TY - JOUR A1 - Kroeber, Jana A1 - Wenger, Barbara A1 - Schwegler, Manuela A1 - Daniel, Christoph A1 - Schmidt, Manfred A1 - Djuzenova, Cholpon S A1 - Polat, Bülent A1 - Flentje, Michael A1 - Fietkau, Rainer A1 - Distel, Luitpold V. T1 - Distinct increased outliers among 136 rectal cancer patients assessed by \(\gamma\)H2AX JF - Radiation Oncology N2 - Background: In recent years attention has focused on \(\gamma\)H2AX as a very sensitive double strand break indicator. It has been suggested that \(\gamma\)H2AX might be able to predict individual radiosensitivity. Our aim was to study the induction and repair of DNA double strand breaks labelled by \(\gamma\)H2AX in a large cohort. Methods: In a prospective study lymphocytes of 136 rectal cancer (RC) patients and 59 healthy individuals were ex vivo irradiated (IR) and initial DNA damage was compared to remaining DNA damage after 2 Gy and 24 hours repair time and preexisting DNA damage in unirradiated lymphocytes. Lymphocytes were immunostained with anti-\(\gamma\)H2AX antibodies and microscopic images with an extended depth of field were acquired. \(\gamma\)H2AX foci counting was performed using a semi-automatic image analysis software. Results: Distinct increased values of preexisting and remaining \(\gamma\)H2AX foci in the group of RC patients were found compared to the healthy individuals. Additionally there are clear differences within the groups and there are outliers in about 12% of the RC patients after ex vivo IR. Conclusions: The \(\gamma\)H2AX assay has the capability to identify a group of outliers which are most probably patients with increased radiosensitivity having the highest risk of suffering radiotherapy-related late sequelae. KW - histone H2AX KW - blood lymphocytes KW - in vivo KW - foci KW - individual radiosensitivity KW - rectal cancer KW - radiotherapy KW - DNA double strand breaks KW - phosphorylation KW - neck cancer KW - oral mucositis KW - DNA damage KW - radiosensitivity KW - repair KW - \(\gamma\)h2ax Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144085 VL - 10 IS - 36 ER - TY - JOUR A1 - Kuger, Sebastian A1 - Flentje, Michael A1 - Djuzenova, Cholpon S. T1 - Simultaneous perturbation of the MAPK and the PI3K/mTOR pathways does not lead to increased radiosensitization JF - Radiation Oncology N2 - Background The mitogen-activated protein kinases (MAPK) and the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathways are intertwined on various levels and simultaneous inhibition reduces tumorsize and prolonges survival synergistically. Furthermore, inhibiting these pathways radiosensitized cancer cells in various studies. To assess, if phenotypic changes after perturbations of this signaling network depend on the genetic background, we integrated a time series of the signaling data with phenotypic data after simultaneous MAPK/ERK kinase (MEK) and PI3K/mTOR inhibition and ionizing radiation (IR). Methods The MEK inhibitor AZD6244 and the dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 were tested in glioblastoma and lung carcinoma cells, which differ in their mutational status in the MAPK and the PI3K/mTOR pathways. Effects of AZD6244 and NVP-BEZ235 on the proliferation were assessed using an ATP assay. Drug treatment and IR effects on the signaling network were analyzed in a time-dependent manner along with measurements of phenotypic changes in the colony forming ability, apoptosis, autophagy or cell cycle. Results Both inhibitors reduced the tumor cell proliferation in a dose-dependent manner, with NVP-BEZ235 revealing the higher anti-proliferative potential. Our Western blot data indicated that AZD6244 and NVP-BEZ235 perturbed the MAPK and PI3K/mTOR signaling cascades, respectively. Additionally, we confirmed crosstalks and feedback loops in the pathways. As shown by colony forming assay, the AZD6244 moderately radiosensitized cancer cells, whereas NVP-BEZ235 caused a stronger radiosensitization. Combining both drugs did not enhance the NVP-BEZ235-mediated radiosensitization. Both inhibitors caused a cell cycle arrest in the G1-phase, whereas concomitant IR and treatment with the inhibitors resulted in cell line- and drug-specific cell cycle alterations. Furthermore, combining both inhibitors synergistically enhanced a G1-phase arrest in sham-irradiated glioblastoma cells and induced apoptosis and autophagy in both cell lines. Conclusion Perturbations of the MEK and the PI3K pathway radiosensitized tumor cells of different