TY - THES A1 - Stallforth, Sabine T1 - Unterschiedliche Wirkungen der TNF-alpha-Rezeptoren auf De- und Regeneration peripherer NervenEine Studie an TNF-alpha-Rezeptor-Knockoutmäusen in zwei verschiedenen Tiermodellen für Nervenläsionen T1 - Different effects of TNF-alpha-receptors on de- and regeneration of the peripheral nerveA study in TNF-alpha-receptor-knockout-mice in two different models of nerve injury N2 - Noch immer ist die Behandlung von Neuropathien mit den gängigen therapeutischen Mitteln für viele Patienten sehr unbefriedigend. Als erfolgsversprechender therapeutischer Ansatz werden zur Zeit Wege erforscht, welche direkt in die molekularen Entstehungsmechanismen pathologischer Veränderungen und regenerationsfördernder Mechanismen eingreifen, um dadurch eine Heilung von Nervenschäden zu ermöglichen. Bisher sind die Erkenntnisse über diese Mechanismen nicht vollständig genug, um daraus eine sichere Behandlungsmöglichkeit abzuleiten. Wegweisende Erkenntnisse deuten sich allerdings durch Studien von unterschiedlichen Vertretern des Zytokinnetzwerkes an - darunter auch TNF-alpha - welche als molekulare Ursache neuropathischer Veränderungen diskutiert werden. In dieser Studie wurde an Knockoutmäusen der Einfluss des jeweiligen TNF-alpha-Rezeptors auf morphologische Veränderungen nach CCI (Chronic constriction injury) und Crush-Verletzung des N. ischiadicus untersucht. Nach 3,7,15 und 36 Tagen (CCI) bzw. 3,7 und 28 Tagen (Crush) wurden in Methylenblau gefärbten Semidünnschnitten intakte und degenerierte Nervenfasern, Makrophagen, Angioproliferation, Ödembildung udn Veränderung des Anteils nicht neuronaler Zellen lichtmikroskopisch beurteilt. Zusätzlich wurden Mac-1+ Makrophagen immunzytochemisch erfasst. Die Ergebnisse zeigten in beiden Modellen und bei beiden Knockouttypen eine starke axonale Schädigung, die von einer großen endoneuroalen Makrophagenansammlung begleitet war. Bei TNF-R1-/- Mäusen war eine stärkere und verlängerte Degeneration mit entsprechend höheren Makrophagenzahlen sichtbar. In den Immunzytochemischen Färbungen wiesen die TNF-R1-/- Mäuse hingegen den geringsten Makropahgenanteil auf.Trotz der starken Schädigung war die anschließende Regeneration im Gegensatz zu WT und TNF-R2-/- Mäusen besser. Die Ödembildung war bei den TNF-R2-/- nach CCI besonders stark ausgeprägt und von einer schlechten Regeneration gefolgt. Während die gefundenen Daten auf eine Beteiligung beider Rezeptoren während degenerativer Prozesse hindeuten, scheint insbesondere TNF-R2 regenerationsfördernde Effekte zu vermitteln. N2 - Current Treatment of neuropathic disorders is still dissatisfactory for many patients. A promising approach is the investigation of agents that directly interfere with molecular development of pathologic changes and regeneration. Up to now, consolidated findings of the underlying mechanisms are not yet sufficent to allow therapeutic intervention. Pathbreaking findings come from studies investigating different agents of the cytokine network - as e.g. TNF-alpha - that are discussed as molecular cause of neuropathic changes. This study investigated the influence of both TNF-alpha-receptors on morphologic changes after CCI (chronic constriction injury) and crush-injury of the sciatic nerve of TNF-R-knockoutmice. After 3,7,15 and 36 days (CCI), and 3,7 and 28 respectively (Crush),intact and degenerating nerve fibers, macrophages, angioproliferation, development of edema and changes in the amount of non-neuronal cells were acquired by light microscopy of toluidin-stained semithin sections. Additionally Mac-1+ macrophages were acquired via immuncytochemically stained sections. The results showed strong axonal damage in both knockout-types accompanied by large amounts of endoneurial macrophages. TNF-R1-/-mice showed a longer degeneration phase including respectively higher amounts of macrophages. In contrast the TNF-R1-/-mice revealed the fewest amount of macrophages in immunocytochemical sections. Despite the strong damage better nerve regeneration was observed compared to WT and TNF-R2-/-mice. Formation of edema was pronounced in TNF-R2-/- after CCI and followed by poorly regeneration. Whereas these findings point to a participation of both receptors in degeneration, TNF-R2 seems to support regeneration. KW - peripheral nerve KW - TNF KW - TNF-R1 KW - TNF-R2 KW - TNF-receptors KW - knockout KW - Crush KW - CCI KW - sciatic nerve injury KW - Cytokines KW - regeneration KW - degeneration KW - Degeneration KW - Regeneration KW - TNF-Rezeptor-1 KW - TNF-Rezeptor-2 KW - degeneration KW - regeneration KW - TNF-receptor-1 KW - TNF-receptor-2 Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24808 ER - TY - THES A1 - Rieger, Reinhard T1 - Einflussfaktoren auf die Thrombozytenregeneration nach Hochdosischemotherapie und autologer Stammzelltransplantation - Untersuchung anhand multipler Regressionsanalysen T1 - Influencing factors for the recovery of the platelet count after high-dose therapy and autologous stem cell transplantation - Study based on multiple regression analyses N2 - Das Verfahren der Hochdosischemotherapie mit nachfolgender autologer Stammzelltransplantation ist eine etablierte, gut untersuchte Therapieoption in der Behandlung hämatoonkologischer Erkrankungen. Die sich dabei entwickelnde Thrombozytopenie stellt einen der therapielimitierenden Faktoren dar, wobei sich hier große interindividuelle Unterschiede zeigen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Einflussfaktoren auf die Regeneration der Thrombozytenzahlen nach Hochdosistherapie und autologer Transplantation zu untersuchen. Hierzu erfolgte eine retrospektive Untersuchung von 110 Patientendaten, die von 1994 bis 2003 an der Medizinischen Klinik und Poliklinik II des Universitätsklinikums behandelt wurden. Die Thrombozytenzahlen wurden vier Wochen, drei Monate und sechs Monate nach Transplantation dokumentiert, außerdem wurde die Dauer in Tagen bis zu dem Erreichen der beiden Thrombozytenschwellenwerte 10.000/µl und 20.000/µl untersucht. An potentiellen Einflussfaktoren gingen das Alter zum Zeitpunkt der Transplantation, der body mass index zum Zeitpunkt der Transplantation, das Geschlecht, das Vorhandensein einer vorausgegangenen Ganzkörperbestrahlung, das Vorhandensein