago by means of inserting reporter genes. With the recent development of endonuclease-based tools for genome editing, it is now possible to delete sequences in a marker-free way. In the fourth part of my thesis, I show the results on the implementation of the highly efficient genome-editing CRISPR-Cas9 system in T. brucei using episomes. As a proof of principle, I inserted the sequence coding for the enhanced green fluorescent protein (eGFP) at the end of the SCD6 coding sequence (CDS). Fluorescent cells were observed as early as two days after transfection. Therefore, after the successful set up of the CRISPR-Cas9 system it will be possible to modify genomic regions with more relevance for the biology of the parasite, such as the substitution of codons present in gene tandem arrays. The implementation of ribosome profiling in T. brucei opens the opportunity for the study of translational regulation in a genome-wide scale, the re-annotation of the currently available genome, the search for new putative coding sequences, the detection of putative ncRNAs, the evaluation of the coding potential in uORFs and the role of unstranslated regions (UTRs) in the regulation of translation. In turn, the implementation of the CRISPR-Cas9 system offers the possibility to manipulate the genome of the parasite at a nucleotide resolution and without the need of including resistant makers. The CRISPR-Cas9 system is a powerful tool for editing ncRNAs, UTRs, multicopy gene families and CDSs keeping their endogenous UTRs. Moreover, the system can be used for the modification of both alleles after just one round of transfection and of codons coding for amino acids carrying post-translational modifications (PTMs) among other possibilities.     N2 - Trypanosoma brucei ist nicht nur als Erreger der Schlafkrankheit von großer epidemiologischer Bedeutung, sondern dient auch der Zell-­‐ und Molekularbiologie – insbesondere zur Erforschung der Genregulation auf posttranskriptionaler Ebene – als wichtiger Modellorganismus. In den vergangenen 30 Jahren konnten mehrere Forschungsarbeiten zeigen, dass mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung maßgeblich zur Regulation der Genexpression beitragen. Anders als in den meisten Eukaryoten sind die Gene in T. brucei in polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTUs) angeordnet. Die reife mRNA entsteht aus dem polycistronischen Transkript in einem gekoppelten Prozess aus Trans-­‐splicing und paralleler Polyadenylierung. Beide Vorgänge allein, mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung, reichen nicht aus, um die Regulation der Genexpression in T. brucei vollständing zu erklären und zusätzliche Mechanismen müssen wirksam sein. Daher habe ich im ersten Teil meiner hier vorliegenden Doktorarbeit die Genregulation auf Ebene der Translation mittels genomweitem Ribosome Profiling untersucht. Die dabei gewonnen Daten deuten darauf hin, dass die Translationseffizienzen nicht nur zwischen prozyklischen-­‐ und Blutstromformen des Parasiten differieren, sondern auch die Gene innerhalb eines Stadiums verschieden effizient translatiert werden. Zudem war es mir mit diesem Ansatz möglich, neue, noch nicht annotierte kodierende Sequenzen zu identifizieren und das Kodierungspotenzial der jeweils vorgelagerten offenen Leseraster (ORFs) zu evaluieren. Mithilfe bereits veröffentlichter Proteom-­‐ und RNA Interferenz-­‐ Studien (RIT-­‐seq) konnte ich einige der neu identifizierten kodierenden Sequenzen validieren und deren Bedeutung für die Fitness des Parasiten bestimmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die ermittelten Translations-­‐ und Transkriptionsprofile miteinander verglichen, um auf diese Weise mögliche nicht-­‐kodierende RNAs (ncRNAs) zu identifizieren. Dies führte zu einer eingehenderen Betrachtung der Kodierungspotenziale der dem exprimierten variablen Oberflächenproteins (VSG) vor-­‐ und nachgeschalteten Regionen. In früheren Arbeiten wurde bereits beschrieben, dass eine Deletion der dem VSG vorgelagerten, sogenannten co-­‐transposed region (CTR), vermehrt zu einer Aktivierung einer alternativen VSG Expressionsseite (in situ switches) führt. Ribosome Profiling zeigte, dass eben jede Regionen zwar moderat transkribiert, jedoch nicht translatiert werden. Da diese Ergebnisse vermuten ließen, dass die CTR für eine ncRNA kodiert, hab ich im dritten Teil meiner Arbeit die CTR Transkripte mittels Northern Blot und RACE weiter charakterisiert. Auf diese Weise konnte ich spezifische, 1200 Nukleotide (nt) lange und am 3`-­‐Ende polyadenylierte Transkripte nachweisen. Die bereits erwähnte Deletion der CTR verbunden mit einer erhöhten Rate an in situ switches wurde vor etwa 20 Jahren durch Insertion von Reportergenen durchgeführt. Heute ist es möglich mithilfe von Endonukleasen Genome ohne solche Marker zu editieren. So beschreibt der vierte Teil der Arbeit die Konstruktion von Episomen zur Etablierung und Anwendung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei. Als Machbarkeitsnachweis wurde die kodierende Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) am Ende des SCD6 Gens als Fusionsprotein inseriert. Grün fluoreszierende Zellen konnten bereits zwei Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden. Nachdem CRISPR-­‐Cas9 erfolgreich in T. brucei etabliert werden konnte, werde ich im Folgenden weitere relevante Regionen im Genom modifizieren und beispielsweise die Deletion zweier Histonvarianten durchführen. Die Ribosome Profiling Studie in T. brucei erlaubt es uns, genomweit Genregulation auf Ebene der Translation zu analysieren, das uns zurzeit vorliegende Genom zu re-­‐annotieren, neue kodierende Sequenzen wie auch ncRNAs zu identifizieren und den Einfluss nicht-­‐kodierender Sequenzen auf die Translation zu untersuchen. Gleichzeitig ermöglicht die Etablierung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei eine hochpräzise Manipulation des Genoms ohne den Einsatz von Resistenzmarkern. Auf diese Weise ist es möglich, Gene zu modifizieren und dabei die zugehörigen untranslatierten Bereiche (UTRs) zu erhalten, aber auch ncRNAs, UTRs und mehrfache Kopien eines Gens (gleichzeitig) zu editieren. Ebenso können einzelne Kodons in der Sequenz und somit posttranslational modifizierte Aminosäuren im Genprodukt verändert werden, was uns weitere Möglichkeiten zur Erforschung der Genregulation eröffnet. KW - Trypanosoma brucei KW - Ribosom KW - Posttranskriptionelle Regulation KW - Trypanosoma brucei KW - Gene expression regulation KW - Ribosome profiling KW - CRISPR Cas9 KW - CRISPR Cas9 system Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133996 ER -