TY - THES A1 - Stürzebecher, Paulina Elena T1 - Die Rolle von LASP1 in der Pathogenese der Atherosklerose im murinen Modell T1 - The role of LASP1 in the pathogenesis of atherosclerosis in mice N2 - Das regulatorische Gerüst-Protein LASP1, welches aus der Krebsforschung bekannt ist, wurde 2012 in humanen Makrophagen, den Protagonisten der Atherosklerose nachgewiesen. LASP1 ist durch seine Lokalisation an dynamischen Aktinskelettkonstruktionen (vgl. Invadopodien, Podosomen), nachweislich an Zellmigration, Proliferation und Invasionsfähigkeit bestimmter Tumorzellen beteiligt. Aufgrund einer großen Schnittmenge der Entstehungsmechanismen und zugrundeliegenden Signalwegen von Krebserkrankungen und Atherosklerose wurde LASP1 im Zusammenhang der Atherosklerose untersucht. In einem 16 Wochen Hochfettdiätversuch zeigten LASP1.Ldlr-/--Mäuse mehr atherosklerotische Läsionen in der Gesamtaorta als Ldlr-/--Tiere, was eine athero-protektive Rolle von LASP1 nahelegt. Passend hierzu führte Stimulation mit oxLDL in Makrophagen zu einer Hochregulation von LASP1. Zusätzlich internalisierten LASP1-/--Makrophagen signifikant mehr oxLDL im Vergleich zu LASP1-exprimierenden Zellen. Analog zu den Daten aus der Krebsforschung konnte eine reduzierte endotheliale Adhäsion sowie chemotaktische Migration von Ldlr.LASP1-/--Monozyten im Vergleich zu Ldlr-/-- Monozyten festgestellt werden. Dies ließe isoliert betrachtet eine pro-atherogene Rolle von LASP1 vermuten. Ein Nachweis von LASP1 im Zellkern von BMDMs konnte, zusätzlich zum fehlenden Shuttelproteinpartner ZO-2, nicht erbracht werden. Die Interaktion von LASP1 mit Transkriptionsfaktoren scheint daher unwahrscheinlich. Kongruent mit diesen Ergebnissen zeigte sich keine Veränderung der Transkription, der Proteinexpression sowie Sekretion von TNF! und ADAM17 durch den LASP1-KO. Insgesamt kommt LASP1 eine zweifellos komplexe Rolle in der Atherogenese zu. Die Ergebnisse der HFD-Versuche legen nahe, dass die primär anti-atherosklerotischen Einflüsse von LASP1 in vivo gegenüber den eher pro-atherosklerotischen Effekten des Proteins in vitro überwiegen. N2 - As of today, the regulatory scaffold protein LASP1 is mainly known from cancer research. Through its localization at dynamic actin skeletal constructs (cf. invadopodia, podosomes), LASP1 has been shown to be involved in cell migration, proliferation, and invasiveness of certain tumor cells. In 2012, LASP1 was detected in human macrophages, the protagonists of atherosclerosis. Because of a large intersection of mechanisms and signaling pathways of cancer and atherosclerosis, we further explored the role of LASP1 in the context of atherosclerosis. In a 16-week high-fat diet experiment, LASP1.Ldlr-/- mice showed more atherosclerotic lesions in the total aorta than Ldlr-/- animals, suggesting an athero-protective role of LASP1. In vitro, LASP1-/- macrophages internalized significantly more oxLDL than LASP1 positive cells. LASP1 did not shuttle in the nucleus of bone marrow derived macrophages. Thus, the interaction of LASP1 with transcription factors seems unlikely. Congruent with these results, LASP1-KO had no effects on the transcription, protein expression, or secretion of TNFα and ADAM17. In accordance with the data from cancer research, reduced endothelial adhesion as well as chemotactic migration of Ldlr.LASP1-/- monocytes was detected compared to Ldlr-/-- monocytes. These findings on the other hand would suggest a pro-atherogenic role of LASP1. Overall, LASP1 undoubtedly has a complex role in atherogenesis. The results of the HFD experiments suggest that the primarily anti-atherosclerotic influences of LASP1 in vivo predominate over the more pro-atherosclerotic effects of the protein in vitro. KW - Arteriosklerose KW - Schaumzelle KW - Maus KW - Monozyt KW - lasp Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239353 ER - TY - THES A1 - Englert, Nils T1 - Die Rolle der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in der Lungenfibrose der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in murine lung fibrosis N2 - Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) stellt eine chronische Krankheit mit einer schlechten Prognose dar. Die Erkrankung zeichnet sich durch ein dysfunktionales Alveolarepithel, die Formation von α-smooth muscle actin (α-SMA)-positiven Myofibroblasten, eine starke Kollagendeposition sowie eine fehlgeleitete Inflammation aus. In der Vermittlung dieser pro-fibrotischen Effekte spielt das Zytokin transforming growth factor β (TGF-β) eine Schlüsselrolle. Aufgrund des tödlichen Verlaufs der IPF und der limitierten Therapieoptionen ist die Entdeckung neuer Behandlungsansätze erforderlich. Der NO/cGMP-Signalweg ist in der Modulation grundlegender physiologischer Vorgänge wie der Blutdruckregulation und der Peristaltik involviert. Hierbei spielt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) als NO-Rezeptor eine fundamentale Rolle. In der Lunge wird die NO-GC in glatten Muskelzellen und Perizyten exprimiert. Während das Enzym in glatten Muskelzellen die Relaxation der glatten Muskulatur vermittelt, reguliert die NO-GC in Perizyten die Angiogenese, die Kapillardurchlässigkeit und den Blutfluss. Neben den physiologischen Aufgaben wurden anti-fibrotische sowie anti-inflammatorische Effekte der NO-GC in Herz, Leber, Niere und Haut beschrieben. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit die NO-GC auf eine anti-fibrotische und anti-inflammatorische Bedeutung in der Lungenfibrose der Maus überprüft. Hierzu wurden Wildtyp- (WT) und globale NO-GC-Knockout-Mäuse (GCKO) untersucht. Die Fibrose wurde durch einmalige, orotracheale Bleomycin-Gabe induziert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Tag 7 und 21) untersucht. Unbehandelte (Tag 0) Tiere dienten als Kontrolle. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die NO-GC auf eine anti-fibrotische Wirkung untersucht. Mittels Immunfluoreszenz wurde das Verhalten der α-SMA-positiven Myofibroblasten in den platelet-derived growth factor receptor β (PDGFRβ)-positiven fibrotischen Regionen untersucht. Der Kollagengehalt wurde mithilfe eines Hydroxyprolin-Kollagenassays ermittelt. Die untersuchten Fibrose-Kriterien waren in beiden Genotypen an Tag 21 stärker ausgeprägt als an Tag 7. An Tag 21 konnten im GCKO mehr α-SMA-positive Myofibroblasten, ausgeprägtere PDGFRβ-positive fibrotische Areale und ein höherer Kollagengehalt als im WT festgestellt werden. Zudem zeigten die GCKO-Tiere ein schlechteres Überleben als WT-Mäuse. Diese Ergebnisse wiesen auf eine überschießende fibrotische Antwort im GCKO und somit auf eine anti-fibrotische Wirkung der NO-GC in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin. Dass an Tag 21 die Fibrose im GCKO stärker ausfiel als im WT, konnte mit dem signifikant höheren TGF-β-Gehalt in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) im GCKO erklärt werden. Das Fehlen der NO-GC im GCKO könnte zu einem Wegfall der Inhibierung der TGF-β-vermittelten, pro-fibrotischen Effekte durch die NO-GC führen. Weitere Studien sind erforderlich, um die Hypothese zu belegen und zugrundeliegende Mechanismen aufzuklären. Die de novo Entstehung von Myofibroblasten, die maßgeblich an der Kollagensynthese beteiligt sind, stellt ein entscheidendes Fibrose-Merkmal dar. Umso bedeutender ist die Identifikation zweier Myofibroblasten-Subtypen, die sich in Lokalisation, NO-GC-Expression und Herkunft unterscheiden: (1) interstitielle, NO-GC-positive Myofibroblasten, die von Perizyten abstammen und Kollagen Typ I produzieren, und (2) intra-alveoläre, NO-GC-negative Myofibroblasten, deren Ursprung noch nicht abschließend geklärt ist. Die Anwesenheit beider Myofibroblasten-Typen konnte zu beiden untersuchten Zeitpunkten nach Bleomycin-Gabe bestätigt werden. Die NO-GC-Expression der Alveolarwand-ständigen Myofibroblasten, deren Abstammung von NO-GC-positiven Perizyten sowie deren dauerhafte Präsenz sprechen für eine relevante Rolle der NO-GC in der murinen Lungenfibrose. In weiteren Untersuchungen müssen die exakten Funktionen und spezifische Marker der Myofibroblasten-Subtypen identifiziert werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die NO-GC auf anti-inflammatorische Effekte in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Mittels HE-Färbung und Immunfluoreszenz wurden lymphozytäre Infiltrate an Tag 21 im GCKO festgestellt, was auf einen modulatorischen Einfluss der NO-GC auf das Immunsystem hindeutete. An Tag 21 wurden in der BALF von GCKO-Tieren signifikant mehr Gesamtimmunzellen, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten als im WT gezählt, was auf eine starke Einwanderung von Immunzellen und somit auf eine ausgeprägte Entzündung in GCKO-Lungen hinwies. Folglich könnte die NO-GC eine anti-inflammatorische Rolle über die Regulation der Immigration von Immunzellen in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose spielen. In der Literatur werden pro- und anti-fibrotische Effekte der Immunzellen in der murinen Lungenfibrose diskutiert. Durch Korrelationsanalysen wurde ein positiver Zusammenhang zwischen der Gesamtimmunzellzahl und der TGF-β-Konzentration an Tag 21 festgestellt. In verschiedenen Studien wurde ein pro-fibrotischer Einfluss der Immunzellen über die Aktivierung/Sekretion von TGF-β beschrieben. Die Abwesenheit der NO-GC im GCKO könnte also über die verstärkte Immigration von Immunzellen in einem erhöhten TGF-β-Gehalt resultieren und so zu einer überschießenden fibrotischen Reaktion an Tag 21 führen. Auf welche Weise die NO-GC die Einwanderung der Immunzellen in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose beeinflusst, muss in weiteren Studien untersucht werden. Zusammenfassend deuten die Daten dieser Arbeit auf eine anti-inflammatorische und anti-fibrotische Rolle der NO-GC in der Lungenfibrose der Maus hin. N2 - Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic disease with poor prognosis. The illness is characterized by a dysfunctional alveolar epithelium, formation of α-smooth muscle actin (α-SMA)-positive myofibroblasts, exuberant deposition of collagen, and a dysregulated inflammation. The cytokine transforming growth factor β (TGF-β) is a key player in mediating these pro-fibrotic effects. Due to the fatal course and the limited therapeutic options, new therapeutic approaches must be researched. NO/cGMP signaling modulates fundamental physiological processes like the regulation of blood pressure and peristalsis. Here, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a decisive role as the receptor for NO. In the lung, smooth muscle cells and pericytes express NO-GC. Whereas the enzyme in smooth muscle cells mediates relaxation of smooth muscle, NO-GC in pericytes regulates angiogenesis, capillary permeability, and blood flow. Beside physiological tasks, anti-fibrotic and anti-inflammatory effects of NO-GC have been demonstrated in heart, liver, and skin. Therefore, as part of this work, NO-GC was tested for an anti-fibrotic and anti-inflammatory role in murine lung fibrosis. For this purpose, wild type (WT) and global NO-GC knockout mice (GCKO) were used. Fibrosis was induced by a single orotracheal dose of bleomycin and investigated at different time points (day 7 and 21). Untreated (day 0) animals served as controls. In the first part of this work, immunofluorescence was used to study the performance of α-SMA-positive myofibroblasts in platelet-derived growth factor receptor β (PDGFRβ)-positive fibrotic regions. Hydroxyproline assay was performed to quantify the collagen content. In both genotypes, the fibrosis criteria examined were more pronounced at day 21 than at day 7. At day 21, more α-SMA-positive myofibroblasts, more pronounced PDGFRβ-positive fibrotic areas and a higher collagen content could be detected in the GCKO compared to the WT. In addition, GCKO animals showed poorer survival than WT mice. These results indicated an exaggerated fibrotic response in the GCKO and, thus, an anti-fibrotic effect of NO-GC in bleomycin-induced lung fibrosis. At day 21, a significantly higher TGF-β content in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was determined in GCKO compared to WT. Thus, the more pronounced fibrosis in GCKO compared to WT could be explained at day 21. Consequently, the absence of NO-GC in GCKO could lead to an omission of the inhibition of TGF-β-mediated pro-fibrotic effects by NO-GC. Further studies are required to confirm this hypothesis and to clarify the underlying mechanisms. De novo formation of myofibroblasts, which are substantially involved in collagen synthesis, constitutes an essential fibrotic feature. Therefore, the identification of two myofibroblast subtypes, which differ in localization, expression of NO-GC and origin, is even more crucial: (1) interstitial, NO-GC-positive myofibroblasts, which derive from pericytes and produce collagen type I, and (2) intra-alveolar, NO-GC-negative myofibroblasts, whose lineage has not been finally clarified yet. Appearance of both types of myofibroblasts could be observed at both assessed time points after bleomycin treatment. NO-GC expression of intra-alveolar myofibroblasts, their descent from pericytes and permanent presence indicate a relevant role of NO-GC in murine lung fibrosis. In further studies, exact function and specific marker of myofibroblast subtypes need to be identified. In the second part of this work, NO-GC was investigated for anti-inflammatory effects in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Using HE staining and immunofluorescence, lymphocytic infiltrates were detected in GCKO at day 21, indicating a modulatory influence of NO-GC on the immune system. At day 21, significantly more total immune cells, lymphocytes and neutrophils were counted in the BALF of GCKO animals than in the WT. This suggests a strong immigration of immune cells and, thus, a pronounced inflammation in GCKO lungs. Consequently, NO-GC could play an anti-inflammatory role via regulation of immune cell immigration in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Pro- and anti-fibrotic effects of immune cells in murine pulmonary fibrosis are discussed in the literature. Performing correlation analyses, a positive correlation was found between total immune cell count and TGF-β concentration at day 21. Several studies, have described a pro-fibrotic influence of immune cells via activation/secretion of TGF-β. Thus, the absence of NO-GC in GCKO could result in elevated TGF-β levels via increased immune cell immigration, leading to an exaggerated fibrotic response at day 21. The way in which NO-GC influences immune cell immigration in bleomycin-induced pulmonary fibrosis needs to be investigated in further studies. In conclusion, the data of this work suggest an anti-inflammatory and anti-fibrotic role of NO-GC in murine pulmonary fibrosis. KW - Lunge KW - Fibrose KW - NO-GC KW - TGF-β KW - Guanylatcyclase KW - Maus Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348054 ER - TY - THES A1 - Häbich, Hannes Jan T1 - Die kardialen Auswirkungen einer SPRED2-Defizienz im Mausmodell T1 - The cardiac effects of a SPRED2 deficiency in the mouse model N2 - SPRED 2 wirkt inhibitorisch auf den Ras/ERK-MAPK-Signalweg. Im Knockout Mausmodell zeigen sich einige schwerwiegende phänotypische Eigenschaften, unter anderem zeigen sich ein genereller Minderwuchs, veränderte hormonelle Regelkreise, neurologische Auffälligkeiten, eine deutlich verringerte Lebenserwartung, sowie kardiale Veränderungen. Besonders schwerwiegende SPRED 2 KO typische Ausprägungen im Herzen sind hierbei eine myokardiale Fibrosierung, eine myokardiale Hypertrophie und Herzrhythmusstörungen. In dieser Arbeit wurden insbesondere kardiale Veränderungen auf Zell- und Proteinebene untersucht. Zur Proteinanalyse der Kardiomyozyten wurden Western Blots und eine Schnittbildgebung angefertigt. Für eine funktionelle Untersuchung wurden isolierte vitale Kardiomyozyten mittels Fluoreszenzfarbstoffen untersucht und unter elektrischer Stimulation beobachtet. Desweiteren wurden isolierte Mitochondrien auf ihren Stoffwechsel und eventuelle Defekte hin analysiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass junge SPRED2 KO Mäuse keine wesentlichen hämodynamischen Einschränkungen aufweisen und eine gute Kompensationsfähigkeit gegenüber einer Nachlaststeigerung aufweisen. Auch gezeigt werden konnte, dass Veränderungen im Rahmen der Zellkontraktion beim Kalziumhaushalt und Membranpotential existieren und im Zusammenhang mit einer verminderten Expression von SERCA und CaV1.2 stehen. Bei der Untersuchung von Mitochondrien konnten keine wesentlichen Defizite der mitochondrialen Funktion der SPRED 2 KO Mäuse gefunden werden. In diesem Zusammenhang ist die bekannte Störung der Autophagie am ehesten Ursache für eine gesteigerte Fibrosierung, sowie der gesteigerten Apoptose der Kardiomyozyten. In Folge dessen könnten die oben beschriebenen Veränderungen des Kalziumhaushaltes der Kardiomyozyten stehen und letztendlich über maligne Herzrhythmusstörungen zum vorzeitigen Versterben führen. N2 - SPRED 2 has an inhibitory effect on the Ras/ERK-MAPK signaling pathway. In the knockout mouse model, some severe phenotypic features are shown, among others a general short stature, altered hormonal regulatory circuits, neurological abnormalities, a significantly reduced life expectancy, and cardiac changes. Especially severe SPRED 2 KO typical manifestations in the heart are myocardial fibrosis, myocardial hypertrophy and cardiac arrhythmias. In this work, cardiac changes at the cellular and protein levels were studied in particular. For protein analysis of the cardiomyocytes, Western blots and cross-sectional imaging were performed. For a functional study, isolated vital cardiomyocytes were examined by fluorescent dyes and observed under electrical stimulation. Furthermore, isolated mitochondria were analyzed for metabolism and possible defects. It was shown that young SPRED2 KO mice do not exhibit significant hemodynamic limitations and show a good ability to compensate for the increase in afterload. Moreover, it was shown that alterations in cell contraction exist in calcium balance and membrane potential and are associated with decreased expression of SERCA and CaV1.2. When mitochondria were examined, no significant deficits in mitochondrial function were found in SPRED 2 KO mice. In this context, the known disruption of autophagy is most likely the cause of increased fibrosis, as well as increased apoptosis of cardiomyocytes. As a consequence, the above calcium balance of the cardiomyocytes ultimately lead to premature death via malignant cardiac arrhythmias. KW - Spred-Proteine KW - Herzinsuffizienz KW - TAC KW - Noonan-Syndrom KW - Maus KW - Herz Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346286 ER - TY - THES A1 - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica T1 - Pathomechanisms underlying ischemic stroke T1 - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles N2 - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption. In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment. N2 - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt. Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist. Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sinusthrombose KW - thrombo-inflammation KW - ischemic stroke KW - blood brain barrier KW - CVT KW - platelets Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727 ER - TY - THES A1 - Eckert, Ina-Nathalie T1 - Molecular markers of myeloid-derived suppressor cells and their functional role for homing and in disease models in mice T1 - Molekulare Marker von myeloiden Suppressorzellen und ihre funktionelle Rolle für deren zielgerichtete Migration und bei Krankheitsmodellen in Mäusen N2 - MDSCs are suppressive immune cells with a high relevance in various pathologies including cancer, autoimmunity, and chronic infections. Surface marker expression of MDSCs resembles monocytes and neutrophils which have immunostimulatory functions instead of suppressing T cells. Therefore, finding specific surface markers for MDSCs is important for MDSC research and therapeutic MDSC manipulation. In this study, we analyzed if the integrin VLA-1 has the potential as a novel MDSC marker. VLA-1 was expressed by M-MDSCs but not by G-MDSCs as well as by Teff cells. VLA-1 deficiency did not impact iNOS expression, the distribution of M-MDSC and G-MDSC subsets, and the suppressive capacity of MDSCs towards naïve and Teff cells in vitro. In mice, VLA-1 had no effect on the homing capability of MDSCs to the spleen, which is a major reservoir for MDSCs. Since the splenic red pulp contains collagen IV and VLA-1 binds collagen IV with a high affinity, we found MDSCs and Teff cells in this area as expected. We showed that T cell suppression in the spleen, indicated by reduced T cell recovery and proliferation as well as increased apoptosis and cell death, partially depended on VLA-1 expression by the MDSCs. In a mouse model of multiple sclerosis, MDSC injection prior to disease onset led to a decrease of the disease score, and this effect was significantly reduced when MDSCs were VLA-1 deficient. The expression of Sema7A by Teff cells, a ligand for VLA-1 which is implicated in negative T cell regulation, resulted in a slightly stronger Teff cell suppression by MDSCs compared to Sema7A deficient T cells. Live cell imaging and intravital 2-photon microscopy showed that the interaction time of MDSCs and Teff cells was shorter when MDSCs lacked VLA 1 expression, however VLA-1 expression had no impact on MDSC mobility. Therefore, the VLA-1-dependent interaction of MDSC and Teff cells on collagen IV in the splenic red pulp is implicated MDSC-mediated Teff cell suppression. N2 - MDSCs sind suppressive Immunzellen mit hoher Relevanz bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, Autoimmunerkrankungen und chronischen Infektionen. Die Expression der Oberflächenmarker von MDSCs ähnelt Monozyten und Neutrophilen, welche im Gegensatz zu MDSCs immunstimulatorische Funktionen haben. Daher es wichtig für die Forschung und die therapeutische Manipulation von MDSCs, spezifische Oberflächenmarker für MDSCs zu identifizieren. In dieser Studie haben wir analysiert, ob das Integrin VLA-1 das ein möglicher neuer MDSC-Marker ist. Effektor-T-Zellen und M-MDSCs, aber nicht G-MDSCs exprimierten VLA-1. VLA-1-Defizienz hatte keinen Einfluss auf die iNOS-Expression, die Verteilung der M-MDSC- und G-MDSC-Subpopulationen und die suppressive Kapazität von MDSCs gegenüber naiven und Effektor-T-Zellen in vitro. In Mäusen hatte VLA-1 keinen Einfluss auf die Fähigkeit zur zielgerichteten Migration von MDSCs zur Milz, welche ein wichtiges Reservoir für MDSCs ist. Da die rote Pulpa der Milz Kollagen IV enthält und VLA-1 Kollagen IV mit hoher Affinität bindet, fanden wir wie erwartet MDSCs und Effektor-T-Zellen in diesem Bereich. Wir konnten zeigen, dass die T Zell-Suppression in der Milz, indiziert durch verringerte T-Zell-Wiederfindung und Proliferation sowie erhöhte Apoptose und Zelltod, teilweise von der VLA 1-Expression von MDSCs abhing. In einem Mausmodell für Multiple Sklerose führte die MDSC-Injektion vor Induktion der Krankheit zu einer Verringerung des Krankheits-Scores, und dieser Effekt war signifikant verringert, wenn MDSCs VLA-1-defizient waren. Die Expression von Sema7A durch Effektor-T-Zellen, ein Ligand für VLA-1, der mit negativer T Zell-Regulierung assoziiert ist, führte zu einer etwas stärkeren Effektor-T-Zell-Suppression durch MDSCs im Vergleich zu Sema7A-defizienten T-Zellen. Live-Cell-Imaging und intravitale 2-Photonen-Mikroskopie zeigten eine kürzere Interaktionszeit von MDSCs und Effektor-T-Zellen bei VLA-1 defizienten MDSCs, jedoch hatte die VLA-1-Expression keinen Einfluss auf die MDSC-Mobilität. Die Verwendung von VLA-1 bei der Identifizierungsstrategie von in vitro generierten MDSCs führte zu einer reineren Trennung von iNOS+ und Arg1+ Zellen von Zellen ohne Expression von Suppressormarkern. In Brusttumor-tragenden Mäusen und BCG-infizierten Mäusen, welche etablierte Modelle für die MDSC-Generierung in vivo sind, wurde VLA-1 nicht von endogenen MDSCs hochreguliert, daher ist VLA-1 möglicherweise kein geeigneter MDSC Marker in vivo. In BCG-infizierten Mäusen fanden wir CD16.2 (FcγRIV), welcher möglicherweise an der MDSC-vermittelten Immunsuppression beteiligt ist, in M-MDSCs und G-MDSCs hochreguliert, daher könnte CD16.2 ein neuer potenzieller MDSC-Marker in vivo sein. Die Analyse veröffentlichter RNA-Sequenzierungs- und Proteomikdaten von MDSCs ergab Markerkandidaten, die von MDSCs hochreguliert wurden, einschließlich VCAN und FCN1. KW - Immunologie KW - Immunsuppression KW - Maus KW - Myeloid-derived suppressor cells KW - Integrin KW - VLA-1 KW - Homing Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319974 ER - TY - THES A1 - Yuan, Xidi T1 - Aging and inflammation in the peripheral nervous system T1 - Altern und Entzündung im peripheren Nervensystem N2 - Aging is known to be a risk factor for structural abnormalities and functional decline in the nervous system. Characterizing age-related changes is important to identify putative pathways to overcome deleterious effects and improve life quality for the elderly. In this study, the peripheral nervous system of 24-month-old aged C57BL/6 mice has been investigated and compared to 12-month-old adult mice. Aged mice showed pathological alterations in their peripheral nerves similar to nerve biopsies from elderly human individuals, with nerve fibers showing demyelination and axonal damage. Such changes were lacking in nerves of adult 12-month-old mice and adult, non-aged humans. Moreover, neuromuscular junctions of 24-month-old mice showed increased denervation compared to adult mice. These alterations were accompanied by elevated numbers of macrophages in the peripheral nerves of aged mice. The neuroinflammatory conditions were associated with impaired myelin integrity and with a decline of nerve conduction properties and muscle strength in aged mice. To determine the pathological impact of macrophages in the aging mice, macrophage depletion was performed in mice by oral administration of CSF-1R specific kinase (c-FMS) inhibitor PLX5622 (300 mg/kg body weight), which reduced the number of macrophages in the peripheral nerves by 70%. The treated mice showed attenuated demyelination, less muscle denervation and preserved muscle strength. This indicates that macrophage-driven inflammation in the peripheral nerves is partially responsible for the age-related neuropathy in mice. Based on previous observations that systemic inflammation can accelerate disease progression in mouse models of neurodegenerative diseases, it was hypothesized that systemic inflammation can exacerbate the peripheral neuropathy found in aged mice. To investigate this hypothesis, aged C57BL/6 mice were intraperitoneally injected with a single dose of lipopolysaccharide (LPS; 500 μg/kg body weight) to induce systemic inflammation by mimicking bacterial infection, mostly via activation of Toll-like receptors (TLRs). Altered endoneurial macrophage activation, highlighted by Trem2 downregulation, was found in LPS injected aged mice one month after injection. This was accompanied by a so far rarely observed form of axonal perturbation, i.e., the occurrence of “dark axons” characterized by a damaged cytoskeleton and an increased overall electron density of the axoplasm. At the same time, however, LPS injection reduced demyelination and muscle denervation in aged mice. Interestingly, TREM2 deficiency in aged mice led to similar changes to LPS injection. This suggests that LPS injection likely mitigates aging-related demyelination and muscle denervation via Trem2 downregulation. Taken together, this study reveals the role of macrophage-driven inflammation as a pathogenic mediator in age-related peripheral neuropathy, and that targeting macrophages might be an option to mitigate peripheral neuropathies in aging individuals. Furthermore, this study shows that systemic inflammation may be an ambivalent modifier of age-related nerve damage, leading to a distinct type of axonal perturbation, but in addition to functionally counteracting, dampened demyelination and muscle denervation. Translationally, it is plausible to assume that tipping the balance of macrophage polarization to one direction or the other may determine the functional outcome in the aging peripheral nervous system of the elderly. N2 - Es ist bekannt, dass das Altern ein Risikofaktor für strukturelle Veränderungen und Funktionsstörungen des Nervensystems ist. Die Charakterisierung altersbedingter Veränderungen ist wichtig, um mögliche Wege zu identifizieren, um schädliche Auswirkungen zu überwinden und die Lebensqualität älterer Menschen zu verbessern. In dieser Studie wurde das periphere Nervensystem von 24 Monate alten gealterten C57BL/6-Mäusen untersucht und mit 12 Monate alten adulten Mäusen verglichen. Gealterte Mäuse zeigten ähnliche pathologische Veränderungen in ihren peripheren Nerven wie Nervenbiopsien älterer Menschen, wobei die Nervenfasern eine Demyelinisierung und axonale Schädigung zeigten. Bei den Nerven von adulten 12 Monate alten Mäusen und nicht gealterten Menschen fehlten solche Veränderungen. Darüber hinaus wiesen die neuromuskulären Endplatten von 24 Monate alten Mäusen im Vergleich zu adulten Mäusen eine erhöhte Denervation auf. Diese Veränderungen wurden von einer erhöhten Anzahl von Makrophagen in den peripheren Nerven gealterter Mäuse begleitet. Die neuroinflammatorischen Bedingungen waren mit einer Beeinträchtigung der Myelinintegrität, einer Abnahme der Nervenleitungseigenschaften und der Muskelkraft bei gealterten Mäusen verbunden. Um den pathologischen Einfluss von Makrophagen bei alternden Mäusen zu bestimmen, wurde die Makrophagen-Depletion bei Mäusen durch orale Verabreichung des CSF-1R-spezifischen Kinase-Inhibitors (c-FMS) PLX5622 (300 mg/kg Körpergewicht) durchgeführt, welche die Anzahl der Makrophagen in den peripheren Nerven um 70% reduzierte. Die behandelten Mäuse zeigten eine verminderte Demyelinisierung, eine reduzierte Muskeldenervation und einen Erhalt der Muskelkraft. Dies deutet darauf hin, dass die durch Makrophagen verursachte Entzündung in den peripheren Nerven teilweise für die altersbedingte Neuropathie bei Mäusen verantwortlich ist. Auf der Grundlage früherer Beobachtungen, dass systemische Entzündungen das Fortschreiten der Krankheit in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen beschleunigen können, wurde die Hypothese aufgestellt, dass systemische Entzündungen die periphere Neuropathie in gealterten Mäusen verschlimmern können. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde gealterten C57BL/6-Mäusen eine Einzeldosis Lipopolysaccharid (LPS; 500 μg/kg Körpergewicht) intraperitonal injiziert, um eine systemische Entzündung durch Nachahmung einer bakteriellen Infektion, meist über die Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLRs), zu induzieren. Eine veränderte endoneuriale Makrophagenaktivierung, die durch eine reduzierte Trem2-Expression hervorgehoben wird, konnte bei LPS-injizierten gealterten Mäusen einen Monat nach der Injektion gefunden werden. Dies ging einher mit einer bisher selten beobachteten Form der axonalen Perturbation, d.h. dem Auftreten von "dunklen Axonen", die sich durch ein geschädigtes Zytoskelett und eine erhöhte Gesamtelektronendichte des Axoplasmas auszeichnen. Gleichzeitig verringerte die LPS-Injektion jedoch die Demyelinisierung und Muskeldenervation bei gealterten Mäusen. Interessanterweise führte die TREM2 Defizienz bei gealterten Mäusen zu vergleichbaren Veränderungen wie die LPS-Injektion. Dies deutet darauf hin, dass die LPS-Injektion die alterungsbedingte Demyelinisierung und Muskeldenervierung über die Trem2 Herunterregulation abschwächt. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Rolle der Makrophagen-getriebenen Entzündung als pathogener Mediator bei der altersbedingten peripheren Neuropathie. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die gezielte Behandlung von Makrophagen eine Option zur Linderung peripherer Neuropathien bei alternden Menschen sein könnte. Darüber hinaus zeigt diese Studie, dass die systemische Entzündung ein ambivalenter Modifikator der altersbedingten Nervenschädigung sein kann, der zu einer bestimmten Art von axonaler Perturbation führt, aber zusätzlich zu einer funktionell entgegenwirkenden, weniger schweren Demyelinisierung und Muskeldenervation. Translatorisch ist es plausibel anzunehmen, dass eine Veränderung des Gleichgewichts der Makrophagenpolarisation in die eine oder andere Richtung das funktionelle Ergebnis im alternden peripheren Nervensystem der älteren Menschen bestimmen kann. KW - Maus KW - Peripheres Nervensystem KW - Altern KW - Immunsystem KW - macrophages KW - peripheral nervous system KW - aging KW - neuroinflammation KW - Trem2 KW - systemic inflammation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237378 ER - TY - THES A1 - Kiene, Carmen T1 - Immunozytogenetische Analysen an Interphase-Zellen und Meiose-Stadien der Maus T1 - Immunocytogenetic analysis of mouse interphase cells and meiotic stages N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 5-Methylcytosin Immunofärbung zytogenetische Analysen an Metaphasechromosomen aus der Mitose, an Interphase-Zellen verschiedener Organe und an Meiose-Stadien der Maus (Mus musculus) zur Detektion hypermethylierter DNA durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine C-Bänderung an Metaphasechromosomen und Meiose-Stadien zum Nachweis von konstitutivem Heterochromatin. N2 - In the present work, 5-methylcytosine immunostaining was used to perform cytogenetic analysis on metaphase chromosomes from mitosis, on interphase cells from various organs and on meiotic stages of the mouse (Mus musculus) to detect hypermethylated DNA. In addition, C-banding was performed on metaphase chromosomes and meiosis stages to detect constitutive heterochromatin. KW - Cytogenetik KW - Maus KW - Immunfluoreszenz KW - Meiose KW - Zellkern KW - DNA-Methylierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279109 ER - TY - THES A1 - Auth, Charlotte Sophie T1 - Die Auswirkungen von Tph2-Defizienz und negativen frühen Umwelterfahrungen auf Angstverhalten in weiblichen Mäusen T1 - Differential anxiety-related behaviour and brain activation in Tph2-deficient female mice exposed to adverse early environment N2 - Angsterkrankungen gehören zu den am weitesten verbreiteten psychischen Erkrankungen und stellen eine beträchtliche soziale und wirtschaftliche Herausforderung für unsere Gesellschaft dar. Aversive frühe Erfahrungen sind ein bekannter Risikofaktor für die Entwicklung verschiedener psychischer Erkrankungen, insbesondere Angststörungen. Während der frühen Entwicklung findet die Programmierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden- (HHN)-Achse, die die Ausschüttung des Stresshormons Cortisol in Menschen bzw. Corticosteron in Mäusen steuert, statt. Wenn Individuen in dieser kritischen Phase Stress ausgesetzt sind, wird die regelrechte Ausbildung der HHN-Achse gestört, was zu dysregulierten Verhaltensantworten auf Stressreize im späteren Leben führen kann. Das Serotonin (5-HT)-System als eines der ausgedehntesten Neurotransmittersysteme ist an der Vermittlung der Effekte von früher Stressexposition auf angstähnliche Verhaltensweisen beteiligt. Das Ziel dieser Studie ist es, die Interaktion zwischen genetischer Prädisposition und negativen Einflüssen in frühen Entwicklungsstadien auf die Ausbildung von Angstverhalten im Erwachsenenalter näher zu beleuchten. In dieser Studie wurden Tryptophanhydroxylase 2 (Tph2)-defiziente weibliche Mäuse als Modell für ein lebenslanges konstitutives 5-HT Synthesedefizit im zentralen Nervensystem verwendet. Nachkommen dieser Mauslinie wurden im frühen Lebensalter Maternaler Separation (MS), d.h. einem mütterlichen Trennungsparadigma, unterzogen und im Erwachsenenalter im „Open field“ (OF) oder in der „Dark-light box“ (DLB) getestet. Im Anschluss an die Verhaltensexperimente wurde die neuronale Aktivierung immunhistochemisch durch Darstellung des frühzeitig auftretenden Genprodukts c-Fos bestimmt. In der DLB zeigten homozygot Tph2-defiziente Mäuse eine verringerte motorische Aktivität im hellen Kompartiment, und dieser Effekt konnte durch MS normalisiert werden. Zusätzlich verstärkte MS bei diesem Genotyp das Auftreten von fluchtartigen Sprüngen. Im OF hat MS fluchtartige Verhaltensweisen in homo- und heterozygoten Tph2-defizienten Mäusen befördert. Beide Verhaltenstests führten zu spezifischen neuronalen Aktivierungsmustern, die mithilfe von c-Fos- Immunhistochemie ausgewertet wurden. Die Durchführung des DLB-Tests führte in Abhängigkeit vom Vorhandensein von Tph2 zur Aktivierung des paraventrikulären Kerns des Hypothalamus (PVN) und der basolateralen Amygdala (BL), wohingegen die Exposition gegenüber dem OF-Test zu einer Aktivierung der lateralen Amygdala (La) in Tieren, die einem mütterlichen Trennungsparadigma unterzogen wurden, sowie einer Aktivierung des ventrolateralen (VLPAG) und dorsolateralen (DLPAG) periaquäduktalen Höhlengraus in Abhängigkeit von Tph2 und MS führte. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass MS aktive Verhaltensantworten auf aversive Reize in Abhängigkeit vom Vorhandensein von 5-HT im Gehirn fördert. Diese Effekte könnten durch die spezifische Aktivierung von mit Angstverhalten in Zusammenhang stehenden Gehirnregionen während der Verhaltensexperimente vermittelt werden. N2 - In a previous phase 1 study, it was observed that CBF can be increased by intermittent controlled hypercapnia in the days after aneurysm rupture in patients with poor to very poor SAB. After resetting mechanical ventilation to baseline parameters, CBF showed a slow and asymptotic return to baseline values without a negative rebound effect. This observation suggests that a longer duration of hypercapnia may prolong the CBF-increasing effect. This study was designed as a dose-optimization study to identify the time point at which CBF reaches a maximum and under the assumption that after this maximum, buffering mechanisms in blood and CSF could lead to adaptation mechanisms that result in a negative rebound effect after cessation of the hypercapnic challenge. An optimal duration of hypercapnia of 45 minutes was noted. KW - Angst KW - Maus KW - Serotonin KW - Stress KW - Entwicklung KW - Angstverhalten KW - Early-Life Stress KW - Mausmodell KW - Serotonindefizienz Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239488 ER - TY - THES A1 - Stadler, David T1 - Studien zur Inflammation und neuronalem Schaden in genetischen Modellen von progredienter Multipler Sklerose T1 - Studies in inflammation and neuronal damage in genetic models of progressive multiple sclerosis N2 - Multiple Sklerose ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu motorischen, sensiblen und vegetativen Einschränkungen führt. Häufig beginnt die Erkrankung mit einem schubförmigen Verlauf, dem eine progrediente Verschlechterung folgt. Trotzdem leiden ca. 15% der Patienten bereits von Beginn an, an einer primär progressiven Variante der MS, die bereits mit der progredienten Phase beginnt. Bis jetzt ist die Pathophysiologie nicht vollständig verstanden. Lange Zeit dachte man, dass MS primär eine reine Autoimmun-Erkrankung darstellt, aber in den letzten Jahren ergab sich die Frage, ob es vor allem in den progressiven Formen, eine zytodegenerative Komponente gibt, auf die eine sekundäre Inflammation folgt. Eine mögliche Ursache stellen hier Mutationen des PLP 1 Gens dar, die normalerweise mit leukodystrophischen Erkrankungen assoziiert sind. Es gab zwei Fallberichte, in denen von Patienten berichtet wurde, die unterschiedliche Mutationen in diesem Gen hatten und den klinischen Phänotyp einer MS zeigten. Diese Arbeit sollte nun die Auswirkungen der Mutationen, beziehungsweise einer Nullmutation des PLP 1 Gens in 18- und zum Teil 12-Monate alten Mausmutanten untersuchen. Hier konnten Myelin-Veränderungen und axonaler Schaden in immunhistochemischen Untersuchungen sowie mittels Elektronenmikroskopie und optischer Kohärenztomographie gezeigt werden. Weiter konnte eine Neuroinflammation und damit einhergehend eine zunehmende Anzahl CD8+ T-Zellen sowie einer erhöhten Anzahl an Mikroglia/Makrophagen gefunden werden. Dies ging mit vergleichsweise reduzierten Leistungen der Mutanten bei der motorischen Rotarod-Analyse einher. Interessanterweise wurde weniger neuraler Schaden in den heterozygoten Varianten gefunden, obwohl das Ausmaß der Entzündung gleichblieb. Dies könnte für eine zielgerichtete immunvermittelte Schädigung der Oligodendrozyten sprechen, die zu neuronalem Schaden führt. So konnte gezeigt werden, dass es durch Punktmutationen in einem Myelinprotein-codierendem Gen zu einer sekundären Entzündung kommen kann, die mit dem klinischen Phänotyp einer progressiven MS einhergeht. Weiter sind diese Mausmodelle ein Beispiel für eine genetische Erkrankung des ZNS, in denen die Klinik maßgeblich durch die begleitende Inflammation und nicht allein durch den genetischen Schaden verursacht wird. N2 - Multiple sclerosis (MS) is one of the most common neurological diseases, leading to motor, sensory and vegetative impairment. Frequently, the disease begins as a relapsing remitting form, which is followed by a progressive stage. Nevertheless about 15% of the patients suffer under a primary progressive multiple sclerosis, which starts with the progressive stage. Until now the pathophysiology is not completely understood. For a long time, multiple sclerosis was thought to be an autoimmune disease, but in the last years the question arose if the underlying cause, especially in the progressive forms (PMS), could be a cytodegenerative component, followed by secondary inflammation. A possible candidate here could be point mutations in the PLP 1 gene, which are usually associated with leukodystrophic disorders. There were two case reports about patients carrying distinct point mutations in this gene, leading to the clinical phenotype of multiple sclerosis. This thesis examines 18- and in part 12-month-old mice, carrying these point mutations or having a Plp 1 null mutation. Here myelin alterations and axonal damage in immunohistochemical stainings could be shown, as well as in the optical coherence tomography and electron microscopy. Furthermore, the occurrence of neuroinflammation comprising recruitment of microglia/macrophages and CD8 positive T-cells could be demonstrated. Also, typical clinical symptoms in the Rotarod test were found. Interestingly, there was less neural damage found in heterozygous females than in homozygous mutant mice, while the extent of inflammation was the same. This could indicate a targeted immune-mediated injury of oligodendrocytes leading to neuronal damage. In summary, this thesis shows that a point mutation of a gene coding for a myelin protein of oligodendrocytes can lead to secondary neuroinflammation and a neurological phenotype comparable to PMS. In addition, the generated mouse models are an example for genetic diseases of the CNS, in which the clinical outcome could be driven by inflammation and not only by the primary gene mutation. KW - Multiple Sklerose KW - Maus KW - Genetik KW - Immunsystem KW - Glia KW - Sekundäre Inflammation KW - Neuroinflammation KW - Neurodegeneration KW - Mikroglia KW - Mausmodell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236923 ER - TY - THES A1 - Riedl, Katharina Alina T1 - Optimierung und Validierung einer MRT-Messmethode zur Quantifizierung der Wandschubspannung in arteriellen Gefäßen zur Evaluation der atherosklerotischen Plaqueentwicklung T1 - Optimization and validation of an MR imaging method to quantify wall shear stress in arterial vessels to evaluate the atherosclerotic plaque development N2 - Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen weiterhin die Todesursache Nummer eins in Deutschland dar, welche hauptsächlich durch Atherosklerose verursacht werden. Als ein Prädiktor der atherosklerotischen Plaqueentwicklung wird die Wandschubspannung (WSS) diskutiert. Ziel dieser Arbeit war es daher, anhand von Flussphantomen und C57bl/6 Mäusen eine 2D-Gradientenecho-Bildgebungsmethode mit einer 3D-Phasenkontrast-Flusskodierung zu optimieren und anschließend eine longitudinale Kleintierstudie mit ApoE-/- Mäusen durchzuführen, um den Zusammenhang der WSS und der atherosklerotischen Plaqueentwicklung näher zu untersuchen. Zunächst wurden Flussphantome mit einem Schlauchdurchmesser von 4 mm und 1 mm zur Optimierung der Messmethode verwendet. Anschließend wurde die Messmethode weiter angepasst, um in vivo Messungen an C57bl/6 Mäusen durchführen zu können. Nach erfolgter Optimierung wurde eine longitudinale Kleintierstudie mit zwei verschiedenen Diäten, Western Diät und Chow Diät, durchgeführt. Im Rahmen der Studie erfolgten nach einer, acht und zwölf Wochen MR-Messungen sowie histologische Analysen. Es konnte gezeigt werden, dass die Wandschubspannung in Mäusen bei 17,6 Tesla quantifiziert werden kann. Es zeigte sich eine Tendenz, dass Plaqueformationen mit einer höheren Wandschubspannung einhergehen. N2 - Cardiovascular diseases are the number one of death in Germany, which are mainly caused by atherosclerosis. Wall shear stress (WSS) is discussed as a predictor for atherosclerotic plaque development. The aim of this study was the optimization and validation of a 2D gradient echo imaging method with a 3D phase contrast flow encoding using flow phantoms and C57bl/6 mice and to perform a longitudinal study with ApoE-/- mice to examine the context of WSS and atherosclerotic plaque development. First, flow phantoms with a tube diameter of 4 mm and 1 mm were used to optimize the imaging method. Therefore, the imaging method was further adapted to examine in vivo C57bl/6 mice. After optimization, a longitudinal animal study was performed with two different diets, Western diet and Chow diet. MR measurements and histological analyses were performed after one, eight, and twelve weeks. It could be shown that WSS can be quantified in mice using 17.6 Tesla MRI. There was a tendency towards higher values of wall shear stress in vessels affected by plaque formations. KW - Wandschubspannung KW - Kernspintomografie KW - Maus KW - wall shear stress KW - Ultrahochfeldmagnetresonanztomographie KW - ultra highfield magnetic resonance imaging Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-230814 ER - TY - THES A1 - Volz, Julia T1 - Studies on the influence of platelets on vascular integrity in primary tumors and the role of BIN2 in platelet calcium signaling T1 - Studien zum Einfluss von Thrombozyten auf die Gefäßintegrität im Primärtumor und zur Rolle von BIN2 im Calcium-Signalweg von Thrombozyten N2 - Maintenance of tumor vasculature integrity is indispensable for tumor growth and thus affects tumor progression. Previous studies have identified platelets as major regulators of tumor vascular integrity, as their depletion selectively renders tumor vessels highly permeable, causing massive intratumoral hemorrhage. While these results establish platelets as potential targets for anti-tumor therapy, depletion is not a treatment option due to the essential role of platelets for hemostasis. This thesis demonstrates for the first time that functional inhibition of glycoprotein (GP) VI on the platelet surface rapidly induces tumor hemorrhage and diminishes tumor growth similar to complete platelet depletion but without inducing systemic bleeding complications. Both, the intratumoral bleeding and tumor growth arrest could be reverted by depletion of Ly6G+ cells confirming them to be responsible for the induction of bleeding and necrosis within the tumor. In addition, GPVI inhibition increased intra-tumoral accumulation of co-administered chemotherapeutic agents, thereby resulting in a profound anti-tumor effect. In summary, this thesis manifests platelet GPVI as a key regulator of vascular integrity specifically in growing tumors, serving as a potential basis for the development of anti-tumor strategies. In the second part of this thesis, light is shed on the modulating role of bridging integrator 2 (BIN2) in platelet Ca2+ signaling. Stromal interaction molecule 1 (STIM1) mediated store-operated calcium entry (SOCE) is the major route of Ca2+ influx in platelets, triggered by inositol trisphosphate receptor (IP3R)-dependent Ca2+ store release. In this thesis, the BAR domain superfamily member BIN2 was identified as the first Ca2+ signaling modulator, interacting with both, STIM1 and IP3R in platelets. Deletion of BIN2 resulted in reduced Ca2+ store release and Ca2+ influx in response to all tested platelet agonists. These defects were a consequence of impaired IP3R function in combination with defective STIM1-mediated SOC channel activation, while Ca2+ store content and agonist-induced IP3 production were unaltered. These results establish BIN2 as a central regulator of platelet Ca2+ signaling. The third part of this thesis focuses on the effect of the soluble neuronal guidance protein Sema7A on platelet function. Rosenberger et al. discovered that Sema7A cleavage from red blood cells increases the formation of platelet-neutrophil complexes, thereby reinforcing thrombo-inflammation in myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). This thesis establishes soluble Sema7A as a stimulator of platelet thrombus formation via its interaction with platelet GPIbα, thereby reinforcing PNC formation. Thus, interfering with the GPIb-Sema7A interaction during MIRI represents a potential strategy to reduce cardiac damage and improve clinical outcome following MI. N2 - Die Aufrechterhaltung einer intakten Gefäßstruktur im Primärtumor ist unerlässlich für dessen Wachstum und beeinflusst dadurch die Tumorentwicklung. Es wurde bereits gezeigt, dass Thrombozyten bei diesem Prozess eine große Rolle spielen, da ihre experimentelle Depletion in Mäusen zu extrem durchlässigen Gefäßen und in Folge dessen zu starken Blutungen im Tumor führt. Diese Ergebnisse machen Thrombozyten zu potentiellen Angriffspunkten in der Krebstherapie, eine komplette Depletion ist dabei jedoch auf Grund ihrer essentiellen Funktion bei der Hämostase nicht denkbar. In dieser Thesis wurde zum ersten Mal gezeigt, dass auch die Blockade des Glykoproteins (GP) VI auf der Thrombozytenoberfläche zu vergleichbaren Blutungen im Tumor und zur Hemmung des Tumorwachstums führt, ohne jedoch das generelle Blutungsrisiko zu beeinflussen. Die durch die GPVI Blockade induzierten Effekte können durch eine gleichzeitige Depletion von Ly6G+ Zellen verhindert werden, was zeigt, dass dieser Zelltyp ursächlich an der Entstehung der Blutung beteiligt ist. Des Weiteren führt die Blockade von GPVI in Kombination mit einem Chemotherapeutikum zu einer Erhöhung dessen Konzentration im Tumorgewebe und damit zu einer verstärkten antitumoralen Wirkung. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass GPVI ein wichtiger Regulator der Gefäßintegrität im wachsenden Tumor ist, was als Grundlage für die Entwicklung von Krebstherapien genutzt werden könnte. Im zweiten Teil dieser Thesis wurde die Rolle des bridging integrator 2 (BIN2) im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten untersucht. Der STIM1 abhängige „store operated calcium entry“ (SOCE) vermittelt den größten Ca2+-Einstrom in Thrombozyten. SOCE wird durch den inositol trisphosphate receptor (IP3R)-abhängigen Ca2+ Ausstrom aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir aktiviert. In dieser Thesis wurde BIN2 als erstes Adapterprotein im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten identifiziert, das sowohl mit STIM1 als auch mit IP3R interagiert. Das Fehlen von BIN2 führt zu einer Reduktion des Ca2+ Ausstroms aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir und eine Verminderung des Einstroms von extrazellulärem Ca2+. Diesen Defekten liegen die Beeinträchtigungen der Funktion sowohl des IP3R als auch von STIM1 zugrunde, während die Ca2+ Menge im Reservoir und die Agonisten-induzierte IP3 Produktion unverändert bleiben. Zusammenfassend konnte BIN2 als zentrales Molekül im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten etabliert werden. Der dritte Teil der Thesis befasst sich mit dem Effekt des löslichen „neuronal guidance protein“ Sema7A auf Thrombozyten. Die Arbeitsgruppe um Prof. Rosenberger konnte bereits zeigen, dass das von Erythrozyten abgespaltene Sema7A die Bildung von Komplexen aus Thrombozyten und Neutrophilen (PNC) fördert und damit die Thrombo-Inflammation während Zusammenfassung III des Ischämie/Reperfusionsschadens des Myokards (MIRI) begünstigt. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass die Interaktion des löslichen Sema7A mit GPIbα auf der Thrombozytenoberfläche die Thrombenbildung fördert und über diesen Mechanismus auch die PNC Bildung und somit Thrombo-Inflammation verstärkt. Aufgrund dessen stellt der Eingriff in die GPIbα-Sema7a Interaktion eine potentielle Strategie dar, den Gewebeschaden während des MIRI zu reduzieren und damit den Schaden nach einem Myokardinfarkt einzugrenzen. KW - Thrombozyt KW - Primärtumor KW - Maus KW - GPVI KW - Vaskuläre Integrität KW - Calcium signalling KW - BIN2 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217427 ER - TY - THES A1 - Scheller [geb. Birkholz], Inga T1 - Studies on the role of actin-binding proteins in platelet production and function in mice T1 - Zur Rolle von Aktin-bindenden Proteinen in der Bildung und der Funktion von Thrombozyten in der Maus N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury involves massive cytoskeletal re-organization, which is required for proper platelet function. Moreover, the cytoskeleton plays central roles in megakaryo- and thrombopoiesis. Thus, cytoskeletal protein aberrations can be the underlying reason for many pathological phenotypes. Although intensive research is carried out to identify the key players involved in cytoskeletal reorganization, the signaling cascades orchestrating these complex processes are still poorly understood. This thesis investigates the role of three actin-binding proteins, Coactosin-like (Cotl) 1, Profilin (Pfn) 1 and Thymosin (T) β4, in platelet formation and function using genetically modified mice. ADF-H-containing proteins such as Twinfilin or Cofilin are well characterized as regulators of thrombopoesis and cytoskeletal reorganization. Although Cotl1 belongs to the ADF-H protein family, lack of Cotl1 did not affect platelet count or cytoskeletal dynamics. However, Cotl1-deficiency resulted in significant protection from arterial thrombus formation and ischemic stroke in vivo. Defective GPIb-vWF interactions and altered second wave mediator release present potential reasons for the beneficial effect of Cotl1-deficiency. These results reveal an unexpected function of Cotl1 as a regulator of thrombosis and hemostasis, establishing it as a potential target for a safe therapeutic therapy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. Recent studies showed that the organization of the circumferential actin cytoskeleton modulates calpain-mediated αIIbβ3 integrin closure, thereby also controlling αIIbβ3 integrin localization. The second part of this thesis identified the actin-sequestering protein Pfn1 as a central regulator of platelet integrin function as Pfn1-deficient platelets displayed almost abolished αIIbβ3 integrin signaling. This translated into a profound protection from arterial thrombus formation and prolonged tail bleeding times in vivo which was caused by enhanced calpain-dependent integrin closure. These findings further emphasize the importance of a functional actin cytoskeleton for intact platelet function in vitro and in vivo. Tβ4 is a moonlighting protein, acting as one of the major actin-sequestering proteins in cells of higher eukaryotes and exerting various paracrine functions including anti-inflammatory, immunomodulatory and pro-angiogenic effects. Although excessively studied, its role for cytoskeletal dynamics, the distinction between endo- and exogenous protein function and its uptake and release mechanisms are still poorly understood. Constitutive Tβ4-deficiency resulted in thrombocytopenia accompanied by a largely diminished G-actin pool in platelets and divergent effects on platelet reactivity. Pre-incubation of platelets with recombinant Tβ4 will help to understand the function of endo- and exogenous protein, which is under current investigation. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten bei Gefäßverletzungen zieht massive Umstrukturierungen des Zytoskeletts nach sich, die eine Voraussetzung für die intakte Funktion der Zellen darstellen. Des Weiteren nimmt das Zytoskelett eine zentrale Rolle in der Megakaryo- und Thrombopoese ein. Daher können Anomalien zytoskeletaler Proteine eine Vielzahl von Krankheitsbildern verursachen. Obwohl intensiv an den beteiligten Proteinen geforscht wird, sind die Signalkaskaden, die den komplexen Vorgang der Umstrukturierung des Zytoskeletts steuern, noch weitgehend unbekannt. In dieser Dissertation wurden drei Aktin-bindende Proteine, Coactosin-like (Cotl) 1, Profilin (Pfn) 1 und Thymosin (T) β4, hinsichtlich ihrer Rolle für die Bildung und Funktion von Thrombozyten mittels genetisch veränderter Mäuse untersucht. Proteine wie Twinfilin oder Cofilin, die ADF-H-Domänen enthalten, sind oftmals an der Thrombopoese sowie an zytoskeletaler Umstrukturierung beteiligt. Obgleich Cotl1 der ADF-H Proteinfamilie zugehörig ist, konnte in Cotl1-defizienten Mäusen weder eine Veränderung der Thrombozytenzahlen, noch der zytoskeletalen Dynamik festgestellt werden. Unerwarteter-weise zog eine Cotl1-Defizienz in vivo einen Schutz vor arterieller Thrombose und Schlaganfall nach sich. Defekte GPIb-vWF-Interaktionen sowie eine veränderte Freisetzung von sekundären intrazellulären Mediatoren zeigen mögliche Gründe für den schützenden Effekt einer Cotl1-Defizienz auf. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Cotl1 ein zentraler Regulator von Thrombose und Hämostase ist und etabliert es damit als potentielle antithrombotische Zielstruktur für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. Studien zeigten, dass die Organisation des kortikalen Aktin-Zytoskeletts die Calpain-vermittelte αIIbβ3-Integrin-Inaktivierung moduliert und dadurch die Lokalisation der Integrine kontrolliert. Der zweite Teil dieser Dissertation identifizierte das Aktin-komplexierende Molekül Pfn1 als zentralen Regulator der Integrinfunktion in Thrombozyten, da Pfn1-defiziente Thrombozyten eine stark verminderte Reaktivität nach αIIbβ3-Integrin Aktivierung zeigten. Dies führte zu einem profunden Schutz vor arterieller Thrombusbildung und verlängerten Blutungszeiten in vivo, der durch eine verstärkte Calpain-vermittelte Integrin-Inaktivierung verursacht wurde. Diese Befunde unterstreichen erneut die zentrale Bedeutung eines funktionales Aktin-Zytoskeletts für die Aufrechterhaltung der Thrombozytenfunktion in vitro und in vivo. Tβ4 ist ein bivalentes Protein, das einerseits eine Funktion als Aktin-komplexierendes Protein in Zellen höherer Eukaryoten ausübt und andererseits unterschiedliche parakrine Funktionen hat, zu denen entzündungshemmende, immunmodulierende und pro-angiogene Wirkungen zählen. Obwohl intensiv an Tβ4 geforscht wird, ist seine Bedeutung für die Dynamik des Zytoskeletts sowie die Unterscheidung zwischen endo- und exogener Proteinfunktion und seine Aufnahme- und Freisetzungsmechanismen kaum verstanden. Konstitutive Tβ4-Defizienz zog eine Thrombozytopenie, begleitet von einem stark verminderten G-Aktin-Gehalt in Thrombozyten und gegensätzlichen Effekten auf die Thrombozytenreaktivität, nach sich. Der Effekt von rekombinant exprimiertem Tβ4 auf Thrombozyten, der derzeit untersucht wird, wird zum besseren Verständnis der endo- und exogenen Proteinfunktion, beitragen. KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Maus KW - platelet KW - cytoskeleton KW - Thymosin b4 KW - Profilin KW - Coactosin-like Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168582 ER - TY - THES A1 - Surrey, Verena T1 - Identification of affected cellular targets, mechanisms and signaling pathways in a mouse model for spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) T1 - Identifizierung betroffener zellulärer Zielmoleküle, Mechanismen und Signalwege in einem Maus-Modell für spinale Muskelatrophie mit Ateminsuffizienz Typ 1 (SMARD1) N2 - Spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) is a fatal monogenic motoneuron disease in children with unknown etiology caused by mutations in the immunoglobulin μ-binding protein 2 (IGHMBP2) gene coding for DNA/RNA ATPase/helicase. Despite detailed knowledge of the underlying genetic changes, the cellular mechanisms leading to this disease are not well understood. In the Nmd2J ("neuromuscular disorder") mouse, the mouse model for the juvenile form of SMARD1 patients, in which similar pathological features as diaphragmatic paralysis and skeletal muscle atrophy are observed. Ex vivo studies in Nmd2J mice showed that loss of the motor axon precedes atrophy of the gastrocnemius muscle and does not correlate with neurotransmission defects in the motor endplate. The already described independent myogenic anomalies in the diaphragm and heart of the Nmd2J mouse raised the question whether spinal motoneuron degeneration develops cell autonomously. Ighmbp2 is predominantly localized in the cytoplasm and seems to bind to ribosomes and polysomes, suggesting a role in mRNA metabolism. In this Ph.D. thesis, morphological and functional analyses of isolated Ighmbp2-deficient (Ighmbp2-def.) motoneurons were performed to answer the question whether the SMARD1 phenotype results from dysregulation of protein biosynthesis. Ighmbp2-deficient motoneurons show only negligible morphological alterations with respect to a slight increase in axonal branches. This observation is consistent with only minor changes of transcriptome based on RNA sequencing data from Ighmbp2-deficient motoneurons. Only the mRNA of fibroblast growth factor receptor 1 (Fgfr1) showed significant up-regulation in Ighmbp2-deficient motoneurons. Furthermore, no global aberrations at the translational level could be detected using pulsed SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell culture), AHA (L-azidohomoalanine) labeling and SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) methods. However, a reduced β-actin protein level was observed at the growth cones of Ighmbp2-deficient motoneurons, which was accompanied with a reduced level of Imp1 protein, a known β-actin mRNA interactor. Live-cell imaging studies using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) showed translational down-regulation of eGFPmyr-β-actin 3'UTR mRNA in the growth cones and the cell bodies, although the amount of β-actin mRNA and the total protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons showed no aberrations. This compartment-specific reduction of β-actin protein occurred independently of a non-existent direct IGHMBPF2 binding to β-actin mRNA. Fgfr1, which was upregulated on the RNA level, did not show an increased protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons, whereas a reduced amount could be detected. Interestingly, a correlation could be found between the reduced amount of the Imp1 protein and the increased Fgfr1 mRNA, since the IMP1 protein binds the FGFR1 mRNA and thus could influence the transport and translation of FGFR1 mRNA. In summary, all data suggest that Ighmbp2 deficiency leads to a local but modest disturbance of protein biosynthesis, which might contribute to the motoneuron defects of SMARD1. N2 - Die spinale Muskelatrophie mit Atemnot Typ 1 (SMARD1) ist eine tödliche, monogene Motoneuron-Erkrankung bei Kindern mit unbekannter Ätiologie. SMARD1 wird durch Mutationen im Immunoglobulin µ-bindenden Protein 2 (IGHMBP2)-Gen verursacht, welches für eine DNA/RNA ATPase/Helikase kodiert. Trotz detaillierter Kenntnisse über die zugrunde liegenden genetischen Veränderungen sind die zellulären Mechanismen, die zu dieser Krankheit führen, nicht gut verstanden. In der Nmd2J („neuromuscular disorder“) Maus, dem Mausmodell für die juvenile Form von SMARD1-Patienten, werden ähnliche pathologische Merkmale wie Diaphragma-Lähmung und Skelettmuskelatrophie beobachtet. Ex vivo-Studien an Nmd2J-Mäusen zeigten, dass der Verlust des motorischen Axons einer Atrophie des Gastrocnemius-Muskels vorausgeht und nicht mit Neurotransmissionsfehlern an der motorischen Endplatte korreliert. Die bereits beschriebenen, unabhängig auftretenden myogenen Anomalien in Zwerchfell und Herz der Nmd2J-Maus führten zu der Frage, ob sich die spinale Motoneuron-Degeneration zellautonom entwickelt. Ighmbp2 ist prädominant im Zytoplasma lokalisiert und scheint an Ribosomen und Polysomen zu binden, was auf eine Rolle im mRNA-Stoffwechsel hindeutet. In dieser Doktorarbeit wurden morphologische und funktionelle Analysen von isolierten Ighmbp2-defizienten (Ighmbp2-def.) Motoneuronen durchgeführt, um die Frage zu beantworten, ob der SMARD1-Phänotyp aus der Deregulierung der Proteinbiosynthese resultiert. Ighmbp2-defiziente Motoneuronen weisen nur geringfügige morphologische Unterschiede hinsichtlich einer leichten Zunahme der axonalen Verzweigungen auf. Diese Beobachtung steht im Einklang mit nur geringen Veränderungen im Transkriptom basierend auf den RNA-Sequenzierungs-Daten in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Ausschließlich die mRNA des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (Fgfr1) zeigte eine signifikante Hoch-Regulation in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Des Weiteren konnten keine globalen Aberrationen auf der translationalen Ebene mit Hilfe der gepulsten SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in der Zellkultur), AHA (L-Azidohomoalanin)-Markierung und der SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) Methoden ermittelt werden. Jedoch konnte eine verringerte β-actin Proteinmenge an den Wachstumskegeln von Ighmbp2-defizienten Motoneuronen beobachtet werden, die von einer Reduktion an Imp1 Protein, einem bekannten β-actin mRNA Interaktor, begleitet wurde. Lebendzell-Bildgebungsstudien mittels Fluoreszenz-Recovery after Photobleaching (FRAP) Untersuchung zeigten eine translatorische Herunter-Regulation der eGFPmyr-β-actin 3‘UTR mRNA in Wachstumskegeln und Zellkörpern, obwohl die Menge an β-actin mRNA und die Gesamt-Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen im Vergleich zu wildtypischen Motoneuronen unverändert war. Diese Kompartiment-spezifische Reduktion von β-actin Protein trat unabhängig von einer nicht vorhandenen direkten IGHMBP2-Bindung an die β-actin mRNA auf. Der auf RNA Ebene hochregulierte Fgfr1 zeigte hingegen keine erhöhte, aber eine verringerte Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Interessanterweise konnte ein Zusammenhang zwischen der reduzierten Menge des Imp1 Proteins und der erhöhten FGFR1 mRNA gezogen werden. Da das IMP1 Protein neben der β-actin mRNA ebenfalls die FGFR1 mRNA bindet, könnte es so den Transport und die Translation beeinflussen. Alle Daten deuten zusammenfassend daraufhin, dass Ighmbp2-Mangel zu einer lokalen und geringen Störung der Proteinbiosynthese führt, die aber durchaus zu den beobachteten Motoneuron-Defekten in SMARD1 beitragen könnte. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Ighmbp2 KW - Maus KW - RNA helicase KW - IMP1/ZBP1 KW - SMARD1 KW - motoneuron KW - translation KW - Signalkette KW - Molekularbiologie KW - Atmungsinsuffizienz Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176386 ER - TY - THES A1 - Lu, Yunzhi T1 - Kinetics of mouse and human muscle type nicotinic receptor channels T1 - Kinetik muriner und humaner nikotinischer Rezeptorkanäle vom Muskeltyp N2 - Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated. Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits. N2 - Acetylcholin (ACh) vermittelt Erregungsübertragung an neuromuskulären synaptischen Kontakten (neuromuscular junction, NMJ) von Wirbeltieren und vielen anderen Synapsen. Die postsynaptischen ACh-Rezeptoren an der NMJ sind vom nikotinischen Subtyp (nAChRs). Als Teil der am besten erforschten Kanalrezeptoren dienen sie oft als Modelle oder auch Prototypen für Rezeptoren. Trotz einer Fülle an Informationen über nAChRs des Muskeltyps ist bis heute recht wenig über artenspezifischen funktionellen Unterschiede bekannt. Diese Studie befasst sich daher mit der Untersuchung von nAChRs des Muskeltyps in erwachsenen Mäusen und Menschen. Aufzeichnungen mit sogenannten Cell-attached Patches im heterologen Expressionssystem HEK293T-Zellen lieferten Beweise dafür, dass die ACh-Affinität von rekombinanten erwachsenen Maus- und menschlichen nAChRs vom Muskeltyp unterschiedlich sind. Um diesem nachzugehen, habe ich diese Rezeptoren in Outside-out Patches mit Hilfe eines schnellen Piezogetriebenen Applikationssystems verglichen. Dieses System bietet den Vorteil, dass einzelne Membran-Patches mit Rezeptoren unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ausgesetzt werden können. Als Reaktion auf 10 und 30 µM ACh waren die normalisierten Stromamplituden (î) und Stromanstiegszeiten (tr) der menschlichen Rezeptoren signifikant höher als die der Mausrezeptoren. Die Analyse der Dosis-Wirkungskurven von î und tr sowie die Anpassung eines quantitativen zweistufigen kinetischen Modells mit zwei äquivalenten Bindestellen an die Datensätze zeigten eine zweifach höhere Assoziationsrate für ACh bei menschlichen Rezeptoren, verglichen mit der von Mausrezeptoren. Zudem wurden menschliche nAChRs in Outside-Out-Patches schneller als Mausrezeptoren durch Superfusion mit 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) blockiert, was für eine höhere Affinität auch für α-Bgtx spricht. Schließlich wiesen die menschlichen nAChRs in Outside-Out-Patches bei 3 µM ACh eine höhere Affinität als chimäre Rezeptoren aus Maus α- und menschlichen β-, γ- and ε-Untereinheiten auf. Die höhere Affinität der menschlichen Rezeptoren zu ACh und α-Bgtx im Vergleich zu Mausrezeptoren basiert somit zumindest in Teilen auf Sequenzdifferenzen ihrer α-Einheitenen. KW - nicotinic acetylcholine receptor KW - affinity KW - kinetic mechanism KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Muskelzelle KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192688 ER - TY - THES A1 - Baig, Ayesha Anjum T1 - Studies on platelet interactions with the coagulation system and on modulators of platelet (hem)ITAM signaling in genetically modified mice T1 - Studien zur Thrombozyteninteraktion mit der Gerinnungskaskade und Modulation des (hem)ITAM Signalwegs in genetisch veränderaten Mäusen N2 - Activated platelets and coagulation jointly contribute to physiological hemostasis. However, pathological conditions can also trigger unwanted platelet activation and initiation of coagulation resulting in thrombosis and precipitation of ischemic damage of vital organs such as the heart or brain. The specific contribution of procoagulant platelets, positioned at the interface of the processes of platelet activation and coagulation, in ischemic stroke had remained uninvestigated. The first section of the thesis addresses this aspect through experiments conducted in novel megakaryocyte- and platelet-specific TMEM16F conditional KO mice (cKO). cKO platelets phenocopied defects in platelets from Scott Syndrome patients and had severely impaired procoagulant characteristics. This led to decelerated platelet-driven thrombin generation and delayed fibrin formation. cKO mice displayed prolonged bleeding times and impaired arterial thrombosis. However, infarct volumes in cKO mice were comparable to wildtype (WT) mice in an experimental model of ischemic stroke. Therefore, while TMEM16F-regulated platelet procoagulant activity is critical for hemostasis and thrombosis, it is dispensable for cerebral thrombo-inflammation in mice. The second section describes the generation and initial characterization of a novel knockin mouse strain that expresses human coagulation factor XII (FXII) instead of endogenous murine FXII. These knockin mice had normal occlusion times in an experimental model of arterial thrombosis demonstrating that human FXII is functional in mice. Therefore, these mice constitute a valuable tool for testing novel pharmacological agents against human FXII – an attractive potential target for antithrombotic therapy. Glycoprotein (GP)VI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2)-mediated (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) signaling represent a major pathway for platelet activation. The last section of the thesis provides experimental evidence for redundant functions between the two members of the Grb2 family of adapter proteins - Grb2 and Gads that lie downstream of GPVI and CLEC-2 stimulation. In vitro and in vivo studies in mice deficient in both Grb2 and Gads (DKO) revealed that DKO platelets had defects in (hem)ITAM-stimulation-specific activation, aggregation and signal transduction that were more severe than the defects observed in single Grb2 KO or Gads KO mice. Furthermore, the specific role of these adapters downstream of (hem)ITAM signaling was essential for maintenance of hemostasis but dispensable for the known CLEC-2 dependent regulation of blood-lymphatic vessel separation. N2 - Aktivierte Thrombozyten und die Gerinnungskaskade bilden gemeinsam die Grundlage der physiologischen Hämostase. Daneben können jedoch auch pathologische Bedingungen Thrombozytenaktivierung herbeiführen und die Gerinnungskaskade auslösen und somit zum Gefäßverschluss führen, was häufig ischämische Schäden lebenswichtiger Organe wie beispielsweise des Herzens oder des Gehirns verursachen kann. Prokoagulante Thrombozy-ten befinden sich an der Schnittstelle zwischen Thrombozytenaktivierung und der Gerin-nungskaskade, ihre Funktion bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls wurde jedoch bisher nicht im Detail untersucht. Der erste Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Fragestellung durch die Analyse von neu generierten konditionalen, Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Tmem16f Knockout Mäusen. TMEM16F-defiziente Thrombozy-ten wiesen ähnliche Defekte wie die Thrombozyten von Scott-Syndrom-Patienten sowie stark beeinträchtigte prokoagulante Eigenschaften auf. Diese Defekte gingen mit signifikant verlangsamter thrombozytenabhängiger Thrombingenerierung und verzögerter Fibrinbildung einher. TMEM16F-Defizienz führte zu verlängerter Blutungszeit und beeinträchtigte in einem experimentellen Modell die Bildung arterieller Thromben. TMEM16F-defiziente Mäuse wiesen jedoch im Vergleich zu wildtypischen Mäusen keinerlei Unterschiede im experimentellen ischämischen Schlaganfall auf. TMEM16F-gesteuerte prokoagulante Thrombozytenfunktion ist demnach kritisch für Hämostase und Thrombose, während sie eine untergeordnete Rolle in zerebraler Thrombo-Inflammation spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Generierung und Erstbeschreibung einer neuen Mauslinie, welche den humanen Hageman-Faktor (FXII) anstelle des endogenen murinen FXII exprimiert. In den resultierenden Knock-in Mäusen war die Bildung okklusiver arterieller Thromben nach chemisch induzierter Gefäßverletzung nicht beeinträchtigt, was zeigt, dass der humane FXII im Maussystem voll funktionstüchtig ist. Somit können diese Mäuse in der Zukunft als ein wertvolles Werkzeug zum Testen neuer pharmakologischer Ansätze zur Herabsetzung der FXII-Aktivität eingesetzt werden, welche einen vielver-sprechenden Targets neuartiger antithrombotischer Behandlungsansätze darstellt. Die thrombozytären Rezeptoren Glykoprotein (GP)VI und C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) lösen (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelte Signalwege aus, welche eine eine Schlüsselrolle in der Thrombozytenaktivierung spielen. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit liefert experimentelle Hinweise für überlappende Funkti-onen der Adapterproteine Grb2 und Gads in der (hem)ITAM-anhängigen Signalkaskade. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass Grb2/Gads-doppeldefiziente Thrombozyten (hem)ITAM-spezifische Defekte in der Aktivierung, Aggregation und Signaltransduktion aufweisen, die im Vergleich zu einzeldefizienten Thrombozyten deutlich ausgeprägter sind und somit eine redundante Rolle der Adapterproteine offenbaren. Während Grb2 und Gads gemeinsam an der Aufrechterhaltung physiologischer Hämostase beteiligt sind, tragen sie nicht entscheidend zur bekannten CLEC-2-abhängigen Regulation der Trennung von Blut- und Lymphgefäßen bei. KW - Blutgerinnung KW - Thrombozyt KW - Signaltransduktion KW - Maus KW - Thrombosis KW - Thrombo-inflammation KW - TMEM16F KW - (hem)ITAM signaling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164888 ER - TY - THES A1 - Uri, Anna T1 - Differential requirement for CD28 co-stimulation on donor T cell subsets in mouse models of acute graft versus host disease and graft versus tumour effect T1 - Unterschiedlicher Einfluss der CD28 Kostimulation auf Donor-T Zell-Populationen in Mausmodellen der akuten Graft-versus-Host Disease und des Graft-versus-Tumor Effekts N2 - Hematopoietic stem cell transplantation is a curative therapy for malignant diseases of the haematopoietic system. The patients first undergo chemotherapy or irradiation therapy which depletes the majority of tumour cells before they receive the transplant, consisting of haematopoietic stem cells and mature T cells from a healthy donor. The donor T cells kill malignant cells that have not been eliminated by the conditioning therapy (graft versus leukaemia effect, GvL), and, therefore, are crucially required to prevent relapse of the tumour. However, the donor T cells may also severely damage the patient’s organs causing acute graft versus host disease (aGvHD). In mice, aGvHD can be prevented by interfering with the co-stimulatory CD28 signal on donor T cells. However, experimental models using conventional CD28 knockout mice as T cell donors or αCD28 antibodies have some disadvantages, i.e. impaired T cell development in the thymus of CD28 knockout mice and systemic CD28 blockade with αCD28 antibodies. Thus, it remains unclear how CD28 co-stimulation on different donor T cell subsets contributes to the GvL effect and aGvHD, respectively. We developed mouse models of aGvHD and the GvL effect that allowed to selectively delete CD28 on certain donor T cell populations or on all donor T cells. CD4+ conventional T cells (Tconv cells), regulatory T cells (Treg cells) or CD8+ T cells were isolated from either Tamoxifen-inducible CD28 knockout (iCD28KO) mice or their wild type (wt) littermates. Allogeneic recipient mice were then transplanted with T cell depleted bone marrow cells and different combinations of iCD28KO and wt T cell subsets. Tamoxifen treatment of the recipients caused irreversible CD28 deletion on the iCD28KO donor T cell population. In order to study the GvL response, BCL-1 tumour cells were injected into the mice shortly before transfer of the T cells. CD4+ Tconv mediated aGvHD was efficiently inhibited when wt Treg cells were co-transplanted. In contrast, after selective CD28 deletion on donor Treg cells, the mice developed a late and lethal flare of aGvHD, i.e. late-onset aGvHD. This was associated with a decline in iCD28KO Treg cell numbers around day 20 after transplantation. CD28 ablation on either donor CD4+ Tconv cells or CD8+ T cells reduced but did not abrogate aGvHD. Moreover, iCD28KO and wt CD8+ T cells were equally capable of killing allogeneic target cells in vivo and in vitro. Due to this sufficient anti-tumour activity of iCD28KO CD8+ T cells, they had a therapeutic effect in our GvL model and 25% of the mice survived until the end of the experiment (day 120) without any sign of the malignant disease. Similarly, CD28 deletion on all donor T cells induced long-term survival. This was not the case when all donor T cells were isolated from wt donor mice. In contrast to the beneficial outcome after CD28 deletion on all donor T cells or only CD8+ T cells, selective CD28 deletion on donor CD4+ Tconv cells completely abrogated the GvL effect due to insufficient CD4+ T cell help from iCD28KO CD4+ Tconv cells. This study demonstrates that therapeutic inhibition of the co-stimulatory CD28 signal in either all donor T cells or only in CD8+ T cells might protect patients from aGvHD without increasing the risk of relapse of the underlying disease. Moreover, deletion of CD28 on donor Treg cells constitutes a mouse model of late-onset aGvHD which can be a useful tool in aGvHD research. N2 - Die hämatopoetische Stammzelltransplantation ist eine heilende Therapie für maligne Erkrankungen des blutbildenden Systems. Die Patienten müssen sich zuerst einer Chemotherapie oder einer Strahlentherapie unterziehen, welche den Großteil der Tumorzellen beseitigt, bevor sie das Transplantat erhalten. Dieses besteht aus hämatopoetischen Stammzellen und reifen T-Zellen eines gesunden Spenders. Die transplantierten T-Zellen töten die malignen Zellen, die zuvor durch die Chemo- bzw. Strahlentherapie nicht zerstört wurden (Graft versus Leukämie Effekt, GvL), und sind daher essenziell, um ein Rezidiv der Tumorerkrankung zu verhindern. Die T-Zellen des Spenders können aber auch die Organe des Patienten schwer schädigen und dadurch die akute Graft versus Host Disease (aGvHD) verursachen. In Mäusen kann die aGvHD verhindert werden, indem man das kostimulatorische Signal des CD28 Moleküls moduliert. Mausmodelle, in denen konventionelle CD28 Knock-out Mäuse als T-Zell-Donoren verwendet werden oder αCD28 Antikörper eingesetzt werden, haben einige Nachteile, wie zum Beispiel eine gestörte T-Zell Entwicklung in CD28 Knock-out Mäusen oder die systemische Blockade des CD28 Moleküls mit Antikörpern. Dadurch blieb bislang unklar, inwiefern CD28-Kostimulation auf verschiedenen T-Zell-Populationen zum GvL Effekt und zur aGvHD beiträgt. Wir haben Mausmodelle der aGvHD und des GvL Effekts entwickelt, die ermöglichen, das CD28 Molekül entweder nur auf bestimmten Spender-T-Zell-Populationen oder auf allen Spender-T-Zellen zu deletieren. Hierfür wurden CD4+ konventionelle T-Zellen (Tconv Zellen), regulatorische T Zellen (Treg Zellen) und CD8+ T-Zellen von Tamoxifen-induzierbaren CD28 Knockout (iCD28KO) Mäusen bzw. deren wildtypischen (wt) Wurfgeschwistern isoliert. Den allogenen Empfängermäusen wurden dann T-Zell-depletierte Knochenmarkszellen und verschiedene Kombinationen aus iCD28KO und wt Spender-T-Zellen transplantiert. Die Behandlung der Empfängertiere mit Tamoxifen führte zu einer irreversiblen Deletion von CD28 auf den iCD28KO T-Zell-Populationen. Um den GvL Effekt zu untersuchen, wurden den Mäusen kurz vor dem T-Zell-Transfer BCL-1 Tumorzellen injiziert. Die von den CD4+ Tconv Zellen verursachte aGvHD konnte sehr gut kontrolliert werden, indem zusätzlich wt Treg Zellen transplantiert wurden. Im Gegensatz dazu entwickelten die Mäuse einen späten und tödlichen Schub der aGvHD, auch late-onset aGvHD genannt, wenn die CD28 Expression auf den Treg Zellen des Spenders deletiert wurde. Dies ging mit einem Rückgang der iCD28KO Treg-Zellzahlen ca. 20 Tage nach Transplantation einher. Die Deletion von CD28 auf CD4+ Tconv Zellen oder auf CD8+ T-Zellen reduzierte die aGvHD, konnte diese aber nicht vollständig verhindern. Des Weiteren waren iCD28KO und wildtypische CD8+ T-Zellen gleichermaßen in der Lage, allogene Zellen zu töten, in vivo wie auch in vitro. Aufgrund dieser hinreichenden Anti-Tumor-Antwort hatten iCD28KO CD8+ T-Zellen einen therapeutischen Effekt in unserem GvL Modell und 25 % der Tiere überlebte bis zum Versuchsende (Tag 120) ohne Anzeichen des Tumors. Ein Langzeitüberleben der Tiere wurde auch beobachtet, wenn das CD28 Molekül auf allen Spender-T-Zellen fehlte. Dies war nicht der Fall, wenn alle Spender-T-Zellen von wt Mäusen isoliert wurden. Im Gegensatz zur CD28 Deletion auf entweder allen Spender-T-Zellen oder nur auf den CD8+ T-Zellen, ging der GvL Effekt vollständig verloren, wenn CD28 nur auf den CD4+ Tconv Zellen entfernt wurde, da diese dann keine ausreichende T-Zellhilfe mehr leisten konnten. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine therapeutische Blockade des kostimulatorischen CD28 Signals entweder in allen Spender T-Zellen oder nur in CD8+ T-Zellen vor der aGvHD schützen könnte ohne gleichzeitig das Risiko eines Rezidivs zu erhöhen. Darüber hinaus steht mit der Deletion von CD28 auf Treg Zellen ein Mausmodell der late-onset aGvHD zur Verfügung, welches für die weitere Erforschung dieser Krankheit nützlich sein kann. KW - Antigen CD28 KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Maus KW - Graft versus host disease KW - GvHD Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165863 ER - TY - THES A1 - Frenz, Silke T1 - Generierung und Evaluation von Mausmodellen für die auditorische Neuropathie T1 - Generation and evaluation of mouse models of auditory neuropathy N2 - Der Hörsinn ist für uns Menschen von entscheidender Bedeutung, um mit der Umwelt kommunizieren zu können. Hörstörungen werden dabei in sensorineurale Erkrankungen der neuronalen Strukturen und nicht-sensorineurale Schallleitungsschwerhörigkeiten unterschieden. In der vorliegenden Studie sollte es darum gehen zu untersuchen, inwiefern ein neues konditionelles Mausmodell, die Brn3.1 IRES Cre Maus, und ein bestehendes Mausmodell, die pmn-Maus, sich eignen, um die Erkrankung der auditorischen Neuropathie nachzubilden. Die Brn3.1 IRES Cre Maus wurde zur Evaluation der Expression von Cre-Rekombinase unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors mit gefloxten Reporter-Mauslinien verkreuzt. Die pmn-Maus ist ein anerkanntes Modell einer Motoneuronerkrankung, hatte aber in vorherigen Untersuchungen erhöhte Hörschwellen gezeigt. Alle verwendeten Mauslinien wurden mittels ABR und DPOAE frequenzspezifisch untersucht, um die Funktion der Haarzellen im Corti´schen Organ zu evaluieren. Bei der pmn-Linie wurden die audiologischen Untersuchungen wöchentlich zwischen P21 und P35 durchgeführt. Zusätzlich wurde das Corti´sche Organ zu diesen Zeitpunkten morphologisch untersucht. Es zeigte sich, dass alle verwendeten Mauslinien unauffällige Hörschwellen verglichen zur Backgroundlinie C57BL/6 hatten sowie DPOAE-Antworten zeigten. Die Verkreuzung der Brn3.1 IRES Cre Linie mit den beiden Reporterlinien zeigte eine nachweisbare Cre-Rekombinase-Expression unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors nur an den postnatalen Tagen P14 und P21. Diese Expression erfolgte mosaikartig in den äußeren Haarzellen. Mit Hilfe einer RT-PCR wurde eine Diskrepanz zwischen Genotyp und Expression des Reporterproteins im Gewebe festgestellt. Dies ließ vermuten, dass die Expression von Cre-Rekombinase durch gene silencing Prozesse unterdrückt wurde und Brn3.1 als Promotor nicht leistungsstark genug war, um eine Cre-Rekombinase-Expression steuern zu können. Die pmn-Linie zeigte in ABR-Untersuchungen bereits zum Zeitpunkt P21 erhöhte Hörschwellen in allen untersuchten Frequenzen im Vergleich zum Wildtyp. DPOAE-Antworten waren in der pmn-Linie nur bedingt auslösbar. Es zeigte sich in der morphologischen Evaluation ein Verlust von äußeren Haarzellen über die gesamte Länge des Corti´schen Organes. Durch einen TUNEL-Assay konnte das Absterben dieser Zellen durch apoptotische Vorgänge nachgewiesen werden. Der pmn-Phänotyp entsteht durch eine Mutation im TBCE Gen. Dieses Gen kodiert für ein Protein, welches einen stabilisierenden Einfluss auf die Organisation der Mikrotubuli hat. Die TBCE-Verteilung im Corti´schen Organ zeigte, dass dieses hauptsächlich in den äußeren Haarzellen und inneren Stützzellen exprimiert wird und damit wahrscheinlich einen bedeutenden Einfluss auf die Erhaltung der Haarzellen hat. Eine Analyse des Hörnervs zeigte einen Verlust von Mikrotubuli. Neben diesen in vivo Untersuchungen sollte außerdem eine gliazellfreie Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen etabliert werden. Hierfür wurden mehrere Faktoren einer Primärzellkultur in Bezug auf ihren Einfluss auf die Gesamtzellzahl, den prozentualen Neuronanteil und die Axonlänge der Neurone untersucht. Das Medium, die Beschichtung des Zellkulturgefäßes, die Gabe von Neurotrophinen/Zytokinen und der Einsatz eines Zytostatikums wurden separat untersucht. Es zeigte sich, dass das Medium, die Beschichtung und Neurotrophin-/Zytokingabe hauptsächlich einen Einfluss auf das axonale Längenwachstum von Neuronen haben. Den Prozentsatz der Neurone beeinflusste nur der Einsatz des Zytostatikums Cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) signifikant. Die Ergebnisse wurden auch im Zusammenhang mit der reellen Neuronanzahl in Kultur gesehen. Es ergab sich weiterhin eine Präferenz für DMEM- über NB-Medium sowie für zusätzliche Lamininbeschichtung, für den Einsatz des Zytokins LIF gegenüber den neurotrophen Faktoren BDNF und NT-3 und die Gabe des Zytostatikums AraC ab Tag 2 nach Ausplattierung in einer Konzentration von 5-10 µM. Ein kombinatorischer Einsatz dieser Präferenzen spiegelte in Summe die Ergebnisse der Versuchsreihen Neurotrophine/Zytokin und AraC wieder. Der Anteil der Neurone in der Kultur konnte im Durchschnitt auf 10-12 % gesteigert werden. Eine Verschiebung des Glia-/Neuronenanteils zugunsten letzterer ist vermutlich nur durch den Einsatz weiterer Faktoren oder anderer Methoden möglich. Die untersuchten Mausmodelle zeigten auf Grund der Untersuchungsergebnisse nur teilweise Ähnlichkeiten mit der Erkrankung der auditorischen Neuropathie. Die Erkenntnisse zur pmn-Mauslinie über das frequenzspezifische Hörvermögen und die morphologische Degeneration im Corti´schen Organ im altersabhängigen Verlauf können aber hilfreich sein, um neben der motorischen auch die sensorische Degeneration dieser Pathologie besser zu verstehen. Zudem konnten auch umfassende Erkenntnisse für die Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen der Maus in Bezug auf verschiedene Variablen erhalten werden. N2 - As one of the five senses the aural sense is the most essential part for human interactions and communication. Disturbances of this sense are differentiated into non-sensorineural disorders with a disturbed sound transmission, and sensorineural ones, which affect the neural structures of the ear. The actual study was focused on the question if a newly generated mouse model, the Brn3.1 IRES Cre mouse, and an established line, the pmn-mouse, were suitable to simulate the pathology of auditory neuropathy. The Brn3.1 IRES Cre mouse was crossbred with flox reporter mouse lines to evaluate the expression of Cre recombinase under the activity of the Brn3.1 promotor. The pmn-mouse is the existing murine model of a motoneuron disease, but showed elevated hearing thresholds in previous studies. All used lines were audiologically tested at different frequencies using ABR and DPOAE to evaluate the functional status of the hair cells in the organ of Corti. These evaluations were done in the pmn-line weekly from P21 to P35. At those time points the organ of Corti was also evaluated morphologically. The study showed that all used mouse lines showed normal hearing thresholds compared to the background line C57BL/6 and displayed DPOAE answers. In F1 offspring of Brn3.1 IRES Cre crossbred with the LacZ reporter line Cre recombinase expression under Brn3.1 promotor activity was observed at P14 and P21. Expression was mosaic-like in outer hair cells and limited to the aforementioned time points. Using RT-PCR is was possible to show a discrepancy between genotype and expression of the reporter protein in the tissue. It was assumed, that expression of Cre recombinase was suppressed by gene silencing processes and Brn3.1 was not potent enough to drive sufficient Cre recombinase expression. The audiological evaluation of the pmn-line showed already at P21 elevated hearing thresholds compared to wildtype mice. DPOAE answers could be elicited only in certain frequencies in pmn-mice. Morphological analysis showed a loss of outer hair cells spanning the whole length of the organ of Corti at all phases. A TUNEL assay showed that the hair cells died by apoptosis. The pmn-phenotype is characterized by a mutation in the TBCE gene, a protein responsible for organization of microtubules. A distribution analysis showed that TBCE in the organ of Corti was mainly expressed in the outer hair cells as well as the inner pillar cells and thus likely influences the maintenance of these structures. The auditory nerves of the pmn-mice also displayed some loss of microtubules. Additionally to the in vivo evaluation, it was tried to establish a glial cell free culture of dissociated spiral ganglia neurons. Therefore several factors of a primary cell culture were evaluated concerning their influence on overall cell number, percentage of neurons and neuritic outgrowth. To establish a glial cell free culture of dissociated spiral ganglia neurons, the variables media, coating, neurotrophins/cytokines and use of a cytostatic were evaluated separately. While the first three mentioned mainly influenced the neurite outgrowth in culture, the last one increased the percentage of neurons. The results were checked against the real number of neurons in culture. The results yielded a preference for DMEM over NB medium, as well as for additional laminin coating, the use of the cytokine LIF over the neurotrophins BDNF and NT-3 and the application of the cytostatic cytosine-β-D-arabinofuranosid at a concentration of 5-10 µM from day 2 after plating. Combining these preferences yielded similar results to those of the test series of neurotrophins/cytokines and cytostatic. The percentage of neurons in culture could be increased to an average of 10-12 %. A shift of the glial cell/neuron percentage in favor of the latter seems to need the addition of further factors or the use of other methods. The results showed, that the mouse lines evaluated in this study did not resemble pathologies fully comparable to those of auditory neuropathy. However, further information on the pmn-mouse line concerning frequency-specific hearing thresholds and morphologic degeneration in the organ of Corti in a time dependent manner could be gathered. This may be helpful to better understand sensory next to motor neuron degeneration in this pathology. Furthermore comprehensive results could be gained for the culture of dissociated spiral ganglia neurons concerning different variables. KW - Audiologie KW - Neuropathologie KW - Elektrophysiologie KW - Sinneszelle KW - Auditorische Neuropathie KW - Haarzelle KW - Corti-Organ KW - transgenes Modell KW - sensorische Neurone KW - Transgener Organismus KW - Maus KW - Tiermodell Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177101 ER - TY - THES A1 - Segerer, Gabriela T1 - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM T1 - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism. N2 - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus. Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht. Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert. Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität. Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert. Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären. PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf. Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Phosphoglykolat-Phosphatase KW - Maus KW - Cytologie KW - Physiologie KW - Phosphatasen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847 ER - TY - THES A1 - Winter, Patrick T1 - Neue Methoden zur Quantitativen Kardiovaskulären MR-Bildgebung T1 - New methods for quantitative cardiovascular magnetic resonance imaging N2 - Herzkreislauferkrankungen stellen die häufigsten Todesursachen in den Industrienationen dar. Die Entwicklung nichtinvasiver Bildgebungstechniken mit Hilfe der Magnetresonanz-Tomografie (MRT) ist daher von großer Bedeutung, um diese Erkrankungen frühzeitig zu erkennen und um die Entstehungsmechanismen zu erforschen. In den letzten Jahren erwiesen sich dabei genetisch modifzierte Mausmodelle als sehr wertvoll, da sich durch diese neue Bildgebungsmethoden entwickeln lassen und sich der Krankheitsverlauf im Zeitraffer beobachten lässt. Ein große Herausforderung der murinen MRT-Bildgebung sind die die hohen Herzraten und die schnelle Atmung. Diese erfordern eine Synchronisation der Messung mit dem Herzschlag und der Atmung des Tieres mit Hilfe von Herz- und Atemsignalen. Konventionelle Bildgebungstechniken verwenden zur Synchronisation mit dem Herzschlag EKG Sonden, diese sind jedoch insbesondere bei hohen Feldstärken (>3 T) sehr störanfällig. In dieser Arbeit wurden daher neue Bildgebungsmethoden entwickelt, die keine externen Herz- und Atemsonden benötigen, sondern das MRT-Signal selbst zur Bewegungssynychronisation verwenden. Mit Hilfe dieser Technik gelang die Entwicklung neuer Methoden zur Flussbildgebung und der 3D-Bildgebung, mit denen sich das arterielle System der Maus qualitativ und quantitativ erfassen lässt, sowie einer neuen Methode zur Quantisierung der longitudinalen Relaxationszeit T1 im murinen Herzen. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden ermöglichen robustere Messungen des Herzkreislaufsystems. Im letzten Kapitel konnte darüber hinaus gezeigt werden dass sich die entwickelten Bildgebungstechniken in der Maus auch auf die humane Bildgebung übertragen lassen. N2 - Cardiovascular diseases are one of the main causes of death in western countries. Hence, the development of non-invasive imaging techniques using Magnetic Resonance Imaging (MRI) is very important for early detection of these illnesses and for examination of the biological mechanisms. In the past years genetically modified mouse models have proven to be great assets, since they allow the development of new imaging techniques and to investigate the progress of cardiovascular diseases in time lapse. The main challenge of murine MRI is the high heart rate und the fast respiration. Hence, synchronization of the measurement with cardiac motion and breathing by using cardiac and respiration signals is required. Most imaging techniques use ECG leads for synchronization with the heartbeat, however, these probes are prone to disturbances at high magnetic field strengths (>3 T). In this work new imaging techniques were developed that do not use external cardiac and respiration signals but the MRI signal itself for motion synchronization. With these techniques new methods for flow quantification und 3D imaging could be developed for qualitative and quantitative measurements in the murine arteries. Furthermore, a new method for quantification of the longitudinal relaxation time T1 in the murine heart could be developed. The methods presented in this work enable more robust measurements of the cardiovascular system. In the last chapter it could be shown that the imaging techniques developed in the mouse can also be transferred to human MRI. KW - Kernspintomografie KW - Kardiovaskuläres System KW - Flussbildgebung KW - 3D-Bildgebung KW - Selbstnavigation KW - T1 KW - UTE KW - Maus KW - Aorta KW - Herzmuskel KW - Herzschlag Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174023 ER - TY - THES A1 - Bacmeister, Lucas T1 - Effect of Cadherin-13 inactivation on different GABAergic interneuron populations of the mouse hippocampus T1 - Effekt der Cadherin-13 Inaktivierung auf verschiedene GABAerge Interneuronenpopulationen im Hippocampus der Maus N2 - Cadherin-13 (CDH13) is an atypical member of the cadherin superfamily, a group of membrane proteins mediating calcium-dependent cellular adhesion. Although CDH13 shows the classical extracellular cadherin structure, the typical transmembrane and cytoplasmic domains are absent. Instead, CDH13 is attached to the cell membrane via a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. These findings and many studies from different fields suggest that CDH13 also plays a role as a cellular receptor. Interestingly, many genome-wide association studies (GWAS) have found CDH13 as a risk gene for attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and other neurodevelopmental disorders. In previous work from our research group, strong expression of Cdh13 mRNA in interneurons of the hippocampal stratum oriens (SO) was detected. Therefore, double-immunofluorescence studies were used to evaluate the degree of co-expression of CDH13 with seven markers of GABAergic interneuron subtypes. For this purpose, murine brains were double stained against CDH13 and the respective marker and the degree of colocalization in the SO of the hippocampus was assessed. Based on the result of this immunofluorescence study, quantitative differences in interneuron subtypes of the SO between Cdh13 knockout (ko), heterozygote (het) and wildtype (wt) mice were investigated in this dissertation using stereological methods. In addition, genotype- dependent differences in the expression of genes involved in GABAergic and glutamatergic neurotransmission were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Primers targeting different GABA receptor subunits, vesicular GABA and glutamate transporter, GABA synthesizing enzymes and their interaction partners were used for this purpose. The results of the stereological quantification of the interneuron subtypes show no significant differences in cell number, cell density or volume of the SO between Cdh13 ko, het and wt mice. On the other hand, qRT-PCR results indicate significant differences in the expression of tropomyosin-related kinase B gene (TrkB), which encodes the receptor of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a regulator of GABAergic neurons. This finding supports a role for CDH13 in the regulation of BDNF signaling in the hippocampus. N2 - Cadherine sind eine große Gruppe von calciumabhängigen Typ-1 Transmembranproteinen, die an der Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten beteiligt sind. Cadherin-13 (CDH13) ist ein atypisches Mitglied dieser Proteinfamilie. Obwohl es die gleiche extrazelluläre Struktur wie klassische Cadherine besitzt, fehlen sowohl die cytoplasmatische als auch die Transmembrandomäne. Stattdessen ist CDH13 über einen GPI-Anker an der zellulären Plasmamembran befestigt. Diese Ergebnisse und viele andere Studien aus unterschiedlichen Bereichen lassen vermuten, dass CDH13 auch als zellulärer Rezeptor wirkt. Interessanterweise ergaben verschiedene genomweite Assoziationsstudien, dass CDH13 ein vielversprechendes Kandidatengen für das Auftreten von Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und anderen Störungen der neuronalen Entwicklung ist. In früheren Studien unserer Arbeitsgruppe wurde eine starke Expression von Cd13 mRNA in Interneuronen des stratum oriens (SO) des Hippocampus festgestellt. Daher wurde mit Hilfe von Immunfluoreszenz der Grad der Koexpression von CDH13 mit 7 verschiedenen Markern von Subtypen GABAerger Interneuronen ermittelt. Zu diesem Zweck wurden Doppelfärbungen gegen CDH13 und den jeweiligen Marker durchgeführt und anschließend der Grad der Kolokalisation im SO des Hippocampus berechnet. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden in dieser Dissertation quantitative Unterschiede zwischen verschiedenen Subtypen von Interneuronen in Cdh13 knockout (ko), heterozygoten (het) und Wildtyp (wt)-Mäusen mit Hilfe von stereologischen Methoden ermittelt. Darüber hinaus wurden genotypabhängige Unterschiede in der GABAergen und glutamatergen Neurotransmission mit quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) evaluiert. Hierzu wurden Primer eingesetzt, die sowohl auf Untereinheiten des GABA Rezeptors, GABA-synthetisierende Enzyme als auch auf GABA- und Glutamat-Transporter innerhalb synaptischer Vesikel abzielen. In der stereologischen Quantifizierung der Interneuron-Subtypen wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Zellzahl, der Zelldichte oder des Volumens des SO zwischen den verschieden Genotypen gefunden. Im Gegensatz dazu zeigten sich in der qRT-PCR signifikante Unterschiede in der Expression von tropomyosin-related kinase B (TrkB), einem Gen, das für den Rezeptor des brain-derived neurotrophic factor (BDNF) kodiert. Bei diesem handelt es sich um einen Regulator von GABAergen Neuronen. Diese Ergebnisse bekräftigen, dass CDH13 an der Regulation des BDNF-Signalwegs im Hippocampus teilnimmt. KW - Cadherine KW - GABAerge Nervenzelle KW - Hippocampus KW - Cadherin-13 KW - CDH13 KW - Tropomyosin receptor kinase B KW - TrkB KW - Maus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172693 ER - TY - THES A1 - Cabello González, Victoria T1 - From behavioral to neurobiological characterization of Rsk2 knockout mice as an animal model for Coffin-Lowry syndrome T1 - Vom Verhalten bis zur neurobiologischen Charakterisierung von Rsk2-defizienten Mäusen, einem Tiermodell für das Coffin-Lowry Syndrom N2 - Coffin-Lowry syndrome is a rare syndromic form of X-linked mental retardation caused by heterogeneous loss-of-function mutations in the gene RPS6KA3 that encodes the RSK2 protein. Clinical features are delayed motor development, small height, progressive skeletal malformations and mental retardation. Rsk2 deficiency affects behavioral, cellular and molecular functions. To characterize and investigate how this deficiency affects these functions, we made a series of experiments using Rsk2-deficient mice as the animal model for Coffin-Lowry syndrome. We applied a battery of behavioral tests and included the use of the IntelliCage for the first time as a behavioral paradigm to study anxiety-like behavior and depression-like behavior in Rsk2-deficient mice. Results from the conventional behavioral tests and from the IntelliCage indicate that Rsk2-deficient mice may have an anti-anxiety and anti-depressive phenotype. We evaluated in Rsk2 deficient mice the relative gene expression of a set of genes coding for proteins related to RSK2 which are involved in fear memory, synaptic plasticity, neurogenesis, learning, emotional behavior and stress. We found gene expression alterations in the prefrontal cortex and striatum. These results suggest that RSK2 may be involved in the expression of the genes. RSK2 is known to be related to monoamine neurotransmitter function. We measured the levels of dopamine, serotonin and noradrenaline/norepinephrine and their metabolites in different brain regions of Rsk2-deficient mice. We found differences in the dopaminergic and noradrenergic systems suggesting an increased or decreased activity of these neurotransmission systems as a result of Rsk2 deficiency. Adult neurogenesis is a form of neuronal plasticity and a multi-step process of cell development. We explored if this form of neuronal plasticity was affected by Rsk2-deficiency. Our results indicate that adult hippocampal neurogenesis is not influenced by lifelong Rsk2 deficiency. It would be worth to analyze in the future other aspects of neuroplasticity. We have confirmed, that behavioral characteristics of Rsk2-deficient mice make them an interesting model to study the Coffin-Lowry syndrome by extending the behavioral characterization on the emotional level. Furthermore, we have extended the characterization of the model on a molecular level, opening new opportunities to study and understand the pathophysiological basis of the Coffin-Lowry syndrome. N2 - Das Coffin-Lowry Syndrom ist eine seltene syndromale Form X-gebunden vererbter geistiger Behinderung, verursacht durch heterogene loss of function Mutationen im RPS6KA3-Gen, welches für das RSK2-Protein kodiert. Klinische Charakteristika sind eine verzögerte motorische Entwicklung, eine geringe Körpergröße, fortschreitende Skelett- Malformationen und geistige Behinderung. Die Rsk2-Mutation hat einen Einfluss auf das Verhalten, auf zelluläre und molekulare Funktionen. Um zu charakterisieren und zu untersuchen, wie diese Defizienz diese Funktionen beeinflusst, führten wir eine Reihe von Experimenten durch und verwendeten Rsk2-defiziente Mäuse als Tiermodell für das Coffin-Lowry Syndrom. Wir wandten eine Reihe von Verhaltens-Tests an, einschließlich erstmals den IntelliCage als ein Verhaltensparadigma, um Angst-ähnliches und Depressions-ähnliches Verhalten in Rsk2-defizienten Mäusen zu untersuchen. Ergebnisse konventioneller Verhaltenstests und aus dem IntelliCage sprechen dafür, dass Rsk2-defiziente Mäuse einen „anti-ängstlichen“ und „anti-depressiven“ Phänotyp haben. Wir haben bei Rsk2-defizienten Mäusen die Expression einer Reihe von Genen untersucht, die für Proteine kodieren, die mit RSK2 in Zusammenhang stehen und darüber hinaus eine Bedeutung für das Angst-Gedächtnis, synaptische Plastizität, Neurogenese, Lernen, emotionales Verhalten und Stress haben. Im präfrontalen Kortex und Striatum konnten wir Genexpressionsunterschiede zwischen Rsk2-Wildtyp- und Knockout-Mäusen detektieren. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass RSK2 eine Rolle bei der Expression dieser Gene spielt. Es ist bekannt, dass RSK2 eine Rolle für die monoaminerge Neurotransmitter-Funktion spielt. Deshalb haben wir die Konzentration von Dopamin, Serotonin und Noradrenalin/Norepinephrin und ihrer Metaboliten in verschiedenen Gehirnregionen von Rsk2-defizienten Mäuse untersucht. Wir haben Unterschiede im dopaminergen und noradrenergen System gefunden, was auf eine gesteigerte oder verminderte Aktivität dieser Neurotransmittersysteme als Folge der Rsk2-Defizienz hinweist. Adulte Neurogenese ist eine Form neuronaler Plastizität und ein mehr-stufiger Prozess zellulärer Entwicklung. Unsere Untersuchungen der adulten Neurogenese im Hippocampus zeigten, dass sie nicht durch eine lebenslange Rsk2-Defizienz beeinflusst wird. In Zukunft wäre es jedoch sinnvoll, andere Aspekte der Neuroplastizität zu analysieren. Durch unsere Verhaltensstudien wurde die Charakterisierung der Rsk2-defizienten Mäuse vor allem im emotionalen Bereich stark erweitert, wodurch wir bestätigen konnten, dass diese Mauslinie ein interessantes Modell zur Untersuchung des Coffein-Lowry Syndroms ist. Darüber hinaus haben wir die Charakterisierung des Modells auf der molekularen Ebene erweitert und damit neue Möglichkeiten eröffnet, die pathophysiologische Grundlage des Coffin-Lowry Syndroms zu studieren. KW - Knockout KW - Maus KW - Coffin-Lowry syndrome KW - Animal behavior IntelliCage system KW - RSK2 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171275 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Lukas T1 - The α-galactosidase A deficient mouse as a model for Fabry disease and the effect of Gb3 depositions on peripheral nociceptive ion channel function T1 - Die α-Galaktosidase A defiziente Maus als Modell für M. Fabry und der Effekt von Gb3-Ablagerungen auf die Funktion von peripheren nozizeptiven Ionenkanälen N2 - Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder with intracellular accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) due to α-galactosidase A deficiency. We studied α-galactosidase A knockout mice (GLA KO) as a model for sensory disturbance and pain in FD. Pain associated behavior of young (3 months) and old (≥18 months) GLA KO mice and wildtype (WT) littermates in an inflammatory and a neuropathic pain model was investigated. Furthermore, affective and cognitive behavior was assessed in the naïve state and in an inflammatory pain model. Gene and protein expression of pain associated ion channels and Gb3 accumulation in dorsal root ganglion (DRG) neurons was determined. We also performed patch clamp analysis on cultivated DRG neurons and human embryonic kidney 293 (HEK) cells expressing voltage-gated-sodium channel 1.7 (Nav1.7) as an in vitro model of FD. Intracellular Gb3 deposits were modulated using shRNA silencing of α-galactosidase A. After intraplantar injection of complete Freund`s adjuvant (CFA) and chronic constriction injury (CCI) of the right sciatic nerve, old GLA KO mice did not develop heat and mechanical hypersensitivity in contrast to young GLA KO and old WT mice. Additionally, we found no relevant differences between genotypes and age-groups in affective and cognitive behavior in the naïve state and after CFA injection. Gene and protein expression analysis provided no explanation for the observed sensory impairment. However, cultured DRG neurons of old GLA KO mice revealed a marked decrease of sodium and Ih-currents compared to young GLA KO and old WT mice. DRG neurons of old GLA KO mice displayed substantial intracellular accumulation of Gb3 compared to young GLA KO and old WT mice. Similar to cultured neurons, sodium currents were also decreased in HEK cells treated with shRNA and consecutively increased intracellular Gb3 deposits compared to the control condition, but could be rescued by treatment with agalsidase-alpha. Our study unveils that, similar to patients with FD, GLA KO mice display age-dependent sensory deficits. However, contrary to patients, GLA KO mice are also protected from hypersensitivity induced by inflammation and nerve lesion due to Gb3-dependent and reversible reduction of neuronal sodium- and Ih-currents. Our data provide evidence for direct Gb3-dependent ion channel impairment in sensory DRG neurons as a potential contributor to sensory dysfunction and pain in FD. N2 - Bei Morbus Fabry (M. Fabry) handelt es sich um eine X-chromosomal vererbte, lysosomale Speichererkrankung mit intrazellulärer Akkumulation von Globo-triaosylceramid (Gb3) aufgrund eines α-Galaktosidase-A Mangels. Um die Pathophysiologie des M. Fabry aufzuklären, untersuchten wir die α-Galaktosidase-A defiziente Maus (GLA KO) als Modell für sensible Wahrnehmungsstörungen und Schmerz. Das schmerzassoziierte Verhalten von jungen (3 Monate) und alten (≥18 Monate) GLA KO Mäusen und Wildtyp (WT) Wurfgeschwistern wurde in einem Entzündungs- und einem neuropathischen Schmerzmodell untersucht. Zudem wurde das affektive und kognitive Verhalten im naiven Zustand und in einem Entzündungsschmerzmodell betrachtet. Auf molekularer Ebene wurden die Gen- und Proteinexpression von schmerzassoziierten Ionenkanälen und die Gb3-Akkumulation in Spinalganglionneuronen (dorsal root ganglion, DRG) bestimmt. Darüber hinaus wurden kultivierte DRG Neurone und humane embryonale Nierenzellen 293 (HEK) mittels Patch-clamp-Analyse elektrophysiologisch untersucht. Die HEK Zellen dienten als in vitro Modell für M. Fabry und exprimierten stabil den spannungsgesteuerten Natriumkanal 1.7 (Nav1.7). Intrazelluläre Gb3 Ablagerungen wurden unter Verwendung von shRNA-Silencing der α-Galaktosidase A induziert. Nach intraplantarer Injektion von complete Freund‘s Adjuvans (CFA) und chronic constriction injury (CCI) des rechten N. ischiadicus entwickelten alte GLA KO Mäuse, im Gegensatz zu jungen GLA KO und alten WT Mäusen, keine Überempfindlichkeit gegenüber Hitze und mechanischen Reizen. Darüber hinaus fanden wir keine relevanten Unterschiede zwischen Genotypen und Altersgruppen im affektiven und kognitiven Verhalten im naiven Zustand und nach Injektion von CFA. Gen- und Proteinexpressionsanalysen lieferten keine Erklärung für die sensible Beeinträchtigung. Jedoch zeigten kultivierte DRG Neurone von alten GLA KO Mäusen eine deutliche Abnahme der Natriumströme und der Ih Ströme im Vergleich zu jungen GLA KO und alten WT Mäusen. Außerdem wiesen DRG Neurone von alten GLA KO Mäusen eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von Gb3 im Vergleich zu jungen GLA KO und alten WT Mäusen auf. Ähnlich wie bei kultivierten Neuronen waren die Natriumströme in, mit shRNA behandelten HEK-Zellen, im Vergleich zu den Kontrollzellen ebenfalls verringert, konnten aber durch die Behandlung mit Agalsidase-alpha wiederhergestellt werden. Unsere Studie zeigt, dass GLA KO Mäuse ähnlich wie Patienten mit M. Fabry altersabhängige sensible Veränderungen aufweisen. Im Gegensatz zu Patienten sind GLA KO Mäuse jedoch auch vor der Überempfindlichkeit geschützt, die durch eine Entzündung und Nervenläsion hervorgerufen wird. Unsere elektrophysiologischen Ergebnisse jedoch, deuten darauf hin, dass die Reduktion der Natrium- und Ih Ströme mit den veränderten Antworten auf die sensiblen Reize zusammenhängt. Diese Daten lassen auf eine Gb3 abhängige Ionenkanaldysfunktion in DRG Neuronen als potentiellen Faktor für sensible Fehlfunktion und Schmerz bei M. Fabry schließen. KW - Fabry-Krankheit KW - Gb3 accumulation KW - Ion channel function KW - Galactosidase KW - Ionenkanal KW - Maus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158513 ER - TY - THES A1 - Heinrichs, Susanne Margarete T1 - Myocardial B-cell infiltration following occlusion of the left anterior descending artery in mice is driven by CXCL13 T1 - Die Infiltration des Myokards durch B-Lymphozyten nach Ligatur der linken Koronararterie im Mausmodell wird durch CXCL13 verursacht N2 - Myocardial B-cell infiltration after LAD occlusion in mice is driven by CXCL13 After myocardial infarction, the immune system is activated and regulates wound healing and remodeling processes in the heart. While the role of T cells has been elucidated already, the function of B cells in myocardial infarction remained relatively unclear until now. It is, however, already known that B cells are of importance in healing processes in other tissues, for example in the skin. Our studies therefore addressed the role and function of B cells in healing and early remodeling processes in the myocardium after infarction. Under physiological conditions, only few B cells can be found in the heart. After myocardial infarction, however, which we modelled with a permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD) in C57BL/6J mice, we could demonstrate that B lymphocytes accumulate in the early phase after tissue injury (days one to seven) in the myocardium. To detect B cells, we performed immunofluorescence stainings on cryosections of infarcted hearts using an anti-B220 antibody. Quantitative analysis of tissue infiltration revealed that B cells peaked at day seven. In flow cytometry, we further characterized the B cells infiltrating infarcted tissue. We found that most of them were mature B cells (IgM+, IgD+). Next, we wanted to outline a potential mechanism responsible for B-cell infiltration to the site of tissue injury. We therefore performed ELISA experiments revealing that CXCL13 was upregulated in scar tissue. Antibody-mediated neutralization of CXCL13 verifiably attenuated B-cell infiltration. Treated mice also showed – in the tendency – smaller infarct sizes and an improved survival. In conclusion, we could show that B lymphocytes infiltrate the myocardium after MI in mice following a local CXCL13 gradient and that it is, most likely, beneficial to inhibit this process. N2 - Nach einem Herzinfarkt wird das Immunsystem aktiviert und bestimmt die Wundheilung sowie das Remodeling im Herzen. Während die Rolle von T-Zellen [dabei] bereits relativ gut untersucht ist, war die Funktion von B-Zellen beim Myokardinfarkt bis heute relativ unklar. Man weiß bisher allerdings, dass B-Zellen eine wichtige Rolle in Heilungsprozessen in anderen Geweben spielen, z.B. in der Haut. Unsere Untersuchungen beschäftigten sich daher mit der Rolle und Funktion von B-Zellen nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell. Unter physiologischen Bedingungen finden sich nur wenige B-Zellen im Herzen. Nach Herzinfarkt, den wir mithilfe einer permanenten Ligatur der linken Herzkranzarterie in C57BL/6J-Mäusen induzierten, konnten wir jedoch zeigen, dass B-Zellen in der frühen Phase nach Gewebeschädigung (Tag eins bis sieben) im Myokard akkumulieren. Um B-Zellen zu detektieren, führten wir Immunfluoreszenz-Färbungen mit einem monoklonalen Anti-B220-Antikörper auf Gefrierschnitten des Herzens durch. Eine quantitative Auswertung der Gewebeinfiltration ergab, dass die Anzahl der B-Zellen an Tag sieben ihren Höhepunkt erreicht. In durchflusszytometrischen Untersuchungen charakterisierten wir [anschließend] die das infarzierte Gewebe infiltrierenden B-Zellen (weiter). Wir stellten dabei fest, dass es sich bei den meisten dieser Zellen um reife B-Zellen (IgM+, IgD+) handelte. Als nächsten Schritt wollten wir einen möglichen Mechanismus, der die B-Zell-Infiltration am Ort der Gewebeschädigung erklärt, umreißen. Wir führten daher ELISA-Messungen durch, die ergaben, dass CXCL13 im Narbengewebe hochreguliert war. Eine Antikörper-vermittelte Neutralisation von CXCL13 konnte nachweisbar die B-Zell-Infiltration hemmen. So behandelte Mäuse zeigten – in der Tendenz – kleinere Infarktgrößen und ein verbessertes Überleben. Zusammenfassend konnten wir somit zeigen, dass B-Lymphozyten nach Myokardinfarkt in der Maus das Myokard aufgrund eines lokalen CXCL13-Gradienten infiltrieren und dass es höchstwahrscheinlich vorteilhaft ist, diesen Prozess zu unterbinden. KW - Maus KW - CXCL13 KW - Herzinfarkt KW - B-Lymphozyt KW - LAD Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168554 ER - TY - THES A1 - Popp, Michael T1 - Mechanisms of platelet activation and receptor regulation in genetically modified mice T1 - Mechanismen der Thrombozytenaktivierung und Rezeptorregulation in genetisch veränderten Mäusen N2 - This work summarizes the results of studies on several major aspects of platelet activation and platelet receptor regulation. Therefore, this thesis is divided into four parts. Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Agonist-induced elevation in cytosolic Ca2+ concentrations is essential for platelet activation in hemostasis and thrombosis. The principal route of Ca2+ influx in platelets is store-operated calcium entry (SOCE). The calcium sensor molecule stromal interaction molecule 1 (STIM1) regulates SOCE by activating the membrane calcium channel protein Orai1, but the exact mechanisms of this interaction are not fully understood. Using affinity chromatography to screen for STIM1 interacting proteins in platelets, bridging integrator 2 (BIN2), an adapter protein belonging to the family of BAR proteins that is mainly expressed in the hematopoietic system, was identified. Newly generated BIN2 KO mice were viable and fertile but their platelets displayed markedly impaired SOCE in response to thapsigargin (TG) as well as agonists acting on immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) or G protein-coupled receptors. This SOCE defect resulted in impaired (hem)ITAM induced platelet activation, aggregate formation under flow and procoagulant activity. As a consequence, mice lacking BIN2 in platelets were protected from occlusive arterial thrombus formation and thrombo-inflammatory cerebral infarct progression in a model of experimental stroke. These results identify BIN2 as a critical regulator of platelet SOCE in thrombosis and thrombo-inflammatory disease. Integrin αIIbβ3 plays a central role in the adhesion and aggregation of platelets. Integrin activation requires the transmission of a signal from the small cytoplasmic tails of the α or β subunit to the large extracellular domains resulting in conformational changes of the extracellular domains to enable ligand binding. It was hypothesized that Hic-5 is a novel regulator of integrin αIIbβ3 activation in mice. As demonstrated in the second part of this thesis, lack of Hic-5 had no detectable effect on platelet integrin activation and function in vitro and in vivo under all tested conditions. These results indicate that Hic-5 is dispensable for integrin αIIbβ3 activation and consequently for arterial thrombosis and hemostasis in mice. The Rho GTPase family members RhoA and Rac1 play major roles in platelet activation at sites of vascular injury. Little is known about possible redundant functions of these Rho GTPases in regulating platelet function. To investigate functional redundancies of RhoA and Rac1 in platelet production and function, mice with MK- and platelet-specific double- deficiencies in RhoA and Rac1 were generated. RhoA/Rac1 double-deficiency phenocopied the respective single knockouts without any additional effects in the double-knockout animals, demonstrating for the first time a functional non-redundancy of RhoA and Rac1 in platelet function. Antibodies against platelet glycoproteins (GP) trigger platelet destruction in immune thrombocytopenia (ITP) by binding to Fcγ receptors (FcγRs) on immune cells. However, antibodies against the platelet collagen receptor GPVI exert powerful anti-thrombotic action in vivo by inducing ectodomain shedding of the receptor associated with a transient thrombocytopenia. As shown in the final part of this thesis, blockade or deficiency of the inhibitory FcγRIIB abolished sequestration of anti-GPVI opsonized platelets in the hepatic vasculature and GPVI shedding. This process was mediated by liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), the major FcγRIIB expressing cell type in the body. Furthermore, LSEC FcγRIIB mediated hepatic platelet sequestration and contributed to thrombocytopenia in mice treated with antibodies against αIIbβ3, the major target antigen in human ITP. These results reveal a novel and unexpected function of hepatic FcγRIIB in the processing of antibody-opsonized platelets. N2 - Diese Arbeit fasst Untersuchungen zu verschiedenen Aspekten der Aktivierung von Thrombozyten und deren Rezeptorregulation zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in vier Teile gegliedert. Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden, kann aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall, führen. Bei der Aktivierung der Thrombozyten kommt es zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration. Der Ca2+-Einstrom in die Thrombozyten erfolgt hauptsächlich durch den „store operated calcium entry“ (SOCE). Der Calciumsensor „stromal interaction molecule 1“ (STIM1) reguliert den SOCE indem er das Ionenkanal-bildende Protein Orai1 in der Plasmamembran aktiviert. Der genaue Mechanismus dieser Interaktion ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Durch den Einsatz von Affinitätschromatographie, um Interaktionspartner von STIM1 zu identifizieren, wurde „bridging integrator 2“ (BIN2) gefunden. BIN2 ist ein Adapterprotein, aus der Familie der BAR Proteine, welches hauptsächlich von Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert wird. BIN2-defiziente Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, aber ihre Thrombozyten zeigten einen deutlich verminderten SOCE. Diese Reduktion zeigte sich sowohl nach der Stimulation mit Thapsigargin, aber auch nach der Stimulation mit Agonisten, die „immunoreceptor tyrosine-based activation motif-“ (ITAM-) oder G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren. Der defekte SOCE führte zu verminderter (hem)ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung, reduzierter Thrombenbildung im Flusskammersystem und verminderter prokoagulanter Aktivität. Dies hatte zur Folge, dass Mäuse mit thrombozytenspezifischer BIN2-Defizienz vor arterieller Thrombose und, in einem Schlaganfallmodell, vor thrombo-inflammatorischer Infarktprogression geschützt sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass BIN2 ein wichtiger Regulator des SOCE in Thrombozyten bei Thrombosen und thrombo-inflammatorischen Erkrankungen ist. Das Integrin αIIbβ3 spielt bei der Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten eine wichtige Rolle. Um das Integrin zu aktivieren, bedarf es einer Signalübertragung von den kleinen zytoplasmatischen Teilen der α und β Untereinheiten zu den großen extrazellulären Domänen, was zu deren Konformationsänderung führt und schließlich die Ligandenbindung ermöglicht. Es besteht die Hypothese, dass Hic-5 an der Regulation des Integrins αIIbβ3 in murinen Thrombozyten beteiligt ist. Wie im zweiten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, hat eine Hic-5 Defizienz jedoch weder in vitro noch in vivo Einfluss auf die Aktivierung und Funktion des Integrins αIIbβ3 in Thrombozyten. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hic-5 für die Aktivierung des Integrins αIIbβ3 und folglich auch für die arterielle Thrombose und Hämostase in Mäusen entbehrlich ist. Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Rac1 spielen bei der Thrombozytenaktivierung bei Gefäßverletzungen eine wichtige Rolle. Dennoch ist wenig über redundante Funktionen von RhoA und Rac1 bei der Steuerung der Thrombozytenfunktion bekannt. Um eine mögliche funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 zu untersuchen, wurden MK- und thrombozytenspezifische RhoA und Rac1 doppelt-defiziente Tiere gezüchtet. Die Thrombozyten der Tiere zeigten die Phänotypen einer RhoA- und Rac1-Defizienz, ohne dass weiter Effekte bemerkbar waren. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass es keine funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 bei der Regulation der Thrombozytenfunktion gibt. Antikörper, die gegen Glykoproteine auf Thrombozyten gerichtet sind, führen bei einer Immunthrombozytopenie (ITP) durch die Bindung an Fcγ Rezeptoren auf Immunzellen, zu einer Zerstörung der Thrombozyten. Eine Ausnahme sind Antikörper gegen den Kollagenrezeptor GPVI der Thrombozyten. Hier führen diese Antikörper zu einem starken antithrombotischen Schutz in vivo, indem sie das sog. „Shedding“ der Ektodomäne des Rezeptors und nur eine vorübergehende Thrombozytopenie auslösen. Im letzten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die Blockade, also auch das vollständige Fehlen des inhibitorischen FcγRIIB, die Sequestrierung von anti-GPVI-opsonierten Thrombozyten und das Shedding von GPVI verhindert. Für diese Prozesse ist speziell der FcγRIIB auf „liver sinusoidal endothelial cells“ (LSEC) ursächlich. Ferner konnte gezeigt werden, dass FcγRIIB auf LSECs auch für die Sequestrierung von Thrombozyten und die Thrombozytopenie in Mäusen, die mit Antikörpern gegen αIIbβ3, dem Hauptantigen bei humaner ITP, behandelt wurden, verantwortlich ist. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue und unerwartete Funktion des hepatischen FcγRIIB bei der Reaktion auf Antikörper-opsonierte Thrombozyten. KW - Hämostase KW - Maus KW - Thrombose KW - Thrombozyt KW - Schlaganfall KW - RhoGTPase KW - Hic-5 KW - SOCE KW - GPVI Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135494 ER - TY - THES A1 - Pennington, Laura Sophie T1 - The role of Cadherin-13 in serotonergic neurons during different murine developmental stages T1 - Die Rolle von Cadherin-13 in serotonergen Neuronen während verschiedener Entwicklungsstadien in der Maus N2 - Abstract Background: Attention-deficit/ hyperactivity disorder (ADHD) ranges among the most common neurodevelopmental disorders worldwide with a prevalence of 3-12% in childhood and 1-5% for adults. Over the last decade extensive genetic research has been conducted in order to determine its causative genetic factors. None of the so far identified susceptibility genes, however, could explain the estimated ADHD heritability of 76%. In this thesis one of the most promising candidates -Cadherin 13 (Cdh13) - was examined in terms of its influence on the central serotonergic (5-HT) system. In addition to that, the Cdh13 protein distribution pattern was analysed over time. Methods: The developing serotonergic system was compared over three embryonic and postnatal stages (E13.5, E17.5 and P7) in different Cdh13 genotypes (WT, HZ and KO) using immunohistochemistry and various double staining protocols. Results: The raphe nuclei of the 5-HT system develop in spite of Cdh13 absence and show a comparable mature constellation. The cells in the KO, however, are slightly more scattered than in the WT. Furthermore the dynamics of their formation is altered, with a transient delay in migration at E13.5. In early developmental stages the total amount of serotonergic cells is reduced in KO and HZ, though their proportional distribution to the raphe nuclei stays constant. Strikingly, at P7 the absolute numbers are comparable again. Concerning the Cdh13 protein, it shows high concentrations on fibres running through hindbrain and midbrain areas at E13.5. This, however, changes over time, and it becomes more evenly spread until P7. Furthermore, its presence in serotonergic cells could be visualised using confocal microscopy. Since the described pattern is only in parts congruent to the localisation of serotonergic neurons, it is most likely that Cdh13 is present in other developing neurotransmitter systems, such as the dopaminergic one, as well. Conclusion: It could be proven that Cdh13 is expressed in serotonergic cells and that its knockout does affect the developing serotonergic system to some degree. Its absence, however, only slightly and transiently affects the measured parameters of serotonergic system development, indicating a possible compensation of CDH13 function by other molecules in the case of Cdh13 deficiency. In addition further indicators could be found for an influence of Cdh13 on outgrowth and path finding of neuronal processes. N2 - Zusammenfassung Hintergrund: Das Aufmerksamkeits-Defizit/ Hyperaktivitäts-Syndrom (ADHS) gehört zu den häufigsten psychiatrischen Erkrankungen weltweit und betrifft 3- 12% aller Kinder und 1-5% der Erwachsenen. In den letzten Jahren wurde eine große Anzahl verschiedener genetischer Studien durchgeführt, um die zugrunde liegenden genetischen Ursachen genauer zu bestimmen. Von den vielen hundert bis dato gefundenen Kandidatengenen erreichte jedoch keines eine ausreichende statistische Signifikanz. Diese Arbeit befasst sich mit Cadherin 13, einem der vielversprechendsten Kandidatengene, und untersucht einen möglichen Zusammenhang mit der Entwicklung des serotonergen Systems. Zusätzlich wird das Cdh13 Verteilungsmuster im ZNS über die Zeit analysiert. Methoden: Es wurden embryonale und postnatale Entwicklungsstadien des serotonergen Systems (E13.5, E17.5 und P7) in drei Cdh13 Genotypen mit (WT, HZ, KO) verglichen. Dabei kamen Methoden der Immunhistochemie und diverse Doppelfärbungsprotokolle zum Einsatz. Ergebnisse: Die Raphe Kerne des serotonergen Systems entwickeln sich trotz fehlendem Cdh13 und zeigen im ausgereiften Zustand eine ähnliche Morphologie in allen Genotypen. Allerdings liegen die Neurone der Raphe Kerne im KO etwas weiter verstreut. Zudem hat es den Anschein als wäre die Dynamik ihrer Entwicklung beeinträchtigt. So liegt beispielsweise um E13.5 der KO im Vergleich zum WT vorübergehend etwas zurück. Außerdem weisen die frühen Entwicklungsstadien im KO und HZ deutlich reduzierte Zellzahlen auf, wobei deren anteilmäßige Verteilung zu den einzelnen Raphe Kernen zwischen den Genotypen unverändert ist. Überraschenderweise finden sich in P7 wieder vergleichbare Zellzahlen. Was die Verteilung von Cdh13 betrifft, so liegt es ab E13.5 vor allem auf Fasern von Hirnstamm und Mittelhirn in hohen Konzentrationen vor. Im Laufe der Entwicklung verliert Cdh13 diese begrenzte Lokalisation und zeigt sich homogen in weiten Teilen des ZNS verteilt. Da sein Verteilungsmuster nur teilweise Ähnlichkeiten mit dem 5-HT System aufweist, muss davon ausgegangen werden, dass es noch in anderen Neurotransmittersystemen wie etwa dem dopaminergen System eine Rolle spielt. Schlussfolgerung: Es ist gezeigt worden, dass Cdh13 in serotonergen Zellen exprimiert wird und seine Abwesenheit Einfluss auf die Entwicklung des serotonergen Systems nimmt. Angesichts seiner geringen Auswirkungen lässt sich allerdings vermuten, dass sein Fehlen teilweise von anderen Molekülen kompensiert wird. Darüber hinaus sind weitere Hinweise darauf gefunden worden, dass Cdh13 eine Rolle bei der Lenkung auswachsender neuronaler Fortsätze spielt. KW - Cadherine KW - Serotonerge Nervenzelle KW - Maus KW - Epigenetik KW - Cadherin 13 KW - Raphe Kerne KW - ADHS KW - Neurodevelopment KW - Genetics Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161331 ER - TY - THES A1 - Dietl, Sebastian T1 - Etablierung orthotoper Gehirntumor-Modelle in der Maus T1 - Establishment of orthotopic brain tumor models in mice N2 - Gehirntumore stellen die zweithäufigste Tumorart im Kindesalter dar. Trotz zahlreicher medizinischer Fortschritte verstirbt auch heute noch ca. 1/3 der Betroffenen und die Überlebenden leiden häufig unter geistigen und körperlichen Langzeitfolgen. Zwei Entitäten, die auch heute noch zu den großen Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie zählen, sind das Glioblastom und das Medulloblastom. Um beide Tumorarten weiter erforschen und neue Therapiekonzepte entwickeln zu können, wurden im Zuge dieser Arbeit zwei orthotope Mausmodelle etabliert: ein syngenes Glioblastom- und ein xenogenes Medulloblastom-Modell: GL261-FLuc Glioblastom-Modell: Das Glioblastom ist ein seltener Tumor im Kindesalter. Die extrem schlechte Prognose macht neue Behandlungsstrategien jedoch dringend erforderlich. Immuntherapien könnten hier ein rationaler Ansatz sein. Durch orthotope Inokulation lentiviral transduzierter GL261-FLuc Zellen wurde im Rahmen dieser Arbeit das syngene GL261 Modell etabliert und hinsichtlich seiner biomorphologischen und immunologischen Eigenschaften evaluiert: Ähnlich wie humane Glioblastome zeigen GL261-FLuc Zellen in vivo ein aggressives Wachstum, welches von einer schnellen Proliferation und deutlichen Invasionsneigung geprägt ist. Histologisch bestehen GL261-FLuc Tumore aus astrozytär differenzierten Zellen, die neben typischen Nekrosen auch eine starke, funktionell pathologische Vaskularisierung zeigen. Interessanterweise offenbarte das in vivo BLI nach orthotoper Inokulation eine Phase der „Tumoradaptation“ (Tag 6-14), die immunologischer Natur zu sein scheint. Die Tatsache, dass das Tumorwachstum wie beim Menschen in einer prinzipiell immunkompetenten Umgebung stattfindet und dass GL261-FLuc Zellen eine konstitutionelle und durch IFN γ stimulierbare MHC Klasse I Expression aufweisen, qualifiziert das Modell für immuntherapeutische Untersuchungen. Insgesamt handelt es sich nicht nur um ein gut voraussag- und reproduzierbares Modell, das die immunologischen und bio-morphologischen Kennzeichen des humanen Vorbildes suffizient rekapituliert, sondern es liefert auch dank der Möglichkeit, das Zellwachstum mittels BLI zu verfolgen, interessante Einblicke in das in vivo Verhalten der Zellen. MB3W1 Medulloblastom-Modell: Das Medulloblastom ist der häufigste maligne Gehirntumor des Kindesalters und kann, wie neue Genexpressionsstudien zeigen, in verschiedene molekulare Subgruppen unterteilt werden. Für Gruppe 3 Medulloblastome, die mit Abstand die schlechteste klinische Prognose besitzen, gibt es aktuell nur limitierte Daten, unter anderem auch deshalb, weil kaum geeignete Mausmodelle existieren. Der außergewöhnliche Fall eines zweijährigen Jungen, der an einem äußerst aggressiven anaplastischen Medulloblastom verstorben war, führte zur Etablierung des zweiten Hirntumormodells. Mit Zellen dieses Tumors (MB3W1 Zellen), die nach extrakranieller Metastasierung aus malignen Pleuraergüssen isoliert werden konnten, wurde ein orthotopes Xenograftmodell etabliert. Erstaunlicherweise ließen die Zellen sowohl Tumorstammzell- als auch Gruppe 3-Charakteristika erkennen: In vitro wachsen MB3W1 Zellen wie für Stammzellen typisch in Form von Neurosphären und zeigen neben der Fähigkeit zur exponentiellen Langzeitproliferation auch eine hohe ALDH Aktivität. Die Expression typischer Oberflächenmarker wie CD15 und CD133 ist ebenfalls suggestiv für Tumorstammzelleigenschaften. Die hohe Tumorigenität von MB3W1 Zellen in immuninkompetenten Mäusen (bereits 500 Zellen führten zu 100 % Tumorraten) ist neben der Tatsache, dass die induzierten Tumore exakt die histopathologischen Eigenschaften des Primärtumors rekapitulierten und eine multilineäre Differenzierung zeigten, als weiteres Stammzell-kennzeichen zu werten. Ergänzend zum genetischen Profil (MYC Amplifikation, Gruppe 3 spezifisches Genexpressionsmuster, Tetraploidie, 17q Zugewinne), das MB3W1 Zellen klar als Gruppe 3 Medulloblastom identifiziert, spiegeln MB3W1 Zellen auch das aggressive und disseminierende Verhalten, welches Gruppe 3 Tumore auszeichnet, wider. Die Xenotransplantate zeigten nicht nur ein rapides invasives Wachstum in vivo, sondern es konnte interessanterweise auch am Versuchsende regelhaft eine Metastasierung der Zellen in den zerebrospinalen Liquor beobachtet werden. Das im Zuge dieser Arbeit etablierte Xenograftmodell komplementiert die beiden einzigen derzeit veröffentlichten syngenen Gruppe 3 Modelle, da es im Gegensatz zu diesen ohne zusätzliche genetische Manipulation auskommt. Die einzige Modifikation der Zellen (die lentivirale Transduktion mit eGFP und FLuc) diente dem besseren in vivo „Monitoring“, war optional und veränderte auch das biologische Verhalten der Zellen nicht. Insgesamt ist es ein einfaches und gut reproduzierbares Tumormodell, das die gleichzeitige Erforschung von Tumorstammzell- und Gruppe 3-Eigenschaften erlaubt. Vor allem vor dem Hintergrund des außergewöhnlichen klinischen Verlaufs des Primärtumors ist es ein extrem wertvolles Werkzeug, das in Zukunft hoffentlich dazu beitragen wird, neue gezielte Therapiestrategien für die Behandlung solch aggressiver Tumore entwickeln zu können. N2 - Brain tumors are the second most common tumor entity in childhood. Despite of advances in treatment, one third of patients dies and survivors often suffer from severe side effects of therapy. Two (even today) challenging tumor entities are glioblastoma and medulloblastoma. For exploring these tumors and developing new treatment strategies, two orthotopic brain tumor models in mice should be established within this work: a syngenic gliblastoma model and a xenogenic medulloblastoma model: GL261-FLuc glioblastoma model: Glioblastoma is rare in childhood, but because of the devastating prognosis new treatment options are urgently needed. Immunotherapy seems to be a rational strategy. Within this work an orthotopic mouse model was established using lentiviral transduced GL261-FLuc cells and evaluated regarding to its biomorphological and immunological features: Like human glioblastoma GL261-FLuc cells show aggressive tumor growth with high proliferation and invasion. Histologically tumors are built of astrocytic differentiated tumor cells and typically exhibit necrosis and pathological vascularisation. Interestingly tumor growth is characterized through a typical phase of adaption during day 6-14, which seems to be of immunological nature. This and the facts that tumor growth takes place in an immunocompetent environment and that GL261-Fluc cells show expression of MHC I (stimulable with IFN γ) makes this model valuable for immunotherapy investigations. Taken together the GL261-FLuc model is not only good predictable and reproducible, it also reflects the immunological and biomorphological features of the human counterpart. The ability to visualize the tumor growth with BLI gives interesting insights in tumor behaviour within this model. MB3W1 medulloblastoma model: Medulloblastoma is the most frequent brain tumor in childhood. New gene expression studies now reveal four distinct molecular subgroups of medulloblastoma. For group 3 tumors, which by far have the worst prognosis, only limiting data exists, not least because of a lack of suitable tumor models. An extraordinary case of a two-year-old boy suffering from a highly aggressive anaplastic medulloblastoma led to the second tumor model within this work. With cells, isolated from malignant pleural effusions of this tumor (MB3W1 cells), an orthotopic xenograft model was established. Interestingly tumor cells not only exhibit signs of a group 3 medulloblastoma, but also of tumor stem cells: In vitro cultured cells show exponential longterm proliferation, formation of neurospheres and expression of several stem cell markers like CD15, CD133 and high ALDH activity. In vivo tumor cells typically are highly tumorigenic in immunocompromised mice leading to exact copies of the primary tumor and furthermore show the capacity of multilineage differentiation. The clinical course of the patient and the genetic profile of MB3W1 cells (MYC amplification, group 3 gene expression pattern, tetraploidy and gain of chromosome 17q) clearly classifies the tumor as group 3 medulloblastoma. Furthermore the established MB3W1 tumor model mimics the aggressive behaviour of the patient’s tumor by recapitulating its dissemination tendency. Xenotransplants not only show rapid in vivo proliferation, but also metastasize regularly into the cerebrospinal fluid and invade from there again into the cerebral parenchyma. This xenograftmodel is a valid and good reproducible medulloblastoma model, which exhibits not only tumor stem cell features, but also has a clear group 3 signature and therefore complements the only two at the moment published group 3 models. Especially in light of the extraordinary clinical course of the patient, this model will be an extreme valuable instrument to further investigate this aggressive subtype of medulloblastoma and to develop new treatment strategies. KW - Tumor KW - Maus KW - Modell KW - Glioblastom KW - Medulloblastom KW - orthotopes Gehirntumormodell KW - Mausmodell KW - Tumormodell KW - brain tumor model KW - mice Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160762 ER - TY - THES A1 - Bucher, Hannes T1 - Pre-clinical modeling of viral- and bacterial-induced exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease T1 - Prä-klinische Modellierung von viral und bakteriell induzierten Exazerbationen von Chronisch Obstruktiver Lungenerkrankung N2 - Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) exacerbations are a considerable reason for increased morbidity and mortality in patients. Infections with influenza virus (H1N1), respiratory syncytial virus (RSV) or nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are important triggers of exacerbations. To date, no treatments are available which can stop the progression of COPD. Novel approaches are urgently needed. Pre-clinical models of the disease are crucial for the development of novel therapeutic options. In order to establish pre-clinical models which mimic aspects of human COPD exacerbations, mice were exposed to cigarette smoke (CS) and additionally infected with H1N1, RSV and/or NTHi. Clinically relevant treatments such as the corticosteroids Fluticasone propionate and Dexamethasone, the phosphodiesterase-4 (PDE-4) inhibitor Roflumilast and the long-acting muscarinic receptor antagonist Tiotropium were tested in the established models. Furthermore, a novel treatment approach using antibodies (Abs) directed against IL-1α, IL-1β or IL-1R1 was examined in the established CS/H1N1 model. Levels of IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, KC, TNF-α, RANTES, IL-17, MCP-1, MIP 1α and MIP-1β were measured in lung homogenate. Numbers of total cells, neutrophils and macrophages were assessed in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid. Hematoxylin- and eosin- (H&E-) stained lung slices were analyzed to detect pathological changes. Quantitative polymerase-chain-reaction (qPCR) was used to investigate gene expression of ICAM-1 and MUC5 A/C. The viral/bacterial load was investigated in lung homogenate or BAL fluid. In addition to the in vivo studies, the effects of the above mentioned treatments were investigated in vitro in H1N1, RSV or NTHi-infected (primary) human bronchial epithelial cells using submerged or air-liquid-interface (ALI) cell culture systems. Four pre-clinical models (CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi) were established depicting clinically relevant aspects of COPD exacerbations such as increased inflammatory cells and cytokines in the airways and impaired lung function. In the CS/H1N1 model, Tiotropium improved lung function and was superior in reducing inflammation in comparison to Fluticasone or Roflumilast. Moreover, Fluticasone increased the loss of body-weight, levels of IL-6, KC and TNF-α and worsened lung function. In CS/RSV-exposed mice Tiotropium but not Fluticasone or Roflumilast treatment reduced neutrophil numbers and IL-6 and TNF α levels in the lung. The viral load of H1N1 and RSV was significantly elevated in CS/virus-exposed mice and NCI-H292 cells after Fluticasone and Dexamethasone treatment. The results from these studies demonstrate that Tiotropium has anti-inflammatory effects on CS/virus-induced inflammation and might help to explain the observed reduction of exacerbation rates in Tiotropium-treated COPD patients. Furthermore, the findings from this work indicate that treatment with Fluticasone or Dexamethasone might not be beneficial to reduce inflammation in the airways of COPD patients and supports clinical studies that link treatment with corticosteroids to an increased risk for pneumonia. Testing of anti-IL-1α, anti-IL-1β or anti-IL-1R1 Abs in the CS/H1N1 model suggests that, in line with clinical data, antagonization of IL-1β is not sufficient to reduce pulmonary inflammation and indicates a predominant role of IL-1α in CS/virus-induced airway inflammation. In line with the in vivo findings, anti-IL-1α but not anti-IL-1β Abs reduced levels of TNF-α and IL-6 in H1N1-infected primary human bronchial epithelial ALI cell culture. Blocking the IL-1R1 provided significant inhibitory effects on inflammatory cells in vivo but was inferior compared to inhibiting both its soluble ligands IL-1α and IL-1β. Concomitant usage of Abs against IL-1α/IL-1β revealed strong effects and reduced total cells, neutrophils and macrophages. Additionally, levels of KC, IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1α and MIP-1β were significantly reduced and ICAM-1 mRNA expression was attenuated. These results suggest that combined inhibition of IL-1α/IL-1β might be beneficial to reduce inflammation and exacerbations in COPD patients. Moreover, combined targeting of both IL-1α/IL-1β might be more efficient compared to inhibition of the IL-1R1. As in the CS/virus models, corticosteroid treatment failed to reduce inflammatory cells in the CS/NTHi and CS/H1N1/NTHi models, increased the loss of body-weight and the bacterial load. Furthermore, Roflumilast administration had no significant effects on cell counts or cytokines. However, it improved compliance in the CS/NTHi model. Treatment with Azithromycin reduced the bacterial load in the CS/NTHi model and reduced numbers of total cells, neutrophils, macrophages and levels of KC and TNF-α in the CS/H1N1/NTHi model. In conclusion, the established CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi models depict clinically relevant aspects of human COPD exacerbations in mice and provide the opportunity to investigate underlying disease mechanisms and to test novel therapies. N2 - Exazerbationen von Chronisch Obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) sind ein bedeutender Grund für erhöhte Morbidität und Mortalität von Patienten. Infektionen mit Influenza Virus (H1N1), Respiratory Syncytial Virus (RSV) oder nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) gelten als wichtige Auslöser von Exazerbationen. Bis heute gibt es keine Therapien, welche die Progression von COPD verhindern können. Neue Therapieansätze werden daher dringend benötigt. Prä-klinische Modelle spielen bei der Entwicklung neuer Therapien eine entscheidende Rolle. Um Aspekte einer humanen COPD-Exazerbation abzubilden, wurden Mäuse Zigarettenrauch (CS) ausgesetzt und zusätzlich mit H1N1, RSV und/oder NTHi infiziert. Klinisch relevante Behandlungen, z.B. die Kortikosteroide Fluticasonpropionat und Dexamethason, der Phosphodiesterase 4 (PDE-4) Inhibitor Roflumilast und der muskarinische Rezeptorantagonist Tiotropium, wurden in den etablierten Modellen getestet. Zudem wurde ein neuer therapeutischer Ansatz untersucht bei dem IL-1α, IL-1β neutralisierende bzw. IL-1R1 blockierende Antikörper (Ak) zum Einsatz kamen. Die Mengen von IFN-γ, IL-1β, IL 2, IL-6, KC, TNF-α, RANTES, IL-17, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β wurden im Lungenhomogenat gemessen. Die Gesamtzellzahl und die Anzahl von Neutrophilen und Makrophagen wurden in bronchoalveolärer Lavage (BAL) Flüssigkeit bestimmt. Hematoxylin- und Eosin- (H&E-) gefärbte Lungenschnitte wurden analysiert, um pathologische Veränderungen zu detektieren. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurde genutzt, um die Genexpression von ICAM-1 und MUC5 A/C zu untersuchen. Die Virus /Bakterienlast wurde in BAL Flüssigkeit oder Lungenhomogenat gemessen. Darüber hinaus wurden die Effekte der oben genannten Behandlungen in vitro in H1N1, RSV oder NTHi infizierten (primären) humanen bronchialen Epithelzellen in „submerged“ oder „air-liquid-interface (ALI)“ Zellkultur-Systemen untersucht. Vier prä-klinische Modelle (CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi) wurden etabliert, die relevante Aspekte einer Exazerbation, wie beispielsweise den Einstrom inflammatorischer Zellen, erhöhte Zytokinlevel oder verminderte Lungenfunktion abbilden. Im CS/H1N1-Modell verbesserte Tiotropium die Lungenfunktion und zeigte stärker anti-entzündliche Effekte als Fluticason oder Roflumilast. Zudem verstärkte Fluticason den Gewichtsverlust, erhöhte die Level von IL-6 und TNF-α und verschlechterte die Lungenfunktion. Im CS/RSV-Modell reduzierte Tiotropium, aber nicht Fluticason oder Roflumilast die Zahl der Neutrophilen sowie IL-6 und TNF-α Mengen. Die Menge von H1N1 und RSV war in den CS/Virus-Modellen sowie in NCI-H292 Zellen nach Fluticason- oder Dexamethason-Behandlung signifikant erhöht. Die Ergebnisse dieser Studien demonstrieren anti-inflammatorische Effekte von Tiotropium auf CS/Virus-induzierte Entzündung und könnten helfen, reduzierte Exazerbationshäufigkeiten in mit Tiotropium behandelten Patienten zu erklären. Zudem könnten die Resultate dieser Arbeit darauf hindeuten, dass die Behandlung mit Kortikosteroiden nicht geeignet ist, um Entzündung in COPD-Patienten zu reduzieren, und könnten dabei helfen, das in klinischen Studien festgestellte erhöhte Risiko von Pneumonien bei Behandlung mit Kortikosteroiden zu erklären. Im Einklang mit klinischen Daten deutet die Testung von anti-IL-1α, anti-IL-1β oder anti IL-1R1 Ak im CS/H1N1-Modell darauf hin, dass die Neutralisation von IL-1β nicht ausreicht, um die Entzündung in der Lunge zu reduzieren, und impliziert eine prädominierende Rolle von IL-1α in CS/H1N1-induzierter Atemwegsentzündung. Konform mit den in vivo Ergebnissen, reduzierten anti-IL-1α, aber nicht anti-IL-1β Ak, TNF-α und IL-6 in H1N1-infizierter primärer humaner bronchialer epithelialer ALI-Zellkultur. Die Blockade von IL-1R1 zeigte in vivo signifikante inhibitorische Effekte auf inflammatorische Zellen, die verglichen mit der Neutralisation seiner löslichen Liganden IL-1α/IL-1β allerdings unterlegen waren. Die kombinierte Neutralisation von IL-1α/IL-1β war sehr effektiv und reduzierte die Gesamtzellzahl sowie die Zahl der Neutrophilen und Makrophagen in der Lunge. Zusätzlich wurden die Level von KC, IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β signifikant reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kombinierte Inhibition von IL-1α/IL-1β geeignet sein könnte, um Entzündung und Exazerbationen in COPD-Patienten zu reduzieren. Zudem könnte IL-1α/IL-1β-Neutralisation effektiver sein als IL-1R1-Blockade. Wie in den CS/Virus-Modellen wurden inflammatorische Zellen durch Kortikosteroid-Behandlung im CS/NTHi- und CS/H1N1/NTHi-Modell nicht reduziert, verstärkten zudem den Gewichtsverlust und erhöhten die Bakterienmenge. Roflumilast zeigte keine Effekte auf Zellzahlen und Zytokine. Allerdings verbesserte die Behandlung damit die Compliance im CS/NTHi-Modell. Die Behandlung mit Azithromycin reduzierte die Bakterienmenge im CS/NTHi-Modell und reduzierte die Gesamtzellzahl und Anzahl von Neutrophilen und Makrophagen, sowie die Level von KC und TNF-α im CS/H1N1/NTHi-Modell. Zusammenfassend bilden die etablierten CS/H1N1-, CS/RSV-, CS/NTHi-, CS/H1N1/NTHi-Modelle klinisch relevante Aspekte von humanen COPD-Exazerbationen ab und ermöglichen die Erforschung von Krankheitsmechanismen und neuen Therapieansätze. KW - Obstruktive Ventilationsstörung KW - COPD KW - Exacerbation KW - Tiotropium KW - Influenza KW - NTHi KW - Preclinical KW - Model KW - Treatment KW - Exazerbation KW - Maus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144368 ER - TY - THES A1 - Bartlang, Manuela Slavica T1 - Timing is everything: The interaction of psychosocial stress and the circadian clock in male C57BL/6 mice T1 - Auf das richtige Timing kommt es an: Die Interaktion zwischen psychosozialem Stress und der inneren Uhr in männlichen C57BL/6 Mäusen N2 - Due to the rotation of the earth in the solar system all inhabitants of our planet are exposed to regular environmental changes since more than 3.5 billion years. In order to anticipate these predictable changes in the environment, evolutionarily conserved biological rhythms have evolved in most organisms – ranging from ancient cyanobacteria up to human beings – and also at different levels of organization – from single cells up to behavior. These rhythms are endogenously generated by so called circadian clocks in our body and entrained to the 24 h cycle by external timing cues. In multi-cellular organisms the majority of the cells in the body is equipped with such an oscillator. In mammals, the circadian system is structured in a hierarchical fashion: A central pacemaker resides in the bilateral suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus, while subsidiary peripheral clocks exist in nearly every tissue and organ. In contrast to the aforementioned recurrent environmental changes most organisms are also exposed to unpredictable changes in the environment. In order to adapt to these sudden alterations the acute activation of the stress response system, involving the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and the sympathetic nervous system, displays a fundamental survival mechanism. However, if activation of the stress system becomes chronic, devastating somatic and affective disorders might be the consequence. At first glance, the circadian and the stress system seem to represent two separate bodily control systems that are involved in adaptation to predictable and unpredictable stimuli, respectively. However, both systems are fundamental for survival, and thus, communicate with each other at various levels. Early studies already demonstrated that stressor exposure at different times of the diurnal cycle generates different stress effects, whereupon the type of stressor plays a pivotal role. Moreover, alterations in the SCN and peripheral circadian clocks could be shown following stressor exposure. In cooperation with various co-workers, I investigated whether the stress responsiveness is modulated by the endogenous clock in a diurnal fashion and whether repeated psychosocial stress impacts the circadian clock depending on the time of day of stressor exposure. Therefore, male C57BL/6 mice were repeatedly exposed to a psychosocial stressor, either at the beginning of the inactive/light phase (SDL mice) or active/dark phase (SDD mice). Subsequently, different behavioral, physiological/endocrine and immunological/ inflammatory consequences were assessed. It could be shown that the effects of repeated psychosocial stressor exposure strongly depend on the time of day of stressor exposure. The present results demonstrate that repeated daily stressor exposure has a more negative outcome when applied during the active/dark phase compared to the inactive/light phase. Stressor exposure during the active phase resulted in a loss of general activity, decreased interest in an unfamiliar conspecific, a shift towards a more pro-inflammatory body milieu, and rhythm disturbances in plasma hormones, all representing well-accepted hallmarks of depression. In contrast, C57BL/6 mice exposed to the stressor in their inactive phase exhibited minor physiological alterations that might prevent the formation of the maladaptive consequences mentioned above, thus representing beneficial adaptations. The second focus of this thesis was put on the investigation of the effects of repeated psychosocial stressor exposure at different times of the light-dark cycle on various levels of the circadian system. An increased expression of the PERIOD2 (PER2) protein, which represents an essential core clock component, could be found in the SCN of mice repeatedly exposed to the stressor during their active phase. In consistence with the alterations in the central circadian pacemaker, the daily rhythm of different hormones and the activity rhythm were considerably affected by SDD. Mice exposed to the psychosocial stressor in their active phase showed a shifted, or absent, rhythm of the hormones corticosterone and leptin. Moreover, their activity was found to be phase-delayed, which seems to be attributable to the Period (Per) gene since Per1/Per2 double-mutants still exhibited their normal activity rhythm following 19 days of stressor exposure during the active phase. In contrast, a phase-advance in the peripheral adrenal gland clock could be seen in C57BL/6 mice subjected to the stressor during their inactive phase. This phase-shift might be required for maintaining the normal rhythmicity in hormonal release and activity. It has previously been suggested that activation of the HPA axis upon stressor exposure at different times of the light-dark cycle is depending on whether the stressor is of physical or psychological nature. Data from the HPA axis analysis now refine previous findings, indicating that psychosocial stressors also modulate HPA axis responses based on the time of day of stressor presentation. The present results demonstrate that HPA axis activity was reduced following repeated stressor exposure during the active phase. It is reasonable to speculate that this reduced basal activity of the stress system represents a failure in HPA axis adjustment, which could contribute to the negative consequences of repeated psychosocial stressor exposure during the dark phase. Taken together, it can be concluded that the endogenous clock in mice modulates the stress responsiveness in a circadian fashion and that repeated psychosocial stressor exposure affects the biological clock depending on the time of day of stressor presentation. Thereby, stressor exposure during the active phase results in a more negative outcome as compared to stressor experience during the inactive phase. It is assumed that the interaction between the circadian clock and the stress system is a complex issue that might ensure that the endogenous clock does not get out of synchrony in any order. N2 - Aufgrund der Bewegung der Erde in unserem Sonnensystem sind alle Lebewesen auf unserem Planeten seit mehr als 3,5 Milliarden Jahren tagesperiodischen Veränderungen der Umweltbedingungen ausgesetzt. In Anpassung an diese zeitlichen Abläufe haben sich im Laufe der Evolution bei fast allen Organismen – vom Bakterium bis hin zum Menschen – und auf verschiedenen Ebenen – von der Zellebene bis zum Verhalten – biologische Rhythmen entwickelt, die von endogenen Uhren im Körper und äußeren Zeitgebern gesteuert werden. Bei vielzelligen Organismen besitzen nahezu alle Zelltypen ihren eigenen Oszillator. In Säugetieren ist das zirkadiane System hierarchisch strukturiert. Der zentrale Schrittmacher der inneren Uhr befindet sich im bilateralen suprachiasmatischen Nukleus (SCN) des Hypothalamus, während untergeordnete periphere Taktgeber in beinahe jedem Gewebe und Organ oszillieren. Im Gegensatz zu den oben erwähnten regelmäßig wiederkehrenden Veränderungen der Umweltbedingungen sind die meisten Lebewesen ebenso unvorhersehbaren und raschen Umweltveränderungen ausgesetzt. In Anpassung an derartig plötzlich wechselnde Reizbedingungen ist die kurzfristige Aktivierung des Stress-Systems, bestehend aus der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis) und dem sympathischen Nervensystem, für eine adaptive Reaktion essentiell und sogar lebensnotwendig. Im Gegensatz dazu zählt eine andauernde/chronische Aktivierung des Stress-Systems zu den Risikofaktoren für eine Reihe von somatischen und affektiven Erkrankungen. Obwohl das zirkadiane System und das Stress-System auf den ersten Blick zwei verschiedene körperliche Anpassungssysteme darstellen, kommt es auf mehreren Ebenen zum wechselseitigen Einfluss. Es wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass eine Stressorexposition zu unterschiedlichen Tageszeiten verschiedene Effekte hervorruft, wobei die Natur des Stressors dabei eine entscheidende Rolle spielt. Des Weiteren konnten Veränderungen im SCN und peripheren zirkadianen Uhren als Folge einer Stressorexposition aufgezeigt werden. In Zusammenarbeit mit verschiedenen Kollegen wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit untersucht, ob die endogene Uhr die Stressempfindlichkeit tageszeitabhängig moduliert und ob wiederholter psychosozialer Stress die innere Uhr in Abhängigkeit von der Tageszeit der Stressorexposition beeinflusst. Männliche C57BL/6 Mäuse wurden daher entweder zu Beginn der inaktiven/Licht-Phase (SDL Mäuse) oder der aktiven/Dunkel-Phase (SDD Mäuse) wiederholt einem psycho-sozialem Stressor ausgesetzt. Im Anschluss wurden verschiedene Verhaltensweisen sowie physio¬logische/endo-krine und immunologische/inflammatorische Konsequenzen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Effekte wiederholter Stressorexposition auf das Verhalten, die Physiologie und die Immunologie deutlich von der Tageszeit der Stressorexposition abhängt. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass wiederholte Stressor¬exposition während der aktiven/Dunkel-Phase negativere Konsequenzen nach sich zieht als die Stressorexposition während der inaktiven/Licht-Phase. Wurden C57BL/6 Mäuse dem psychosozialen Stressor während ihrer aktiven Phase ausgesetzt, führte dies zu typischen Symptomen von depressiven Patienten wie z.B. einer Verringerung der Aktivität und des sozialen Erkundungsverhaltens, Entzündungserscheinungen, sowie Veränderungen in hormonalen Rhythmen im Plasma. Im Gegensatz dazu wiesen C57BL/6 Mäuse, die dem Stressor in ihrer inaktiven Phase begegneten, geringfügige physiologische Veränderungen auf, welche die Entstehung der oben genannten negativen Konsequenzen verhindern und somit positive Adaptationen darstellen könnten. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit die Effekte wiederholter Stressorexposition zu unterschiedlichen Tageszeiten auf verschiedene Ebenen des zirkadianen Systems untersucht. Es konnte eine erhöhte Expression des PERIOD2 (PER2) Proteins, das einen essentiellen Bestandteil des zirkadianen Uhrenmechanismus darstellt, im SCN nach wiederholter Stressorexposition während der aktiven Phase festgestellt werden. Die Veränderung im zentralen Schrittmacher spiegelte sich auch in der Tagesrhythmik verschiedener Hormone sowie im rhythmischen Verhalten der Tiere wider. SDD Mäuse zeigten dabei einen verschobenen oder fehlenden Rhythmus in den Hormonen Corticosteron und Leptin. Des Weiteren war die Aktivität nach 19-tägiger Stressorexposition zu Beginn der aktiven Phase deutlich nach hinten verschoben. Dabei kommt dem Period (Per) Gen eine zentrale Bedeutung zu, da SDD Per1/Per2 Doppelmutanten keinen veränderten Aktivitätsrhythmus aufwiesen. Eine verfrühte Phasenlage der peripheren Uhr in der Nebenniere zeigte sich hingegen in C57BL/6 Mäusen, die dem Stressor während ihrer inaktiven Tageszeit ausgesetzt wurden. Diese Phasenverschiebung nach vorne könnte für die Aufrechterhaltung der Rhythmik im Verhalten und in der Hormonausschüttung eine Rolle spielen. Vorangehende Arbeiten wiesen bereits darauf hin, dass die HPA-Achsen-Aktivierung infolge einer Stressorexposition zu unterschiedlichen Tageszeiten davon abhängt, ob der Stressor von physischer oder psychologischer Natur ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erweitern die bestehenden Erkenntnisse insofern, als dass die HPA-Achsen-Antwort auch von psychosozialen Stressoren tageszeitabhängig beeinflusst wird. Die HPA-Achsen-Analyse dieser Arbeit zeigte eine verringerte Aktivität der Stressachse nach wiederholter Stressorexposition zu Beginn der aktiven Phase. Mit großer Wahrscheinlichkeit stellt diese Verringerung der basalen HPA-Achsen-Aktivität eine dysfunktionale Überadjustierung dar, die zu den negativen Konsequenzen in Folge der Stressorexposition während der aktiven Phase beitragen könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die endogene Uhr in Mäusen die Stressempfindlichkeit tageszeitabhängig moduliert und dass wiederholter psychosozialer Stress die innere Uhr in Abhängigkeit von der Tageszeit der Stressorexposition beeinflusst. Dabei zieht die Stressorexposition während der aktiven Phase weitaus negativere Konsequenzen nach sich als die Stressor¬exposition in der inaktiven Phase. Aus den Daten kann geschlossen werden, dass die Wechselwirkung von der inneren Uhr und dem Stress-System einen komplexen Sachverhalt darstellt, der gewährleisten soll, dass die innere Uhr nicht beliebig aus dem Takt geraten kann. KW - Maus KW - Stressreaktion KW - Chronobiologie KW - psychosocial stress KW - clock genes KW - interaction stress and circadian system KW - Period2 KW - Tagesrhythmus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106486 ER - TY - THES A1 - Dünnes, Sarah T1 - Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit der murinen Aorta T1 - Influence of NO-sensitive guanylyl-cyclase on cGMP/cAMP crosstalk and the stiffness of the murine aorta N2 - Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC führt zur Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert. Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A. Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden. N2 - The NO/cGMP-mediated signaling cascade is crucially involved in the regulation of blood pressure. Within the cascade, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a key role as the most important receptor for the signaling molecule nitric oxide (NO). NO is endogenously produced by three different isoforms of NO synthase. Binding of NO to NO-GC stimulates the production of the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). cGMP, in turn, activates various effector molecules, finally leading to smooth muscle relaxation. Another second messenger, the signalling molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP), also participates in the regulation of smooth muscle tone and is thus also involved in the regulation of blood pressure. Phosphodiesterases (PDE) degrade cyclic nucleotides thereby ending their signalling. In order to investigate the effect of NO-GC on the cardiovascular system, mice with global (GCKO) or smooth muscle-specific (SMC-GCKO) deletion of NO-GC have been generated. To shed light into the interplay of cAMP and cGMP, PDE3 was studied in the first part of this thesis. PDE3 plays a special role in cGMP/cAMP crosstalk based on its mixed substrate specificity. From the two PDE3 isoenzymes (PDE3A and PDE3B), only PDE3A is expressed in the aorta. The aortas of GCKO- and SMC-GCKO animals are more sensitive to PDE3A inhibition than those from control animals. The acute blockade of NO-GC using ODQ also leads to this sensitivity effect. As a result of NO-GC deletion, PDE3A expression and activity are reduced by approx. 50%. This is probably a compensatory response in order to maintain functional cAMP signalling and to guarantee cAMP-induced relaxation of blood vessels. These results indicate a direct regulation of PDE3A in smooth muscle cells by the NO/cGMP-signalling cascade and a PDE3-mediated cAMP/cGMP crosstalk. The exact mechanism how NO-GC/cGMP regulates PDE3A expression remains unclear; conceivable options are a cGMP-mediated regulation of transcription or a modulation of PDE3A translation. Loss of NO-GC in GCKO and SMC-GCKO mice leads to an elevated systolic blood pressure by around 30 mmHg. In the second part of this thesis, stiffness of aortae from these KO animals was examined. In GCKO mice, the pulse wave velocity (PWV) was significantly faster than in control animals indicating an increased aortic stiffness. The increase in PWV in GCKO animals is likely to be explained by a reduced aortic diameter. Even though elastin and collagen content were unchanged, the aortas of these animals have an altered wall structure. SMC-GCKO animals show neither an increase in PWV nor morphological changes of the aorta. Thus, an increased aortic stiffness can be excluded as cause for the elevated systolic blood pressure in GCKO animals. KW - Knock-Out KW - Maus KW - Guanylatcyclase KW - Cyclo-GMP KW - Aorta KW - Guanylyl-Cyclase KW - Cyclo-AMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Phosphodiesterase 3 KW - Pulswellengeschwindigkeit Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141479 ER - TY - THES A1 - Pasch, Elisabeth T1 - The role of SUN4 and related proteins in sperm head formation and fertility T1 - Die Rolle von SUN4 und verwandten Proteinen in der Spermienkopfformierung und Fertilität N2 - Spermiogenesis describes the differentiation of haploid germ cells into motile, fertilization-competent spermatozoa. During this fundamental transition the species-specific sperm head is formed, which necessitates profound nuclear restructuring coincident with the assembly of sperm-specific structures and chromatin compaction. In the case of the mouse, it is characterized by reshaping of the early round spermatid nucleus into an elongated sickle-shaped sperm head. This tremendous shape change requires the transduction of cytoskeletal forces onto the nuclear envelope (NE) or even further into the nuclear interior. LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) complexes might be involved in this process, due to their general function in bridging the NE and thereby physically connecting the nucleus to the peripheral cytoskeleton. LINC complexes consist of inner nuclear membrane integral SUN-domain proteins and outer nuclear membrane KASH-domain counterparts. SUN- and KASH-domain proteins are directly connected to each other within the perinuclear space, and are thus capable of transferring forces across the NE. To date, these protein complexes are known for their essential functions in nuclear migration, anchoring and positioning of the nucleus, and even for chromosome movements and the maintenance of cell polarity and nuclear shape. In this study LINC complexes were investigated with regard to their potential role in sperm head formation, in order to gain further insight into the processes occurring during spermiogenesis. To this end, the behavior and function of the testis-specific SUN4 protein was studied. The SUN-domain protein SUN4, which had received limited characterization prior to this work, was found to be exclusively expressed in haploid stages during germ cell development. In these cell stages, it specifically localized to the posterior NE at regions decorated by the manchette, a spermatid-specific structure which was previously shown to be involved in nuclear shaping. Mice deficient for SUN4 exhibited severely disorganized manchette residues and gravely misshapen sperm heads. These defects resulted in a globozoospermia-like phenotype and male mice infertility. Therefore, SUN4 was not only found to be mandatory for the correct assembly and anchorage of the manchette, but also for the correct localization of SUN3 and Nesprin1, as well as of other NE components. Interaction studies revealed that SUN4 had the potential to interact with SUN3, Nesprin1, and itself, and as such is likely to build functional LINC complexes that anchor the manchette and transfer cytoskeletal forces onto the nucleus. Taken together, the severe impact of SUN4 deficiency on the nucleocytoplasmic junction during sperm development provided direct evidence for a crucial role of SUN4 and other LINC complex components in mammalian sperm head formation and fertility. N2 - Die Spermiogenese beschreibt die Differenzierung haploider Keimzellen zu beweglichen, fortpflanzungsfähigen Spermatozoen. Während dieses fundamentalen Entwicklungsabschnittes wird neben dem Aufbau von spermienspezifischen Strukturen und der Kompaktierung des Chromatins auch der speziesspezifische Spermienkopf geformt. Im Falle der Maus ist dies eine aktive Umformung des runden Zellkerns in einen gestreckten, sichelförmigen Spermienkopf. Eine derart gravierende Formveränderung erfordert eine Kraftweiterleitung aus dem Zytoskelett auf die Kernhülle und das Kerninnere. In diesem Zusammenhang könnten LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) Komplexe eine Rolle spielen, da ihre grundlegende Funktion darin besteht die Kernhülle zu überbrücken und somit den Kern mit dem peripheren Zytoskelett zu verbinden. LlNC Komplexe werden aus SUN und KASH Domänen Proteinen aufgebaut, welche in die innere beziehungsweise äußere Kernmembran eingelagert sind. Diese membranintegralen Proteine sind direkt miteinander verbunden, so dass sie einen Komplex bilden, der zur Kräfteübertragung geeignet ist. LINC Komplexe besitzen vielfältige Funktionen in Prozessen wie nuklearer Migration, Verankerung und Positionierung des Zellkerns, Chromosomenbewegungen und in der Aufrechterhaltung der Zellpolarität oder der Kernform. Um ein größeres Verständnis der Prozesse während der Spermiogenese zu gewinnen, wurden in dieser Studie die Funktionen von LINC Komplexen in der Spermiogenese und ihre spezifische Rolle bei der gerichteten Spermienkopf-strukturierung untersucht. Dabei wurde insbesondere das Verhalten und die Funktion des bisher wenig charakterisierten SUN Domänen Proteins SUN4 erforscht. Entsprechend der Ergebnisse dieser Studie ist SUN4 ein hodenspezifisches Protein, das ausschließlich in haploiden Keimzellen exprimiert wird. In diesen lokalisiert es in der posterioren Kernhülle, spezifisch in Regionen, an die sich die spermatidenspezifische Manschette anlagert. Dies ist eine Struktur, für die bereits gezeigt wurde, dass sie an der Verformung des Kerns beteiligt ist. SUN4 defiziente Mäuse zeigten ausschließlich Spermatiden mit stark desorganisierten Manschettenüberresten und einen gravierend verformten Spermienkopf. Insgesamt führten die Fehlbildungen zu einem globozoospermieartigen Phänotyp und männlicher Sterilität bei Mäusen. Dabei zeigte sich, dass SUN4 nicht nur zwingend erforderlich ist für den korrekten Aufbau und die Verankerung der Manschette, sondern auch für die korrekte Lokalisation von SUN3 und Nesprin1, wie auch für weitere Komponenten der posterioren Kernhülle. Interaktionsstudien zeigten, dass SUN4 sowohl mit SUN3 und Nesprin1 als auch mit sich selbst interagieren kann, vermutlich um funktionsfähige LINC Komplexe zu bilden, die die Manchette verankern und Kräfte aus dem Zytoskelett auf den Kern übertragen. Zusammenfassend zeigen die schwerwiegenden Auswirkungen auf die kernzytoplasmatische Verbindung während der Spermienentwicklung, die durch den Verlust von SUN4 entstanden, einen direkten Nachweis einer entscheidenden Rolle von SUN4 und anderen LINC-Komplex-Komponenten für die Spermienkopfentwicklung und Fertilität bei Säugetieren. KW - Maus KW - spermiogenesis KW - Fertilität KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Molekularbiologie KW - LINC complex KW - SUN domain proteins KW - sperm head formation KW - fertility KW - Spermiogenese KW - Spermienbildung KW - Kernproteine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139092 ER - TY - THES A1 - Schraut, Karla-Gerlinde T1 - Epigenetic programming by prenatal stress in female serotonin transporter deficient mice T1 - Epigenetische Programmierung durch Pränatalstress in weiblichen Serotonintransporter-defizienten Mäusen N2 - Early life stress, including exposure to prenatal stress (PS), has been shown to affect the developing brain and induce severe effects on emotional health in later life, concomitant with an increased risk for psychopathology. However, some individuals are more vulnerable to early-life stress, while others adapt successfully, i.e. they are resilient and do not succumb to adversity. The molecular substrates promoting resilience in some individuals and vulnerability in other individuals are as yet poorly investigated. A polymorphism in the serotonin transporter gene (5­HTT/SLC6A4) has been suggested to play a modulatory role in mediating the effects of early-life adversity on psychopathology, thereby rendering carriers of the lower-expressing short (s)-allele more vulnerable to developmental adversity, while long (l)-allele carriers are relatively resilient. The molecular mechanisms underlying this gene x environment interaction (GxE) are not well understood, however, epigenetic mechanisms such as DNA methylation and histone modifications have been discussed to contribute as they are at the interface of environment and the genome. Moreover, developmental epigenetic programming has also been postulated to underlie differential vulnerability/resilience independent of genetic variation. The present work comprises two projects investigating the effects of prenatal maternal restraint stress in 5-HTT deficient mice. In the first study, we examined to which extent previously observed changes in behavior and hippocampal gene expression of female 5-Htt+/- prenatally stressed (PS) offspring were associated with changes in DNA methylation patterns. Additionally, we investigated the expression of genes involved in myelination in hippocampus and amygdala of those animals using RT-qPCR. The genome-wide hippocampal DNA methylation screening was performed using methylated-DNA immunoprecipitation (MeDIP) on Affymetrix GeneChip® Mouse Promoter 1.0R arrays. In order to correlate individual gene-specific DNA methylation, mRNA expression and behavior, we used hippocampal DNA from the same mice as assessed before. 