einer Antibiotikagabe aufgrund einer transplantationsassoziierten Infektion, die Aplasiedauer, die Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, die Anzahl der transfundierten colony forming units (CFUs), die Anzahl der transfundierten blood forming units (BFUs), das Vorliegen eines Rezidivs und der Thrombozytenausgangswert vor Hochdosistherapie in die Analyse ein. An statistischen Testverfahren wurde der Mann-Whitney-U-Test, der Kruskal-Wallis-Test und der Korrelationskoeffizient nach Spearman verwendet, bei nachgewiesenem potentiellen Zusammenhang erfolgte eine Quantifizierung mittels multipler Regressionsanalysen. Anhand der beiden nichtparametrischen Testverfahren und der Bestimmung des Korrelationskoeffizienten nach Spearman konnte gezeigt werden, dass für die Parameter „Ausgangswert der Thrombozyten vor Hochdosistherapie“, „Dauer der Aplasie“ und „Vorliegen einer Ganzkörperbestrahlung“ ein systematischer Zusammenhang zu den Thrombozytenwerten nach vier Wochen, drei Monaten bzw. sechs Monaten vorliegt. An den beiden Schwellenwerten „Dauer bis Thrombozytenzahl 10.000/µl“ und „Dauer bis Thrombozytenzahl 20.000/µl“ galt das für die Variablen „Dauer der Aplasie“, „Vorhandensein einer Antibiotikatherapie“ und „Geschlecht“. Für die restlichen Parameter konnte keine signifikante Korrelation zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden, was insbesondere für Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, CFUs bzw. BFUs überraschte und anhand klinischer Vorüberlegungen nicht zu erwarten war. Mit Hilfe der oben genannten Parameter, für die ein nichtzufälliger Zusammenhang zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden konnte, erfolgten zu den drei Messpunkten und den zwei Schwellenwerten separate multiple Regressionsanalysen. Im Ergebnis konnten fünf Gleichungen formuliert werden, die, nach Einsetzen der Prädiktoren „Dauer der Aplasie“, „Thrombozytenausgangswert vor Transplantation“ und „Geschlecht“ eine Prognose der Thrombozytenzahlen zu den entsprechenden Zeitpunkten und Zielwerten ermöglichen. Ein möglicher klinischer Einsatz dieser Ergebnisse wäre die Identifikation von Risiko- und Hochrisikogruppen im Vorfeld einer Hochdosischemotherapie und autologer Stammzelltransplantation anhand prognostizierter Thrombozytenwerte. Dies würde ein angepasstes therapeutisches und diagnostisches Vorgehen ermöglichen, wodurch die Sicherheit des Verfahrens und der Krankheitsverlauf verbessert werden könnten. N2 - The protocol of high-dose chemotherapy with autologous stem cell transplantation is an approved and established option in the treatment of haematological malignancies. The developing thrombocytopenia is one of the limiting factors of this therapy, but there are large interindividual differences. The purpose of this study was to identify possible factors of influence for the recovery of the platelet count after high-dose therapy and autologous stem cell transplantation. In order to do this we did a retrospective study that analyses the data of 110 patients, who were treated by the department of medical clinic II of the University Hospital in Würzburg in the years 1994 to 2003. The platelet counts were documented four weeks, three months and six months after the autologous transplantation. Furthermore the duration of time taken for the platelet count of 10.000/µl and 20.000/µl was reviewed. The following parameters were used as potential predictors: age at the time of transplantation, body mass index at the time of transplantation, gender, previous total body irradiation, antibiotics given because of transplantation-associated infections, duration of aplasia, number of transfused CD34+-cells, number of transfused colony forming units (CFUs), number of transfused blood forming units (BFUs), relapse, and the platelet count before high-dose therapy. For the statistical evaluation the Mann-Whitney-U-Test, the Kruskal-Wallis-Test and Spearman´s rank correlation coefficient were used. The quantification of proved correlation was done by multiple regression analyses. The results of the two nonparametric tests and Spearman´s correlation coefficient showed that there was a systematic correlation for the parameters “platelet count before high-dose therapy”, “duration of aplasia” and “previous total body irradiation” to the platelet count after four weeks, three months and six months. There were also significant correlations to the two thresholds “duration until platelet count 10.000/µl” and “duration until platelet count 20.000/µl” for the variables “duration of aplasia”, “antibiotics because of associated infections” and “gender”. The remaining parameters were tested negative. This was surprising under clinical considerations, especially for the numbers of transfused CD34+-cells, CFUs and BFUs. The above mentioned significant, non-random parameters were used for the multiple regression analyses, one analysis for each of the three measurement points and the two thresholds. In the result there were five equations, which allow you to predict the platelet counts at the measurement points and thresholds. You only have to know and insert the duration of aplasia, the gender and the platelet count before high-dose therapy. A possible clinical application of predicted platelet counts could be the identification of risk and high risk groups before the application of high-dose therapy with autologous transplantation. Adjusted therapeutic and diagnostic procedures could improve the safety of the protocol with a possible positive effect on the course of the disease. KW - Regeneration KW - Thrombozyt KW - Blutstammzelle KW - Stammzelle KW - Autogene Transplantation KW - Hochdosischemotherapie KW - Regressionsanalyse KW - Multiple Regression KW - Einflussfaktoren KW - Thromboyztenregeneration KW - CFU KW - BFU KW - influencing factors KW - recovery KW - platelet count KW - high-dose chemotherapy KW - autologous stem cell transplantation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76288 ER - TY - THES A1 - Schaafhausen, Anne T1 - Proteininteraktionen der Vitamin K Epoxid Reduktase Proteine VKORC1 und VKORC1L1 T1 - Protein interactions of the vitamin K epoxide reductase proteins VKORC1 and VKORC1L1 N2 - Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll. N2 - Since the first gene of the vitamin K epoxide reductase complex (VKORC1) - the key enzyme for the regeneration of vitamin KH2 - has been discovered, no more components of the complex have been described. To date, the only known function of VKORC1 is the reduction of vitamin K-2,3-epoxide (VKO) in the vitamin K cycle. VKO plays a role as an oxidative cofactor during post-translation carboxylation. VKORC1 is also the target protein of anticoagulant drugs of the coumarin type (e.g. warfarin or marcumar). Genetic variants in VKORC1 have recently been shown to significantly affect the coumarin dose and the stability of hamostasis (measured as INR level) during thrombosis treatment. Simultaneously with VKORC1, a homologues protein called VKORC1-like1 (VKORC1L1) was identified. The physiological function of VKORC1L1 was unknown at the beginning of this thesis. The present thesis focuses on two aspects: A. Kinetic properties and subcellular localization of VKORC1L1-protein as well as B. identification and characterization of potential interaction partners of VKORC1 and VKORC1L1, respectively. The results could be summarised as follows: A.1. Kinetic studies revealed a high similarity of VKORC1 and VKORC1L1: Both VKOR-proteins have shown a VKR-activity in our assay and a higher affinity for Vitamin K2-epoxid than for Vitamin K1-epoxid. Both enzymes could be inhibited by warfarin and the exchange of homologous Cysteins leads to an almost complete loss of function for both proteins. A.2. Localisation studies identified VKORC1L1 in the ER when co-expressed in HeLa cells with VKORC1. Accordingly, we suggest that VKORC1L1 has a similar function, localisation and structure as VKORC1 and therefore becomes a potential component of the VKOR-complex. Nevertheless, important arguments lead to the fact that both proteins are not interchangeable as neither patients with VKCDF2 nor VKORC1-knock out mice could be counterbalanced by VKORC1L1. B. Using the split-ubiquitin-system, a method based on yeast two-hybrid system which is capable to investigate membrane-proteins, 114 potential interactions candidates for VKORC1 and VKORC1L1 were found in a human adult liver cDNA library screen. 5 of them were further investigated using co-immunprecipitation and co-localisation studies. Interestingly, various similar hits could be detected for both proteins. B.1. For the first time we were able to show an in vitro-interaction of VKORC1 with itself and the homologues protein VKORC1L1. This might be due to the high level of homology between the two proteins but also leads to a new hypothesis in respect to the vitamin K metabolism. B.2. The interaction of VKORC1 and “stress-associated endoplasmatic reticulum protein 1” (SERP1) connects vitamin K with oxidative stress. This is in accordance with new results from the group of J. Oldenburg (formerly Würzburg, now Bonn). They postulate an antioxidant role of VKORC1L1. Whether VKORC1L1 and vitamin K have an antioxidative effect needs to be solved in further studies. B.2. Furthermore, we showed an interaction between VKORC1 and the “emopamil binding protein” (EBP). Genetic variants in EBP lead to a rare genetic disease chondrodysplasia punctata which can be considered a phenocopy of warfarin embryopathy, which is caused by medication of woman with coumarin derivatives during the first trimester of pregnancy. This interaction and the similar phenotypes suggest a connection between the vitamin K- and calcium metabolism. B.3. The following proteins, which were found using split-ubiquitin-system, could not be confirmed via co-immunoprecipitaion: protein-disulfide-isomerase A6 (PDIA6), CD63, a member of the tetraspanin-family, and fibrinogen-gamma-chain (FGG). A PDI-form was proposed to provide electrons for reduction of the thioredoxin-like CXXC center in VKORC1. Tetraspanins are a large family of cell-surface proteins, which interact with proteins in a molecular network that is known as the tetraspanin web. FGG is the gamma component of fibrinogen, the only identified protein which is known to play a role in blood coagulation. These results suggest new functions of VKOR-proteins related to protection against oxidative stress and a connection to the calcium-metabolism. Both aspects need to be analysed further. Therefore, it would make sense to analyse the remaining candidates found via split-ubiquitin-system with regard to these new functions. KW - Vitamin-K-Gruppe KW - Regeneration KW - Proteine KW - Molekulargenetik KW - Vitamin K KW - VKORC1 KW - VKORC1L1 KW - Proteininteraktion KW - vitamin K KW - VKORC1 KW - VKORC1L1 KW - protein interaction Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55442 ER - TY - THES A1 - Heffels, Karl-Heinz T1 - Functional nanofibres for regenerative medicine T1 - Funktionelle Nanofasern für die regenerative Medizin N2 - This thesis concerned the design and examination of a scaffold for tissue engineering applications. The template for the presented scaffold came from nature itself: the intercellular space in tissues that provides structure and support to the cells of the respective tissue, known as extracellular matrix (ECM). Fibres are a predominant characteristic feature of ECM, providing adhesion sites for cell-matrix interactions. In this dissertation a fibrous mesh was generated using the electrospinning technique to mimic the fibrous structure of the ECM. Two base polymers were explored: a biodegradable polyester, poly(D,L-lactide-co-glycolide); and a functional PEG-based star polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). This topic was described in three major parts: the first part was materials based, concerning the chemical design and characterisation of the polymer scaffolds; the focus was then shifted to the cellular response to this fibrous scaffold; and finally the in vivo performance of the material was preliminarily assessed. The first steps towards an electrospun mesh started with adjusting the spinning parameters for the generation of homogeneous fibres. As reported in Chapter 3 a suitable setup configuration was on the one hand comprised of a spinning solution that consisted of 28.5 w/v% PLGA RG 504 and 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL acetone, 50 µL DMSO and 10 