origins and the combination of AZD6244 and NVP-BEZ235 yielded cytostatic effects in several tumor entities. However, this is the first study assessing, if the combination of both drugs also results in synergistic effects in terms of radiosensitivity. Our study demonstrates that simultaneous treatment with both pathway inhibitors does not lead to synergistic radiosensitization but causes cell line-specific effects. KW - autophagy KW - radiosensitivity KW - NVP-BEZ235 KW - AZD6244 KW - cell cycle arrest KW - apoptosis Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126104 VL - 10 IS - 214 ER - TY - JOUR A1 - Djuzenova, Cholpon S. A1 - Zimmermann, Marcus A1 - Katzer, Astrid A1 - Fiedler, Vanessa A1 - Distel, Luitpold V. A1 - Gasser, Martin A1 - Waaga-Gasser, Anna-Maria A1 - Flentje, Michael A1 - Polat, Bülent T1 - A prospective study on histone γ-H2AX and 53BP1 foci expression in rectal carcinoma patients: correlation with radiation therapy-induced outcome JF - BMC Cancer N2 - Background The prognostic value of histone γ-H2AX and 53BP1 proteins to predict the radiotherapy (RT) outcome of patients with rectal carcinoma (RC) was evaluated in a prospective study. High expression of the constitutive histone γ-H2AX is indicative of defective DNA repair pathway and/or genomic instability, whereas 53BP1 (p53-binding protein 1) is a conserved checkpoint protein with properties of a DNA double-strand breaks sensor. Methods Using fluorescence microscopy, we assessed spontaneous and radiation-induced foci of γ-H2AX and 53BP1 in peripheral blood mononuclear cells derived from unselected RC patients (n = 53) undergoing neoadjuvant chemo- and RT. Cells from apparently healthy donors (n = 12) served as references. Results The γ-H2AX assay of in vitro irradiated lymphocytes revealed significantly higher degree of DNA damage in the group of unselected RC patients with respect to the background, initial (0.5 Gy, 30 min) and residual (0.5 Gy and 2 Gy, 24 h post-radiation) damage compared to the control group. Likewise, the numbers of 53BP1 foci analyzed in the samples from 46 RC patients were significantly higher than in controls except for the background DNA damage. However, both markers were not able to predict tumor stage, gastrointestinal toxicity or tumor regression after curative RT. Interestingly, the mean baseline and induced DNA damage was found to be lower in the group of RC patients with tumor stage IV (n = 7) as compared with the stage III (n = 35). The difference, however, did not reach statistical significance, apparently, because of the limited number of patients. Conclusions The study shows higher expression of γ-H2AX and 53BP1 foci in rectal cancer patients compared with healthy individuals. Yet the data in vitro were not predictive in regard to the radiotherapy outcome. KW - radiosensitivity KW - peripheral blood lymphocytes KW - DNA repair KW - DNA damage Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125303 VL - 15 IS - 856 ER - TY - THES A1 - Geier, Katja T1 - Durchflusszytometrische Diagnostik bei Verdacht auf Nijmegen Breakage Syndrom T1 - Diagnostic in suspicion of Nijmegen breakage syndrome by flow cytometry N2 - Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine seltene autosomal- rezessive Erkrankung, die durch ein typisches Erscheinungsbild mit Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, Immundefizienz sowie durch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung und eine erhöhte Prädisposition gegenüber malignen Tumoren charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch Mutationen im NBS1-Gen verursacht, welches auf Chromosom 8q21 lokalisiert werden konnte. Das NBS1-Gen Produkt, Nibrin, ist Teil des MRE11-RAD50-Nibrin Proteinkomplexes, welcher eine zentrale Rolle bei der Erkennung und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Das Fehlen von Nibrin führt zu einer fehlerhaften DNA-Reparatur und erklärt die verschiedenen klinischen und zellulären Symptome bei NBS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Daten von 40 Patienten ausgewertet, die im Rahmen der Verdachtsdiagnose eines Nijmegen Breakage Syndroms mit der Durchflusszytometrie untersucht wurden. Für die Unterscheidung zwischen NBS-positiven und NBS-negativen Fällen sind folgende Parameter von diagnostischer Relevanz: 1) der Anteil nichtproliferierender Zellen (G0/G1-Phase-Zelle), welcher bei NBS-Patienten meist deutlich höher sind als bei gesunden Kontrollen. Sie spiegeln bei erhöhten Werten die herabgesetzte Mitogenantwort wider. 