5-Htt genotype, PS and their interaction differentially affected the DNA methylation signature of numerous genes, a part of which were also differentially expressed. More specifically, we identified a differentially methylated region in the Myelin basic protein (Mbp) gene, which was associated with Mbp expression in a 5-Htt-, PS- and 5-Htt x PS-dependent manner. Subsequent fine-mapping linked the methylation status of two specific CpG sites in this region to Mbp expression and anxiety-related behavior. We furthermore found that not only the expression of Mbp but of large gene set associated with myelination was affected by a 5-Htt x PS interaction in a brain-region specific manner. In conclusion, hippocampal DNA methylation patterns and expression profiles of female PS 5-Htt+/- mice suggest that distinct molecular mechanisms, some of which are associated with changes in gene promoter methylation, and processes associated with myelination contribute to the behavioral effects of the 5-Htt genotype, PS exposure, and their interaction. In the second study, we aimed at investing the molecular substrates underlying resilience to PS. For this purpose, we exposed 5-Htt+/+ dams to the same restraint stress paradigm and investigated the effects of PS on depression- and anxiety-like behavior and corticosterone (CORT) secretion at baseline and after acute restraint stress in female 5-Htt+/+ and 5-Htt+/- offspring. We found that PS affected the offspring’s social behavior in a negative manner. When specifically examining those PS animals, we grouped the PS offspring of each genotype into a social, resilient and an unsocial, vulnerable group. While anxiety-like behavior in the EPM was reduced in unsocial, but not social, PS 5-Htt+/+ animals when compared to controls, this pattern could not be found in animals of the other genotype, indicating that social anxiety and state anxiety in the EPM were independent of each other. We then assessed genome-wide hippocampal gene expression profiles using mRNA sequencing in order to identify pathways and gene ontology (GO) terms enriched due to 5-Htt genotype (G), PS exposure (E) and their interaction (GxE) as well as enriched in social, but not unsocial, PS offspring, and vice versa. Numerous genes were affected by 5-Htt genotype, PS and most of all a GxE-interaction. Enrichment analysis using enrichr identified that the genotype affected mitochondrial respiration, while GxE-interaction-affected processes associated primarily with myelination and chromatin remodeling. We furthermore found that 5-Htt+/- mice showed profound expression changes of numerous genes in a genomic region located 10 mio kb upstream of the 5 Htt locus on the same chromosome. When looking at social vs. unsocial mice, we found that a much higher number of genes was regulated in 5 Htt+/- animals than in 5-Htt+/+ animals, reflecting the impact of GxE-interaction. Double the number of genes was regulated in social PS vs. control mice when compared to unsocial PS vs. control in both genotypes, suggesting that the successful adaption to PS might have required more active processes from the social group than the reaction to PS from the unsocial group. This notion is supported by the up-regulation of mitochondrial respiration in social, but not in unsocial, PS 5-Htt+/- mice when compared to controls, as those animals might have been able to raise energy resources the unsocial group was not. Next to this, processes associated with myelination seemed to be down-regulated in social 5-Htt+/- mice, but not in unsocial animals, when compared to controls. Taken together, PS exposure affected sociability and anxiety-like behavior dependent on the 5-Htt genotype in female offspring. Processes associated with myelination and epigenetic mechanisms involved in chromatin remodeling seemed be affected in a GxE-dependent manner in the hippocampus of these offspring. Our transcriptome data furthermore suggest that mitochondrial respiration and, with this, energy metabolism might be altered in 5-Htt+/- offspring when compared to 5-Htt+/+ offspring. Moreover, myelination and mitochondrial respiration might contribute to resilience towards PS exposure in 5-Htt+/- offspring, possibly by affecting brain connectivity and energy capabilities. N2 - Frühes Stresserleben wie zum Beispiel in Form von pränatalem Stress (PS) kann sich auf die Entwicklung des Gehirns auswirken und einen gravierenden Einfluss auf die emotionale Gesundheit im Erwachsenenaltern ausüben, was mit einem erhöhten Risiko für eine Psychopathologie einhergeht. Manche Individuen sind jedoch frühem Stresserleben gegenüber vulnerabler, während andere Individuen sich erfolgreich anpassen, d.h. resilient sind, und widrigen Umständen nicht erliegen. Die molekularen Substrate, die Resilienz in manchen und Vulnerabilität in anderen Individuen bedingen, sind bisher nur unzureichend erforscht. Ein Polymorphismus im Serotonintransportergen (5-HTT/SLC6A4) soll eine modulierende Rolle in der Vermittlung der Effekte von frühem Stresserleben auf die Entwicklung einer Psychopathologie spielen, wobei Träger des niedrig-exprimierenden kurzen (s-) Allels empfänglicher gegenüber Stresserlebnissen während der Entwicklung sind, während Träger des langen (l-) Allels als resilienter gelten. Die molekularen Mechanismen, die dieser Gen-Umwelt-Interaktion zu Grunde liegen, sind noch nicht aufgeklärt. Epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung und Histonmodifikationen könnten jedoch dazu beitragen, da sie an der Schnittfläche zwischen Genom und Umwelt liegen. Des Weiteren wird vermutet, dass epigenetische Programmierung während der Entwicklung unabhängig von genetischer Varianz zur Ausbildung von Resilienz bzw. Vulnerabilität beiträgt. Die vorliegende Arbeit umfasst zwei Projekte, in denen die Auswirkungen von pränatalem „maternal restraint“ Stress in 5-HTT defizienten Mäusen behandelt werden. In der ersten Studie wurde untersucht, in ob und in welchem Maß zuvor beobachtete Veränderungen im Verhalten und in der hippocampalen Genexpression in weiblichen PS Mäusen mit Veränderungen in DNA-Methylierungsmustern einhergingen. Des Weiteren untersuchten wir mittels RT-qPCR die Expression von Genen, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, im Hippocampus und in der Amygdala dieser Tiere. Ein genomweites hippocampales DNA-Methylierungsscreening wurde durchgeführt indem methylierte DNA mit Hilfe der Methyl-DNA-Immunoprezipitation angereichert und auf Affymetrix GeneChip® Mouse Promoter 1.0R Arrays aufgetragen wurde. Um individuelle genspezifische DNA-Methylierung, mRNA-Expression und Verhalten miteinander korrelieren zu können, wurde hippocampale DNA derselben Mäuse, die zuvor getestet wurden, dafür eingesetzt. Der 5-Htt Genotyp, PS und ihre Interaktion veränderten die DNA-Methylierung von zahlreichen Genen, wovon ein Teil auch differentiell exprimiert war. Um genau zu sein, identifizierten wir eine differentiell methylierte Region im Myelin basic protein (Mbp) Gen, was mit Mbp Expressionsveränderungen auf Grund eines 5-Htt-, PS und eines 5-Htt x PS-Effekts einherging war. Eine anschließende genauere Untersuchung dieser Region zeigte eine Assoziation zwischen dem Methylierungsstatus zweier spezifischer CpG-Stellen mit der Mbp Expression und Angst-ähnlichem Verhalten. Es zeigte sich weiterhin, dass nicht nur die Expression von Mbp sondern eines ganzes Satzes an Genen, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, durch eine 5-Htt x PS-Interaktion in einer Gehirnregionen-spezifischen Weise verändert war. Zusammenfassend weisen die hippocampalen DNA-Methylierungsmuster und Genexpressionprofile der weiblichen PS 5-Htt+/- Mäuse darauf hin, dass eindeutige molekulare Mechanismen, wovon einige mit Veränderungen in der Promotermethylierung einhergingen, und Prozesse, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, zu den Verhaltenseffekten des 5-Htt Genotyps, PS-Exposition und ihrer Interaktion beitragen. Die zweite Studie hatte zum Ziel, molekulare Substrate, die einer Resilienz gegenüber PS zu Grunde liegen, zu erforschen. Zu diesem Zweck wandten wir das gleiche „restrainst stress“ Paradigma wie zuvor auf schwangere 5-Htt+/+ Weibchen an und untersuchten die PS-Effekte auf Depressions- und Angst-ähnliches Verhalten sowie auf die Corticosteronausschüttung im Grundzustand und nach akutem „restraint stress“ im weiblichen 5-Htt+/+ und 5-Htt+/- Nachwuchs. Wir stellten fest, dass sich PS negativ auf das Sozialverhalten auswirkte. Als wir die PS Tiere genauer untersuchten, teilten wir den PS Nachwuchs jeden Genotyps in je eine soziale, resiliente und eine unsoziale, vulnerable Gruppe ein. Während das Angst-ähnliche Verhalten im EPM in unsozialen, aber nicht sozialen, 5-Htt+/+ PS Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren verringert war, konnte man diesen Effekt im anderen untersuchten Genotyp nicht finden, was darauf hinweist, dass soziale Ängstlichkeit und die sogenannte „state anxiety“, wie in potentiell angsteinflößenden Situationen zu Tage tritt, unabhängig voneinander funktionierende Prozesse sind. Wir erstellten anschließend mittels mRNA-Sequenzierung genomweite hippocampale Genexpressionsprofile um Netzwerke und Gene Ontology (GO) Terms zu identifizieren, die auf Grund des 5-Htt Genotyps (G), der PS-Exposition (E) oder einer Interaktion (GxE) sowie in sozialem, aber nicht in unsozialem, PS Nachwuchs und umgekehrt angereichert waren. Die Expression zahlreicher Gene war durch den 5-Htt Genotyp, der PS-Exposition und vor allem einer GxE-Interaktion verändert. Durch eine Anreicherungsanalyse mittels enrichr stellten wir fest, dass die mitochondriale Atmungskette vom Genotyp beeinflusst wurde, wohingegen sich die GxE-Interaktion vor allem auf Prozesse, die mit Myelinisierung und Chromatinumgestaltung in Verbindung standen, auswirkte. Darüber hinaus fanden wir in 5-Htt+/- Mäusen höchst signifikante Expressionsveränderungen zahlreicher Gene, die in einer genomischen Region 10 mio kb in 5‘ Richtung des 5-Htt Lokus auf dem gleichen Chromosom lagen. Als wir soziale und unsoziale PS Mäuse verglichen, zeigte sich, dass eine deutlich höhere Anzahl an Genen in 5-Htt+/- Mäusen als in 5-Htt+/+ Mäusen reguliert war, was die Auswirkungen der GxE-Interaktion widerspiegelt. In beiden Genotypen war die doppelte Anzahl an Genen in sozialen PS vs. Kontroll-Tieren im Vergleich zu unsozialen PS vs. Kontroll-Tieren verändert, was darauf hinweist, dass eine erfolgreiche Anpassung an PS den sozialen Tieren möglicherweise mehr aktive Prozesse abverlangte als die Reaktion auf PS in der unsozialen Gruppe. Diese Vorstellung wird durch eine Steigerung der mitochondrialen Atmungskette auf mRNA-Ebene in sozialen, aber nicht in unsozialen, 5-Htt+/- Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen unterstützt, da diese Tiere in der Lage gewesen sein könnten, Energieressourcen zu mobilisieren, die den unsozialen Tieren nicht zur Verfügung standen. Des Weiteren schienen Prozesse, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, in sozialen, aber nicht in unsozialen, PS 5-Htt+/- Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen herunterreguliert zu sein. Zusammengefasst wirkte sich die PS-Exposition auf das Sozial- und Angst-ähnliche Verhalten abhängig vom 5-Htt Genotyp im weiblichen Nachwuchs aus. Prozesse, die mit Myelinisierung im Zusammenhang stehen, und epigenetische Mechanismen, die in der Chromatinumgestaltung beteiligt sind, schienen von einer GxE-Interaktion im Hippocampus dieser Tiere beeinflusst zu sein. Unsere Transkriptomdaten gaben des weiteren Hinweise darauf, dass die mitochondriale Atmungskette, und damit vermutlich auch der Energiemetabolismus, in 5-Htt+/- Tieren im Vergleich zu 5-Htt+/+ Tieren verändert sein könnte. Ferner könnten Veränderungen in der Myelinisierung sowie in der mitochondrialen Atmungskette zur Resilienzentwicklung gegenüber PS in 5-Htt+/- Mäusen beitragen, möglicherweise durch Veränderungen in der Gehirnkonnektivität und in den zu mobilisierenden Energieressourcen. KW - Stress KW - Serotonin KW - Pränatale Entwicklung KW - Maus KW - Epigenetic KW - DNA methylation KW - Epigenetik KW - Hippocampus KW - Depression Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120270 ER - TY - THES A1 - Bettaga, Noomen T1 - Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in angiogenesis and arteriogenesis in mice N2 - Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese. N2 - Nitric oxide (NO) plays an important role in vascular remodelling processes such as angiogenesis and arteriogenesis. The synthesis of NO in the vascular system is ensured mainly by endothelial NO synthase (eNOS). It can be regulated by a number of factors, such as shear stress and cytokines like the vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is an important stimulator of angiogenesis and is upregulated during this process. Most of the physiological effects of NO are mediated by the NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). As the main receptor for NO, NO-GC produces the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and thereby leads to a variety of physiological effects. However, whether the effects of NO in angiogenesis and arteriogenesis are also mediated by NO-GC is still unclear. NO-GC consists of two subunits (α and ß). The deletion of the ß1 subunit in mice results in a global knockout mouse (GCKO). Using the Cre-LoxP system we also generated smooth muscle cell-specific (SMC GCKO) and endothelial cell-specific knockout mice (EC GCKO). To investigate the role of NO-GC in angiogenesis and arteriogenesis, three well-established methods have been used. In the first part of the project, the expression of the NO-GC in endothelial cells should be investigated. By using the reverse transcription polymerase chain reaction method (RT-PCR), the results show a very weak expression of the NO-GC in endothelial cells of the lung. A role for NO-GC in the VEGF-mediated angiogenesis was ascertained by the aortic ring assay. The results show an increased angiogenesis in the global absence of NO-GC. However, the EC-GCKO shows no difference compared to control mice. This indicates that NO-GC in endothelial cells is unlikely to play a major role in VEGF-mediated angiogenesis. In the second part of the project, the role of NO-GC in angiogenesis was investigated in an in vivo model. In the oxygen induced-retinopathy model (OIR), GCKO mice showed reduced vaso-obliteration, slowed angiogenesis and increased tuft formation. Similar results were observed in the SMC-GCKO animals. In contrast, EC-GCKO mice showed vaso-obliteration as well as angiogenesis rate and tuft formation similar to those seen in control animals. The results of this experiment suggest that NO-GC in endothelial cells is not involved in vaso-obliteration, physiological angiogenesis and tuft formation. Immunhistochemical analyses showed the expression of NO-GC in pericytes of the vascular capillaries of the mouse retina. Therefore, NO-GC in this cell type could be responsible for the effects in GCKO- and SMC-GCKO animals. In the last part of this thesis, hindlimb-ischemia experiments were performed. For this purpose, the paws of all GCKO- and some SMC-GCKO animals showed necrosis after ligation of the femoral artery. The regeneration of legs from EC-GCKO animals after the operation was normal. These results exclude a major role of NO-GC in endothelial cells, but show that NO-GC in smooth muscle cells is essential in the arteriogenesis process. In summary, the deletion of NO-GC in smooth muscle cells and probably also in pericytes leads to a slowed angiogenesis and inhibits arteriogenesis. KW - Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Angiogenese KW - Arteriogenese KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284 ER - TY - THES A1 - Frank, Nicolas Clemens T1 - Lokale axonale Wirkungen der CNTF-STAT3 Signalkaskade in Motoneuronen der pmn Maus - einem Mausmodel für die Amyotrophe Lateralsklerose T1 - Local Axonal Function of CNTF-STAT3 Signaling in Motoneurons of the pmn-Mouse – a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis N2 - 1. Zusammenfassung Während der Embryogenese und nach Verletzungen von Nerven regulieren neurotrophe Faktoren Signalwege für Apoptose, Differenzierung, Wachstum und Regeneration von Neuronen. In vivo Experimente an neugeborenen Nagern haben gezeigt, dass der Verlust von Motoneuronen nach peripherer Nervenläsion durch die Behandlung mit GDNF, BDNF, und CNTF reduziert werden kann In der pmn-Mausmutante, einem Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose, führt die Gabe von CNTF, nicht aber von GDNF zu einem verzögerten Krankheitsbeginn und einem verlangsamten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Auslöser der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus ist eine Mutation im Tubulin spezifischen Chaperon E (Tbce) Gen, das für eines von fünf Tubulin spezifischen Chaperonen (TBCA-TBCE) kodiert und an der Bildung von -Tubulinheterodimeren beteiligt ist. Diese Arbeit sollte dazu beitragen, die CNTF-induzierten Signalwege zu entschlüsseln, die sich lindernd auf den progredienten Verlauf der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus auswirken. Primäre pmn mutierte Motoneurone zeigen ein reduziertes Axonwachstum und eine erhöhte Anzahl axonaler Schwellungen mit einer anomalen Häufung von Mitochondrien - ein frühes Erkennungsmerkmal bei ALS-Patienten. Die Applikation von CNTF nicht aber von BDNF oder GDNF, kann in vitro die beobachteten Wachstumsdefekte und das bidirektionale axonale Transportdefizit in pmn mutierten Motoneurone verhindern. Aus älteren Untersuchungen war bekannt, dass CNTF über den dreiteiligen transmembranen Rezeptorkomplex, bestehend aus CNTFR, LIFR und gp130, Januskinasen aktiviert, die STAT3 an Tyrosin 705 phosphorylieren (pSTAT3Y705). Ich konnte beobachten, dass axonales fluoreszenzmarkiertes pSTAT3Y705 nach CNTF-Gabe nicht retrograd in den Nukleus transportiert wird. Stattdessen führt die CNTF-induzierte Phosphorylierung von STAT3 an Tyrosin 705 zu einer transkriptionsunabhängigen lokalen Reaktion im Axon. Diese pSTAT3Y705 abhängige Reaktion ist notwendig und ausreichend, um das reduzierte Axonwachstum pmn mutierter Motoneurone zu beheben. Wie die Kombination einer CNTF Behandlung mit dem shRNA vermittelten knock-down von Stathmin in pmn mutierten Motoneuronen zeigt, zielt die CNTF-STAT3 Signalkaskade auf die Stabilisierung axonaler Mikrotubuli ab und wirkt sich positiv auf die anterograde und retrograde Mobilität von axonalen Mitochondrien aus. Interessanter Weise konnte ich außerdem feststellen, dass eine akute Gabe von CNTF das mitochondriale Membranpotential in Axonen primärer pmn mutierter und wildtypischer Motoneurone erhöht und einen Anstieg von ATP auslöst. Meine Beobachtungen legen nahe, dass CNTF unerwarteter Weise auch eine transiente Phosphorylierung an STAT3 Serin 727 (pSTAT3S727) auslöst, die zur anschließenden Translokation von pSTAT3S727 in Mitochondrien führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass STAT3 mehrere lokale Ziele im Axon besitzt, nämlich axonale Mikrotubuli und Mitochondrien. N2 - 2. Summary Both during development and after injury neurotrophic factors induce signaling pathways that regulate apoptosis, differentiation, growth and regeneration of neurons. In newborn rodents, treatment with GDNF, BDNF and CNTF can reduce the loss of motoneurons after peripheral nerve lesion. In the pmn mutant mouse, a model for amyotrophic lateral sclerosis, CNTF but not GDNF delays disease onset and slows down the course of motoneurons degeneration. Pmn mutant mice, suffer from a point mutation in tubulin specific chaperon E (Tbce) gene that codes for one of five tubulin specific chaperones (TBCA-TBCE) and is necessary for proper -tubulin heterodimer formation. The work presented here was designed to study the specific signaling pathways that are used by CNTF for attenuating progression of motoneuron degeneration in pmn mutant mice. Primary motoneurons from pmn mutant mice show reduced axon growth and irregular axonal swellings with abnormal accumulation of mitochondria – an early hallmark of pathology in ALS patients. In vitro, CNTF but not BDNF or GDNF was able to rescue defective axon growth and to prevent bidirectional transport interruption. It has already been shown that CNTF acts via the tripartite transmembrane receptor complex, composed of CNTFR, LIFR and gp130 to recruit Janus kinases that subsequently phosphorylate STAT3 on tyrosine 705 (pSTAT3Y705). After application of CNTF, I observed that axonal pSTAT3Y705 fused to a fluorescent tag is not retrogradely transported to the nucleus. In contrast, CNTF induced phosphorylation of STAT3 at tyrosine 705 leads to a transcriptional independent local reaction in motor axons which is necessary and sufficient to rescue axon growth in pmn mutant motoneurons. Combining CNTF treatment with shRNA mediated knock-down of Stathmin in pmn mutant motoneurons shows that CNTF-STAT3 signaling leads to microtubule stabilization in axons as well as improving anterograde and retrograde mobility of axonal mitochondria. Interestingly, I additionally found that an acute application of CNTF increases the membrane potential of axonal mitochondria that is accompanied with a rise of ATP levels in pmn mutant and wildtype motoneurons. Unexpectedly, I found STAT3 phosphorylated on serine 727 co-localizing with mitochondria after CNTF application. These results demonstrate that multiple local targets of STAT3 exist in axons that modulate structure and function of microtubules and mitochondria. KW - Motoneuron KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - CNTF KW - STAT3 KW - axonaler Transport KW - Motoneuronenerkrankung KW - Maus KW - Ciliary neurotrophic factor KW - Amyotrophe Lateralsklerose Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121065 ER - TY - THES A1 - Klein, Dennis T1 - The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy T1 - Die pathogenetische Funktion von endogenen Antikörpern in einem Maus-Modell der Charcot-Marie-Tooth 1B Neuropathie N2 - Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B. In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response. These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages. N2 - Als Charcot-Marie-Tooth (CMT) Typ 1 Erkrankungen bezeichnet man eine genetisch heterogene Gruppe von nicht behandelbaren, erblichen Neuropathien, die das periphere Nervensystem betreffen und letztendlich zu starken motorischen und sensorischen Defiziten führen. Anhand verschiedener Studien konnte gezeigt werden, dass sekundäre Entzündungsreaktionen, insbesondere des angeborenen und adaptiven Immunsystems, eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von zwei verschiedenen CMT1-Mausmodellen (CMT1B und CMT1X) spielen. Jedoch ist der genaue Mechanismus, in dem das adaptive Immunsystem zur Pathogenese beiträgt, nicht komplett bekannt. In einer veröffentlichten Studie wurden gebundenen endogenen Antiköpern eine wichtige Rolle beim raschen Myelinabbau nach Nervläsion während der Waller´schen Degeneration zugeschrieben. In Mäusen, die heterozygot defizient für P0 (P0het) sind und einige typische Merkmale der CMT1B Neuropathie aufweisen, sollte ein möglicherweise ähnlicher Mechanismus von endogenen Antikörpern untersucht werden, der zur Verstärkung der Krankheitsentwicklung führt. In dieser Studie konnte eine vermehrte Antikörperbindung in den betroffenen peripheren Nerven von P0het Myelinmutanten beobachtet werden. Anhand von Verkreuzungs-Experimenten von P0het Mutanten mit Mäusen, die keine B-Lymphozyten besitzen und daher keine Antikörper bilden können (JHD-/-), konnte zudem in den untersuchten 6 Monate alten Doppelmutanten eine verringerte Anzahl endoneuraler Makrophagen und eine deutliche Verbesserung der Demyelinisierung aufgezeigt werden. Zusätzlich konnte anhand von Rekonstitutions-Experimenten mit mausspezifischen-IgGs der neuropathische Phänotyp in peripheren Nerven wiederhergestellt werden, was die mögliche pathogenetische Rolle endogener Antikörper im frühen Stadium der Erkrankung bekräftigt. Unerwarteterweise führte die JHD-Defizienz jedoch in 12 Monate alten P0het Mausmutanten eher zu einer Verschlechterung der Neuropathie, zusammen mit einer verstärkten Entzündungsreaktion und M2-polarisierten Makrophagen-Aktivierung. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Fehlen von Antikörpern in einem etablierten Mausmodell für CMT1B unterschiedliche Folgen hat, da dies zu einer verringerten Makrophagen-vermittelten Demyelinisierung im frühen Erkrankungsverlauf führt, gleichzeitig aber im späteren Alter in einer verstärkten Entzündungsreaktion und einem vermehrten Nervschaden resultiert. KW - Charcot-Marie-Tooth KW - Demyelinisierung KW - Adaptives Immunsystem KW - Antikörper KW - Makrophagen KW - B-Lymphocyten KW - Fc-Rezeptor KW - Komplement KW - demyelination KW - antibodies KW - macrophages KW - adaptive immune system KW - B-lymphocytes KW - Fc-receptor KW - complement KW - Maus KW - Charcot-Marie-Syndrom KW - Immunsystem KW - Antikörper Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121941 ER - TY - THES A1 - Busch, Martin T1 - Aortic Dendritic Cell Subsets in Healthy and Atherosclerotic Mice and The Role of the miR-17~92 Cluster in Dendritic Cells T1 - Subsets dendritischer Zellen in der Aorta gesunder und atherosklerotischerMäuse und die Rolle des miR-17~92 Clusters in dendritischen Zellen N2 - Atherosclerosis is accepted to be a chronic inflammatory disease of the arterial vessel wall. Several cellular subsets of the immune system are involved in its initiation and progression, such as monocytes, macrophages, T and B cells. Recent research has demonstrated that dendritic cells (DCs) contribute to atherosclerosis, too. DCs are defined by their ability to sense and phagocyte antigens, to migrate and to prime other immune cells, such as T cells. Although all DCs share these functional characteristics, they are heterogeneous with respect to phenotype and origin. Several markers have been used to describe DCs in different lymphoid and non-lymphoid organs; however, none of them has proven to be unambiguous. The expression of surface molecules is highly variable depending on the state of activation and the surrounding tissue. Furthermore, DCs in the aorta or the atherosclerotic plaque can be derived from designated precursor cells or from monocytes. In addition, DCs share both their marker expression and their functional characteristics with other myeloid cells like monocytes and macrophages. The repertoire of aortic DCs in healthy and atherosclerotic mice has just recently started to be explored, but yet there is no systemic study available, which describes the aortic DC compartment. Because it is conceivable that distinct aortic DC subsets exert dedicated functions, a detailed description of vascular DCs is required. The first part of this thesis characterizes DC subsets in healthy and atherosclerotic mice. It describes a previously unrecognized DC subset and also sheds light on the origin of vascular DCs. In recent years, microRNAs (miRNAs) have been demonstrated to regulate several cellular functions, such as apoptosis, differentiation, development or proliferation. Although several cell types have been characterized extensively with regard to the miRNAs involved in their regulation, only few studies are available that focus on the role of miRNAs in DCs. Because an improved understanding of the regulation of DC functions would allow for new therapeutic options, research on miRNAs in DCs is required. The second part of this thesis focuses on the role of the miRNA cluster miR- 17~92 in DCs by exploring its functions in healthy and atherosclerotic mice. This thesis clearly demonstrates for the first time an anti-inflammatory and atheroprotective role for the miR17-92 cluster. A model for its mechanism is suggested. N2 - Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der arteriellen Gefäßwand und zahlreiche Zellen des Immunsystems, wie zum Beispiel Monozyten, Makrophagen, T und B Zellen sind an der Entstehung und Entwicklung beteiligt. Aktuelle Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass auch dendritische Zellen (DCs) zur Atherosklerose beitragen. DCs sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, Antigene zu erkennen, aufzunehmen, zu migrieren und andere Immunzellen, wie zum Beispiel T Zellen, zu aktivieren. Auch wenn alle DCs diese funktionellen Merkmale teilen, so sind sie in Bezug auf ihren Phänotyp oder Ursprung eine eher heterogene Gruppe. Zahlreiche Oberflächenmoleküle wurden in der Vergangenheit genutzt, um DCs in lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben zu beschreiben. Allerdings hat sich keines dieser Moleküle als spezifisch und unverwechselbar erwiesen. Die Expression von Oberflächenmolekülen ist sehr variabel und hängt nicht nur vom Aktivierungszustand der DCs, sondern auch vom umliegenden Gewebe ab. Dazu kommt, dass DCs in der Aorta, beziehungsweise im atherosklerotischen Plaque, von designierten Vorläuferzellen, aber auch von Monozyten abstammen können und DCs das Profil ihrer Oberflächenmoleküle, sowie ihre funktionellen Eigenschaften, mit anderen myeloiden Zellen wie Monozyten und Makrophagen teilen. Neuere Arbeiten haben damit begonnen das Repertoire an DCs in der Aorta von gesunden und atherosklerotischen Mäusen zu untersuchen. Da es naheliegt, dass verschiedene DC Untergruppen ganz bestimmte Funktionen ausüben, wird eine detaillierte Beschreibung vaskulärer DCs in der Forschung benötigt. Weil es hierzu allerdings bislang kaum Studien gibt, untersucht der erste Teil dieser Arbeit zum ersten Mal systematisch die in gesunden und atherosklerotischen Mäusen vorkommenden Gruppen an DCs. Sie beschreibt außerdem eine zuvor nicht beachtete DC-Untergruppe und gibt Aufschluss über den Ursprung vaskulärer DCs. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass microRNAs (mirRNAs) zahlreiche zelluläre Vorgänge wie Apoptose, Differenzierung, Entwicklung und Proliferation regulieren. Obwohl viele Zelltypen in Bezug auf die in ihrer Regulation eingebundenen mirRNAs charakterisiert wurden, gibt es nur wenige Studien, die sich mit der Rolle von mirRNAs in DCs beschäftigen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Rolle der miRNA Gruppe miR-17~92 in DCs und untersucht deren Rolle in gesunden und atherosklerotischen Mäusen. Diese Arbeit zeigt erstmals eine deutliche anti-inflammatorische und protektive Rolle dieser miRNA und schlägt ein Modell für die entdeckten Mechanismen vor. KW - Aorta KW - Maus KW - Zelle KW - Cluster KW - miRNS KW - Dendritische Zelle KW - Arteriosklerose KW - miR-17~92 KW - dendritic cells KW - atherosclerosis KW - mice KW - murine Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71683 ER - TY - THES A1 - Lies, Barbara Christiane T1 - Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen T1 - Investigation of NO/cGMP signaltransduction in smooth muscle of NO-GC-deficient mice N2 - Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte. N2 - The nitric oxide (NO)/cGMP signal transduction has a prominent role in the control of smooth muscle tone. Besides its outstanding function in vascular relaxation NO is a major inhibitory neurotransmitter in the gastrointestinal (GI) tract. It acts predominantly via NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) which consists of two subunits (α and ß). Deletion of the ß1 subunit in the mouse leads to a global NO-GC knockout (GCKO). In the GI tract, expression of NO-GC is detected in smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC) and fibroblast-like cells (FLC). Using cell-specific knock-out mice the impact of NO/cGMP-signaling on regulation of contraction and relaxation in the respective GI cell types was investigated. SMC- and ICC-specific GCKO mice already existed in our lab whereas FLC-specific GCKO mice were generated and then crossed to obtain double and triple mutants. GI smooth muscle from FLC-GCKO mice shows a WT-like relaxation towards NO. Also tissue from FLC/ICC- and FLC/SM-GCKO mice can be relaxed by addition of NO. Only deletion of NO-GC in all three cell types leads to an abolished relaxation as seen in GCKO tissue. Surprisingly, FLC-GCKO mice show an accelerated gut transit time in comparison to WT animals. These results lead to the conclusion that NO-GC in all three GI cell types mediates nitrergic signaling in smooth muscle, even though in different ways. There seems to be an interaction of the three cell types which needs to be further attended to by investigation of the double- and triple-GCKO mutants. The second part of this project engaged in the investigation of NO-GC in the lower urinary (LU) tract. Here, expression of NO-GC is detected in urethra and urinary bladder. Urethral NO-GC is expressed in SMC whereas in the urinary bladder NO-GC expression can only be detected in interstitial cells. As a consequence, NO-induced urethral relaxation is exclusively dependent on SMC. Bladder smooth muscle does not reveal NO-mediated relaxation. The identification and function of the NO-GC expressing interstitial cells remains to be further investigated. Investigation of the NO-GC inhibitors ODQ and NS2028 shows that their efficiency is dependent on three different factors: (1) class of NO donor, (2) incubation time of the inhibitor and the NO donor and (3) the strength of pre-contraction when using smooth muscle tissue. The choice of these parameters determines to which extent ODQ and NS2028 are able to inhibit NO-GC. For that reason use of these inhibitors should not be taken as proof of cGMP-independent effects. KW - Glatte Muskulatur KW - Gastrointestinaltrakt KW - NO-sensitive Guanylyl-Cyclase KW - unterer Harntrakt KW - NO-sensitive guanylyl cyclase KW - lower urinary tract KW - gastrointestinal tract KW - smooth muscle KW - Maus KW - Knockout KW - Stickstoffoxide KW - Cyclo-GMP KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85499 ER - TY - THES A1 - Proft, Florian Lukas Patrick T1 - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch T1 - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men N2 - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern. Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren. N2 - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees. Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility. In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter. Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated. The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted. For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system. Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes. Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen. Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms. New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention. Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis. For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response". rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response. It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4. The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary. KW - Wirkmechanismus KW - Venlafaxin KW - Pharmakogenetik KW - Genexpression KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201 ER - TY - THES A1 - Karabeg, née Lee, Margherita Maria T1 - Differences and Similarities in the Impact of Different Types of Stress on Hippocampal Neuroplasticity in Serotonin Transporter Deficient Mice T1 - Unterschiede und Gemeinsamkeiten in den Auswirkungen verschiedener Arten von Stress auf die Neuroplastizität im Hippocampus von Mäusen mit fehlendem Serotonin Transporter N2 - Stress has been shown to influence neuroplasticity and is suspected to increase the risk for psychiatric disorders such as major depression and anxiety disorders. Additionally, the short variant of the human serotonin transporter (5-HTT) length polymorphism (5-HTTLPR) is suggested to increase the risk for the development of such disorders. While stress as well as serotonergic signaling are not only discussed to be involved in the development of psychiatric disorders, they are also known to influence hippocampal adult neurogenesis (aN). Therefore, it has long been suspected that aN is involved in the etiology of these illnesses. The exact role of aN in this context however, still remains to be clarified. In the present doctoral thesis, I am introducing two different studies, which had been carried out to assess possible changes in neuroplasticity and behavior as a result of 5-HTT genotype by stress interactions. In both studies, animals of the 5-HTT knock-out (5-HTT-/-) mouse line were used, which have been found to exhibit increased anxiety- and depression-related behavior, an altered stress response and decreased aggressive behavior. The aim of the first study, the so-called Spatial Learning study, had been to evaluate whether mice with altered levels of brain 5-HT as a consequence of lifelong 5-HTT deficiency perform differently in two spatial memory tests, the Morris Water Maze (WM) and the Barnes Maze (BM) test prospectively differing in aversiveness. Mice of the Spatial Learning study were of male sex and six months of age, and where subjected to a total of 10 (BM) or 15 (WM) trials. My particular interest was to elucidate if there are genotype by treatment interactions regarding blood plasma corticosterone levels and, if neurobiological equivalents in the brain to the found behavioral differences exist. For this purpose I carried out a quantitative immunohistochemistry study, investigating stem cell proliferation (via the marker Ki67) and aN (via the immature neuron marker NeuroD), as well as expression of the two immediate early genes (IEGs) Arc and cFos as a markers for neuronal activity in the hippocampus. The aim of the second study, the chronic mild stress (CMS) study had been to evaluate whether the innate divergent depression-like and anxiety-like behavior of mice with altered levels of brain 5-HT as a consequence of 5-HTT-deficiency is altered any further after being subjected to a CMS paradigm. Two cohorts of one-year-old female mice had been subjected to a variety of unpredictable stressors. In order to exclude possible interfering influences of behavioral testing on corticosterone levels and the outcome of the quantitative immunohistochemistry study the first cohort had been behaviorally tested after CMS while the second one had remained behaviorally untested. The objective of my part of the study was to find out about possible genotype by treatment interactions regarding blood plasma corticosterone as well as regarding aN in the hippocampus of the mice that had been subjected to CMS. For this purpose I performed a quantitative immunohistochemistry study in order to investigate the phenomenon of adult neurogenesis (via Ki67, NeuroD and the immature neuron marker DCX). Both studies led to interesting results. In the CMS study, we could not replicate the increased innate anxiety- and depression-like behavior in 5-HTT-/- mice known from the literature. However, with regard to the also well documented reduced locomotor activity, as well as the increased body weight of 5-HTT-/- mice compared to their 5-HTT+/- and 5-HTT+/+ littermates, we could demonstrate that CMS leads to increased explorative behavior in the Open Field Test and the Light/Dark Box primarily in 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ mice. The Spatial learning study revealed that increased stress sensitivity of 5-HTT-/- mice leads to a poorer performance in the WM test in relation to their 5-HTT+/+ and 5-HTT+/- littermates. As the performance of 5-HTT-/- mice in the less aversive BM was undistinguishable from both other genotypes, we concluded that the spatial learning ability of 5-HTT-/- mice is comparable to that of both other genotypes. As far as stress reactivity is concerned, the experience of a single trial of either the WM or the BM resulted in increased plasma corticosterone levels, irrespective of the 5-HTT genotype. After several trials 5-HTT-/- mice exhibited higher corticosterone concentrations compared with both other genotypes in both tests. Blood plasma corticosterone levels were highest in 5-HTT-/- mice tested in the WM indicating greater aversiveness of the WM and a greater stress sensitivity of 5-HTT deficient mice. In the CMS study, the corticosterone assessment of mice of cohort 1, which had undergone behavioral testing before sacrifice, resulted in significantly elevated corticosterone levels in 5-HTT-/- mice in relation to their 5-HTT+/+ controls. Contrary, corticosterone levels in mice of cohort 1, which had remained behaviorally untested, were shown to be elevated / increased after CMS experience regardless of the 5-HTT genotype. Regarding neuroplasticity, the Spatial Learning study revealed higher baseline levels of cFos- and Arc-ir cells as well as more proliferation (Ki67-ir cells) and higher numbers of neuronal progenitor cells (NeuroD-ir cells) in 5-HTT-/- compared to 5-HTT+/+ mice. Moreover, in 5-HTT-/- mice we could demonstrate that learning performance in the WM correlates with the extent of aN. The CMS study, in which aN (DCX-ir cells), has also been found to be increased in 5-HTT-/- mice compared to their 5-HTT+/+ littermates, yet only in control animals, did show hampered proliferation (Ki67-ir cells) in the hippocampus of all 5-HTT genotypes following CMS experience. Interestingly, the number of immature neurons (DCX-ir cells) was diminished exclusively in 5-HTT-/- mice in response to CMS. From the Spatial Learning study we concluded, that increased IEG expression and aN levels observed in the hippocampus of 5-HTT deficient mice can be the neurobiological correlate of emotion circuit dysfunction and heightened anxiety of these mice and that 5-HTT-/- animals per se display a “stressed” phenotype as a consequence of long-life 5-HTT deficiency. Due to the different age and sex of the mice in the two studies, they cannot be compared easily. However, although the results of the CMS study seem to contradict the results of the Spatial Learning study at the first glance, they do support the conclusion of the Spatial Learning study by demonstrating that although CMS does have an impact on 5-HTT-/- mice on the neurobiological level (e.g. manifesting in a decrease of DXC-ir cells following CMS) CMS experience cannot add onto their heightened inborn stress-level and is almost ineffective regarding further changes of the behavior of 5-HTT-deficient mice. I thus propose, that 5-HTT-/- mice as a result of lifelong altered 5-HT signaling display a stressed phenotype which resembles a state of lethargy and is paralleled by baseline heightened IEG expression and aN. It cannot be altered or increased by CMS, but it becomes most visible in stressful situations such as repeated spatial learning tests like the WM in which locomotor activity is required. N2 - Es ist bekannt, dass Stress die Neuroplastizität beeinflusst und es wird vermutet, dass dieser das Risiko erhöht eine psychische Erkrankung wie Depressionen oder Angststörungen zu entwickeln. Daneben wurde auch die kurze Variante des menschlichen Serotonintransporter (5-HTT)-Gens mit einem erhöhten Risiko für psychische Erkrankungen assoziiert. Stress und 5-HT werden jedoch nicht nur mit psychischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, sondern sie sind auch bekannt dafür, dass sie die hippocampale adulte Neurogenese (aN) beeinflussen. Nicht zuletzt deswegen wird seit langem vermutet, dass die aN an der Ätiologie dieser Erkrankungen beteiligt ist. Dabei ist jedoch noch