µL of an aqueous trifluoroacetic acid solution. On the other hand an ideal spinning behaviour was achieved at process parameters such as a flow rate of 0.5 mL/h, spinneret to collector distance of 12-16 cm and a voltage of 13 kV. The NCO-sP(EO-stat-PO) containing fibres proved to be highly hydrophilic as the functional additive was present on the fibre surface. Furthermore, the fibres featured a bulk degradation pattern as a consequence of the proportion of PLGA. Besides the morphologic similarity to ECM fibres, the functionality of the electrospun fibres is also decisive for a successful ECM mimicry. In Chapter 4, the passive as well as active functionality of the fibres was investigated. The fibres were required to be protein repellent to prevent an unspecific cell adhesion. This was proven as even 6.5 % sP(EO-stat-PO) in the PLGA fibres reduced any unspecific protein adsorption of bovine serum albumin and foetal calf serum to less than 1 %. However, avidin based proteins attached to the fibres. This adhesion process was avoided by an additional fibre surface treatment with glycidol. The active functionalisation of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres was investigated with two fluorescent dyes and biocytin. A threefold, chemically orthogonal, fibre modification was achieved with these dyes. The chapters about the chemical and mechanical properties laid the basis for the in vitro chapters where a specific fibre functionalisation with peptides was conducted to analyse the cell adhesion and biochemical expressions. Beginning with fibroblasts in Chapter 5 the focus was on the specific cell adhesion on the electrospun fibres. While NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres without peptides did not allow any adhesion of fibroblasts, a fibre modification with GRGDS (an adhesion mediating peptide sequence) induced the adhesion and spreading of human dermal fibroblasts on the fibrous scaffolds. The control sequence GRGES that has no adhesion mediating qualities did not lead to any cell adhesion as observed on fibres without modifications. While the experiments of Chapter 5 were a proof-of-concept, in Chapter 6 a possible application in cartilage tissue engineering was examined. Therefore, primary human chondrocytes were seeded on fibrous scaffolds with various peptide sequences. Though the chondrocytes exhibited high viability on all scaffolds, an active interaction of cells and fibres was only found for the decorin derived sequence CGKLER. Live-cell-imaging revealed both cell attachment and migration within CGKLER-modified meshes. As chondrocytes undergo a de-differentiation towards a fibroblast-like phenotype, the chondrogenic re-differentiation on these scaffolds was investigated in a long term cell culture experiment of 28 days. Therefore, the glycosaminoglycan production was analysed as well as the mRNA expression of genes coding for collagen I and II, aggrecan and proteoglycan 4. In general only low amounts of the chondrogenic markers were measured, suggesting no chondrogenic differentiation. For conclusive evidence follow-up experiments are required that support or reject the findings. The success of an implant for tissue engineering relies not only on the response of the targeted cell type but also on the immune reaction caused by leukocytes. Hence, Chapter 7 dealt with primary human macrophages and their behaviour and phenotype on two-dimensional (2D) surfaces compared to three-dimensional (3D) fibrous substrates. It was found that the general non-adhesiveness of NCO-sP(EO-stat-PO) surfaces and fibres does not apply to macrophages. The cells aligned along the fibres on surfaces or resided in the pores of the meshes. On flat surfaces without 3D structure the macrophages showed a retarded adhesion kinetic accompanied with a high migratory activity indicating their search for a topographical feature to adhere to. Moreover, a detailed investigation of cell surface markers and chemokine signalling revealed that macrophages on 2D surfaces exhibited surface markers indicating a healing phenotype while the chemokine release suggested a pro-inflammatory phenotype. Interestingly, the opposite situation was found on 3D fibrous substrates with pro-inflammatory surface markers and pro-angiogenic cytokine release. As the immune response largely depends on cellular communication, it was concluded that the NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres induce an adequate immune response with promising prospects to be used in a scaffold for tissue engineering. The final chapter of this thesis reports on a first in vivo study conducted with the presented electrospun fibres. Here, the fibres were combined with a polypropylene mesh for the treatment of diaphragmatic hernias in a rabbit model. Two scaffold series were described that differed in the overall surface morphology: while the fibres of Series A were incorporated into a thick gel of NCO-sP(EO-stat-PO), the scaffolds of Series B featured only a thin hydrogel layer so that the overall fibrous structure could be retained. After four months in vivo the treated defects of the diaphragm were significantly smaller and filled mainly with scar tissue. Thick granulomas occurred on scaffolds of Series A while the implants of Series B did not induce any granuloma formation. As a consequence of the generally positive outcome of this study, the constructs were enhanced with a drug release system in a follow-up project. The incorporated drug was the MMP-inhibitor Ilomastat which is intended to reduce the formation of scar tissue. In conclusion, the simple and straight forward fabrication, the threefold functionalisation possibility and general versatile applicability makes the meshes of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres a promising candidate to be applied in tissue engineering scaffolds in the future. N2 - Diese Dissertation beschäftigte sich mit der Entwicklung und Untersuchung eines Gerüsts zur Geweberegeneration. Der interzelluläre Raum, der in Geweben für die Gewebestruktur verantwortlich ist, wurde als Vorbild aus der Natur für das entwickelte Gerüst verwendet. Fasern sind in dieser extrazellulären Matrix (EZM) ein charakteristischer Bestandteil, die Adhäsionssequenzen