TY  - THES
A1  - Imdahl, Fabian Dominik
T1  - Development of novel experimental approaches to decipher host-pathogen interaction at the single-cell level
T1  - Entwicklung neuer experimenteller Ansätze zur Entschlüsselung von Wirt-Pathogen-Interaktion auf Einzelzellebene
N2  - Abstract:
COVID-19 has impressively shown how quickly an emerging pathogen can have a massive impact on our entire lives and show how infectious diseases spread regardless of national borders and economic stability. We find ourselves in a post-antibiotic era and have rested too long on the laurels of past research, so today more and more people are dying from infections with multi-resistant germs.
Infections are highly plastic and heterogeneous processes that are strongly dependent on the individual, whether on the host or pathogen side.
Improving our understanding of the pathogenicity of microorganisms and finding potential targets for a completely new class of drugs is a declared goal of current basic research. To tackle this challenge, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is our most accurate tool.
In this thesis we implemented different state of the art scRNA-seq technologies to better understand infectious diseases. Furthermore, we developed a new method which is capable to resolve the transcriptome of a single bacterium. Applying a poly(A)-independent scRNA-seq protocol to three different, infection relevant growth conditions we can report the faithful detection of growth-dependent gene expression patterns in individual Salmonella Typhimurium and Pseudomonas aeruginosa bacteria. The data analysis shows that this method not only allows the differentiation of various culture conditions but can also capture transcripts across different RNA species.
Furthermore, using state of the art imaging and single-cell RNA sequencing technologies, we comprehensively characterized a human intestinal tissue model which in further course of the project was used as a Salmonella enterica serovar Typhimurium infection model. While most infection studies are conducted in mice, lacking a human intestinal physiology, the in vitro human tissue model allows us to directly infer in vivo pathogenesis. Combining immunofluorescent imaging, deep single-cell RNA sequencing and HCR-FISH, applied in time course experiments, allows an unseen resolution for studying heterogeneity and the dynamics of Salmonella infection which reveals details of pathogenicity contrary to the general scientific opinion.
N2  - Zusammenfassung:
COVID-19 hat eindrucksvoll gezeigt, wie schnell ein neu auftretender Erreger massive Auswirkungen auf unser aller Leben haben kann und wie sich Infektionskrankheiten unabhängig von Landesgrenzen und wirtschaftlicher Stabilität ausbreiten. Wir befinden uns in einer post-antibiotischen Ära und haben uns zu lange auf den Lorbeeren der vergangenen Forschung ausgeruht, so dass heute immer mehr Menschen an Infektionen mit multiresistenten Keimen sterben.
Infektionen sind sehr plastische und variable Prozesse, die stark vom Individuum abhängen, sei es auf Seiten des Wirts oder des Erregers. Die Pathogenität von Mikroorganismen besser zu verstehen und potenzielle Angriffspunkte für eine völlig neue Klasse von Arzneimitteln zu finden ist ein erklärtes Ziel der aktuellen Grundlagenforschung. Um diese Herausforderung zu meistern, ist die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) unser präzisestes Werkzeug.
In dieser Arbeit haben wir verschiedene hochmoderne scRNA-seq-Technologien eingesetzt, um Infektionskrankheiten besser zu verstehen. Darüber hinaus haben wir eine neue Methode entwickelt, die in der Lage ist, das Transkriptom eines einzelnen Bakteriums aufzulösen. Durch die Anwendung eines poly(A)-unabhängigen scRNA-seq-Protokolls unter drei verschiedenen, infektionsrelevanten W achstumsbedingungen konnten wir die wachstumsabhängigen Genexpressionsmuster in einzelnen Salmonella Typhimurium- und Pseudomonas aeruginosa- Bakterien zuverlässig nachweisen. Die Datenanalyse zeigt, dass diese Methode nicht nur die Differenzierung verschiedener Kulturbedingungen ermöglicht, sondern auch Transkripte über verschiedene RNA-Spezies hinweg erfassen kann.