2) die G2/GF-Ratio als Maß für Strahlensensitivität, welche bei NBS-Patienten charakteristischerweise erhöht ist. Die Auswertung der Daten erlaubte es in 22 Fällen die Verdachtsdiagnose NBS auszuschließen, da diese für beide Parameter Werte im Normalbereich zeigten. In 16 Fällen ergab sich ein positives Ergebnis mit erhöhtem Anteil nichtproliferierender Zellen und erhöhter Strahlensensitivität. Unter den positiven Fällen konnte bei 9 Patienten die Diagnose des Nijmegen Breakage Syndroms mittels Mutationsanalyse bestätigt werden. Bei 7 Patienten konnte jedoch trotz erhöhter Strahlensensitivität keine Mutation im NBS1-Gen nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Durchflusszytometrie das Vorliegen einer erhöhten Strahlensensitivität eindeutig nachweisen kann. Eine erhöhte Strahlensensitivität ist wiederum ein charakteristisches Merkmal des Nijmegen Breakage Syndroms, da es in direkten Zusammenhang mit dem verursachenden Gendefekt steht. Die Durchflusszytometrie kann daher als ein sinnvolles diagnostisches Verfahren von hoher Sensitivität bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose NBS angesehen und erfolgreich eingesetzt werden. Allerdings ist die Spezifität des Verfahrens sehr viel geringer. Die Methode der Wahl für die Primärdiagnostik des Nijmegen Breakage Syndroms wird in Zukunft daher die Mutationsanalyse sein. N2 - Nijmegen breakage syndrome is a rare autosomal recessive chromosomal instability disorder with hypersensitivity to ionizing radiation and an increased cancer risk. The clinical phenotype is characterized by congenital microcephaly, dysmorphic facial appearance, growth retardation and immunodeficiency. At the cellular level NBS is characterized with increased spontaneous and induced chromosomal breaks and cell cycle aberrations. NBS1, the gene defective in Nijmegen breakage syndrome, is located on chromosome 8q21 and has been cloned. The NBS1 gene codes for the protein nibrin which is a member of the MRE11-RAD50-NBS1 complex, a central player associated with double–strand breaks repair. Most NBS patients are Slavic origin and homozygous for the founder mutation 657del5, which leads to a frameshift and protein truncation. We have studied 40 patients with the clinical suspicion of NBS using a cell cycle based screening assay. Peripheral blood mononuclear cells were exposed to ionizing radiation and incubated for 72 h in the presence of phytohemagglutinin. To decide between NBS-positive and NBS-negative group the following cell cycle parameters were ascertained: 1. proportion of non-proliferation (G0/G1) cells as a measure of the mitogen response. 2. Proportion of first cycle G2-phase cells relative to the growth fraction as a measure of radiosensitivity. 22 cases could assign to the NBS-negative group and 16 cases could assign to the NBS-positive group. 9 cases of the NBS-positive group were confirmed by NBS mutation analysis. In the other 7 cases no NBS-mutation could be found. We conclude that cell cycle testing by flow cytometry is a very sensitive screening procedure for radiosensitivity and can be successfully applied to the diagnostic of Nijmegen breakage syndrome. But the primary diagnostic of NBS is mutation analysis. KW - Durchflusscytometrie KW - Nijmegen Breakage Syndrom KW - Nibrin KW - Chromosomeninstabilitätssyndrome KW - Strahlensensitivität KW - Nijmegen breakage syndrome KW - chromosomal instability disorder KW - nibrin KW - radiosensitivity KW - flow cytometry Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27695 ER - TY - THES A1 - Müller, Birgit T1 - Induktion und Reparatur von DNS-Schäden im Comet-Assay, klonogene Überlebensrate und Mikrokernfrequenz von humanen Zellen unterschiedlicher Herkunft nach Röntgenbestrahlung in vitro T1 - Radiation induced DNA damage and damage repair in human tumor and fibroblast cell lines assessed by the Comet assay, micronucleus assay and colony-forming assay N2 - Die Entwicklung prädiktiver Testverfahren, mit denen vor einer Bestrahlung die Strahlenempfindlichkeit von Normalgeweben und Turmoren bestimmt werden kann, stellt einen wichtigen Forschungsbereich in der Strahlentherapie dar. Mit solchen Testverfahren würde eine individuelle Strahlentherapie möglich, die bei tolerierbarem Nebenwirkungslevel einen maximalen Effekt am Tumor erzielen könnte. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit drei etablierten Testmethoden zur Erkennung von Strahlenschäden an Zellkulturen in vitro. Der Kolonietest, der Mikrokern-Assay und der Comet-Assay wurden mit jeweils acht Zelllinien durchgeführt. Darunter befanden sich Fibroblasten von Patienten mit den hereditären Syndromen Ataxia teleangiektasia und Fanconi-Anämie, zwei Zelllinien von klinisch durchschnittlich strahlensensiblen Patienten und Zellen eines Patienten mit einem AT-ähnlichen Syndrom. Außerdem wurden drei Tumorzelllinien, ein malignes Melanom, ein Chorionkarzinom und ein Glioblastom, getestet. Bei jedem Testverfahren wurde zunächst das Verhalten der einzelnen Zelllinien untersucht und anschließend versucht, Korrelationen zwischen den Verfahren zu finden. Es zeigte sich, dass mit dem Kolonietest, der als Standard unter den prädiktiven Testverfahren gilt, die Zelllinien bezüglich ihrer Strahlensensibilität in einer Reihenfolge angeordnet werden konnten, die der klinischen Erwartung entsprach. Aufgrund bis zu drei Wochen dauernden Inkubationszeiten ist der Kolonietest jedoch für eine klinisch Anwendung ungeeignet. Bei einem Vergleich der Fraktion überlebender Zellen im Kolonietest und dem prozentualen Anteil mikrokernhaltiger Zellen im Mikrokern-Assay nach Bestrahlung mit 1, 2 und 3 Gy konnte für sechs der acht getesteten Zelllinien eine statistisch signifikante Korrelation jeweils innerhalb der einzelnen Zelllinie, nicht jedoch zwischen verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden. Offensichtlich besitzt jede Zelllinie eine unterschiedliche Neigung, Mikrokerne zu bilden, die wiederum dosisabhängig mit der Fraktion überlebender Zellen im Mikrokern-Assay korreliert. Eine sinnvolle Anordnung im Hinblick auf die Strahlensensibilität der einzelnen Zelllinien konnte mit dem Mikrokern-Assay jedoch nicht gezeigt werden. Der Comet-Assay stellt ein gut reproduzierbares mit wenigen Zellen in kurzer Zeit durchführbares Testverfahren dar. Mit Hilfe des Comet-Assays konnte eine signifikante Korrelation zwischen der Fraktion überlebender Zellen im Kolonietest und der Reparaturhalbwertszeit von DNS-Schäden im Comet-Assay für sechs von acht Zelllinien gefunden werden. Diese Ergebnisse wecken zusammen mit anderen aktuellen Studien die Hoffnung, dass mit dem Comet-Assay zumindest für definierte Indikationen in naher Zukunft ein prädiktiver Test für eine klinische Anwendung zur Verfügung stehen wird. N2 - Methods to predict the radioresponse of individual human cancers has long been a major goal of radiation research. The benefits of such a technique would be first to predict the outcome of standard radiotherapy, second, to adjust the prescribed radiation doses to minimize the adverse reaction of normal tissue while maximizing the response of tumor. Spontaneous and radiation-induced genetic instability of 8 cell lines was examined using the single-cell gel electrophoresis (Comet) assay and a micronucleus (MN) test and the results were compared with the clonogenic survival test. The cell lines studied were normal skin fibroblasts derived from 2 cancer patients with normal clinical radiation reaction of the skin, an ataxia telangiectasia (AT) patient, a Fanconi anemia patient and a patient with AT-like syndrome. In addition a malignant melanoma, a chorion carcinoma and a glioblastoma tumor cell lines were studied. As expected, using a colony-forming assay it was possible to rank the tested cell lines according their clinical radiation response. Comparison of the clonogenic survival with the rate of the MN induction revealed a significant correlation for the 6 out of 8 tested cell lines within every cell line. But there was no correlation between different ones. The Comet analysis of in vitro irradiated cells did not revealed any significant correlation between the initial DNA damage and a parameter of SF2 (survival fraction at 2 Gy), however, a significant correlation was found between the clonogenic survival and the DNA repair kinetics for the 6 out of 8 tested cell lines. These data suggest that the Comet assay in vitro could be a useful adjunct to predict clinical radiation reaction. KW - Strahlensensibilität KW - DNS-Reparatur KW - Kolonietest KW - Mikrokern-Assay KW - Comet-Assay KW - radiosensitivity KW - DNA repair KW - Comet assay KW - micronucleus assay KW - colony-forming assay Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18492 ER - TY - THES A1 - Schulte, Stephanie T1 - Strahlensensibilität von Fibroblasten und Lymphozyten bei Brustkrebspatientinnen: Vergleich des alkalischen Comet Assay mit der klinisch beobachteten