für Zell-Matrix-Interaktionen enthalten und zur strukturellen Organisation der Gewebe beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden Faservliese mit Hilfe des elektrostatischen Verspinnens hergestellt, um die natürlichen Fasern der EZM zu imitieren. Zwei Polymere bildeten die chemische Grundlage für diese Fasern: Ein bioabbaubarer Polyester, Poly(D,L-Laktid-co-Glykolid) (PLGA) und ein funktionales auf Polyethylenglykol basierendes, sternförmiges Polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). Der erste Teil des in drei Hauptteile untergliederten Themas beschäftigte sich mit dem chemischen Design und der Fasercharakterisierung im Sinne der Materialeigenschaften. Der zweite Teil betrachtet die Auswirkungen der Fasern auf zellulärer Ebene, während der dritte Teil einen ersten Eindruck über die in vivo Reaktion auf die Materialien vermittelt. Die ersten Schritte in Richtung eines elektrostatisch gesponnenen Vlieses begannen mit der Erforschung geeigneter Einstellungen für eine homogene Faserproduktion. Kapitel 3 thematisiert geeignete Spinnparameter, zu denen auf der einen Seite eine spinnfähige Lösung gehörte, die aus 28.5 w/v% PLGA RG 504 und 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL Aceton, 50 µL DMSO und 10 µL trifluoressigsaurer wässriger Lösung besteht. Auf der anderen Seite wurden Prozessparameter gefunden, wie zum Beispiel eine Flussrate von 0.5 mL/h und ein Kollektor-Abstand von 12-16 cm, die bei einer Potentialdifferenz von 13 kV ein stabiles Spinnverhalten garantierten. Fasern mit dem Additiv NCO-sP(EO-stat-PO) zeigten eine äußerst starke Hydrophilie, da das Additiv während des Spinnprozesses an die Faseroberfläche segregierte. Des Weiteren sind die Fasern dank des PLGA-Anteils nach einem Volumenabbaumechanismus unter physiologischen Bedingungen degradierbar. Neben der morphologischen Ähnlichkeit zwischen natürlichen Fasern der EZM und elektrogesponnenen Fasern ist die Funktionalität der synthetischen Fasern entscheidend für eine erfolgreiche Imitation der EZM. Kapitel 4 betrachtet deswegen sowohl die passive als auch aktive Funktionalität der Fasern. Unter passive Funktionalität fällt das proteinabweisende Verhalten, welches eine unspezifische Zelladhäsion verhindert. Es wurde gezeigt, dass ein Anteil von 6.5 % sP(EO-stat-PO) in den PLGA-Fasern ausreicht, um die unspezifische Adhäsion von Albumin aus Rinderserum und fötalem Kälberserum auf weniger als 1 % zu senken. Dennoch adhärierten avidinbasierte Proteine auf den Fasern, was jedoch durch eine Behandlung mit Glycidol unterbunden werden konnte. Die aktive Funktionalisierung wurde exemplarisch mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen und Biocytin untersucht. Mit diesen Modellmolekülen wurde eine dreifache, chemisch orthogonale Fasermodifizierung erreicht. Die Kapitel über die chemischen und mechanischen Eigenschaften haben die Grundlage für in vitro Zellversuche gelegt, bei denen eine Faserfunktionalisierung mit Peptidsequenzen durchgeführt wurde, um eine spezifische Zelladhäsion zu erreichen und die biochemische Reaktion der Zellen zu untersuchen. In Kapitel 5 lag der Fokus auf der spezifischen Adhäsion von humanen dermalen Fibroblasten an den elektrogesponnenen Fasern. Während NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern ohne Peptide keine Zelladhäsion zuließen, induzierte eine Fasermodifikation mit GRGDS, einer adhäsionsvermittelnden Peptidsequenz, sowohl die Adhäsion als auch Ausbreitung der Fibroblasten auf den Fasern. Eine Kontrollsequenz ohne adhäsionsvermittelnde Eigenschaften (GRGES), führte, wie auch Fasern ohne Peptide, zu keiner Zelladhäsion. Die Experimente von Kapitel 6 gingen über das reine Machbarkeitskonzept von Kapitel 5 hinaus, indem eine mögliche Anwendung im Bereich der Knorpelregeneration untersucht wurde. Daher wurden primäre humane Chondrozyten auf Faservliesen ausgesät, die mit unterschiedlichen Peptiden modifiziert wurden. Trotz einer allgemein sehr guten Vitalität der Zellen auf allen Fasertypen, zeigten die Chondrozyten nur auf Vliesen mit der aus Decorin abgeleiteten CGKLER-Sequenz eine aktive Interaktion. Diese konnte mit dem Live-Cell-Imaging-Verfahren anhand der Zelladhäsion und Zellmigration beobachtet werden. Da Chondrozyten in der 2D-Expansionszellkultur einer Dedifferenzierung in Richtung eines Fibroblasten ähnlichen Zelltypen unterliegen, wurde eine 28-tägige Studie durchgeführt, um das Redifferenzierungsverhalten auf den Fasergerüsten zu untersuchen. Dazu wurde sowohl die Glykosaminoglykanproduktion analysiert als auch die mRNA Expression der Gene, die die Kollagen I und II, Aggrecan und Proteoglykan 4 Produktion regulieren. Die chondrogenen Marker wurden in diesen Versuchen nur geringfügig ausgeschüttet, was in Anbetracht der großen Varianzen in den Messwerten auf keine Redifferenzierung schließen lässt. Für eine abschließende Beurteilung werden Folgeexperimente empfohlen, die die gemachten Beobachtungen bestärken oder widerlegen. Der Erfolg eines Implantats zur Geweberegeneration beruht nicht nur auf der gewünschten Reaktion des Zielzelltyps, sondern auch auf der Immunreaktion des Organismus, welche durch Leukozyten gesteuert wird. Folglich beschäftigte sich Kapitel 7 mit dem Verhalten und den Phänotypen primärer humaner Makrophagen auf dreidimensionalen Fasergerüsten und zweidimensionalen Oberflächen im Vergleich zueinander. Bei den Versuchen zeigte sich, dass die generelle Nicht-Adhäsivität von NCO-sP(EO-stat-PO) Oberflächen für Makrophagen nicht zutrifft. Die Zellen richteten sich an den Fasern auf den Oberflächen aus oder saßen in den Poren der Vliese. Auf flachen Oberflächen ohne dreidimensionale Struktur wiesen die Makrophagen ein verzögertes Adhäsionsverhalten auf und migrierten stark über die Oberfläche auf der Suche nach topographischen Unebenheiten, um dort adhärent zu werden. Des Weiteren zeigte eine detaillierte Untersuchung der Oberflächenmarker und der Zytokinausschüttung, dass Makrophagen auf 2D-Oberflächen gemäß der Oberflächenmarker einen entzündungs-hemmenden Phänotypen aufwiesen, während die Zytokinausschüttung einen entzündungs-fördernden Phänotypen suggerierte. Interessanterweise bot sich das entgegengesetzte Bild auf 3D-Faseroberflächen. Hier wurde die Erkenntnis gewonnen, dass