Darüber hinaus haben wir unter Verwendung modernster Bildgebungs- und Einzelzell-RNA- Sequenzierungstechnologien ein menschliches Darmgewebemodell umfassend charakterisiert, das im weiteren Verlauf des Projekts als Salmonella Typhimurium-Infektionsmodell verwendet wurde. Während die meisten Infektionsstudien in Mäusen durchgeführt werden, denen die menschliche Darmphysiologie fehlt, ermöglicht uns das in vitro Modell des menschlichen Gewebes direkte Rückschlüsse auf die Pathogenese in vivo. Die Kombination aus immunfluoreszierender Bildgebung, deep single-cell RNA Sequenzierung und HCR-FISH, angewandt in Zeitverlaufsexperimenten, ermöglicht eine bisher ungesehene Auflösung zur Untersuchung von Heterogenität und Dynamik einer Salmonella Infektion, welche Details der Pathogenität entgegen der allgemeinen wissenschaftlichen Meinung offenbaren.
KW  - Salmonella
KW  - Einzelzellanalyse
KW  - Dünndarm
KW  - Gewebemodell
KW  - Single-cell RNA-sequencing
KW  - Infektionsmodell
KW  - Heterogenität von Mikroorganismen
KW  - Pathogenität
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289435
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ye, Liqing
T1  - RNA-RNA interactions in viral genome packaging
T1  - RNA-RNA-Interaktionen bei der viralen Genomverpackung
N2  - RNA is one of the most abundant macromolecules and plays essential roles in numerous biological processes. This doctoral thesis consists of two projects focusing on RNA structure and RNA-RNA interactions in viral genome packaging. In the first project I developed a method called Functional Analysis of RNA Structure (FARS-seq) to investigate structural features regulating genome dimerization within the HIV-1 5’UTR. Genome dimerization is a conserved feature of retroviral replication and is thought to be a prerequisite for binding to the viral structural protein Pr55Gag during genome packaging. It also plays a role in genome integrity and evolution through recombination, and is linked to a structural switch that may regulate genome packaging and translation within cells. Despite its importance for HIV-1 replication, the RNA signals regulating genome dimerization, and the molecular mechanism leading to the selection of the genome dimer over the monomer for packaging are incompletely understood. The FARS-seq method combines RNA structural information obtained by chemical probing with single nucleotide resolution profiles of RNA function obtained by mutational interference. In this way, we found nucleotides that were critical for dimerization, especially within the well-characterized dimerization motif within stem-loop 1 (SL1). We also found stretches of nucleotides that enhanced genome dimerization upon mutation, suggesting their role in negatively regulating dimerization. A structural analysis identified distinct structural signatures within monomeric and dimeric RNA. The dimeric conformation displayed the canonical transactivation response (TAR), PolyA, primer binding site (PBS), and SL1-SL3 stem-loops, and contained a long range U5-AUG interaction. Unexpectedly, in monomeric RNA, SL1 was reconfigured into long- and short-range base-pairings with PolyA and PBS, respectively. Intriguingly, these base pairings concealed the palindromic sequence needed for dimerization and disrupted the internal loop in SL1 previously shown to contain the major packaging motif for Pr55Gag. We therefore rationally introduced mutations into PolyA and PBS, and showed how these regions regulate genome dimerization, and the binding of Pr55Gag in vitro, as well as genome packaging into virions. These findings give insights into late stages of the HIV-1 life cycle and a mechanistic explanation for the link between RNA dimerization and packaging.
In the second project, I developed a proximity ligation and high-throughput sequencing-based method, RNA-RNA seq, which can measure direct (RNA-RNA) and indirect (protein-mediated) interactions. In contrast to existing methods, RNA-RNA seq is not limited by specific protein or RNA baits, nor to a particular crosslinking reagent. The genome of influenza A virus contains eight segments, which assemble into a “7+1” supramolecular complex. However, the molecular details of genome assembly are poorly understood. Our goal is to use RNA-RNA seq to identify the sites of interaction between the eight genomic RNAs of influenza, and to use this information to define the quaternary RNA architecture of the genome. We showed that RNA-RNA seq worked on model substrates, like the HIV-1 Dimerization Initiation Site (DIS) RNA and purified ribosome, as well as influenza A virus infected cells.