Hautreaktion nach Bestrahlung T1 - In vitro radiosensitivity measured in lymphocytes and fibroblasts by the comet assay: comparison with clinical acute reactions to radiotherapy in breast cancer patients. N2 - Wichtiges Forschungsthema der letzten Jahre war die Entwicklung eines prädiktiven Testsystems zur Bestimmung der individuellen Strahlenempfindlichkeit von Tumorpatienten im Vorfeld einer Strahlentherapie. Ziel ist eine individuelle Dosisanpassung mit möglichst effizienter Tumorzerstörung bei maximaler Schonung des Normalgewebes. Standardmethode zur Messung der zellulären Strahlenempfindlichkeit ist der Koloniebildungstest, der sich jedoch für eine prädiktive Testung nicht eignet, da es mehrere Wochen, wenn nicht Monate dauert, bis die Resultate vorliegen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob der Comet Assay als prädiktiver Test zur Erfassung der Strahlenempfindlichkeit normaler Gewebe geeignet ist. Dazu wurden bestrahlte Hautfibroblasten und periphere Blutlymphozyten von 30 Brustkrebspatientinnen im Comet Assay analysiert und die Resultate mit den akuten radiogenen Hautreaktionen der Patientinnen verglichen. Vor allem die Versuche mit Lymphozyten ergaben eine gute Korrelation zwischen initialem DNS-Schaden bzw. Schaden nach 40minütiger Reparatur und den klinisch beobachteten frühen Normalgewebsnebenwirkungen. Anhand der in vitro-Ergebnisse konnte klar zwischen durchschnittlich und überdurchschnittlich strahlenempfindlichen Patientinnen unterschieden werden. Bei den Fibroblasten waren die Patientinnen mit durchschnittlichen Reaktionen und die mit stärkeren radiogenen Nebenwirkungen nur im Initialschaden deutlich voneinander verschieden. Der Comet Assay scheint demzufolge ein günstiger Test zu sein, um eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit zu erfassen, vor allem wenn Lymphozyten aus dem peripheren Blut analysiert werden. Er kann schnell und mit wenigen Zellen durchgeführt werden und ist bei standardisierten Versuchsbedingungen gut reproduzierbar. Mit dem Comet Assay ist es möglich, in kurzer Zeit mehrere Malignompatienten auf ihre Radiosensitivität hin zu untersuchen, wobei diese nur eine Blutprobe zur Lymphozytenisolation abgeben müssen. Im Hinblick auf die Anwendung als prädiktiver Test im klinischen Alltag ist die Kombination mit anderen Methoden wie z. B. dem Mikronukleus-Test und der FISH-Technik empfehlenswert, was die Zuverlässigkeit und Aussagekraft der Resultate noch steigern würde. N2 - Considerable interpatient and intertumour heterogeneity in response to ionising radiation is a consistent clinical experience in radiotherapy. One major focus of research in radiobiology is the development of assays to predict individual radiosensitivity of normal and tumour tissues before treatment commences. This could eventually lead to individualization of fractionation schedules. The colony-forming assay has been the gold standard for quantifying cytotoxic damage in normal and tumour cells. But it takes weeks to months to obtain results. The comet assay is a simple, rapid, and sensitive technique to quantify DNA/chromatid-damage in mammalian cells. Purpose of this study was to evaluate its potential as a predictive test for individual radiosensitivity. After irradiation, skin fibroblast and peripheral blood lymphocytes of 30 breast cancer patients were analyzed with the comet assay and the results correlated to the patients´ acute skin reactions. Results of the comet assay in lymphocytes showed a significant correlation with the clinical data when patients were divided into two groups with average and elevated acute reactions. Apart from initial damage, fibroblasts did not show significant differences between the two patient groups. Repeated comet assays in lymphocytes of the same patient drawn before treatment and before and after external radiotherapy demonstrated good reproducibility of the test and no significant impact of preceding radiation treatment. In this cohort of patients, a significant correlation between the in vitro results of the comet assay in lymphocytes and clinical acute reactions was detected. These findings encourage the use of the comet assay as a predictive test for clinical radiosensitivity, especially in relation to other methods like the micronucleus-test or the FISH-technique. KW - Comet Assay KW - Strahlensensibilität KW - Brustkrebs KW - comet assay KW - radiosensitivity KW - breast cancer Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6415 ER -