die Morphologie einen größeren Einfluss auf die Zellreaktion hat als die Oberflächenchemie. Da die Immunantwort eines Organismus auf ein Implantat stark von der interzellularen Kommunikation abhängt, wurde gefolgert, dass die NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern eine adäquate Immunantwort hervorrufen mit vielversprechenden Aussichten, die Fasergerüste im Bereich der Geweberegeneration einzusetzen. Das letzte Kapitel der Dissertation berichtet über eine erste in vivo Studie der hier vorgestellten Fasern. Mit den Fasern wurde ein bestehendes Behandlungskonzept für Hernien des Zwerchfells erweitert und die Leistungsfähigkeit in einem Kaninchenmodell überprüft. Zwei Gerüsttypen wurden untersucht, die sich in der Oberflächenmorphologie maßgeblich unterschieden: In Serie A wurden die elektrogesponnenen Fasern in ein Gel aus NCO-sP(EO-stat-PO) gebettet, während die Fasern in Serie B nur mit einer dünnen Gelschicht bedeckt wurden, so dass die topografische Faserstruktur erhalten blieb. Nach 4 Monaten in vivo waren die behandelten Zwerchfelldefekte signifikant kleiner und überwiegend mit Narbengewebe gefüllt. Die ausgeprägte Granulombildung bei Fasergerüsten der Serie A konnte in der darauffolgenden Studie (Serie B) minimiert werden. Das gute Abschneiden dieser Studien wurde zum Anlass genommen, die Vliese weiterzuentwickeln und eine Medikamentenfreisetzung (Ilomastat) zu integrieren, um die Narbenbildung zu minimieren. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation einen einfachen und direkten Weg, Fasern für eine gezielte Geweberegeneration zu erzeugen, die dreifach funktionalisierbar und vielseitig anwendbar sind. Dies macht Fasergerüste auf der Basis von NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA zu einem vielversprechenden Kandidaten um in der Geweberegeneration eingesetzt zu werden. KW - Nanofaser KW - Gewebe KW - Regeneration KW - Extrazelluläre Matrix KW - Polymere KW - Elektrostatisches Verspinnen KW - Geweberegeneration KW - Fibroblasten KW - Makrophagen KW - Chondrozyten KW - Wirkstofffreisetzung KW - Oberflächenfunktionalisierung KW - Electrospinning KW - tissue engineering KW - surface functionalisation KW - drug release Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75684 N1 - Die Arbeit wurde am Lehrstuhl für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde angefertigt ER - TY - THES A1 - Zovko, Josip T1 - Die E3-Ubiquitinligase HectD1 reguliert die Stabilität des antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieds A1 T1 - The E3-Ubiquitinligase HectD1 regulates the stabiliy of the anti-apoptotic Bcl-2-protein A1 N2 - Die Bcl-2-Familienmitglieder A1 und sein humanes Homolog Bfl-1 gewährleisten das Überleben der Zelle. Gleichzeitig trägt eine Dysregulation der Expression von A1/ Bfl-1 zur Krebsentstehung bei. Die Stabilität von A1/ Bfl-1 wird durch deren Ubiquitinylierung sowie die anschließende proteosomale Degradation gesteuert. Mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens wurde die E3-Ubiquitinligase HectD1 als potentieller Interaktionspartner von A1/ Bfl-1 identifiziert. Die Interaktion von A1 und HectD1 des Yeast-Two-Hybrid-Screens konnte in Säugerzellen bestätigt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass lediglich 87 Aminosäuren für eine Interaktion von HectD1 und A1 nötig sind. Da membrangebundenes HectD1 zu einer Translokation von zytosolischem A1 an die Zellmembran führt, kann man davon ausgehen, dass beide Proteine auch in vivo miteinander interagieren. Eine dominant negative HectD1-Mutante schließlich beeinflusst die Ubiqutinylierung von A1 und führt somit zu dessen Stabilisierung. Diese Daten legen nahe, dass HectD1 ein wichtiger negativer Regulator von A1/ Bfl-1 ist und dass HectD1 für die Regulierung der A1/ Bfl-1-Proteinmenge in (Krebs)zellen sehr wichtig ist. N2 - The Bcl-2 family members A1 and its human orthologue Bfl-1 support survival of cells. Dysregulation of their expression contributes to cancer. Stability of A1/ Bfl-1 is controlled by ubiquitination followed by degradation via the proteasome. Using a yeast two-hybrid screen we identified the E3 ubiquitin-ligase HectD1 as potential A1/ Bfl-1-interacting partner. We confirmed interaction of these two proteins in mammalian cells. Only 87 amino acids of HectD1 are necessary for the interaction of the protein with A1. Membrane-bound HectD1 recruits A1 to the membranes further supporting the notion that the two proteins interact in vivo. Importantly, dominant negative versions of HectD1 interfered with ubiquitination of A1 stabilizing the protein. These findings indicate that HectD1 maybe an important negative regulator of the A1/ Bfl-1 anti-apoptotic protein, providing an important target for interfering with dysregulation of A1/ Bfl-1 in cancer. KW - Zelltod KW - Ubiquitinierung KW - Bcl-2 Familie KW - Bcl-2 family KW - Regeneration KW - Bcl-2-Proteinfamilie KW - Ubiquitination Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87922 ER - TY - THES A1 - Ibrahim, Sani T1 - Évolution des paysages dunaires fixés par la végétation au Niger T1 - Veränderung der Dünenlandschaften durch die Vegetation in Niger N2 - Les sécheresses des années 1970 et 1980 ont occasionné des changements remarquables dans les paysages et écosystèmes sahéliens. Au Niger, les milieux dunaires sont les plus affectés par la dégradation des paysages aux conséquences parfois irréversibles. Cette étude tente de montrer que, malgré les modifications climatiques et les pressions anthropiques, une régénération des sols dunaires serait possible, dans cette dynamique complexe. Cela a été démontré à travers l’analyse micromorphologique des matériaux des parties superficielles des sols (0-20 cm). L’étude des caractéristiques particulières des croûtes (organisations pelliculaires de surface des sols) offre des pistes de recherches pouvant proposer des moyens et méthodes de fixation des dunes dégradées. Elle propose également des alternatives de lutte contre l’érosion éolienne et hydrique dans les écosystèmes sahéliens. Ceci cadre parfaitement avec la situation au Niger, où les phénomènes de désertification et d’ensablement des cuvettes interdunaires constituent une préoccupation majeure en matière de protection de l’environnement. N2 - Die Dürrephasen der 1970er und 1980er Jahre haben in den Landschaften und Ökosystemen des Sahel deutliche Veränderungen verursacht. In Niger waren die Dünenlandschaften am stärksten von Degradation betroffen, teils in irreversiblem Ausmaß. Die vorliegende Studie zeigt, dass in dieser komplexen Dynamik trotz Klimaschwankungen und Nutzungsdruck die Regeneration von Böden dennoch möglich ist. Dies wurde anhand mikromorphologischer Analysen von oberflächigem Bodenmaterial (0-20 cm Tiefe) nachgewiesen. Die Untersuchung insbesondere der Eigenschaften von Oberflächenkrusten (i.S. von filmartiger Organisation der Bodenoberfläche) eröffnet Forschungsperspektiven zu Möglichkeiten und Methoden der Stabilisierung degradierter Dünen. Ebenso zeigt sie Alternativen auf im Kampf gegen äolische und durch Spülprozesse hervorgerufene Abtragung in sahelischen Ökosystemen. Damit lässt sie sich perfekt auf die Situation in Niger anwenden, wo die Phänomene der Desertifikation und der Sandeinwehung in interdunäre Wannen im Rahmen des Umweltschutzes eine wesentliche Herausforderung darstellen. T3 - Schriftenreihe Junges Afrikazentrum (JAZ) - 4 KW - Degradation KW - Regeneration KW - Dünen KW - Sahel KW - sol KW - micromorphologie KW - géochimie KW - minéralogie KW - microscopie KW - microstratigraphie KW - dégradation KW - régénération KW - dunes KW - croûtes Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126528 SN - 2199-4315 ER - TY - THES A1 - Sani, Ibrahim T1 - Évolution des paysages dunaires fixés par la végétation au Niger : Modifications morphologiques actuelles dans les couches superficielles des dunes et possibilités de « régénération » et de « pédogénèse » T1 - Entwicklung der Dünenlandschaften in Niger : Gegenwärtige morphologische Änderungen in den oberflächennahen Sediment-Schichten der Dünen und Möglichkeiten der "Regeneration" und Bodenbildung N2 - Les sécheresses des années 1970 et 1980 ont occasionné des changements remarquables dans les paysages et écosystèmes sahéliens. Au Niger, les milieux dunaires sont les plus affectés par la dégradation des paysages aux conséquences parfois irréversibles. Cette étude tente de montrer que, malgré les modifications climatiques et les pressions anthropiques, une régénération des sols dunaires serait possible, dans cette dynamique complexe. Cela a été démontré à travers l’analyse micromorphologique des matériaux des parties superficielles des sols (0-20 cm). L’étude des caractéristiques particulières des croûtes (organisations pelliculaires de surface des sols) offre des pistes de recherches pouvant proposer des moyens et méthodes de fixation des dunes dégradées. Elle propose également des alternatives de lutte contre l’érosion éolienne et hydrique dans les écosystèmes sahéliens. Ceci cadre parfaitement avec la situation au Niger, où les phénomènes de désertification et d’ensablement des cuvettes interdunaires constituent une préoccupation majeure en matière de protection de l’environnement. N2 - Die Dürrephasen der 1970er und 1980er Jahre haben in den Landschaften und Ökosystemen des Sahel deutliche Veränderungen verursacht. In Niger waren die Dünenlandschaften am stärksten von Degradation betroffen, teils in irreversiblem Ausmaß. Die vorliegende Studie zeigt, dass in dieser komplexen Dynamik trotz Klimaschwankungen und Nutzungsdruck die Regeneration von Böden dennoch möglich ist. Dies wurde anhand mikromorphologischer Analysen von oberflächigem Bodenmaterial (0-20 cm Tiefe) nachgewiesen. Die Untersuchung insbesondere der Eigenschaften von Oberflächenkrusten (i.S. von filmartiger Organisation der Bodenoberfläche) eröffnet Forschungsperspektiven zu Möglichkeiten und Methoden der Stabilisierung degradierter Dünen. Ebenso zeigt sie Alternativen auf im Kampf gegen äolische und durch Spülprozesse hervorgerufene Abtragung in sahelischen Ökosystemen. Damit lässt sie sich perfekt auf die Situation in Niger anwenden, wo die Phänomene der Desertifikation und der Sandeinwehung in interdunäre Wannen im Rahmen des Umweltschutzes eine wesentliche Herausforderung darstellen. KW - Degradation KW - Niger KW - Sahel KW - Sol KW - Micromorphologie KW - géochimie KW - minéralogie KW - microscopie KW - microstratigraphie KW - Sahara KW - Düne KW - Abtragung KW - Desertifikation KW - Regeneration Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128014 UR - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126528 N1 - Diese Arbeit ist auch als Band 4 der Schriftenreihe Junges Afrika Zentrum erschienen und online verfügbar unter: http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126528 ER - TY - THES A1 - Yorulmazel, Berrin T1 - Der Einfluss des cysteinreichen Proteins 61 auf die Muskelregeneration nach akuter Beinverkürzung und anschließender Verlängerung T1 - The effect of cysteine-rich protein 61 on muscle regeneration after acute limb-shortening and following distraction N2 - In der vorliegenden Arbeit wird der Einfluss des lokal applizierten, proangiogenen Faktors CYR61 auf die Muskelkraftregeneration, die mögliche Reduktion der Fibrosierung und auf die Gefäßneubildung untersucht. Wir erzeugten ein standardisiertes Trauma des M. tibialis anterior durch Kontusion und Ischämie mit erhöhtem Kompartmentdruck bei 10 Kaninchen der Rasse Weiße Neuseeländer. Anschließend erfolgten die primäre Resektion der Tibia mit lokaler Einlage des CYR61-getränkten Kollagenträgers und die graduelle Distraktion zur Wiederherstellung der ursprünglichen Tibialänge. N2 - In this study we examined the effect of the locally applied proangiogenic factor CYR61 on muscle force restoration, reduction of scar tissue formation and angiogenesis. We generated a standardized trauma of the tibialis anterior muscle with contusion and ischemia and increased compartment pressure in 10 New Zealand white rabbits. The limbs were shortened and a CYR61-coated collagen matrix was applied locally followed by gradual distraction to restore the original length. KW - Gen CCN1 KW - Skelettmuskel KW - Regeneration KW - Muskelverletzung KW - Angiogenese KW - Muskelregeneration Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250347 ER - TY - THES A1 - Willmann, Lukas T1 - Altersabhängige Makuladegeneration - Regeneration des retinalen Pigmentepithels durch Anregung zur Proliferation