N2  - RNA ist eines der am häufigsten vorkommenden Makromoleküle und spielt bei allen biologischen Prozessen eine wesentliche Rolle. Diese Doktorarbeit besteht aus zwei Projekten, die sich auf die RNA-Struktur und RNA-RNA-Interaktionen bei der viralen Genomverpackung konzentrieren. Im ersten Projekt habe ich eine Methode namens Functional Analysis of RNA Structure (FARS-seq) entwickelt, um strukturelle Merkmale zu untersuchen, die die Genom-Dimerisierung innerhalb des HIV-1 5'UTR regulieren. Die Genomdimerisierung ist ein konserviertes Merkmal der retroviralen Replikation und gilt als Voraussetzung für die Bindung an das virale Strukturprotein Pr55Gag während der Genomverpackung. Sie spielt auch eine Rolle bei der Genomintegrität und -evolution durch Rekombination und ist mit einem strukturellen Schalter verbunden, der die Genomverpackung und -translation in Zellen regulieren kann. Trotz der Bedeutung für die HIV-1-Replikation sind die RNA-Signale welche die Genom-Dimerisierung regulieren, und der molekulare Mechanismus der zur Auswahl des Genom-Dimers gegenüber dem Monomer für die Verpackung führt, nur unvollständig verstanden. FARS-seq kombiniert RNA-Strukturinformationen, die durch chemisches Sondieren gewonnen werden, mit Profilen der RNA-Funktion in Einzelnukleotid-Auflösung, die durch Mutationsinterferenz gewonnen werden. Auf diese Weise fanden wir Nukleotide, die für die Dimerisierung kritisch sind, insbesondere innerhalb des gut charakterisierten Dimerisierungsmotivs  von stem-loop 1 (SL1). Wir fanden auch Nukleotidabschnitte, die bei Mutation die Dimerisierung des Genoms verstärkten, was auf ihre Rolle bei der negativen Regulierung der Dimerisierung hindeutet. Eine Strukturanalyse ergab zudem unterschiedliche strukturelle Signaturen innerhalb der RNA von Monomeren und Dimeren. Die dimere Konformation wies die kanonische Transaktivierungsantwort (TAR), PolyA, die Primerbindestelle (PBS) und SL1-SL3-stem loops auf und enthielt eine weitreichende U5-AUG-Interaktion. Unerwarteterweise interagierte SL1 in monomerer RNA mit dem weit entfernten PolyA Signal und der nahegelegenen PBS. Interessanterweise verbargen diese Basenpaarungen die für die Dimerisierung erforderliche palindromische Sequenz und unterbrachen die interne Schleife in SL1, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie das Hauptverpackungsmotiv für Pr55Gag enthält. Wir haben daher auf rationale Weise Mutationen in PolyA und PBS eingeführt und gezeigt, wie diese Regionen die Dimerisierung des Genoms und die Bindung von Pr55Gag in vitro sowie die Verpackung des Genoms in Virionen regulieren. Diese Ergebnisse geben Einblicke in späte Stadien des HIV-1-Lebenszyklus und eine mechanistische Erklärung für die Verbindung zwischen RNA-Dimerisierung und Verpackung. 
Im zweiten Projekt entwickelte ich eine auf Proximity Ligation und Hochdurchsatz-Sequenzierung basierende Methode, RNA-RNA seq, mit der direkte (RNA-RNA) und indirekte (proteinvermittelte) Wechselwirkungen gemessen werden können. Im Gegensatz zu bestehenden Methoden ist RNA-RNA seq nicht durch spezifische Protein- oder RNA Crosslink-Reagenzien eingeschränkt. Das Genom des Influenza-A-Virus besteht aus acht Segmenten, die zu einem supramolekularen "7+1"-Komplex assemblieren. Die molekularen Details des Genomaufbaus sind jedoch kaum bekannt. Unser Ziel ist es, mit Hilfe von RNA-RNA seq die Interaktionsstellen zwischen den acht genomischen RNAs des Influenza-Virus zu identifizieren und somit die quaternäre RNA-Architektur des Genoms zu definieren. Wir haben gezeigt, dass RNA-RNA seq an Modellsubstraten wie der HIV Dimerization Initiation Site (DIS) RNA und gereinigtem Ribosom sowie an mit dem Influenza-A-Virus infizierten Zellen funktioniert.
KW  - RNS-Viren
KW  - RNA-RNA interactions
KW  - Virus infection
KW  - viral genome packaging
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296361
ER  -