durch den Transkriptionsfaktor E2F2 T1 - Age-related macular degeneration - regeneration of retinal pigment epithelium by stimulation of proliferation by transcription factor E2F2 N2 - Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist weltweit die häufigste Ursache von irreversibler Erblindung des alternden Menschen. Mit der anti-VEGF-Behandlung steht für die deutlich seltenere feuchte AMD eine zugelassene Therapie bereit, die deutlich häufigere trockene AMD entzieht sich aktuell jedoch jeglicher Therapie. Ein zentraler Pathomechanismus der AMD ist der progrediente Untergang des retinalen Pigmentepithels (RPE). Die Rarifizierung und letztendlich Atrophie des RPEs führt zum Untergang der funktionellen Einheit aus RPE, Photorezeptoren und Bruch’scher Membran und somit zum irreversiblen Funktionsverlust. Ein möglicher therapeutischer Ansatz, der progredienten Atrophie des RPEs entgegenzuwirken, ist, das prinzipiell post- mitotischen RPE zur Proliferation anzuregen. Grundlage unserer in vitro Untersuchungen ist das ARPE-19 Zellmodell. Um die Proliferation anzuregen wurden die RPE-Zellen mit E2F2, einem Zellzyklus- regulierendem Transkriptionsfaktor, transfiziert. Zunächst wurde ein nicht-proliferatives RPE-Zellmodell mit spontanem Wachstumsarrest etabliert. Innerhalb von zwei Wochen konnte die Ausbildung von Zonulae occludentes als Zeichen der Integrität des adhärenten Zellmonolayers beobachtet werden. Die chemische Transfektion von E2F2 unter einem CMV-Promoter führte zur Überexpression von E2F2-Protein. Der proliferationssteigernde Effekt von E2F2 konnte durch die Proliferationsmarker Cyclin D1 sowie Ki67, dem Anstieg der BrdU-Aufnahme und der nach Transfektion mit E2F2 zunehmenden Gesamtzellzahl nachgewiesen werden. Der Zellzahlerhöhung standen jedoch potentiell qualitative und funktionelle Einbußen entgegen. So zeigten sich nach Behandlung mit E2F2 die Zellviabilität reduziert und die Apoptoserate sowie die Permeabilität des Epithels erhöht. Diese Einschränkungen waren jedoch nur passager bis 7 Tage nach Transfektion sichtbar und reversibel. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Defizite nicht durch E2F2 selbst, sondern durch das Transfektionsreagenz PEI bedingt waren. Weitere funktionelle Defizite könnten durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) verursacht werden. Hier zeigte sich durch E2F2 keine De-Differenzierung im Sinne einer typischen EMT-Marker- Expression. Die vorliegende Arbeit zeigt in einem in vitro Zellmodell die Grundlagen eines vielversprechenden Ansatzes zur Therapie der trockenen AMD: Durch Überexpression eines den Zellzyklus regulierenden Gens (hier E2F2) wurde die RPE-Regeneration angeregt. Analog zur schon zugelassenen Gentherapie des RPEs bei RPE65-assoziierten Netzhautdystrophien durch den Transfer von funktionstüchtigem RPE65-Gen mittels Adeno-assoziierten Viren könnte mittels E2F2, übertragen mit einem lentiviralen Verktor, eine Stimulation des RPEs zur Proliferation möglich sein. Entscheidend ist der möglichst gute Struktur- und Funktionserhalt des Photorezeptor-Bruch-Membran-RPE Komplexes. Eine Therapie sollte daher in frühen Krankheitsstadien erfolgen, um die Progression zu fortgeschrittenen Erkrankungsstadien mit irreversiblem Funktionsverlust zu verzögern oder zu verhindern. N2 - Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of irreversible blindness in the ageing population worldwide. While for wet AMD an approved therapy is available in form of anti-VEGF treatment, the by far more common dry AMD is currently outside the scope of any therapy. A central pathomechanism of AMD is the progressive degeneration of the retinal pigment epithelium (RPE). Rarefication and finally atrophy of the RPE leads to the collapse of the functional unit consisting of RPE, photoreceptors and Bruch’s membrane, resulting in irreversible loss of function. A possible therapeutic strategy to prevent RPE atrophy is to stimulate the post-mitotic RPE to proliferate. The basis of our in vitro investigations is an ARPE-19 cell culture model. To stimulate proliferation, the RPE cells were transfected with E2F2, a cell cycle regulating transcription factor. First, a non-proliferative RPE cell model with spontaneous growth arrest was established. Within two weeks, the formation of zonulae occludentes was observed as a sign of the integrity of the adherent cell monolayer. Chemical transfection of E2F2 under a CMV promoter led to overexpression of E2F2 protein. The proliferation enhancing effect of E2F2 was demonstrated by proliferation markers cyclin D1 and Ki67, the increase in BrdU uptake, and the increase in total cell number after transfection with E2F2. However, the increase in cell proliferation was potentially offset by qualitative and functional losses. After treatment with E2F2, cell viability was reduced, and apoptosis rate and permeability of the epithelium were increased. These shortcomings were only temporarily detectable up to 7 days after transfection and were reversible. Our results suggest that these deficits were not caused by E2F2 itself, but by the transfection reagent PEI. Further functional deficits could be caused by epithelial-mesenchymal transition (EMT). Here, E2F2 did not show any de-differentiation in the form of typical EMT marker expression. The present study shows the basics of a promising approach for the therapy of dry AMD in an in vitro cell model: RPE regeneration was stimulated by overexpression of a gene regulating the cell cycle (here E2F2). Analogous to approved gene therapy of the RPE for RPE65-associated retinal dystrophies through transfer of functional RPE gene by adeno-associated viruses, a lentiviral vector delivering E2F2 could stimulate the RPE to proliferate. It is essential to preserve the structure and function of the photoreceptor-Bruch's membrane-RPE complex. Therapy therefore needs to take place in early stages of the disease to prevent or slow down progression to advanced stages with irreversible loss of function. KW - Netzhaut KW - Senile Makuladegeneration KW - In vitro KW - Regeneration KW - Makuladegeneration KW - E2F2 KW - transcription factor KW - RPE KW - retinal pigment epithelium KW - retina KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-291833 ER -