unklar, welche Rolle die aN hierbei spielt. In der vorliegenden Doktorarbeit stelle ich zwei verschiedene Studien vor, die durchgeführt wurden um mögliche Veränderungen in der Neuroplastizität und dem Verhalten aufgrund von Interaktionen zwischen dem 5-HTT Genotyp und Stress zu erforschen. In beiden Studien wurden Tiere der 5-HTT knock-out (5-HTT-/-) Mauslinie verwendet, die bekannt dafür sind, erhöhtes depressions- und angstähnliches Verhalten, sowie eine veränderte Stressantwort und verringertes aggressives Verhalten zu zeigen. Das Ziel der ersten Studie, der sogenannten Spatial Learning-Studie, war es herauszufinden ob Mäuse, die aufgrund des lebenslangen Fehlens des 5-HTT einen veränderten 5-HT-Spiegel besitzen, im Morris Water Maze (WM) und dem Barnes Maze (BM), zwei Verhaltenstests, die das räumliche Gedächtnis überprüfen und sich potenziell in ihrer Aversivität unterscheiden, ein verändertes Verhalten zeigen. Die Mäuse der Spatial Learing-Studie waren männlich, sechs Monate alt und waren im Ganzen zehnmal dem BM und fünfzehnmal dem WM unterzogen worden. Mein spezielles Interesse galt der Untersuchung ob es Interaktionen zwischen Genotyp und Testbedingung gibt, die sich auf den Kortikosteron-Spiegel sowie auf neurobiologischer Ebene auswirken. Zu diesem Zweck führte ich eine quantitative immunhistologische Studie durch. In dieser untersuchte ich die hippocampale aN auf Ebene der Stammzellproliferation (über den Marker Ki67) und auf Ebene von jungen unreifen Neuronen (über neuronalen Vorläuferzell-Marker NeuroD) sowie die Expression der beiden Immediate Early Genes (IEGs) Arc und cFos, als Marker für neuronale Aktivität im Hippocampus. Das Ziel der zweiten Studie, in der Mäuse unterschiedlichen 5-HTT-Genotyps chronisch mildem Stress (chronic mild stress, CMS) ausgesetzt wurden, war es herauszufinden, ob das angeborene, verstärkte depressions- und angstähnliche Verhalten von 5-HTT-defizienten Mäusen noch weiter durch den CMS moduliert wird. Hierfür wurden zwei Kohorten von einjährigen weiblichen Mäusen unterschiedlichen 5-HTT-Genotyps einer Auswahl an unvorhersehbaren Stressoren ausgesetzt. Die Mäuse der ersten Kohorte wurden nach dem CMS noch verschiedenen Verhaltenstests unterzogen, während die Mäuse der zweiten Kohorte nicht auf ihr Verhalten hin getestet wurden. Meine Aufgabe in dieser Studie zielte darauf, mögliche Interaktionseffekte zwischen dem 5-HTT-Genotyp und der Behandlung mit CMS in Bezug auf den Kortikosteron-Spiegel im Blutplasma sowie auf die aN im Hippocampus zu finden. Die aN wurde mithilfe der quantitativen Immunhistochemie und verschiedenen Markern einzelner aN-Stadien wie z.B. Ki67, NeuroD sowie DCX untersucht. Beide Studien führten zu interessanten Ergebnissen. Das aus der Literatur bekannte verstärkte depressions- und angstähnliche Verhalten der 5-HTT-/- Mäuse konnte im Rahmen unserer CMS-Studie nicht repliziert werden. Jedoch gelang uns bezüglich der bereits von mehreren Studien ebenfalls dokumentierten reduzierten lokomotiorischen Aktivität, als auch dem erhöhten Gewicht der 5-HTT-/-- im Vergleich zu den 5-HTT+/+-Mäusen der Nachweis, dass CMS vor allem in 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen zu vermehrtem explorativem Verhalten im Open Field Test und in der Light/Dark Box führt. Die Spatial Learning-Studie zeigte, dass 5-HTT-/- Mäuse im Vergleich zu 5-HTT+/+ Mäusen im der WM-Tests, aber nicht der BM-Tests, eine schlechter Leistung an den Tag legten, dass aber alle Mäuse unabhängig vom 5-HTT-Gentoyps gut räumlich lernen konnten. Im Hinblick auf die Stressantwort konnte gezeigt werden, dass ein einzelner Durchgang im WM oder BM zu einem vom 5-HTT-Genotyp unabhängigen Kortikosteronanstieg im Blutplasma führte. Mehrere Durchgänge resultierten jedoch in beiden Tests in Genotyp-abhängigen Unterschieden der Kortikosteronskonzentrationen. Diese waren 5-HTT-/- Mäusen im Vergleich zu 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen erhöht. Hierbei zeigten 5-HTT-/- Mäuse nach mehrfacher WM-Erfahrung, noch tendenziell höhere Kortikosteronkonzentrationen im Blutplasma als die Mäuse nach mehrfacher BM-Erfahrung, was auf eine höhere Aversivität des WM sowie eine höhere Stresssensitivität der 5-HTT-/- Mäuse hindeutet. In der CMS-Studie resultierte die Untersuchung von Mäusen der Kohorte 1, die vor ihrem Tod noch Verhaltenstests unterzogen worden waren, unabhängig von ihrer CMS-Erfahrung in signifikant erhöhten Kortikosteronkonzentrationen in 5-HTT-/- im Vergleich zu 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen. Im Gegensatz dazu waren die Kortikosteron-Werte der Kohorte 2, unabhängig vom Genotyp, in den CMS-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen siginikant erhöht. Die Untersuchung neuroplastischer Phänomene ergab im Rahmen der Spatial Learning-Studie in 5-HTT-/-, verglichen mit 5-HTT+/+-Mäusen, eine erhöhte Anzahl cFos- und Arc-immunreaktiven (ir) Zellen, eine erhöhte Anzahl neuronaler Vorläuferzellen (NeuroD-ir Zellen) sowie mehr proliferierende Zellen (Ki67-ir Zellen). Darüberhinaus konnte in 5-HTT-/- Mäusen gezeigt werden, dass die Leistung im WM-Test mit der Anzahl neu gebildeter junger Neurone korreliert, was für die funktionelle Relevanz der aN spricht. Auch in der CMS Studie, war die aN (DCX-ir Zellen) in 5-HTT-/- gegenüber 5-HTT+/+ Mäusen erhöht, wenn auch nur in Kontrolltieren. Außerdem konnte mit der CMS Studie gezeigt werden dass Stress, sowohl unabhängig vom Genotyp als auch in Interaktion mit dem 5-HTT-/- Genotyp, die Proliferation, sowie die Anzahl unreifer Neurone verringert. Aus den Ergebnissen der Spatial Learning-Studie folgerten wir, dass die Expression von IEGs und das Ausmaß der aN im Hippocampus von 5-HTT-defizienten Mäusen das neurobiologische Korrelat von erhöhter Ängstlichkeit sein könnte, da 5-HTT-/- Mäuse aufgrund des ihnen lebenslang fehlenden 5-HTT von sich aus einen gestressten Phänotyp mitbringen. Aufgrund des unterschiedlichen Alters und Geschlechts der Mäuse dieser beiden Studien ist es nicht leicht die Ergebnisse dieser beiden Studien zu vergleichen. Dennoch unterstützen sie die Schlussfolgerung der Spatial Learning-Studie, selbst wenn die Ergebnisse der CMS Studie denen der Spatial Learning-Studie auf den ersten Blick zu widersprechen scheinen. Und zwar zeigen die Ergebnisse, dass CMS, obwohl er sich neurobiologisch, in Form einer Verringerung von DCX-ir Zellen, auf 5-HTT-/- Mäuse auswirkt, nichts in punkto des angeborenen erhöhten Stress-Levels ausrichten kann und beinahe wirkungslos ist im Hinblick auf das Verhalten der 5-HTT-/- Mäuse. Aus alledem folgere ich, dass 5-HTT-defiziente Mäuse aufgrund ihrer lebenslang veränderten 5-HT-Homöostase einen gestressten Phänotyp aufweisen, welcher sich u.a. durch eine verstärkte Lethargie bemerkbar macht, parallel dazu zeichnen sich die 5-HTT-defizienten Mäuse durch eine verstärkte Expression von IEGs sowie durch erhöhte aN aus. Die genannte verstärkte Lethargie kann durch CMS nicht verändert oder verstärkt werden sondern wird in Situationen mit erhöhtem Stress, z. B. in Verhaltenstests wie dem WM, welche körperliche Aktivität voraussetzen, besonders leicht erkennbar. KW - Serotonin KW - Neuronale Plastizität KW - Maus KW - Stress KW - Serotonin Transporter KW - Chronic Mild Stres KW - Morris Water Maze KW - Neuroplasticity KW - Learning Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115831 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Sebastian T1 - Studies on the function and regulation of CD84, GPVI and Orai2 in genetically modified mice T1 - Untersuchungen zur Funktion und Regulation von CD84, GPVI und Orai2 in genetisch veränderten Mäusen N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury are essential processes to limit blood loss but they also contribute to arterial thrombosis, which can lead to myocardial infarction and stroke. Stable thrombus formation requires a series of events involving platelet receptors which contribute to adhesion, activation and aggregation of platelets. Regulation of receptor expression by (metallo-)proteinases has been described for several platelet receptors, but the molecular mechanisms are ill-defined. The signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) family member CD84 is expressed in immune cells and platelets, however its role in platelet physiology was unclear. In this thesis, CD84 deficient mice were generated and analyzed. In well established in vitro and in vivo assays testing platelet function and thrombus formation, CD84 deficient mice displayed phenotypes indistinguishable from wild-type controls. It was concluded that CD84 in platelets does not function as modulator of thrombus formation, but rather has other functions. In line with this, in the second part of this thesis, a novel regulation mechanism for platelet CD84 was discovered and elucidated. Upon platelet activation, the N-terminus of CD84 was found to be cleaved exclusively by the a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10), whereas the intracellular part was cleaved by calpain. In addition, regulation of the platelet activating collagen receptor glycoprotein VI (GPVI) was studied and it was shown that GPVI is in contrast to CD84 differentially regulated by ADAM10 and ADAM17. A novel role of CD84 under pathophysiological conditions was revealed as CD84 deficient mice were protected from ischemic stroke in the model of transient middle cerebral artery occlusion and this protection was based on the lack of CD84 in T cells. Ca2+ is an essential second messenger that facilitates activation of platelets and diverse functions in different eukaryotic cell types. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) represents the major mechanism leading to rise in intracellular Ca2+ concentration in non-excitable cells. The Ca2+ sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) and the SOC channel subunit protein Orai1 are established mediators of SOCE in platelets. STIM2 is the major STIM isoform in neurons, but the role of the SOC channel subunit protein Orai2 in platelets and neurons has remained elusive. In the third part of this thesis, Orai2 deficient mice were generated and analyzed. Orai2 was dispensable for platelet function, however, Orai2 deficient mice were protected from ischemic neurodegeneration and this phenotype was attributed to defective SOCE in neurons. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Blutplättchen sind wichtige Prozesse um Blutverlust nach Gefäßverletzungen zu vermeiden. Diese Prozesse spielen aber auch eine Rolle in der arteriellen Thrombose, die zu Herzinfarkt und Schlaganfall führen kann. Die Bildung stabiler Thromben setzt eine Reihe von Vorgängen voraus, an denen Blutplättchenrezeptoren beteiligt sind, welche zur Adhäsion, Aktivierung und Aggregation der Blutplättchen beitragen. Für einige Blutplättchenrezeptoren wurde eine Regulation der Expression durch (Metallo )Proteinasen beschrieben, jedoch sind die molekularen Mechanismen weitgehend unbekannt. CD84, ein Protein das zur signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) Familie gehört, wird sowohl in Immunzellen als auch in Blutplättchen exprimiert. Jedoch war die Rolle von CD84 in der Physiologie der Blutplättchen unklar. In der vorliegenden Arbeit wurden CD84 defiziente Mäuse generiert und analysiert. In etablierten in vitro und in vivo Test, welche die Blutplättchenfunktion und Thrombusbildung untersuchen, war der Phänotyp von CD84 defizienten Mäusen unverändert gegenüber Wildtyp-Kontrollen. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass CD84 in Blutplättchen nicht als Modulator der Thrombusbildung fungiert, sondern eher andere Funktionen hat. Im Einklang damit wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein neuer Regulationsmechanismus entdeckt und aufgeklärt. Infolge von Blutplättchenaktivierung wurde der N-terminale Teil von CD84 ausschließlich von a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) geschnitten, während der intrazelluläre Anteil durch Calpain prozessiert wurde. Weiterhin wurde die Regulation des Blutplättchen-aktivierenden Kollagenrezeptors Glykoprotein VI (GPVI) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass GPVI, im Gegensatz zu CD84, einer differenziellen Regulation durch ADAM10 und ADAM17 unterliegt. Unter pathophysiologischen Bedingungen wurde eine neue Rolle von CD84 aufgedeckt, da CD84 defiziente Mäuse vor ischämischem Schlaganfall im transient middle cerebral artery occlusion Modell geschützt waren. Dieser Schutz beruhte auf dem Fehlen von CD84 auf T Zellen. Ca2+ ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff, der die Aktivierung von Blutplättchen ermöglicht sowie diverse Funktionen in verschiedenen eukaryotischen Zellen erfüllt. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) stellt den Hauptmechanismus dar, der zum Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration in nicht-erregbaren Zellen führt. Der Ca2+ Sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) und das SOC-Kanal Protein Orai1 sind als Vermittler des SOCE in Blutplättchen bekannt. STIM2 stellt die Hauptisoform der STIM Moleküle in Neuronen dar, jedoch war die Rolle des SOC-Kanal Proteins Orai2 in Blutplättchen und Neuronen weitgehend unbekannt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Orai2 defiziente Mäuse generiert und analysiert. Orai2 war nicht essentiell für die Funktion von Blutplättchen, jedoch waren Orai2 defiziente Mäuse vor ischämischer Neurodegeneration geschützt. Dieser Phänotyp wurde auf einen defekten SOCE in Neuronen zurückgeführt. KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Genexpression KW - Metalloproteinasen KW - platelets KW - CD84 KW - Metalloproteinase KW - GPVI Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87949 ER - TY - THES A1 - Alrefai, Hani Gouda Alsaid T1 - Molecular Characterization of NFAT Transcription Factors in Experimental Mouse Models T1 - Molekulare Charakterisierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren in experimentellen Mausmodellen N2 - In this work we wanted to investigate the role of NFATc1 in lymphocyte physiology and in pathological conditions (eg. psoriasis). NFATc1 is part of the signal transduction pathways that regulates B cells activation and function. NFATc1 has different isoforms that are due to different promoters (P1 and P2), polyadenylation and alternative splicing. Moreover, we tried to elucidate the points of interactions between the NFAT and the NF-κB pathways in activated B-cell fate. NFAT and NF-κB factors share several properties, such as a similar mode of induction and architecture in their DNA binding domain. We used mice which over-express a constitutive active version of NFATc1/α in their B cells with -or without- an ablated IRF4. IRF4 inhibits cell cycle progression of germinal center B cell-derived Burkitt’s lymphoma cells and induces terminal differentiation toward plasma cells. Our experiments showed that a ‘double hit’ in factors affecting B cell activation (NFATc1 in this case) and late B cell Differentiation (IRF4 in this case) alter the development of the B cells, lead to increase in their numbers and increase in stimulation induced proliferation. Therefore, the overall picture indicates a link between these 2 genes and probable carcinogenic alterations that may occur in B cells. We also show that in splenic B cells, c-Rel (of the NF-κB canonical pathway) Support the induction of NFATc1/αA through BCR signals. We also found evidence that the lack of NFATc1 affects the expression of Rel-B (of the NF-κB non-canonical pathway). These data suggest a tight interplay between NFATc1 and NF-κB in B cells, influencing the competence of B cells and their functions in peripheral tissues. We also used IMQ-induced psoriasis-like inflammation on mice which either lack NFATc1 from B cell. Psoriasis is a systemic chronic immunological disease characterized primarily by abnormal accelerated proliferation of the skin keratinocytes. In psoriasis, the precipitating event leads to immune cell activation. Our experiments showed that NFATc1 is needed for the development of psoriasis. It also showed that IL-10 is the link that enables NFAT from altering the B cell compartment (eg Bregs) in order to affect inflammation. The important role of B cell in psoriasis is supported by the flared up psoriasis-like inflammation in mice that lack B cells. Bregs is a special type of B cells that regulate other B cells and T cells; tuning the immunological response through immunomodulatory cytokines. N2 - Diese Arbeit befasst sich mit der Regulation und der Funktion des Transkriptionsfaktors NFATc1 (“nuclear factor of activated T-cells c1) in B-Lymphozyten. Hierzu wurde zum einen die transkriptionelle Kontrolle des Nfatc1-Gens in aktivierten B-Lymphozyten und zum anderen die Bedeutung dieses Faktors für die Wachstumskontrolle und Autoimmunität anhand verschiedener Modellsysteme analysiert. Sechs verschiedene NFATc1-Isoformen können in B-Lymphozyten durch die Nutzung zweier verschiedener Promotoren, zweier Polyadenylierungsstellen und eines alternativen Splicings generiert werden. Wir zeigen hier, dass insbesondere die NF-kB Faktoren c-Rel und p50 eine essentielle Bedeutung für die starke Induktion des Promoters P1 und damit der Expression der kurzen Isoform NFATc1A in B-Zell-Rezeptor-stimulierten B-Zellen spielen. Interessanterweise zeigen NFATc1-defiziente B-Lymphozyten eine geschwächte Aktivierung der NF-kB-Faktoren, was auf eine enge Verknüpfung dieser zwei Signalwege hindeutet. NFATc1-defiziente B-Lymphozyten weisen eine Aktivierungs- und Wachstumsschwäche auf (Bhattacharyya S., et.al.). Hier zeigen wir, dass die Überexpression von konstitutiv aktivem NFATc1A in B-Lymphozyten, insbesondere wenn dies im Kontext einer IRF4-Defizienz geschieht, zu einer verstärkten Expansion der B-Zellpopulation, insbesondere nach deren Aktivierung, führt. Dies belegt die kritische Bedeutung, die der wohldosierten Expressions- und Aktivierungskontrolle der NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten zukommt. Dies zeigt sich auch in einem Imiquimod-induziertem Psoriasis Mausmodell. Hier wird durch Applikation von Imiquimod auf die Haut eine der Schuppenflechte ähnelnde entzündliche Reaktion ausgelöst, die insbesondere durch eine stark verstärkte Proliferation der Keratinozyten gekennzeichnet ist. Wir können zeigen, dass die NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten kritisch an dieser Reaktion beteiligt sind. Fehlt den B-Lymphozyten das NFATc1-Gen, so produziert eine Subpopulation, die sogenannten regulatorischen B-Zellen, verstärkt das immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch die entzündliche Reaktion fast komplett unterdrückt wird. Dies ähnelt vorhergehenden Beobachtungen, in denen wir zeigen konnten, dass auch in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose (EAE) die Immunreaktion durch den Verlust von NFATc1 in B-Zellen erheblich gelindert werden kann (Bhattacharyya S., et.al.). KW - Schuppenflechte KW - Maus KW - Transkriptionsfaktor KW - B-Lymphozyt KW - NFAT KW - NF-kB KW - Transgenic mice KW - Psoriasis KW - Cancer KW - B cells Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97905 ER - TY - THES A1 - Leicht, Hans Benno T1 - Phänotypische und funktionelle Charakterisierung Dendritischer Zellen aus der Mausmilz T1 - Phenotypic and Functional Characterisation of Dendritic Cells from Murine Spleen N2 - Dendritische Zellen stellen eine Gruppe morphologisch, phänotypisch und funktionell einzigartiger Leukozyten dar, die eine zentrale Rolle bei der Regu-lation des Immunsystems spielen. Als die mit Abstand effektivsten antigen-präsentierenden Zellen besteht ihre Funktion sowohl in der Auslösung als auch in der Verhinderung spezifischer Immunantworten, wobei diese Fähigkeiten von ihrem jeweiligen Reifungsstadium abhängig sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Dendritische Zellen aus Milzen von Mäusen verschiedener Linien mit¬tels Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von OptiPrep (Iodixanol) isoliert und phänotypisch sowie funktionell charakterisiert. Die gewonnenen Zellsuspensionen bestanden durchschnittlich zu 41 Prozent aus residenten konventionellen Dendritischen Zellen. Die isolierten Dendritischen Zellen waren unabhängig von der untersuchten Mauslinie bis zu 26 Prozent CD8α-positiv und bis zu 81 Prozent CD8α-negativ. Dendritische Zellen wiesen unmittelbar nach der Zellgewinnung einen unreifen Phänotyp auf mit starker Expression von MHC-Klasse-II, aber schwacher bis fehlender Expression der kostimulato¬rischen Moleküle CD80, CD86 und CD40. Eine 24- bzw. 48-stündige Kulti¬vierung in vitro führte zur Reifung der Dendritischen Zellen mit Zunahme der Expression von MHC-Klasse-II, CD80, CD86 und CD40 um den Faktor 2 bis 4. Diese Zellen wiesen zudem immunstimulatorische Eigenschaften in der gemischten (allogenen) Leukozytenkultur auf. Dendritische Zellen der Mauslinie NMRInude exprimierten nach der In-vitro-Kultur ebenfalls zahlreiche Ober¬flächenmarker, darunter die Reifungsmarker. Die Stärke der Expression war jedoch um bis zu 50 Prozent schwächer als bei Dendritischen Zellen der anderen Mauslinien. Dieser Befund weist auf potentielle Unterschiede zwischen Dendritischen Zellen der thymuslosen Mauslinie NMRInude und Dendritischen Zellen von Wildtyp-Mäusen hin. Es wurde gezeigt, dass OptiPrep zur Isolierung Dendritischer Zellen aus Mäusemilzen bei geringem Arbeitsaufwand und niedrigen Kosten verwendet werden kann. Die isolierten Dendritischen Zellen weisen die zu erwartenden phänotypischen und funktionellen Eigenschaften auf und scheinen somit für den Einsatz in weiterführenden Experimenten geeignet. N2 - Dendritic cells represent a group of morphologically, phenotypically and functionally unique leukocytes that play a pivotal role in regulating the immune system. By far the most effective antigen-presenting cells, their function consists of both triggering and inhibiting specific immune responses, whereby the actual effect depends on the maturation state of the dendritic cells. In the present study, dendritic cells were isolated from spleens of different mouse lines by density gradient centrifugation using OptiPrep (iodixanol) and subsequently characterised phenotypically and functionally. The yielded cell suspensions consisted of 41 per cent resident conventional dendritic cells on average. Irrespective of the mouse line tested, up to 26 per cent of the isolated dendritic cells were CD8α-positive and up to 81 per cent were CD8α-negative. Freshly isolated dendritic cells displayed an immature phenotype with high expression of MHC class II, but low or no expression of the costimulatory molecules CD80, CD86 and CD40. Culturing dendritic cells in vitro for 24 or 48 hours, respectively, caused their maturation as determined by a 2- to 4-fold increase in the expression of MHC class II, CD80, CD86 and CD40. Additionally, these cells displayed immunostimulatory properties in the (allogeneic) mixed leukocyte culture. In vitro-cultured dendritic cells from mouse line NMRInude also expressed several surface markers, the maturation markers among them. However, the expression levels of these markers were up to 50 per cent lower than in dendritic cells from the other mouse lines investigated. This finding suggests potential differences between dendritic cells from the athymic mouse line NMRInude and dendritic cells from wild-type mice. The present study shows that the isolation of dendritic cells from murine spleens with OptiPrep requires little effort and minimal costs. The isolated dendritic cells exhibited the expected phenotypic and functional properties and, therefore, seem suitable for further experimental usage. KW - Dendritische Zelle KW - Milz KW - Maus KW - Dichtegradient KW - Durchflusscytometrie KW - Phänotyp KW - Funktion KW - Reifung KW - Dichtegradientenzentrifugation KW - gemischte Leukozytenkultur KW - mixed leukocyte culture KW - mixed leukocyte reaction KW - Transplantationsimmunologie KW - Alloantigenerkennung KW - allorecognition Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111092 ER - TY - THES A1 - Weirather, Johannes T1 - Role of CD4+ T lymphocytes in cardiac wound healing and remodeling after experimental myocardial infarction in mice T1 - Die Bedeutung von CD4+ T-Lymphozyten für die kardiale Wundheilung und Remodeling nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell N2 - Cardiac healing after myocardial infarction (MI) represents the cardinal prerequisite for proper replacement of the irreversibly injured myocardium. In contrast to innate immunity, the functional role of adaptive immunity in postinfarction healing has not been systematically addressed. The present study focused on the influence of CD4+ T lymphocytes on wound healing and cardiac remodeling after experimental myocardial infarction in mice. Both conventional and Foxp3+ regulatory CD4+ T cells (Treg cells) became activated in heart draining lymph nodes after MI and accumulated in the infarcted myocardium. T cell activation was strictly antigen-dependant as T cell receptor-transgenic OT-II mice in which CD4+ T cells exhibit a highly limited T cell receptor repertoire did not expand in heart-draining lymph nodes post-MI. Both OT-II and major histocompatibility complex class II-deficient mice lacking a CD4+ T cell compartment showed a fatal clinical postinfarction outcome characterized by disturbed scar tissue construction that resulted in impaired survival due to a prevalence of left-ventricular ruptures. To assess the contribution of anti-inflammatory Treg cells on wound healing after MI, the Treg cell compartment was depleted using DEREG mice that specifically express the human diphtheria toxin receptor in Foxp3-positive cells, resulting in Treg cell ablation after diphtheria toxin administration. In a parallel line of experiments, a second model of anti-CD25 antibody-mediated Treg cell immuno-depletion was used. Treg cell ablation prior to MI resulted in adverse postinfarction left-ventricular dilatation associated with cardiac deterioration. Mechanistically, Treg cell depletion resulted in an increased recruitment of pro-inflammatory neutrophils and Ly-6Chigh monocytes into the healing myocardium. Furthermore, Treg cell-ablated mice exhibited an adverse activation of conventional non-regulatory CD4+ and CD8+ T cells that showed a reinforced infiltration into the infarct zone. Increased synthesis of TNFα and IFNγ by conventional CD4+ and CD8+ T cells in hearts of Treg cell-depleted mice provoked an M1-like macrophage polarization characterized by heightened expression of healing-compromising induced NO synthase, in line with a reduced synthesis of healing-promoting transglutaminase factor XIII (FXIII), osteopontin (OPN) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Therapeutic Treg cell activation by a superagonistic anti-CD28 monoclonal antibody stimulated Treg cell accumulation in the infarct zone and led to an increased expression of mediators inducing an M2-like macrophage polarization state, i.e. interleukin-10, interleukin-13 and TGFβ1. M2-like macrophage differentiation in the healing infarct was associated with heightened expression of scar-forming procollagens as well as scar-stabilizing FXIII and OPN, resulting in improved survival due to a reduced incidence of left-ventricular ruptures. Therapeutic Treg cell activation and the induction of a beneficial M2-like macrophage polarization was further achieved by employing a treatment modality of high clinical potential, i.e. by therapeutic administration of IL-2/ anti-IL-2 monoclonal antibody complexes. The findings of the present study suggest that therapeutic Treg cell activation and the resulting improvement of healing may represent a suitable strategy to attenuate adverse infarct expansion, left-ventricular remodeling, or infarct ruptures in patients with MI. N2 - Die kardiale Wundheilung nach einem Herzinfarkt ist unabdingbare Voraussetzung um das unwideruflich beschädigte Myokard zu ersetzen. Im Gegensatz zur Rolle der angeborenen Immunität ist zur Bedeutung der adaptiven Immunität für die kardiale Wundheilung nur wenig bekannt. Im Fokus der Studie stand deshalb die Rolle von CD4+ T-Zellen bei der Wundheilung und kardialem Remodeling nach einem experimentellen Herzinfarkt im Mausmodell. Sowohl konventionelle, als auch Foxp3-positive regulatorische CD4+ T Zellen (Treg-Zellen) wurden im Lymphknoten infarzierter Tiere aktiviert und akkumulierten im Infarktareal. Die Aktivierung von CD4+ T Zellen nach MI setzte die Erkennung von Selbstantigenen voraus, da OT-II Tiere, die ein stark eingeschränktes T-Zell-Rezeptor-Repertoire aufweisen, keine T-Zell-Aktivierung zeigten. Sowohl OT-II Tiere, als auch Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Knock-out Mäuse, die kein CD4+ T-Zell Kompartment aufweisen, zeigten einen fatalen klinischen Phänotyp, welcher durch eine gestörte Narbenbildung und damit verbunden einem verstärkten Auftreten linksventrikulärer Rupturen verbunden war. Um den Einfluss anti-inflammatorischer Treg-Zellen auf die kardiale Wundheilung nach Herzinfarkt zu untersuchen, wurde das Treg-Zell Kompartment vor MI Induktion depletiert. Hierzu wurden DEREG Mäuse verwendet, in denen Foxp3-positive Zellen den humanen Diphtherietoxin-Rezeptor exprimieren, sodass nach nach Diphtierietoxin-Applikation die Treg-Zellen spezifisch depletiert werden. In einer dazu parallel verlaufenden Versuchsreihe wurden die Treg-Zellen mittels anti-CD25 monoklonaler Antikörper depletiert. Die Depletion des Treg-Zell Kompartments 2 Tage vor MI Induktion bewirkte ein verschlechtertes links-ventrikuläres Remodeling und damit einhergehend eine signifikante Verschlechterung der Herzfunktion. Mechanistisch führte die Treg-Zell Depletion zu einer verstärkten Rekrutierung pro-inflammatorischer Ly-6Chigh Monozyten und neutrophilen Granulozyten ins Infarktareal. Die Depletion von Treg-Zellen war weiterhin mit einer adversen Aktivierung konventioneller CD4+ und CD8+ T-Zellen assoziiert, die eine verstärkte Infiltration ins infarzierte Myokard zeigten. Die erhöhte Synthese von TNFα und IFNγ in konventionellen T-Zellen führte zu einer M1-Makrophagen Polarisierung, welche durch eine verstärkte Expression der induzierbaren NO Synthase charakterisiert war. Weiterhin exprimierten diese M1 Makrophagen signifikant weniger der für eine geordnete Heilung essentiellen Faktoren Osteopontin, Transglutaminase Faktor XIII und transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Im Gegensatz zu den Depletionsversuchen führte die therapeutische Aktivierung der Treg-Zellen durch einen superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper zu einer verstärkten Rekrutierung von Treg-Zellen ins Infarktareal und bewirkte eine erhöhte Synthese von Interleukin (IL)-10, IL-13 sowie TGFβ1. Die damit einhergehende M2 Makrophagenpolarisierung im Infarktareal war mit einer verstärkten Narbenbildung sowie der Synthese von Osteopontin und Transglutaminase Faktor XIII verbunden, welche sich stabilisierend auf die Narbenbildung auswirken. Folgerichtig zeigten die behandelten Tiere ein verbessertes Überleben aufgrund einer signifikant verringerten Inzidenz linksventrikulärer Rupturen. Alternativ zum superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper wurde ein weiterer klinisch relevanter Ansatz zur therapeutischen Aktivierung von Treg-Zellen verfolgt. Durch die Applikation von IL-2/ anti-IL-2 Antikörper-Komplexen konnte ebenfalls eine M2 Makrophagenpolarisierung hervorgerufen werden, die mit einer verstärkten Narbenbildung einherging. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten darauf hin, dass eine therapeutische Aktivierung von Treg-Zellen bei Infarktpatienten und die dadurch hervorgerufene Verbesserung der Wundheilung potentiell einen geeigneten Ansatz darstellt, durch welchen adverses linksventrikuläres Remodeling sowie Infarktrupturen verhindert werden können. KW - Antigen CD4 KW - T-Lymphozyt KW - Herzinfarkt KW - Wundheilung KW - wound healing KW - Foxp3+CD4+ regulatory T cell KW - myocardial infarction KW - macrophage KW - Maus KW - Myokardinfarkt KW - T-Zelle KW - Makrophagen KW - Heilung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107225 ER - TY - THES A1 - Hofstetter, Christine T1 - Inhibition of H3K27me-Specific Demethylase Activity During Murine ES cell Differentiation Induces DNA Damage Response T1 - Inhibierung der H3K27me-Spezifischen Demethylase Aktivität in Murin Differenzierenden ES Zellen Induziert die DNA Schadensantwort N2 - Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms. During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation. KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation. In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells. N2 - Stammzellen sind definiert durch ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und dem Potential in multiple Zellinien zu differenzieren. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) können sich fortlaufend erneuern und besitzen zudem das Potential, in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm) zu differenzieren. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaften sind ES Zellen seit Jahrzehnten im Focus der Wissenschaft. Wenn ES Zellen differenzieren, sind sie in der Lage, sphäroid-förmige Aggregate zu bilden, welche als embryoide Körperchen (EBs) bezeichnet werden. In EBs finden sich Zellen aller 3 Keimblätter und daher dienen sie als in vitro Modell für frühe embryonale Entwicklung. Während der ES Zell Differenzierung verändert die De-repression oder Repression von Genen die Struktur des Chromatins. ES Zellen besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die mit der Regulation des Chromatins assoziiert sind, einschließlich post-translationale Modifikationen an Histonen. Post-translationale Histon- methylierung gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Modifikationen und spielen z.B. ein wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Bis zur Entdeckung der ersten Histon-Demethylase KDM1A im Jahre 2004 glaubte man, dass Modifikationen an Histonen irreversible sind. Bislang wurden jedoch eine Vielzahl an Histon-Demethylasen identifiziert, welche mit der Genregulation, sowie der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzelle in Verbindung gebracht werden konnten. KDM6A und KDM6B sind H3K27me3/2-spezifische Histon-Demethylasen, welche bei der posterioren Entwicklung durch Regulation der Hox Gene eine wichtige Rolle spielen. Bislang ist über die molekulare Funktion von KDM6A und KDM6B in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen wenig bekannt. Um die KDM6A und KDM6B Demethylase Aktivität in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen außer Kraft zu setzten kam ein spezifischer Inhibitor (GSK-J4) zum Einsatz. Die Behandlung mit GSK-J4 zeigte keine Auswirkungen auf die Viabilität oder Proliferation von nicht differenzierten ES Zellen. Jedoch war die Differenzierung von ES Zellen in Gegenwart von GSK-J4 inhibiert und zeigte einen erhöhten G1-Phase Arrest sowie eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen. Eine globale Transkriptionsanalyse in frühen differenzierenden ES Zellen, in Gegenwart von GSK- J4 zeigte, dass lediglich eine relativ geringe Zahl von Genen differenziell reguliert war. Dabei waren mehr Gene hochreguliert als herunterreguliert. Viele der hochregulierten Gene konnten mit der DNA Schadensantwort in Verbindung gebracht werden. In Übereinstimmung damit konnte in Gegenwart von GSK-J4 in differenzierenden ES Zellen DNA Schaden nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation von H3K27me3 oder KDM6B mit γH2AX markierten Foci, welche DNA Schaden markieren, konnte nicht nachgewiesen werden. Nichts desto trotz zeigten GSK-J4 behandelte, differenzierende Eed KO ES Zellen, welche keine H3K27me3 Modifikation besitzen, eine abgemilderte DNA Schadensantwort. In Anwesenheit von GSK-J4 konnte während der hämatopoetischen Differenzierung eine reduzierte Kolonie-Bildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass in Anwesenheit von GSK-J4 ebenfalls auch die hämatopoetische Differenzierung inhibiert wird. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass die enzymatische Aktivität von KDM6A und KDM6B für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands nicht essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die enzymatische Aktivität von beiden Proteinen unabdingbar für die ES Zell sowie die hämatopoetische Differenzierung. Die enzymatische Inhibierung von KDM6A und KDM6B führt während der Differenzierung zu einem erhöhten DNA Schaden, wodurch die DNA Schadensantwort aktiviert wird. Somit sind KDM6A und KDM6B mit DNA Schaden und der DNA Schadensantwort assoziiert. KW - Embryonale Stammzelle KW - Epigenetic KW - Maus KW - Histone KW - Demethylierung KW - DNS-Schädigung KW - Epigenetik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107023 ER - TY - THES A1 - Fraune, Johanna T1 - The evolutionary history of the mammalian synaptonemal complex T1 - Die Evolutionsgeschichte des Synaptonemalkomplexes der Maus N2 - Der Synaptonemalkomplex (SC) ist eine hochkonservierte Proteinstruktur. Er weist eine dreiteili-ge, leiterähnliche Organisation auf und ist für die stabile Paarung der homologen Chromosomen während der Prophase der ersten meiotischen Teilung verantwortlich, die auch als Synpase be-zeichnet wird. Fehler während der Synpase führen zu Aneuploidie oder Apoptose der sich entwi-ckelnden Keimzellen. Seit 1956 ist der SC Gegenstand intensiver Forschung. Seine Existenz wurde in zahlreichen Orga-nismen von der Hefe bis zum Menschen beschrieben. Seine Struktur aus zwei parallel verlaufen-den Lateralelementen (LE), die durch eine Vielzahl von sogenannten Transversalfilamenten (TF) verbunden werden und dem Zentralen Element (CE) in der Mitte des SC ist dabei offensichtlich über die Millionen von Jahren der Evolution erhalten geblieben. Einzelne Proteinkomponenten des SC wurden jedoch nur in wenigen Modelorganismen charakterisiert, darunter Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans und Mus mus-culus. Unerwarteter Weise gelang es bei dieser Charakterisierung nicht, eine evolutionäre Ver-wandtschaft, d.h. eine Homologie zwischen den Proteinsequenzen der verschiedenen SCs nach-zuweisen. Diese Tatsache sprach gegen die grundsätzliche Annahme, dass der SC in der Evolution nur einmal entstanden sei. Diese Arbeit hat sich nun der Aufgabe gewidmet, die Diskrepanz zwischen der hochkonservierten Struktur des SC und seiner augenscheinlich nicht-homologen Proteinzusammensetzung zu lösen. Dabei beschränkt sie sich auf die Analyse des Tierreichs. Es ist die erste Studie zur Evolution des SC in Metazoa und demonstriert die Monophylie der Säuger SC Proteinkomponenten im Tierreich. Die Arbeit zeigt, dass mindestens vier von sieben SC Proteinen der Maus spätestens im letzten gemeinsamen Vorfahren der Gewebetiere (Eumetazoa) enstanden sind und auch damals Teil ei-nes ursprünglichen SC waren, wie er heute in dem Nesseltier Hydra zu finden ist. Dieser SC weist die typische Struktur auf und besitzt bereits alle notwendigen Komponenten, um die drei Domä-nen – LE, TF und CE – zu assemblieren. Darüber hinaus ergaben die einzelnen Phylogenien der verschiedenen SC Proteine der Maus, dass der SC eine sehr dynamische Evolutionsgeschichte durchlaufen hat. Zusätzliche Proteine wurden während der Entstehung der Bilateria und der Wir-beltiere in den SC integriert, während andere ursprüngliche Komponenten möglicherweise Gen-Duplikationen erfuhren bzw. besonders in der Linie der Häutungstiere verloren gingen oder sich stark veränderten. Es wird die These aufgestellt, dass die auf den ersten Blick nicht-homologen SC Proteine der Fruchtfliege und des Fadenwurms tatsächlich doch von den ursprünglichen Prote-inenkomponenten abstammen, sich aber aufgrund der rasanten Evolution der Arthropoden und der Nematoden bis zu deren Unkenntlichkeit diversifizierten. Zusätzlich stellt die Arbeit Hydra als alternatives wirbelloses Modellsystem für die Meiose- und SC-Forschung zu den üblichen Modellen D. melanogaster und C. elegans vor. Die kürzlich gewon-nenen Erkenntnisse über den Hydra SC sowie der Einsatz der Standard-Methoden in diesem Orga-nismus werden in dem abschließenden Kapitel zusammengefasst und diskutiert. N2 - The synaptonemal complex (SC) is a highly conserved structure in sexually reproducing organism. It has a tripartite, ladder-like organization and mediates the stable pairing, called synapsis, of the homologous chromosomes during prophase of meiosis I. Failure in homolog synapsis result in aneuploidy and/or apoptosis of the developing germ cells. Since 1956, the SC is subject of intense research and its presence was described in various species from yeast to human. Its structure was maintained during millions of years of evolution consist-ing of two parallel lateral elements (LEs), joined by numerous transverse filaments (TFs) which run perpendicular to the LEs and an electron dense central element (CE) in the middle of the SC. Individual protein components, however, were characterized only in few available model organ-isms, as for example Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans and Mus musculus. Rather unexpectedly, these characterizations failed to detect an evolutionary homology between the protein components of the different SCs. This fact challenged the general idea of a single origin of the SC in the evolution of meiosis and sexual reproduction. This thesis now addressed itself to the task to unravel the discrepancy between the high conser-vation of the SC structure and its diverse and apparently non-homologous protein composition, focusing on the animal kingdom. It is the first study dealing with the evolution of the SC in Meta-zoa and demonstrates the monophyly of the mammalian SC components in metazoan species. The thesis demonstrates that at least four out of seven murine SC proteins emerged in Eumeta-zoa at the latest and have been likewise part of an ancient SC as it can be found in the present-day cnidarian species Hydra. This SC displays the common organization and already possesses the minimal protein kit corresponding to the three different structural domains: LEs, TFs and the CE. Additionally, the individual phylogenies of the murine SC proteins revealed the dynamic evolu-tionary history of the ancient SC. Further components were added during the diversification of Bilateria and vertebrates while ancestral proteins likely duplicated in the vertebrate lineage and diversified or got lost in the branch leading to ecdysozoan species. It is hypothesized that the apparently non-homologous SC proteins in D. melanogaster and C. elegans actually do derive from the ancient SC proteins but diversified beyond recognition during the fast evolution of Ar-thropoda and Nematoda. The study proposes Hydra as an alternative invertebrate model system for meiosis and SC re-search to the standard organisms D. melanogaster and C. elegans. Recent results about the cni-darian SC as well as the possible application of standard methods is discussed and summarized in the concluding section. KW - Synaptinemal-Komplex KW - Maus KW - Hydra KW - Evolution KW - Meiose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100043 ER - TY - THES A1 - Morowski, Martina T1 - Relevance of platelet count and ITAM-signalling pathway in murine models of haemostasis, thrombosis and thrombo-inflammation T1 - Relevanz der Thrombozytenzahl und des ITAM-Signalwegs in Mausmodellen der Hämostase, Thrombose und Thromboinflammation N2 - Platelets are important players in haemostasis and their activation is essential to limit post-traumatic blood loss upon vessel injury. On the other hand, pathological platelet activation may lead to thrombosis resulting in myocardial infarction and stroke. Platelet activation and subsequent thrombus formation are, therefore, tightly regulated and require a well-defined interplay of platelet surface receptors, intracellular signalling molecules, cytoskeletal rearrangements and the activation of the coagulation cascade. In vivo thrombosis and haemostasis models mimic thrombus formation at sites of vascular lesions and are frequently used to assess thrombotic and haemostatic functions of platelets. In this dissertation, different in vivo models were used in mice to address the question at what level a reduced platelet count (PC) compromises stable thrombus formation. To study this, mice were rendered thrombocytopenic by low-dose anti-GPIbα antibody treatment and subjected to a tail bleeding time assay as well as to four different in vivo thrombosis models. Haemostasis and occlusive thrombus formation in small vessels were only mildly affected even at severe reductions of the PC. In contrast, occlusive thrombus formation in larger arteries required higher PCs demonstrating that considerable differences in the sensitivity for PC reductions exist between these models. In a second part of this study, mice were rendered thrombocytopenic by injection of high-dose anti-GPIbα antibody which led to the complete loss of all platelets from the circulation for several days. During recovery from thrombocytopenia, the newly generated platelet population was characterised and revealed a defect in immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-signalling. This defect translated into impaired arterial thrombus formation. To further investigate ITAM-signalling in vivo, genetically modified mice were analysed which display a positive or negative regulation of platelet ITAM-signalling in vitro. Whereas mice lacking the adapter Grb2 in platelets showed a delayed thrombus formation in vivo after acetylsalicylic acid treatment, Clp36ΔLIM bone marrow chimeric mice and SLAP/SLAP2-deficient mice displayed pro-thrombotic properties in vivo. Finally, mice lacking the adapter protein EFhd2 were analysed in vitro and in vivo. However, EFhd2-deficient platelets showed only a minor increase in the procoagulant activity compared to control. N2 - Thrombozyten sind wichtige Zellen für die Hämostase, die bei einer Verletzung der Gefäßwand aktiviert werden, um den Blutverlust zu begrenzen. Auf der anderen Seite kann die pathologische Aktvierung von Thrombozyten jedoch zu Thromboseereignissen und in Konsequenz zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen. Die Aktivierung von Thrombozyten und die nachfolgende Thrombusbildung sind daher streng reguliert und setzen ein enges Zusammenspiel von Thrombozytenoberflächenrezeptoren, intrazellulären Signalmolekülen, Zytoskelettumstrukturierungen und die Aktivierung der Koagulationskaskade voraus. In vivo Thrombose- und Hämostase-Modelle ahmen die Thrombusbildung in Gefäßen nach und werden häufig benutzt um die hämostatische und thrombotische Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In dieser Dissertation wurden verschiedene in vivo Modelle in Mäusen genutzt, um zu klären, ab welcher Thrombozytenzahl eine stabile Thrombusbildung beeinträchtigt ist. Für diese Untersuchung wurden Mäuse mit geringen Dosen anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einer Reduktion der Thrombozytenzahl führen. Anschließend wurden die Mäuse in einem Blutungszeitmodel und vier verschiedenen thrombotischen Modellen untersucht. Hämostase oder okklusive Thrombusbildung in kleinen Gefäßen waren auch bei einer sehr starken Reduktion der Thrombozytenzahl kaum beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu war für eine normale Thrombusbildung in größeren Gefäßen eine höhere Thrombozytenzahl nötig. Verschiedene in vivo Modelle zeigen daher eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber einer Reduktion der Thrombozytenzahl. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer hohen Dosis anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einem völligen, mehrtägigen Verlust aller Thrombozyten im Blutkreislauf führte. Während sich die Thrombozytenzahl erholte, wurden neu generierte Thrombozyten charakterisiert, die einen deutlichen Defekt im ITAM-Signalweg zeigten. Dieser Defekt führte zu einer verminderten arteriellen Thrombusbildung. Um Auswirkungen eines Defektes im ITAM-Signalweg detaillierter in vivo zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse, die in vitro eine reduzierte oder verstärkte ITAM-Signaltransduktion in Thrombozyten zeigen, untersucht. Während Mäuse, die in Thrombozyten kein Grb2 exprimieren nach Acetylsalicylsäurebehandlung in vivo eine verlangsamte Thrombusbildung zeigten, war die Thrombusbildung in Clp36ΔLIM Knochenmarkchimären und SLAP/SLAP2-defizienten Mäusen beschleunigt. Darüber hinaus wurden EFhd2-defiziente Mäuse in vitro und in vivo analysiert. EFhd2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch nur eine geringe Steigerung in der prokoagulatorischen Aktivität im Vergleich zu Kontrolltieren. KW - Thrombozyt KW - Platelet count KW - ITAM-signalling KW - Murine models of thrombosis and haemostasis KW - Maus KW - Blutstillung KW - Thrombose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99193 ER - TY - THES A1 - Thielmann, Ina T1 - Function and regulation of phospholipase D in blood platelets: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Funktion und Regulation von Phospholipase D in Thrombozyten: in vitro und in vivo Studien in Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation are crucial for primary hemostasis but can also result in occlusive thrombus formation. Agonist induced platelet activation involves different signaling pathways leading to the activation of phospholipases (PL) which produce second messengers. While the role of PLCs in platelet activation is well established, less is known about the relevance of PLDs. In the current study, the function and regulation of PLD in platelets was investigated using genetic and pharmacological approaches. In the first part of this thesis, adhesion, activation and aggregation of platelets from mice lacking PLD2 or both PLD1 and PLD2 were analyzed in vitro and in vivo. While the absence of PLD2 resulted in slightly reduced PLD activity in platelets, it had no detectable effect on the platelet function in vitro and in vivo. However, the combined deficiency of both PLD isoforms resulted in defective alpha-granule release and protection in a model of ferric chloride induced arteriolar thrombosis, effects that were not observed in mice lacking only one PLD isoform. These results revealed, for the first time, redundant roles of PLD1 and PLD2 in platelet alpha-granule secretion and indicate that this may be relevant for pathological thrombus formation. Thus, PLD might represent a promising target for antithrombotic therapy. Thus, this hypothesis was tested more directly in the second part of this thesis. The effects of pharmacological inhibition of PLD activity on hemostasis, thrombosis and thrombo-inflammatory brain infarction in mice were assessed. Treatment of platelets with the reversible, small molecule PLD inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) led to a specific blockade of PLD activity that was associated with reduced -granule release and integrin activation. Mice that received FIPI at a dose of 3 mg/kg displayed reduced occlusive thrombus formation upon chemical injury of carotid arteries or mesenterial arterioles. Similarly, FIPI-treated mice had smaller infarct sizes and significantly better motor and neurological function 24 hours after transient middle cerebral artery occlusion. This protective effect was not associated with major intracerebral hemorrhage or prolonged tail bleeding times. Thus, pharmacological PLD inhibition might represent a safe therapeutic strategy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. After revealing a central role for PLD in thrombo-inflammation, the regulation of PLD activity in platelets was analyzed in the last part of the thesis. Up to date, most studies made use of inhibitors potentially exerting off-target effects and consequently PLD regulation is discussed controversially. Therefore, PLD activity in mice genetically lacking potential modulators of PLD activity was determined to address these controversies. These studies revealed that PLD is tightly regulated during initial platelet activation. While integrin outside-in signaling and Gi signaling was dispensable for PLD activation, it was found that PLC dependent pathways were relevant for the regulation of PLD enzyme activity. N2 - Zusammenfassung Thrombozytenaktivierung und -aggregation sowie die anschließende Thrombusbildung sind essentielle Prozesse während der primären Hämostase. Andererseits kann unkontrollierte Thrombozytenaktivierung zum Gefäßverschluss und somit zu Schlaganfall oder Herzinfarkt führen. Verschiedene Signalwege, die für die Thrombozytenaktivierung von Bedeutung sind, führen zur Aktivierung von Phospholipasen (PL), die daraufhin sekundäre intrazelluläre Botenstoffe generieren. Während die Rolle von PLCs für die Thrombozytenaktivierung bekannt ist, ist die Relevanz der PLDs noch ungeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Regulation von PLD in der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung mittels genetisch veränderter Mäuse. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Adhäsion, Aktivierung und Aggregation von Pld2-/- und Pld1-/-/Pld2-/- Thrombozyten in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von PLD2 zu einer verminderten PLD Aktivität in Thrombozyten führte. Dies hatte allerdings keinen erkennbaren Effekt auf die Funktion der Thrombozyten in vitro und in vivo. Die PLD doppel-defizienten Thrombozyten hingegen wiesen Defekte bei der Sekretion der α-Granula auf, was zur Bildung von instabilen FeCl3-induzierten Thromben in einem in vivo Thrombosemodell führte. Diese Effekte waren in den einzeldefizienten Mäusen nicht vorhanden, was auf redundante Funktionen von PLD1 und PLD2 in diesem Prozess schließen lässt. Interessanterweise wurden keine hämostatischen Defekte durch die Doppeldefizienz hervorgerufen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass PLD eine neue potentielle antithrombotische Zielstruktur darstellt. Diese Hypothese wurde im zweiten Teil der Arbeit weiter überprüft. Der Effekt einer PLD Hemmung durch den reversiblen PLD Inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) auf Hämostase und Thrombose wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit FIPI zu einer spezifischen Blockade von PLD führte, die die alpha-Degranulierung und Integrinaktivierung, im ähnlichen Ausmaß wie in den doppeldefizienten Mäusen, beeinträchtigte. Des Weiteren zeigten Mäuse, die mit 3 mg/kg FIPI behandelt wurden, starke Defekte in der arteriellen Thrombusbildung in Makro- und Mikrogefäßen. FIPI vermittelte PLD Inhibition führte außerdem zu einem Schutz der Mäuse in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls, ohne intrazerebrale Blutungen hervorzurufen. Diese Ergebnisse etablieren FIPI als potentiellen antithrombotischen Wirkstoff für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. Da PLD eine zentrale Rolle während der Thrombusbildung hat, wurde im letzten Teil der Arbeit auf die Regulation von PLD während der Thrombozytenaktivierung eingegangen. Bisherige Studien verwendeten häufig Inhibitoren, die zu unspezifischen Effekten führen können. Daher wird die Regulation von PLD in der Literatur kontrovers diskutiert. Die Untersuchung der PLD Aktivität in verschiedenen knockout Mauslinien stellt einen nützlichen Ansatz dar, um die kontrovers diskutierte PLD Regulation aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde die PLD Aktivität in genetisch veränderten Mäusen, denen potentielle Regulatoren von PLD fehlen, gemessen. Im Zuge diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass integrinabhängige- und Gi-vermittelte Signalwege keinen Einfluss auf die Regulation von PLD hatten, während PLC vermittelte Signale von Bedeutung waren. KW - Phospholipase D KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Schlaganfall KW - Hämsotase KW - Phospholipase D KW - Thrombose KW - Hämostase KW - Schlaganfall KW - Blutstillung KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99179 ER - TY - THES A1 - Thakur, Chitra T1 - Lineage tracing of metastasis in a mouse model for Non-small cell lung cancer (NSCLC) T1 - Untersuchung metastatischer Prozesse durchgenetische Zellmarkierung in einem Mausmodelldes nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) N2 - Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the deadliest form of lung cancer and has a poor prognosis due to its high rate of metastasis. Notably, metastasis is one of the leading causes of death among cancer patients. Despite the clinical importance, the cellular and molecular mechanisms that govern the initiation, establishment and progression of metastasis remain unclear. Moreover, knowledge gained on metastatic process was largely based on cultured or in vitro manipulated cells that were reintroduced into immune-compromised recipient mice. In the present study, a spontaneous metastasis mouse model for NSCLC was generated with a heritable fluorescent tag (DsRed) driven by CAG (combination of cytomegalovirus early enhancing element and chicken beta actin) promoter in alveolar type II cells (SpC-rtTA/TetO-Cre/LSL-DsRed). This approach is essential, keeping in mind the reprogramming nature of Myc oncogene (Rapp et al, 2009). Such genetic lineage tracing approach not only allowed us to monitor molecular and cellular changes during development of primary tumor but also led us to identify the different stages of secondary tumor development in distant organs. Upon combined expression of oncogenic C Raf-BXB and c-Myc (MYC-BXB-DsRed) in lung alveolar type II epithelial cells, macroscopic lung tumors arose comprising of both cuboidal and columnal cellular features. C Raf-BXB induced tumors (CRAF-DsRed) exhibit cuboidal morphology and is non-metastatic whereas Myc-BXB induced lung tumors (Myc-BXB-DsRed) present cuboidal-columnar cellular features and is able to undergo metastasis mainly in liver. Surprisingly, cystic lesions which were negative for SpC (Surfactant protein C) and CCSP (Clara cell secretory protein), strongly expressed DsRed proteins indicating its origin from lung alveolar type II cells. Moreover, early lung progenitor markers such as GATA4 (GATA-binding protein 4) and TTF1 (Thyroid Transcription Factor 1) were still expressed in these early cystic lesions suggesting metastasis as a faulty recapitulation of ontogeny (Rapp et al, 2008). Interestingly, mixed cystic lesions and metastatic tumors contained DsRed and SpC positive cells. These results demonstrate secondary tumor progression from cystic, mixed cystic to malignant transformation. Our results shed tremendous light on reprogramming of metastasizing cells during secondary tumor development. Moreover, such fluorescent tagged metastatic mice model can also be used to track the migration ability of metastatic cancer cell to different organs and its potential to differentiate into other cell types such as blood vessel or stromal cell within the primary tumor. N2 - Das nichtkleinzellige Lungenkarzinom (‚non-small cell lung cancer‘, NSCLC) ist die tödlichste Form des Lungenkrebses mit schlechter Prognose aufgrund hoher Metastasierungsneigung. Metastasierung ist eine der häufigsten Todesursachen bei Krebspatienten. Trotz ihrer klinischen Bedeutung sind die zellulären und molekularen Mechanismen der Entstehung, Etablierung und Progression von Metastasen weiterhin unklar. Darüberhinaus basiert das bisherige Wissen über den Metastasierungsprozess überwiegend auf Zellen, die entweder in vitro kultiviert oder manipuliert und danach in immundefiziente Mäuse rückübertragen wurden.In der vorliegenden Studie wurde ein Mausmodell mit erblichem Fluoreszenzmarker (DsRed) zur spontanen Metastasierung bei NSCLC entwickelt, der durch den CAG-Promotor (‚combination of cytomegalovirus early enhancing element and chicken beta actin‘) in alveolären Typ II-Zellen (SpC-rtTA/TetO-Cre/LSL-DsRed) exprimiert wird. Aufgrund des Reprogrammierungscharakters des Myc-Onkogens war dieser Ansatz essentiell (Rapp et al, 2009). Die Markierung der Zellpopulation auf genetischem Weg erlaubte uns zum einen, die molekularen und zellulären Veränderungen während der Bildung des Primärtumors zu verfolgen, zum anderen konnte so die Entwicklung von Sekundärtumoren unterschiedlicher Stadien in entfernten Organen identifiziert werden. Bei kombinierter Expression von onkogenem C Raf-BXB und c-Myc (MYC-BXB-DsRed) in Lungenalveolar-Epithelzellen vom Typ II entstanden makroskopische Tumore in der Lunge, die auf zellulärer Ebene sowohl kuboidalen als auch kolumnaren Charakter aufwiesen und Metastasen, vorwiegend in der Leber, ausbildeten. Durch C Raf-BXB (CRAF-DsRed) induzierte Tumore erschienen morphologisch als kuboidal ohne Metastasierungsneigung. Überraschenderweise exprimierten zystische Läsionen in der Leber, obwohl negativ für SpC (‚surfactant protein C‘) und CCSP (‚Clara cell secretory protein‘), als Kennzeichen für deren Ursprung aus Lungenalveolarzellen Typ II stark das DsRed-Protein. Darüberhinaus sind in den frühen zystischen Läsionen Marker für frühe Lungenvorläuferzellen wie GATA4 (‚GATA-binding protein 4‘) und TTF1 (‚thyroid transcription factor 1‘) weiterhin exprimiert, was auf den Metastasierungsprozess als gestörte Rekapitulation der Ontogenese hindeutet (Rapp et al, 2008). Metastatische Tumore und Mischformen zu zystischen Läsionen enthielten DsRed- und SpC-positive Zellpopulationen. Diese Ergebnisse weisen in Sekundärtumoren den Übergang von zystischer Läsion zur Mischform mit zystischem Anteil und zur malignen Transformation nach.Unsere Resultate werfen ein neues Licht auf Reprogrammierungsprozesse metastasierender Zellen bei der Bildung von Sekundärtumoren. Das vorgestellte fluoreszenzmarkierte und metastasenbildende Mausmodell kann zum einen zur Untersuchung der Migrationsfähigkeit metastasierender Krebszellen in unterschiedliche Organe verwendet werden. Darüberhinaus ermöglicht dieses Mausmodell die Untersuchung des Differenzierungspotenzials markierter Zellen in andere Zelltypen wie Blutgefäße oder Stromazellen im Primärtumor. KW - Lungenkrebs KW - Metastase KW - Lungenkrebs KW - Metastasierung KW - Lung Cancer metastasis KW - Maus Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85420 ER - TY - THES A1 - Kreutzfeldt, Simon T1 - Studien zur Expression von Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts 1 (MLC1/Mlc1) in humanen und murinen Geweben T1 - Studies on the expression of megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts 1 (MLC1/Mlc1) in human and murine tissues N2 - Das humane MLC1 (auch als KIAA0027 oder WKL1 benannt) ist ein 377 AS umfassendes Protein, welches vornehmlich in neuralen Geweben exprimiert wird. Aufgrund von Strukturanalysen und Homologievergleichen wurde eine Funktion als Ionenkanal mit acht Transmembrandomänen postuliert. Loss-of-function-Mutationen des MLC1-Gens lassen sich mit dem Auftreten der Megalenzephale Leukenzephalopathie mit subkortikalen Zysten korrelieren. Ferner konnte anhand einer Stammbaumanalyse gezeigt werden, dass die C1121A-Mutation in einer größeren Familie mit dem Auftreten der Periodischen Katatonie nach Leonhardt (PK) kosegregierte, wobei Folgeuntersuchungen zur Assoziation von MLC1-Mutationen und dem Auftreten der PK widersprüchliche Ergebnisse erbrachten. Zur weiteren Aufklärung der biologischen Funktion von MLC1 war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, in zwei experimentellen Ansätzen nähere Kenntnisse zum transkriptionellen Expressionsmuster von MLC1 in vivo zu gewinnen, und anschließend durch Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen das humane MLC1 den Grundstein für weitergehende Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung von MLC1 zu legen. Mittels In Situ-Hybridisierung humaner und muriner Gewebeschnitte aus Hippocampus und Cerebellum konnte gezeigt werden, dass die MLC1/Mlc1-Transkription in diesen Geweben vornehmlich in den Bergmann-Gliazellen der Purkinjezellschicht des Cerebellums sowie – in schwächerem Umfang – in verstreut liegenden und in der subgranulären Zone des Gyrus dentatus gehäuften Astrozyten des murinen Hippocampus nachweisbar war. Im zweiten Schritt der Analyse wurden humane post-mortem cDNA-Proben aus verschiedenen Gehirnregionen und zusätzlich einigen nicht-neuralen Geweben von zwei Menschen gewonnen, mittels quantitativer Real-time-PCR die Genexpression von MLC1 bestimmt und mithilfe des Expressionsniveaus von ausgewählten Housekeeping-Genen (GAPDH, L13a, β-Aktin, ARP und Cyclophilin) normalisiert. Es zeigte sich, dass in allen getesteten Hirnregionen eine deutliche MLC1-Expression festzustellen war, deren Maxima im Cerebellum und Frontalhirn und deren Minima im Putamen bzw. im nicht-neuralen Plexus chorioideus lagen. Zudem konnte eine nicht-neurale Expression auf sehr geringem Niveau für Lunge und Milz nachgewiesen werden. Zur Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers gegen humanes MLC1 wurden mittels computergestützter Verfahren ein 117 AS langes Vakzinierungsprotein entworfen, welches immunogene Abschnitte des N-Terminus (61 AS) und C-Terminus (54 AS) enthielt. Die kodierende Sequenz wurde unter Verwendung des Impact-CN®-Expressionssystems in einen pTYB-Vektor kloniert, in ER2566-Zellen exprimiert, das Protein affinitätschromatographisch über Chitin-Säulen isoliert und aufgereinigt und mittels Bradford-Assay und SDS-Gelelektrophorese nachgewiesen. Leider konnte trotz vielfältiger Variation der Versuchsparameter kein eindeutiger Nachweis einer ausreichenden Expression des MLC1-Proteins in den ER2566-Zellen erbracht werden, die für die anschließende Vakzinierung von Kaninchen zur Gewinnung des polyklonalen Antiserums erforderlich gewesen wäre. Die Gründe hierfür sind unklar, denkbar sind beispielsweise eine suboptimale Codon-Frequenz, eine schlechte Proteinlöslichkeit, intrazelluläre mRNA-Degradation, proteolytische Abbauvorgänge oder eine Hemmung der Proteinbiosynthese durch die biologische Funktion des Proteins. Zusammenfassend konnten die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse einen Beitrag zur Erweiterung des Wissens zur MLC1-Expression leisten. Dabei entsprachen die Befunde zur humanen MLC1-Expression weitgehend den diesbezüglichen Beobachtungen zur regionalen und zellulären Expressionsstärkenverteilung aus dem Mausmodell, welche eine funktionelle Bedeutung von MLC1 im Rahmen von neuralen Schrankenstrukturen nahelegten (vgl. Schmitt et al. 2003). Mittels der zwischenzeitlich von anderen Arbeitsgruppen (über andere experimentelle Verfahren) erzeugten Antikörper gegen MLC1 konnte gezeigt werden, dass funktionelles MLC1 vermutlich als zellmembranständiges Dimer vorliegt und seine biologische Funktion u.a. durch Interaktion mit dem DGC (=Dystrophin-assoziierten Glykoprotein-Komplex) in den Caveolae ausübt. Es bleibt eine Aufgabe für die Zukunft, die genauen molekularen Mechanismen dieser Prozesse und ihre mögliche therapeutische Beeinflussbarkeit zur Behandlung der MLC zu erforschen. Auch die Frage der potenziellen extraneuralen MLC1-Expression, für die in dieser Arbeit Hinweise gefunden wurden, mag ein interessanter Ansatzpunkt für zukünftige Forschungsarbeiten sein. N2 - Studies on the expression of megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts 1 (MLC1/Mlc1) in human and murine tissues KW - MLC1 KW - Schizophrenie KW - MLC KW - Expression KW - Mensch KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90355 ER - TY - THES A1 - Hagedorn, Ina T1 - Novel mechanisms underlying arterial thrombus formation: in vivo studies in (genetically modified) mice T1 - Neue Mechanismen der arteriellen Thrombusbildung: in vivo-Studien in (genetisch veränderten) Mäusen N2 - Thrombus formation at sites of vascular lesions is a dynamic process that requires a defined series of molecular events including the action of platelet adhesion/activation receptors, intracellular signal transduction, cytoskeletal rearrangements and activation of plasma coagulation factors. This process is essential to limit post-traumatic blood loss but may also contribute to acute thrombotic diseases such as myocardial infarction and stroke. With the help of genetically modified mice and the use of specific protein inhibitors and receptordepleting antibodies, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying thrombus formation in hemostasis and thrombosis. In the first part of the study, it was shown that von Willebrand Factor (vWF) binding to glycoprotein (GP)Iba is critical for the formation of stable pathological thrombi at high shear rates, suggesting GPIba as an attractive pharmacological target for antithrombotic therapy. The subsequent analysis of recently generated phospholipase (PL)D1-deficient mice identified this enzyme, whose role in platelet function had been largely unknown, as a potential target protein downstream of GPIba. This was based on the finding that PLD1- deficient mice displayed severely defective GPIba-dependent thrombus stabilization under high shear conditions in vitro and in vivo without affecting normal hemostasis. The second part of the thesis characterizes the functional relevance of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-bearing collagen receptor GPVI and the recently identified hemITAM-coupled C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) for in vivo thrombus formation. Genetic- and antibody-induced GPVI deficiency was found to similarly protect mice from arterial vessel occlusion in three different thrombosis models. These results confirmed GPVI as a promising antithrombotic target and revealed that antibody-treatment had no obvious off-target effects on platelet function. Similarly, immunodepletion of CLEC-2 by treating mice with the specific antibody INU1 resulted in markedly impaired thrombus growth and stabilization under flow in vitro and in vivo. Furthermore, it could be demonstrated that double-immunodepletion of GPVI and CLEC-2 resulted in severely decreased arterial thrombus formation accompanied by dramatically prolonged bleeding times. These data revealed an unexpected redundant function of the two receptors for in vivo thrombus formation and might have important implications for the potential development of anti-GPVI and anti-CLEC-2 antithrombotic agents. The third part of the thesis provides the first functional analysis of megakaryocyte- and platelet-specific RhoA knockout mice. RhoA-deficient mice displayed a defined signaling defect in platelet activation, leading to a profound protection from arterial thrombosis andand ischemic brain infarction, but at the same time also strongly increased bleeding times. These findings identified the GTPase as an important player for thrombus formation in hemostasis and thrombosis. Based on the previous proposal that the coagulation factor (F)XII might represent an ideal target for safe antithrombotic therapy without causing bleeding side effects, the last part of this thesis assesses the antithrombotic potential of the newly generated FXIIa inhibitor rHAInfestin- 4. It was found that rHA-Infestin-4 injection into mice resulted in virtually abolished arterial thrombus formation but no change in bleeding times. Moreover, rHA-Infestin-4 was similarly efficient in a murine model of ischemic stroke, suggesting that the inhibitor might be a promising agent for effective and safe therapy of cardio- and cerebrovascular diseases. N2 - Thrombusbildung an einer verletzten Gefäßstelle ist ein dynamischer Prozess, der ein definiertes Zusammenspiel von Thrombozytenadhäsions-/aktivierungsrezeptoren, intrazellulären Signalen, Zytoskelettumstrukturierungen sowie die Aktivierung von Plasma Koagulationsfaktoren benötigt. Dieser Prozess ist essenziell um Blutungen nach einer Gefäßverletzung zu stoppen, kann aber auch zu akuten thrombotischen Erkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall führen. Mit Hilfe von genetisch veränderten Mäusen und der Verwendung von spezifischen Proteininhibitoren und Rezeptor-depletierenden Antikörpern wurden in der hier vorliegenden Dissertation neue Mechanismen der Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose identifiziert. In dem ersten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen von Willebrand Faktor (vWF) und Glykoprotein (GP)Iba entscheidend für die Bildung von pathologischen Thromben bei hohen Scherraten ist, was auf die Eignung von GPIba als eine attraktive pharmakologische Zielstruktur (Target) für eine antithrombotische Therapie hindeutet. Die anschließende Analyse von vor kurzem generierten Phospholipase (PL)D1- defizienten Mäusen identifizierte dieses Enzym, dessen Rolle in der Thrombozytenfunktion bislang unbekannt war, als eine mögliches Targetprotein im Signalweg von GPIba. Dies basierte vor allem auf der Erkenntnis, dass PLD1-defiziente Mäuse eine stark gestörte GPIba-abhängige Thrombusstabilisierung unter hohen Scherbedingungen aufwiesen, ohne jedoch dabei die normale Hämostase zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die funktionelle Relevanz des immunoreceptor tyrosinebased activation motif (ITAM)-gekoppelten Kollagenrezeptors GPVI und des vor kurzem entdeckten hemITAM-gekoppelten C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) für die in vivo Thrombusbildung charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass genetisch- und durch Antikörperinduzierte GPVI-Defizienz Mäuse gleichermaßen vor arteriellem Gefäßverschluss in drei verschiedenen Thrombosemodellen schützt. Diese Ergebnisse bestätigten GPVI als ein viel versprechendes antithrombotisches Target und zeigten, dass eine Antikörperbehandlung in Mäusen keine offensichtlichen unspezifischen Effekte auf die Thrombozytenfunktion hatte. Eine gleichermaßen induzierte Immunodepletion von CLEC-2 durch die Behandlung von Mäusen mit dem spezifischen Antikörper INU1 führte zu deutlich vermindertem Thrombuswachstum und reduzierter Thrombusstabilisierung unter Flussbedingungen in vitro und in vivo. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Doppel-Immunodepletion von GPVI und CLEC-2 zu einer stark reduzierten arteriellen Thrombusbildung führte, die mit dramatisch verlängerten Blutungszeiten einherging. Diese Ergebnisse machten eineunerwartete funktionelle Redundanz der beiden Rezeptoren deutlich und könnten möglicherweise einen wichtigen Einfluss auf eine eventuelle Entwicklung von anti-GPVI und anti-CLEC-2 antithrombotischen Wirkstoffen haben. Der dritte Teil der Arbeit liefert die erste funktionelle Analyse von Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen RhoA-Knockout Mäusen. RhoA-defiziente Mäuse zeigten einen definierten Signaldefekt in der Thrombozytenaktivierung, der zu einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose und ischämischen Hirninfarkt aber gleichzeitig auch zu stark erhöhten Blutungszeiten führte. Dieses Ergebnis identifizierte die GTPase als einen wichtigen Spieler für die Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose. Basierend auf dem vorausgegangenen Vorschlag, dass der Koagulationsfaktor XII (FXII) ein ideales Target für eine sichere antithrombotische Therapie darstellen könnte, ohne Blutungsnebenwirkungen zu verursachen, untersucht der letzte Teil der Arbeit das antithrombotische Potential des neu generierten FXIIa Inhibitors rHA-Infestin-4. Es konnte gezeigt werden, dass eine Injektion von rHA-Infestin-4 in Mäuse die arterielle Thrombusbildung nahezu aufhob aber Blutungszeiten nicht veränderte. Außerdem war rHAInfestin- 4 gleichermaßen effizient in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls, was darauf schließen lässt, dass der Inhibitor ein vielversprechender Wirkstoff für eine effektive und sichere Therapie von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen sein können KW - Thrombus KW - Gerinnungsfaktor KW - Arterielles Blut KW - Zielstruktur KW - Maus KW - biomedicine KW - cell KW - blood KW - vascular system KW - Allgemeine Zelle KW - Zellkern KW - Blutgefäßsystem KW - Blut-Hirn-Schranke Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85752 ER - TY - THES A1 - Esterlechner, Jasmina T1 - Role of the DREAM complex in mouse embryonic stem cells and identification of ZO-2 as a new LIN9 interacting protein T1 - Die Rolle des DREAM-Komplexes in embryonalen Stammzellen der Maus und Identifikation von ZO-2 als neues LIN9- interagierendes Protein N2 - The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry (MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation. N2 - Der DREAM Komplex spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation im Verlauf des Zellzyklus. Es wurde gezeigt, dass die DREAM Untereinheiten LIN9 und B-MYB für die frühe Embryogenese und den in vitro Erhalt der inneren Zellmasse erforderlich sind. In der vorligenden Arbeit wurde die Auswirkung von LIN9 und B-MYB Depletierung auf embryonale Stammzellen untersucht. Es zeigt sich, dass Depletion von LIN9 und B-MYB die Zellzyklus-Verteilung von embryonalen Stammzellen beeinflusst, zur Akkumulation der Zellen in G2 und M Phase und zu erhöhter Polyploidie führt. Genomweite Expressionsstudien ergaben, dass die Verringerung von LIN9 in der Runterregulierung von mitotischen und in der Hochregulierung von differenzierungsspezifischen Genen resultiert. ChIP-on-chip Experimente ermittelten, dass LIN9 Mitosegene als direkte Ziele hat, wohingegen entwicklungslinienspezifische Marker indirekt reguliert werden. Wesentlich ist, dass LIN9 Depletion nicht die Expression der Pluripotenzgene Oct4 oder Sox2 beeinflusst und embryonale Stammzellen ihre Alkaline Phosphatase Aktivität behalten. Daraus lässt schließen, dass LIN9 essentiell für die Proliferation und genomische Stabilität von embryonalen Stammzellen ist, in dem es Gene aktiviert, die wichtige Funktionen in Mitose und Zytokinese ausüben. Der exakte Mechanismus hinter der Genaktivierung ist noch nicht geklärt, da keine DREAM Untereinheit eine katalytisch aktive Domäne aufweist. Vermutlich ist die Interaktion mit weiteren Proteinen oder Co-Faktoren für die Genaktivierung vonnöten. Diese Studie entdeckte mit in vivo Isotop-Markierung von Proteinen und Massenspektrometrie (MS) potentielle Bindungspartner und untersuchte die identifizierte Bindung mit dem Tight Junction Protein ZO-2 genauer. Diese Bindung ist zellzyklus-abhängig und ist am stärksten während der S-Phase. ZO-2 Depletion führt zu reduzierter Zellproliferation und verringerter G1-Genexpression. Da keine G2/M Gene, typische DREAM Ziele, von einer ZO-2 Depletion beeinflusst werden, ist es unwahrscheinlich, dass die ZO-2 Bindung für einen funktionellen DREAM Komplex benötigt wird. Jedoch demonstriert diese Studie, dass mit (MS)-basierender, quantitativer Proteomik DREAM interagierende Proteine identifiziert werden können. Dies ist hilfreich um die Mechanismen hinter der DREAM vermittelten Genaktivierung aufzuklären. KW - Zellzyklus KW - cellcycle KW - Stammzelle KW - Maus KW - stem cells KW - DREAM KW - Genregulation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90440 ER - TY - THES A1 - Düchs, Matthias T1 - Effects of Toll-like receptor agonists on the pathogenesis of atopic asthma in mice T1 - Effekte von Toll-like Rezeptor Agonisten auf den Krankheitsverlauf von atopischen Asthma im Mausmodell N2 - In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account. N2 - In den letzten Jahrzehnten wurde für Asthma ein Anstieg der Neuerkrankungen und der schweren Krankheitsverläufe verzeichnet. Des Weitern kontrollieren angewandte Therapien zwar Symptome, bieten aber keine Heilung. Ein vielversprechender Ansatz, mit dem Ziel den ursächlichen Krankheitsmechanismus zu inhibieren, ist die TLR Agonisten induzierte Immunmodulation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung von immunstimulatorischen Toll-like Rezeptor (TLR) Agonisten für neue Therapieansätze in allergischen Entzündungsmodellen zu untersuchen. Hierfür wurden fünf verschiedene TLR Agonisten in murinen Modellen von akutem oder chronischem Asthma, sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verabreicht. Als erstes wurden in einem Modell mit akuter Entzündungsreaktion verschiedene Konzentrationen der Agonisten für TLR 2, 3, 4, 7 und 9, vor der pulmonalen Allergenexposition intratracheal appliziert. Hier verminderten TLR9 Agonist CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG) > TLR7 Agonist Resiquimod (R848) > TLR3 Agonist poly(I:C) konzentrationsabhängig die allergen-induzierte Eosinophilie in den Atemwegen. Alle TLR Agonisten erhöhten die Anzahl an Neutrophilen, am stärksten TLR4 Agonist Lipopolysaccharid (LPS) > TLR2 Agonist Lipoteichon Säure (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848. Weiterhin erhöhten, bis auf R848, alle TLR Agonisten die Menge an pro-inflammatorischen Zytokinen in den Atemwegen. Die hierbei beobachteten suppressiven Effekte waren weder IFN-γ noch IL-10 abhängig und korrelierten auch nicht mit einer Erhöhung der pulmonalen regulatorischen T Zellen. Die therapeutische Gabe von TLR Agonisten nach Allergenexposition reduzierte ebenfalls die Eosinophilie sowie IL-4 in den Atemwegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die TLR Agonisten in ihrer suppressiven Wirkung stark unterscheiden, und dass ihre Wirkung zum einen von der verabreichten Konzentration und zum anderen von dem experimentellen Aufbau abhängig ist. Auffällig war, dass alle Agonisten, wenngleich in unterschiedlicher Ausprägung, eine Neutrophilie in den Atemwegen induzierten. Dies wirft die Frage auf, ob eine wiederholte pulmonale Gabe für den Menschen verträglich wäre. Ein anderer Ansatz verwendet TLR Agonisten als Adjuvanzien für die Kombination mit Allergenen in der spezifischen Immuntherapie. Aktuelle klinische Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TLR vermittelte Erhöhung der allergen-spezifischen TH1Antwort die Effektivität der Therapie steigern kann. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit die verschieden TLR Agonisten auf ihre Fähigkeit hin untersucht allergen-spezifische TH1 Antworten auszulösen und allergen-spezifische TH2 Antworten zu unterdrücken. Hierfür wurde Allergen zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der TLR Agonisten appliziert und anschließend die Mäuse Allergen-Aerosol ausgesetzt. Hier konnte eine starke, konzentrationsabhängige Unterdrückung der Atemwegseosinophilie, begleitet von einer Neutrophilie, bei CpG > LPS >LTA beobachten werden. Poly(I:C) und R848 zeigten keine Effekte. Auch wurde die Menge von IL-4 und IL-5 in der bronchoalveolaren Lavage durch poly(I:C), LPS, und CpG erniedrigt. Weiterhin reduzierten alle TLR Agonisten, mit der Ausnahme von poly(I:C), die Menge an allergen-spezifischem IgE im Serum. Die kutane anaphylaktische Reaktion gegen das Allergen wurde durch CpG- oder LPS-Adjuvans komplett verhindert. Die stärkste TH1 Antwort, charakterisiert durch erhöhtes IFN-γ in der Lavage und die größte Menge an allergen-spezifischem IgG2a, wurde durch CpG und poly(I:C) ausgelöst. Diese Resultate unterstützen den klinischen Ansatz CpG als erfolgsversprechenden Adjuvants-Kandidaten für die Kombinationstherapie mit Allergen in der spezifischen Immuntherapie einzusetzen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht ob die Aktivierung von TLRs auch den Krankheitsverlauf von schwerem chronischem Asthma beeinflussen kann. Die beiden TLR Agonisten CpG und R848 reduzierten Faktoren des Atemwegumbaus und der Entzündung effektiver als das Steroid Dexamethasone, wobei CpG die höchste Effektivität aufwies. Dieses Ergebnis unterstützt ebenfalls eine auf TLR9 Agonisten basierende Therapie als einen vielverspechenden Ansatz für die Behandlung von schwerem chronischem Asthma auch als eine potentielle Alternative zur antiinflammatorischen Therapie mit Steroiden. Zusammenfassend unterstützen die Resultate die Verwendung von TLR Agonisten für die Behandlung von Asthma. Die höchste Effektivität und Verträglichkeit ist für eine TLR Allergen Kombinationstherapie mit TLR4 oder TLR9 Agonisten in der spezifischen Immuntherapie zu erwarten. Für eine mögliche TLR Monotherapie zeigten R848 und CpG die besten Wirkungsprofile, für schwereres chronisches Asthma bevorzugt CpG. Hierbei muss jedoch stets berücksichtigt werden, dass TLR Agonisten auch selbst entzündliche Reaktionen hervorrufen können. KW - Toll-like Rezeptor KW - Ligand KW - Bronchialasthma KW - Hypersensibilität KW - Toll-like receptor KW - Asthma KW - allergy KW - mouse model KW - Maus KW - Allergie KW - Maus Modell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66369 ER - TY - THES A1 - Rudolf, Ronald T1 - Transcriptional Regulation of and by NFATc1 in Lymphocytes T1 - Transkriptionelle Regulation von und durch NFATc1 in Lymphozyten N2 - The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms. N2 - Der Transkriptionsfaktor NFATc1 wurde als Regulator der Aktivierung und Differenzierung für T-Zellen, B-Zellen, Dendritische-Zellen und Megakaryozyten beschrieben. Autoimmunerkrankungen und die Entstehung von Krebs wurden mit Fehlregulationen der NFAT-Signalwege in Verbindung gebracht [71]. Ziel dieser Arbeit war der Gewinn neuer Erkenntnisse über die Induktion und Regulation von NFATc1 in Lymphozyten. Darüber hinaus sollten Gene, welche direkt durch NFATc1 gebunden und reguliert werden, identifiziert werden. Um die Induktion und Regulation von NFATc1 in primären T- und B-Zellen untersuchen zu können, wurden drei BAC transgene Reporter Maus Linien (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) verwendet. Dadurch war es uns möglich zu zeigen, dass es einer ununterbrochenen Antigen-Rezeptor Stimulation bedarf, um NFATc1, im Besonderen die Transkription der kurzen Isoform NFATc1/αA, dauerhaft zu induzieren. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Induktoren wie LPS, CpG oder auch die Stimulation des CD40-Rezeptors, die die Expression des Transkriptionsfaktors NF-B zur Folge haben, einen positiven Einfluss auf die Nfatc1-Induktion haben [137]. Unser Interesse lag darin, ein System zu etablieren, dass es uns ermöglichen sollte, neue NFATc1-Zielgene durch ChIP assays und Genom-weite Sequenzierungen zu ermitteln. Es ist uns gelungen, ein neues BAC-Transgen, welches für eine in vivo biotinylierbare Variante des NFATc1/αA Proteins kodiert, zu erzeugen. Dieses Konstrukt wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt - in Zusammenarbeit mit der Universität Mainz (TFM) - in die Vorkerne von Maus-Eizellen injiziert. Ferner wurden biotinylierbare NFATc1-Isoformen kloniert und mit Hilfe retroviraler Plasmide stabil in WEHI-231 B-Lymphom-Zellen integriert. Durch intrazellulare Färbungen, FACS-Analysen, Konfokalmikroskopie und Immunpräzipitationen konnten wir eine erfolgreiche in vivo Biotinylierung in NFATc1/αA- und NFATc1/βC-exprimierenden WEHI-231 Zellen nachweisen. Mittels Next-Generation-Sequencing, in Kollaboration mit TRON, Univ. Mainz, konnten wir 2185 Gene, die spezifisch durch NFATc1/αA kontrolliert wurden, und 1306 Gene, die ausschließlich durch die Überexpression von NFATc1/βC reguliert wurden, identifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Nfatc1 Locus „zwei Gene“ mit alternativer, zum Teil gegensätzlicher Funktion, kodiert sind. Untersuchungen zu Apoptose und Zelltod haben entgegengesetzte Eigenschaften der stark induzierbaren, kurzen Isoform NFATc1/αA und der stetig exprimierten langen Isoform NFATc1/βC aufgezeigt. Daten von Sequenzierungen des gesamten Transkriptoms, die mit NFATc1/αA und -βC überexprimierenden WEHI-231 Zellen durchgeführt wurden (TRON, Mainz), bestätigten diese Befunde. Es zeigte sich, dass es wesentliche Veränderungen der Expressionsprofile Tausender von Genen gab. In WEHI-231-Zellen, die NFATc1/βC überexprimierten, waren viele dieser Gene an Apoptose und Zelltod beteiligt. Demgegenüber waren in NFATc1/αA-Zellen vor allem Gene betroffen, die an transkriptionaler Regulation und dem Zellzyklus beteiligt waren. Überdies war es uns möglich, ChIPseq Assays für NFATc1/αA und NFATc1/βC in einem Antikörper-unabhängigen Ansatz durchzuführen. Dadurch konnten wir neue NFATc1-Bindungstellen identifizieren. Es bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen, um diese Ergebnisse der Genom-weiten ChIPseq Assays zu bestätigen. Durch weitere ChIP Experimente konnten wir eine direkte Bindung von NFATc1/αA und NFATc1/βC an die regulatorischen Regionen der Prdm1- und Aicda-Gene nachweisen. Die Transkription beider Gene wurde durch die Überexpression von NFATc1/αA und -βC deutlich reguliert und spielt offenbar bei der Bildung von Plasma-B-Zellen, die für die Antikörper-Produktion verantwortlich sind, eine wesentliche Rolle. KW - Lymphozyt KW - Transkriptionsfaktor KW - Lymphozyten KW - NFATc1 KW - Lymphocytes KW - NFATc1 KW - Genregulation KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83993 ER - TY - THES A1 - Araragi, Naozumi T1 - Electrophysiological investigation of two animal models for emotional disorders - serotonin transporter knockout mice and tryptophan hydroxylase 2 knockout mice T1 - Elektrophysiologische Untersuchung bei zwei Tiermodellen für emotionale Störungen - Serotonin Transporter knockout Mäuse und Tryptophan Hydroxylase 2 knockout Mäuse N2 - Serotonin (5-HT) has been implicated in the regulation of emotions as well as in its pathological states, such as anxiety disorders and depression. Mice with targeted deletion of genes encoding various mediators of central serotonergic neurotransmission therefore provides a powerful tool in understanding contributions of such mediators to homeostatic mechanisms as well as to the development of human emotional disorders. Within this thesis a battery of electrophysiological recordings were conducted in the dorsal raphe nucleus (DRN) and the hippocampus of two murine knockout lines with deficient serotonergic systems. Serotonin transporter knockout mice (5-Htt KO), which lack protein responsible for reuptake of 5-HT from the extracellular space and tryptophan hydroxylase 2 knockout (Tph2 KO) mice, which lack the gene encoding the neuronal 5-HT-synthesising enzyme. First, 5-HT1A receptor-mediated autoinhibition of serotonergic neuron firing in the DRN was assessed using the loose-seal cell-attached configuration. Stimulation of 5-HT1A receptors by a selective agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), showed a mild sensitisation and a marked desensitisation of these receptors in Tph2 KO and 5-Htt KO mice, respectively. While application of tryptophan, a precursor of 5-HT and a substrate of Tph2, did not cause autoinhibition in Tph2 KO mice due to the lack of endogenously produced 5-HT, data from 5-Htt KO mice as well as heterozygous mice of both KO mice lines demonstrated the presence of autoinhibitory mechanisms as normal as seen in wildtype (WT) controls. When the Tph2-dependent step in the 5-HT synthesis pathway was bypassed by application of 5-hydroxytryptophan (5-HTP), serotonergic neurons of both Tph2 KO and 5-Htt KO mice showed decrease in firing rates at lower concentrations of 5-HTP than in WT controls. Elevated responsiveness of serotonergic neurons from Tph2 KO mice correspond to mild sensitisation of 5-HT1A receptors, while responses from 5-Htt KO mice suggest that excess levels of extracellular 5-HT, created by the lack of 5-Htt, stimulates 5-HT1A receptors strong enough to overcome desensitisation of these receptors. Second, the whole-cell patch clamp recording data from serotonergic neurons in the DRN showed no differences in basic electrophysiological properties between Tph2 KO and WT mice, except lower membrane resistances of neurons from KO mice. Moreover, the whole-cell patch clamp recording from CA1 pyramidal neurons in the hippocampus of 5-Htt KO mice showed increased conductance both at a steady state and at action potential generation. Lastly, magnitude of long-term potentiation (LTP) induced by the Schaffer collateral/commissural pathway stimulation in the ventral hippocampus showed no differences among Tph2 KO, 5-Htt KO, and WT counterparts. Taken together, lack and excess of extracellular 5-HT caused sensitisation and desensitisation of autoinhibitory 5-HT1A receptors, respectively. However, this may not directly translate to the level of autoinhibitory regulation of serotonergic neuron firing when these receptors are stimulated by endogenously synthesised 5-HT. In general, KO mice studied here showed an astonishing level of resilience to genetic manipulations of the central serotonergic system, maintaining overall electrophysiological properties and normal LTP inducibility. This may further suggest existence of as-yet-unknown compensatory mechanisms buffering potential alterations induced by genetic manipulations. N2 - Serotonin (5-HT) ist an der Regulation von der Emotionen, sowie ihrer pathologischen Zustände, wie Angststörungen und Depressionen beteiligt. Mäuse denen, mittels einer zielgerichteteten Deletion von Genen, die verschiedenste Proteine involviert in der zentralen serotonergen Nerotransmission fehlen, dienen daher als ein nützliches Tiermodell, um die Rolle dieser Mediatoren bei Homöostasemechanismen und der Entwicklung emotionaler Störungen beim Menschen zu verstehen. Im Rahmen dieser Thesis wurde eine Batterie von elektrophysiologischen Ableitungen im Hippocampus sowie in der dorsalen Raphe Nucleus (DRN) zweier Knockout-Mauslinien mit einem defizienten serotonergen Systems durchgeführt. Serotonintransporter Knockout-Mäuse (5-Htt KO), denen das Protein zur Wiederaufnahme von 5-HT aus dem extrazellulären Raum fehlt und Tryptophanhydroxylase 2 Knockout-Mäuse (Tph2 KO), denen das Gen für das 5-HT-synthetisierende Enzym im Gehirn fehlt. Zunächst wurde mittels der “loose-seal cell-attached” Aufnahmemethode die Eigenhemmung der serotonergen Neuronen untersucht, die durch 5-HT1A Rezeptoren in der DRN vermittelt wird. Stimulierung der 5-HT1A Rezeptoren durch einen selektiven Agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), zeigte eine milde Sensibilisierung und eine deutliche Desensibilisierung dieser Rezeptoren in Tph2 KO bzw. in 5-Htt KO Mäusen. Während die Anwendung von Tryptophan, eine Vorstufe von 5-HT und ein Substrat der Tph2, keine Eigenhemmung, aufgrund des Mangels an endogen produziertem 5-HT, in Tph2 KO Mäusen verursachte, wiesen Daten von 5-Htt KO Mäusen sowie von heterozygoten Mäusen beider KO Mauslinien die Existenz der Eigenhemmungsmechanismen wie in den Wildtypen (WT) nach. Wurde der Tph2-abhängige Schritt im 5-HT Syntheseweg durch Anwendung von 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) umgangen, zeigten sowohl Tph2 KO als auch 5-Htt KO Mäuse eine Verminderung der serotonergen neuronalen Feuerungsrate bei niedrigeren Konzentrationen von 5-HTP im Vergleich zu den WT. Die erhöhte Reaktionsfähigkeit der serotonergen Neuronen von Tph2 KO Mäusen entsprechen der milden Sensibilisierung der 5-HT1A Rezeptoren. Stattdessen deuten die Reaktionen der serotonergen Neuronen von 5-Htt KO Mäusen darauf hin, dass das überschüssige Niveau von extrazellularem 5-HT, welches durch den Mangel an 5-Htt verursacht wird, 5-HT1A Rezeptoren stark genug stimuliert, um eine Desensibilisierung dieser Rezeptoren zu überwinden. Zweitens zeigten die Daten der whole-cell Patch Clamp Ableitung von serotonergen Neuronen im DRN keine Unterschiede in grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften zwischen Tph2 KO und WT, außer niedrigen Membranwiderständen in KO Mäusen. Darüber hinaus zeigte die whole-cell Patch Clamp Ableitungen von CA1 Pyramidenzellen im Hippocampus der 5-Htt KO Mäuse eine erhöhte Leitfähigkeit sowohl bei Ruheständen als auch bei Aktionspotentialerzeugungen. Schließlich zeigte die Stärke der Langzeitpotenzierung (long-term potentiation: LTP) durch die Stimulation der Schaffer-Kollateralen/kommissuralen Fasern im ventralen Hippocampus keine Unterschiede zwischen Tph2 KO, 5-Htt KO, und jeweiligen WT. Zusammengefasst verursachten der Mangel und der Überschuss von extrazellularen 5-HT eine Sensibilisierung bzw. Desensibilisierung der autoinhibitorischen 5-HT1A Rezeptoren. Dies kann jedoch nicht direkt in die Regulierung von serotonergen Neuronen Feuerung umgesetzt werden, wenn die 5-HT1A Rezeptoren durch endogen synthetisiertes 5-HT stimuliert werden. Im Allgemeinen zeigten die hier untersuchten KO Mäuse, ein erstaunliches Maß an Widerstandskraft, die die allgemeinen elektrophysiologischen Eigenschaften und die normale LTP Induzierbarkeit trotz genetischer Manipulationen des zentralen serotonergen Systems aufrechterhielt. Weiterhin deutet dies auf die Existenz noch unbekannter Kompensationsmechanismen hin, die diese potentiellen Veränderungen abzudämpfen scheinen. KW - Serotonin KW - Elektrophysiologie KW - Tryptophan hydroxylase 2 KW - Knockout KW - Serotonin transporter KW - Depression KW - Anxiety KW - Knockout KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83265 ER - TY - THES A1 - Dreykluft, Angela T1 - The PD-1/B7-H1 Pathway in a Transgenic Mouse Model for Spontaneous Autoimmune Neuroinflammation: Immunological Studies on Devic B7-H1-/- Mice T1 - Der PD-1/B7-H1 Signalweg in einem transgenen Mausmodell für spontane autoimmune Neuroinflammation: Immunologische Studien an Devic B7-H1-/- Mäusen N2 - Multiple sclerosis is an autoimmune disease of the central nervous system characterized by inflammatory, demyelinating lesions and neuronal death. Formerly regarded as a variant of MS, neuromyelitis optica (NMO)/Devic’s disease is now recognized as a distinct neurological disorder exhibiting characteristic inflammatory and demyelinated foci in the optic nerves and the spinal cord sparing the brain. With the introduction of the double-transgenic “Devic mouse” model featuring spontaneous, adjuvant-free incidence of autoimmune neuroinflammation due to the interaction of transgenic MOG-specific T and B cells, a promising tool was found for the analysis of factors triggering or preventing autoimmunity. The co-inhibitory molecule B7-H1 has been proposed to contribute to the maintenance of peripheral tolerance and to confine autoimmune inflammatory damage via the PD-1/B7-H1 pathway. Compared to Devic B7-H1+/+ mice, Devic B7-H1-/- mice developed clinical symptoms with a remarkably higher incidence rate and faster kinetics emphasized by deteriorated disease courses and a nearly quadrupled mortality rate. Remarkably enlarged immune-cell accumulation in the CNS of Devic B7-H1-/- mice, in particular of activated MOG-specific CD4+ T cells, correlated with the more severe clinical features. Our studies showed that the CNS not only was the major site of myelin-specific CD4+ T-cell activation but also that B7-H1 expression within the target organ significantly influenced T-cell activation and differentiation levels. Analysis at disease maximum revealed augmented accumulation of MOG-specific CD4+ T cells in the peripheral lymphoid organs of Devic B7-H1-/- mice partly due to increased T-cell proliferation rates. Transgenic MOG-specific B cells of Devic B7-H1-/- mice activated MOG-specific CD4+ T cells more efficiently than B cells of Devic B7-H1+/+ mice. This observation indicated a relevant immune-modulating role of B7-H1 on APCs (antigen-presenting cells) in this mouse model. We also assumed altered thymic selection processes to be involved in increased peripheral CD4+ T-cell numbers of Devic B7-H1-/- mice as we found more thymocytes expressing the transgenic MOG-specific T-cell receptor (TCR). Moreover, preliminary in vitro experiments hinted on an enhanced survival of TCRMOG-transgenic CD4+ T cells of Devic B7-H1-/- mice; a mechanism that might as well have led to higher peripheral T-cell accumulation. Elevated levels of MOG-specific CD4+ T cells in the periphery of Devic B7-H1-/- mice could have entailed the higher quantities in the CNS. However, mechanisms such as CNS-specific proliferation and/or apoptosis/survival could also have contributed. This should be addressed in future investigations. Judging from in vitro migration assays and adoptive transfer experiments on RAG-1-/- recipient mice, migratory behavior of MOG-specific CD4+ T cells of Devic B7-H1+/+ and Devic B7-H1-/- mice seemed not to differ. However, enhanced expression of the transmigration-relevant integrin LFA-1 on CD4+ T cells in young symptom-free Devic B7-H1-/- mice might hint on temporally differently pronounced transmigration capacities during the disease course. Moreover, we attributed the earlier conversion of CD4+ T cells into Th1 effector cells in Devic B7-H1-/- mice during the initiation phase to the lack of co-inhibitory signaling via PD-1/B7-H1 possibly leading to an accelerated disease onset. Full blown autoimmune inflammatory processes could have masked these slight effects of B7-H1 in the clinical phase. Accordingly, at peak of the disease, Th1 and Th17 effector functions of peripheral CD4+ T cells were comparable in both mouse groups. Moreover, judging from titers of MOG-specific IgG1 and IgM antibodies, alterations in humoral immunity were not detected. Therefore, clinical differences could not be explained by altered T-cell or B-cell effector functions at disease maximum. B7-H1 rather seemed to take inhibitory effect in the periphery during the initiation phase only and consistently within the target organ by parenchymal expression. Our observations indicate that B7-H1 plays a relevant role in the regulation of T-cell responses in this mouse model for spontaneous CNS autoimmunity. By exerting immune-modulating effects in the preclinical as well as the clinical phase of the disease, B7-H1 contributed to the confinement of the immunopathological tissue damage in Devic B7-H1+/+ mice mirrored by later disease onsets and lower disease scores. As a model for spontaneous autoimmunity featuring a close to 100 % incidence rate, the Devic B7-H1-/- mouse may prove instrumental in clarifying disease-triggering and -limiting factors and in validating novel therapeutic approaches in the field of autoimmune neuroinflammation, in particular the human Devic’s disease. N2 - Multiple Sklerose ist eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems, die durch entzündliche, demyelinisierende Läsionen und neuronalen Tod gekennzeichnet ist. Einst als Variante der MS betrachtet, gilt die Neuromyelitis optica (NMO) / Devic-Krankheit heute als eigenständige neurologische Erkrankung, bei der charakteristische Läsionen in den Sehnerven und im Rückenmark jedoch nicht im Gehirn auftreten. Mit der Einführung des doppelt-transgenen "Devic Maus"-Modells, bei dem es zur spontanen, Adjuvans-freien Inzidenz von autoimmuner Neuroinflammation durch Expression transgener MOG-spezifischer T- und B-Zellen kommt, wurde ein vielversprechendes Werkzeug für die Analyse von Faktoren gefunden, die Autoimmunität auslösen bzw. hemmen können. Das ko-inhibitorische Molekül B7-H1 trägt über den PD-1/B7-H1 Signalweg vermeintlich zur Aufrechterhaltung peripherer Toleranz bei. Devic B7-H1-/ - Mäuse entwickelten im Vergleich zu Devic B7-H1+/ + Mäusen Symptome, die mit deutlich höherer Inzidenz und schnellerer Kinetik einhergingen, unterstrichen von verstärkten Krankheitsverläufen und einer nahezu vervierfachten Sterblichkeit. Die verstärkte Akkumulierung von Immunzellen im ZNS, insbesondere von aktivierten MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen, korrelierte mit den schwerwiegenderen klinischen Merkmalen. Unsere Untersuchungen zeigten nicht nur, dass die Aktivierung von myelin-spezifischen CD4+ T-Zellen hauptsächlich im ZNS stattfand, sondern auch, dass im Zielorgan exprimiertes B7-H1 maßgeblich den T-Zell-Aktivierungs- und -Differenzierungsgrad beeinflusste. Analysen am Krankheitsmaximum zeigten eine verstärkte Akkumulierung von MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen in den Lymphorganen von Devic B7-H1-/- Mäusen, die wir teils auf erhöhte T-Zell-Proliferation zurückzuführten. Transgene MOG-spezifische B-Zellen der Devic B7-H1-/- Mäuse aktivierten effizienter als B-Zellen der Devic B7-H1+/+ Mäuse MOG-spezifische CD4+ T-Zellen. Dies deutet auf eine wichtige immunmodulierende Rolle von B7-H1 auf Antigen-präsentierenden Zellen in diesem Mausmodell hin. Veränderte Selektionsprozesse im Thymus trugen wohlmöglich zu den höheren CD4+ T-Zellzahlen in der Peripherie bei. Vorläufige in vitro Experimente deuteten auf ein verbessertes Überleben von TCRMOG-transgenen CD4+ T-Zellen aus Devic B7-H1-/- Mäusen hin. Eine erhöhte Anzahl von peripheren MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen könnte zu den größeren Mengen im ZNS von Devic B7-H1-/- Mäusen geführt haben. Jedoch sind zusätzliche Mechanismen wie ZNS-spezifische Proliferation und/oder Apoptose bzw. Überleben denkbar. Dies sollte in zukünftigen Untersuchungen genauer analysiert werden. Anhand von in vitro-Migrationsassays und Adoptiver Transfer-Experimenten in RAG-1-/- Mäusen schlossen wir, dass das Migrationsverhalten von MOG-spezifischen CD4+ T-Zellen von Devic B7-H1-/- Mäusen nicht verändert war. Allerdings deutet die verstärkte Expression des transmigrationsrelevanten Intergins LFA-1 auf CD4+ T-Zellen in jungen, symptomfreien Devic B7-H1-/- Mäusen auf im Krankheitsverlauf zeitlich verschieden ausgeprägte Transmigrationskapazitäten hin. Die frühere Differenzierung von peripheren CD4+ T-Zellen in Th1-Effektorzellen in Devic B7-H1-/- Mäusen während der Initiationsphase schrieben wir der fehlenden inhibierenden Wirkung des PD-1/B7-H1 Signalwegs zu, was den früheren Krankheitsbeginn bedingt haben könnte. Stark ausgeprägte autoimmune Entzündungsreaktionen am Krankheitsmaximum maskierten jedoch wahrscheinlich diese schwachen Effekte von B7-H1. Dies wurde durch die Tatsache untermauert, dass am Krankheitsmaximum Th1- und Th17-Effektorfunktionen von peripheren CD4+ T-Zellen in beiden Mausgruppen vergleichbar ausgeprägt waren. Des Weiteren bestanden am Krankheitsmaximum keine Unterschiede in der humoralen Immunität. Die beobachteten klinischen Unterschiede waren demnach nicht durch veränderte periphere T-Zell- oder B-Zell-Effektorfunktionen in dieser Krankheitsphase erklärbar. Vielmehr scheint B7-H1 in der Peripherie ausschließlich während der Initiationsphase der Krankheit und fortwährend im Zielorgan durch seine parenchymale Expression immuninhibierend zu wirken. Unsere Beobachtungen zeigen, dass B7-H1 eine relevante Rolle bei der Immunregulierung im vorliegenden Mausmodell für spontane ZNS-Autoimmunität spielt. Durch immunmodulierende Effekte in der präklinischen sowie der klinischen Phase der Krankheit trug B7-H1 zu der Begrenzung der immunpathologischen Gewebeschädigung in Devic B7-H1+/+ Mäusen bei, sichtbar an einem späteren Krankheitsbeginn und leichteren -verlauf. Als Tiermodell für spontane ZNS-Autoimmunität mit nahezu 100 %iger Inzidenz könnte sich die Devic B7-H1-/- Maus als hilfreich bei der Klärung krankheitsauslösender und -limitierender Faktoren erweisen sowie bei der Validierung neuer therapeutischer Ansätze im Bereich der autoimmunen Neuroinflammation, insbesondere der Devic-Krankheit im Menschen. KW - Autoimmunität KW - Zentralnervensystem KW - Neuroinflammation KW - B7-H1 KW - Ko-inhibitorischer Signalweg KW - Devic Maus KW - autoimmunity KW - neuroinflammation KW - B7-H1 KW - co-inhibitory signalling KW - Devic mice KW - Maus KW - Entzündung KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83288 ER - TY - THES A1 - Groneberg, Dieter T1 - Funktion der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in der glatten Muskulatur T1 - The function of NO-sensitive guanylyl cyclase in smooth muscle N2 - Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskulären Faktoren für die Relaxation der Blutgefäße sowie für die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt hauptsächlich über die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen führt zu einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-Mäuse zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskulären und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die Mäuse zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verlängerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion mündet. Allerdings erlaubt eine vollständige Deletion der NO-GC in den Mäusen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der für den erhöhten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gestörten Darm-Motilität zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-Mäuse für die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-Mäuse entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen völlig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. Überraschenderweise ist die Darm-Motilität der SM-GCKO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen unverändert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus für ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Phänotyp dieser Doppel-Knockouts ähnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verlängert. Zusammenfassend führt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollständigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt. N2 - The nitric oxide (NO)-cGMP signaling pathway plays a prominent role in the control of smooth muscle tone. NO is one of the main vascular factors responsible for the relaxation of blood vessels, regulation of blood pressure and also acts as major inhibitory neurotransmitter in the gastrointestinal (GI) tract. It acts predominantly via NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) which is made up of 2 different subunits (α and ß). Deletion of the ß1 subunit in the mouse leads to a global NO-GC knockout (GCKO). GCKO mice do not reveal NO-induced relaxation of vascular and GI smooth muscle. They show hypertension and an increased gut transit time resulting in GI dysfunction. However, global deletion of NO-GC in mice does not allow identification of the cell/tissue type responsible for the elevated blood pressure and GI dysfunction. To determine the relative contribution of smooth muscle cells to the hypertension and GI dysfunction seen in NO-GC knockout mice were generated smooth muscle–specific knockout mice for the ß1 subunit of NO-GC (SM-GCKO) using a tamoxifen-inducible system. SM-GCKO animals develop hypertension over time in combination with a loss of NO-induced smooth muscle relaxation. In sum, these data provide evidence that deletion of NO-GC solely in smooth muscle is sufficient to cause hypertension. Surprisingly, NO-induced relaxation of GI smooth muscle was only slightly reduced in SM-GCKO mice and gut motility was unchanged compared to wild-type mice. Taken together, lack of NO-GC in smooth muscle cells does not impair NO induced relaxation of GI tissues or GI motility. To determine the cell type expressing NO-GC we used immunhistochemistry. We found that, in addition to smooth muscle, interstitial cells of Cajal (ICC) express NO GC. With a Cre specific mouse model for ICC we generated a mouse line lacking NO-GC in both smooth muscle and ICC. In these double knockouts we observed a phenotype similar to that seen in total GCKO mice including lack of nitrergic relaxation and increased gut transit time. In conclusion, lack of NO-GC in both SMC and ICC totally abolishes nitrergic signaling in GI tract. KW - Knockout KW - Glatte Muskulatur KW - Hypertonie KW - Motilität KW - Maus KW - knockout KW - smooth muscle KW - hypertension KW - motility KW - mouse Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67689 ER - TY - THES A1 - Groh, Janos Michael T1 - Pathogenic impact of immune cells in mouse models of neuronal ceroid lipofuscinosis T1 - Pathogener Einfluss von Immunzellen in Mausmodellen der Neuronalen Ceroid Lipofuszinose N2 - The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are fatal neurodegenerative disorders in which the visual system is affected in early stages of disease. A typical accompanying feature is neuroinflammation, the pathogenic impact of which is presently unknown. In this study, the role of inflammatory cells in the pathogenesis was investigated in Palmitoyl-protein thioesterase 1-deficient (Ppt1-/-) and Ceroidlipofuscinosis, neuronal 3-deficient (Cln3-/-) mice, models of the infantile and juvenile forms of NCL, respectively. Focusing predominantly on the visual system, an infiltration of CD8+ cytotoxic Tlymphocytes and an activation of microglia/macrophage-like cells was observed early in disease. To analyze the pathogenic impact of lymphocytes, Ppt1-/- mice were crossbred with mice lacking lymphocytes (Rag1-/-) and axonal transport, perturbation and neuronal survival were scored. Lack of lymphocytes led to a significant amelioration of neuronal disease and reconstitution experiments revealed a crucial role of CD8+ cytotoxic T-lymphocytes. Lack of lymphocytes also caused an improved clinical phenotype and extended longevity. To investigate the impact of microglia/macrophage-like cells, Ppt1-/- and Cln3-/- mice were crossbred with mice lacking sialoadhesin (Sn-/-), a monocyte lineage-restricted cell adhesion molecule important for interactions between macrophage-like cells and lymphocytes. Similar to the lack of lymphocytes, absence of sialoadhesin significantly ameliorated the disease in Ppt1-/- and Cln3-/- mice. Taken together, both T-lymphocytes and microglia/macrophage-like cells were identified as pathogenic mediators in two distinct forms of fatal inherited neurodegenerative storage disorders. These studies expand the concept of secondary inflammation as a common pathomechanistic feature in some neurological diseases and provide novel insights that may be crucial for developing treatment strategies for different forms of NCL. N2 - Die Neuronalen Ceroid Lipofuszinosen (NCL) sind tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen, bei denen das visuelle System frühzeitig im Krankheitsverlauf betroffen ist. Eine typische Begleiterscheinung sind Entzündungsreaktionen, deren pathogenetischer Einfluss bisher ungeklärt ist. In dieser Studie wurde die Rolle von Entzündungszellen bei der Pathogenese in Palmitoyl-protein thioestease 1-defizienten (Ppt1-/-) und Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 3-defizienten (Cln3-/-) Mäusen untersucht, den jeweiligen Modellen der Infantilen und Juvenilen Formen der NCL. Mit besonderem Augenmerk auf das visuelle System wurde früh in der Krankheit ein Aufkommen von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten und eine Aktivierung von Mikroglia/Makrophagen-ähnlichen Zellen beobachtet. Um den pathogenetischen Einfluss der Lymphozyten zu klären, wurden Ppt1-/- Mäuse mit Mäusen verkreuzt, welche keine Lymphozyten besitzen (Rag1-/-). An den generierten Doppelmutanten wurden axonaler Transport, axonale Schädigung und neuronales Überleben bestimmt. Die Abwesenheit von Lymphozyten führte zu einer signifikanten Abmilderung der neuronalen Schädigung und Rekonstitutions-Experimente zeigten, dass CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle spielen. Die Abwesenheit dieser Lymphozyten führte außerdem zu einem abgemilderten klinischen Phänotyp und einem verlängerten Überleben. Um den Einfluss von Mikroglia/Makrophagen zu untersuchen wurden Ppt1-/- und Cln3-/- Mäuse mit Sialoadhesin-defizienten Mäusen (Sn-/-) verkreuzt. Sn ist ein Monozyten-spezifisches Zelladhäsionsmolekül, das wichtig für Interaktionen zwischen Makrophagen-ähnlichen Zellen und Lymphozyten ist. Ähnlich wie die Abwesenheit von Lymphozyten führte die Abwesenheit von Sialoadhesin zu einer signifikanten Abmilderung der Krankheit in Ppt1-/- und Cln3-/- Mäusen. Zusammengefasst wurden sowohl T-Lymphozyten als auch Mikroglia/Makrophagenähnliche Zellen als pathogenetische Mediatoren in zwei verschiedenen Formen von tödlich verlaufenden erblichen neurodegenerativen Speicherkrankheiten identifiziert. Diese Untersuchungen erweitern das Konzept der sekundären Entzündungsreaktion als verbreitete pathomechanistische Erscheinung in einigen neurologischen Erkrankungen und liefern neue Perspektiven für die Entwicklung von Behandlungsstrategien für verschiedene Formen der NCL. KW - Nervendegeneration KW - Maus KW - Entzündung KW - T-Lymphozyt KW - Neuronale Ceroid Lipofuszinose KW - Neuroinflammation KW - Neurodegeneration KW - axonaler Schaden KW - T-Lymphozyten KW - neuronal ceroid lipofuscinosis KW - neuroinflammation KW - neurodegeneration KW - axonal damage KW - T-lymphocytes Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77684 ER - TY - THES A1 - Bäuerlein, Carina T1 - Identification of new predictive markers for an early diagnosis of an imminent acute Graft-versus-Host Disease T1 - Bestimmung neuer prädiktiver Marker zur Früherkennung einer drohenden akuten Graft-versus-Host Disease N2 - Acute graft-versus-host disease (aGvHD) is an immune syndrome associated with allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT) that is mediated by alloreactive donor T cells attacking the gastrointestinal tract, liver, and skin of the host. Early diagnosis remains problematic and to date mainly relies on clinical symptoms and histopathology. Previously, different groups demonstrated that in order to cause aGvHD, alloreactive T cells require the expression of appropriate homing receptors to efficiently migrate from their priming sites to their target tissues. Therefore, the development of a predictive test based on the homing receptor expression profile of peripheral blood T cells seems attractive to identify patients at risk before the onset of aGvHD. The aim of this study was to analyze migrating alloreactive donor T cell kinetics in the peripheral blood early after allo-HCT in a murine model across minor histocompatibility antigens (miHAg) followed by a precise characterization of the homing receptor expression profile of migrating donor lymphocytes in order to identify suitable predictive markers. Combining daily bioluminescence imaging (BLI) and flow cytometry (FC) allowed defining two weeks of massive alloreactive donor T cell migration before clinical aGvHD symptoms became apparent. Peripheral blood donor T lymphocytes highly up-regulated the homing markers α4β7 integrin, and P- and E-selectin-ligand at peak time points of cell migration. The combination with the activation markers CD25 and CD69 and low expression levels of L-selectin allowed alloreactive donor T cell definition. Based on this migration phase we postulated a potential diagnostic window to precisely identify alloreactive donor T cells upon their homing receptor expression profile. Consequently, targeted pre-emptive treatment with rapamycin starting at the earliest detection time point of alloreactive donor T cells in the peripheral blood (day+6) significantly prolonged survival of treated mice. Based on this data, we propose a potential diagnostic window for alloreactive cell detection based on their homing receptor expression profile for a timely and effective therapeutic intervention before the clinical manifestation of aGvHD. N2 - Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist oft die einzig mögliche Behandlungsmethode für maligne und nicht-maligne hämatologische Erkrankungen. Die Graft-versus-Host Disease stellt den größten, limitierenden Faktor dieser Therapie dar. Bei diesem Immunsyndrom greifen alloreaktive Spender-T-Zellen gezielt Organe des Empfängers an, insbesondere den Gastrointestinaltrakt, die Leber und die Haut. Die frühe Diagnose einer bevorstehenden, akuten GvHD gestaltet sich nach wie vor schwierig und basiert heutzutage hauptsächlich auf dem Auftreten klinischer Symptome und histopathologischen Befunden. Die Entwicklung eines prädiktiven Tests zur Früherkennung gefährdeter Patienten hat daher hohe Priorität. Verschiedene Gruppen zeigten kürzlich, dass Spender-T-Zellen spezifische Rezeptoren, sogenannte Homing-Rezeptoren, exprimieren müssen, um in die Zielorgane einwandern zu können. Deshalb scheint die Entwicklung eines auf dem spezifischen Homing-Rezeptor-Expressionsmuster der T-Zellen im peripheren Blut basierenden Tests vielversprechend, um gezielt Patienten zu identifizieren, die möglicherweise eine aGvHD entwickeln werden. Das Ziel dieser Arbeit war die genaue Analyse der Migrationskinetik alloreaktiver Spender-T-Zellen im peripheren Blut in einem klinisch relevanten Mausmodell mit Unterschieden in minor Histokompatibilitätsantigenen. Es folgte eine präzise Charakterisierung des Homing-Rezeptor-Expressionsprofils der migrierenden Spenderlymphozyten zu ausgewählten Zeitpunkten nach Transplantation, um mögliche, geeignete Rezeptoren für einen prädiktiven Test zu identifizieren. Die Kombination von täglicher in vivo Bildgebung der transplantierten Mäuse mit durchflusszytometrischen Analysen des peripheren Blutes ermöglichte es, eine zweiwöchige Phase massiver Spenderzellmigration vor dem Auftreten klinischer aGvHD Symptome zu definieren. Die detektierten Spenderlymphozyten zeigten eine stark erhöhte Expression des für die Migration in den Gastrointestinaltrakt wichtigen Moleküls α4β7 Integrin sowie der Liganden für P- und E-Selektin, die in das Haut-Homing involviert sind. Die Kombination dieser Marker mit der stark reduzierten Expression von L-Selektin, einem Marker für naive T-Zellen, sowie der signifikant höheren Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 im Vergleich zu syngen transplantierten Kontrolltieren ermöglichte die Definition von alloreaktiven Spender-T-Zellen. Eine gezielte, vorbeugende Behandlung mit Rapamycin, beginnend am Tag der Detektion erster alloreaktiver T-Zellen (Tag+6), erhöhte die Überlebensrate der behandelten Mäuse. Aufgrund dieser Daten schlagen wir ein potentielles, diagnostisches Fenster zur Anwendung prädiktiver Tests vor, um Patienten, mit erhöhtem aGvHD-Risiko rechtzeitig zu identifizieren und vorbeugend behandeln zu können. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Graft-versus-host disease KW - Mausmodell KW - T-Zellhoming KW - Graft-versus-host disease KW - mouse model KW - T cell homing KW - Maus KW - Blutstammzelle Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78489 ER - TY - THES A1 - Untucht, Robert T1 - Design und Klonierung eines Targeting Vektors zur Generierung von Plasmakallikrein-defizienten Mäusen T1 - Designing and cloning of a targeting vector for generating plasma kallikrein deficient mice N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist die Erstellung eines sogenannten "Targeting Vektors" zur gezielten Ausschaltung des Gens für Plasmakallikrein in der Maus, als Vorbereitung zur Schaffung einer Plasmakallikrein-defizienten Mauslinie. Plasmakallikrein ist eine im Blut zirkulierende Serinprotease, die Funktionen in Hämostase, Thrombusbildung und Fibrinolyse hat sowie sowohl direkt als auch indirekt mittels Bradykinin an Entzündungsvorgängen beteiligt ist. Zwei 5836 und 3834 bp lange Abschnitte aus dem murinen Plasmakallikrein-Gen wurden durch PCR isoliert und in ein Plasmid kloniert, das neben Resistenzgenen gegen Ampicillin und Neomycin auch das β-Galaktosidase-Gen zum Nachweis einer erfolgreichen Transfektion enthält. Der so entstandene "Targeting Vektor" hat eine Gesamtgröße von 18072 bp, die Basensequenz wurde durch Sequenzierung verifiziert. Der Vektor soll im Plasmakallikrein-Gen einen Teil der Exons 2 und 3 und damit einen Großteil des Signalpeptids und der ersten Proteindomäne funktionsunfähig machen. An den mit dieser Methode erstellten Knockout-Mäusen können die Funktionen von Plasmakallikrein genauer untersucht werden. N2 - This thesis describes the cloning of a targeting vector in the gene targeting strategy for a murine plasma kallikrein (PK) knock-out. PK is a serine protease found in blood which has functions in hemostasis, thrombus formation, fibrinolysis and – both directly and indirectly via bradykinin – inflammation. Two fragments of the murine PK gene with respective lengths of 5836 and 3834 bp were isolated by PCR and cloned into a plasmid containing resistance genes against both ampicillin and neomycin and the β-galactosidase gene for the detection of transfected cells. The targeting vector has a total size of 18072 bp and was verified by sequencing. The vector should destroy parts of the exons 2 and 3 in the gene for PK and thus the greater part of the signal peptide and the first protein domain. With the knock-out mice created by this means the function of PK can be investigated more thoroughly. KW - Kallikreine KW - Maus KW - Plasmakallikrein KW - knockout KW - plasma kallikrein KW - knockout KW - knock-out KW - mouse KW - gene targeting Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78124 ER - TY - THES A1 - Riedel, Simone Stefanie T1 - Characterization of the fluorescence protein FP635 for in vivo imaging and establishment of a murine multiple myeloma model for non-invasive imaging of disease progression and response to therapy T1 - Charakterisierung des Fluoreszenzproteins FP635 für die in vivo Bildgebung und Etablierung eines Maus Modells für die nicht invasive Bildgebung des Krankheitsverlaufes und Ansprechen auf Therapien imMultiplen Myelom N2 - Optical in vivo imaging methods have advanced the fields of stem cell transplantation, graft-versus–host disease and graft-versus-tumor responses. Two well known optical methods, based on the transmission of light through the test animal are bioluminescence imaging (BLI) and fluorescence imaging (FLI). Both methods allow whole body in vivo imaging of the same animal over an extended time span where the cell distribution and proliferation can be visualized. BLI has the advantages of producing almost no unspecific background signals and no necessity for external excitation light. Hence, BLI is a highly sensitive and reliable detection method. Yet, the BLI reporter luciferase is not applicable with common microscopy techniques, therefore abolishing this method for cellular resolution imaging. FLI in turn, presents the appealing possibility to use one fluorescent reporter for whole body imaging as well as cellular resolution applying microscopy techniques. The absorption of light occurs mainly due to melanin and hemoglobin in wavelengths up to 650 nm. Therefore, the wavelength range beyond 650 nm may allow sensitive optical imaging even in deep tissues. For this reason, significant efforts are undertaken to isolate or develop genetically enhanced fluorescent proteins (FP) in this spectral range. “Katushka” also called FP635 has an emission close to this favorable spectrum and is reported as one of the brightest far-red FPs. Our experiments also clearly showed the superiority of BLI for whole body imaging over FLI. Based on these results we applied the superior BLI technique for the establishment of a pre-clinical multiple myeloma (MM) mouse model. MM is a B-cell disease, where malignant plasma cells clonally expand in the bone marrow (BM) of older people, causing significant morbidity and mortality. Chromosomal abnormalities, considered a hallmark of MM, are present in nearly all patients and may accumulate or change during disease progression. The diagnosis of MM is based on clinical symptoms, including the CRAB criteria: increased serum calcium levels, renal insufficiency, anemia, and bone lesions (osteolytic lesions or osteoporosis with compression fractures). Other clinical symptoms include hyperviscosity, amyloidosis, and recurrent bacterial infections. Additionally, patients commonly exhibit more than 30% clonal BM plasma cells and the presence of monoclonal protein is detected in serum and/or urine. With current standard therapies, MM remains incurable and patients diagnosed with MM between 2001 and 2007 had a 5-year relative survival rate of only 41%. Therefore, the development of new drugs or immune cell-based therapies is desirable and necessary. To this end we developed the MOPC-315 cell line based syngeneic MM mouse model. MOPC-315 cells were labeled with luciferase for in vivo detection by BLI. We validated the non-invasively obtained BLI data with histopathology, measurement of idiotype IgA serum levels and flow cytometry. All methods affirmed the reliability of the in vivo BLI data for this model. We found that this orthotopic MM model reflects several key features of the human disease. MOPC-315 cells homed efficiently to the BM compartment including subsequent proliferation. Additionally, cells disseminated to distant skeletal parts, leading to the typical multifocal MM growth. Osteolytic lesions and bone remodeling was also detected. We found evidence that the cell line had retained plasticity seen by dynamic receptor expression regulation in different compartments such as the BM and the spleen. N2 - Optische in vivo bildgebende Verfahren haben die Felder der Stammzelltransplantation, Graft-versus-Host Krankheit und Graft-versus-Tumor Reaktion vorangebracht. Zwei gut bekannte optische Methoden, die auf der transmission von Licht durch das Versuchtier basieren, sind die Biolumineszenz Bildgebung (BLI) und die Fluoreszenz Bildgebung (FLI). Beide Methoden erlauben die in vivo Ganzkörperbildgebung desselben Tieres über lange Zeit wärenddessen die Zellverteilung und Proliferation sichtbar gemacht werden kann. Vorteil der BLI ist, dass beinahe keine unspezifischen Hintergrundsignale erzeugt werden und keine Notwendigkeit für Anregungslicht besteht. Daher ist BLI eine hochsensitive und verlässliche Detektionsmethode. Jedoch erlaubt der BLI Reporter, die Luziferase, keine Anwendung mit gängigen Mikroskopieanwendungen und verhindert daher, dass diese Methode für die Bildgebung auf zellulärer Ebene genutzt werden kann. FLI wiederum bietet die attraktive Möglichkeit einen fluoreszenten Reporter sowohl für die Bildgebung des gesamten Körpers, als auch auf zellulärer Ebene durch die Anwendung von Mikroskopietechniken zu nutzen. Derzeit bestehen noch größere Einschränkungen bei der Arbeit mit fluoreszent markierten Zellen innerhalb eines Tieres. Die allgemeine Autofluoreszenz des umliegenden Gewebes führt zu hohen Hintergrundsignalen. Zusätzlich werden sowohl das Anregungslicht als auch die emittierte Fluoreszenz durch das umliegende Gewebe abgeschwächt. Die Absorption des Lichtes geschieht hauptsächlich durch Melanin und Hämoglobin in Wellenlängen bis zu 650 nm. Daher könnte der Wellenlängenbereich über 650 nm sensitive optische Bildgebung auch in tief liegendem Gewebe ermöglichen. Aus diesem Grund werden erhebliche Anstrenungen unternommen um Fluoreszenzproteine (FP) in diesem spektralen Bereich zu isolieren oder genetisch verbesserte zu entwickeln. „Katushka“ auch FP635 genannt hat eine Emission, die nahe an diesem günstigen Spektrum liegt und wurde als eines der hellsten dunkelroten FPs beschrieben. Wir untersuchten FP635 für die Anwendung als sensitiver Einzelreporter für die Detektion immunologischer Prozesse von der Ganzkörper- bis zur Einzelzellbildgebung. Unsere Experimente zeigten auch deutlich die Überlegenheit der BLI über die FLI für die Ganzkörperbildgebung. Basierend auf diesen Ergebnissen setzten wir die überlegene BLI für die Etablierung eines präklinischen Mausmodells des Multiplen Myeloms (MM) ein. MM ist eine B-Zell Erkrankung wobei maligne Plasmazellen klonal im Knochenmark (BM) älterer Menschen expandieren und erhebliche Morbidität und Sterblichkeit verursacht. Chromosomale Abnormitäten gelten als Kennzeichen des MM, sind bei beinahe allen Patienten vorhanden und können sich während des Krankheitsverlaufes anhäufen oder verändern. Die Diagnose des MM basiert auf klinischen Syptomen inklusive der folgenden Kriterien: erhöhte Serum Kalzium Konzentration, Niereninsuffizienz, Anämie und Knochenläsionen (osteolytische Läsionen oder Osteoporose mit Kompressionsfrakturen). Weitere klinische Symptome beinhalten Hyperviskosität, Amyloidose und wiederkehrende bakterielle Infektionen. Zusätzlich zeigen Patienten verbreitet mehr als 30% klonale BM Plasmazellen und monoklonales Protein ist in Serum und/oder Urin detektierbar. Mit derzeitigen Standardtherapien bleibt MM unheilbar und Patienten, die zwischen 2001 und 2007 mit MM diagnostiziert wurden hatten eine relative 5-jahres Überlebensrate von nur 41%. Daher ist die Entwicklung neuer Medikamente und immunzellbasierten Therapien wünschenswert und notwendig. Zu diesem Zweck entwickelten wir das auf der Zelllinie MOPC-315 basierende syngene MM Mausmodell. Die MOPC-315 Zellen wurden für die in vivo Detektion mittels BLI mit Luziferase markiert. Wir validierten die nichtinvasiv gewonnenen BLI Daten mit Histopathologie, der Messung des idiotypen IgA Spiegels im Serum und Durchflusszytometrie. Alle Methoden bekräftigten die Zuverlässigkeit in vivo BLI Daten für dieses Modell. Wir stellten fest, dass dieses orthotope MM Modell einige Hauptmerkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt. Die MOPC-315 Zellen wanderten effizient in das BM Kompartiment inklusive darauffolgender Proliferation. Ausserdem, streuten die Zellen in entfernte Teile des Skeletts aus was zum typischen multifokalen MM Wachstum führte. Wir stellten auch osteolytische Läsionen und Knochenumbau fest. Wir fanden Hinweise darauf, dass sich die Zelllinie Plastizität bewahrte was durch die dynamische Regulation der Rezeptorexpression in verschiedenen Kompartimenten, wie dem BM und der Milz, sichtbar wurde. KW - Fluoreszenzproteine KW - Plasmozytom KW - Biolumineszenzmessung KW - Maus KW - Multiple myeloma KW - bioluminescence imaging KW - fluorescence imaging KW - FP635 KW - mouse model KW - nichtinvasive Bildgebung KW - Multiples Myelom Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77894 ER - TY - THES A1 - Vetter, Sebastian T1 - Elektrophysiologische Charakterisierung von STIM2-Knock-Out-Mäusen T1 - Electrophysiological characterization of STIM2 knockout mice N2 - Um eine mögliche elektrophysiologische, kardiale Ursache für den plötzlichen Tod von STIM2 Knock-Out Mäusen zu prüfen, wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung mittels Ruhe- und Stress-EKG, telemetrischem Langzeit-EKG sowie Elektrophysiologischer Untersuchung durchgeführt. Hierbei konnte keine kardial-elektrophysiologische Grundlage für den plötzlichen Tod dieser Tiere gefunden werden. N2 - For testing a possible electrophysiological, cardiac reason for the sudden death of STIM2 knockout mice, a electrophysiological characterization was performed by use of resting and stress ecg, telemetric long-term ecg and electrophysiology study. In this study couldn't be found any cardiac electrophysiological cause for the sudden death of these animals. KW - Knock-Out KW - Knockout KW - Elektrophysiologie KW - Maus KW - Maus KW - Kardiologie KW - Elektrophysiologische Untersuchung KW - STIM2 KW - STIM2 KW - electrophysiology study KW - electrocardiography KW - telemetry KW - ecg Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77005 ER - TY - THES A1 - Sönnekes, Stephan T1 - Proteinkinase C-abhängige Oberflächenexpression des Glutamattransporters 1a (GLT1a) in kultivierten zerebellären Körnerzellen der Maus T1 - Protein kinase C-dependent trafficking of glutamate transporter 1a (GLT1a) in cultured cerebellar granule cells of mice N2 - Proteinkinase C-abhängige Oberflächenexpression des Glutamattransporters 1a (GLT1a) in kultivierten zerebellären Körnerzellen der Maus N2 - Protein kinase C-dependent trafficking of glutamate transporter 1a (GLT1a) in cultured cerebellar granule cells of mice KW - Glutamattransporter KW - GLT1a KW - Maus KW - Oberflächenexpression KW - Varikositäten KW - glutamate transporters KW - GLT1a KW - mouse KW - traffiking KW - neurites varicosities Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76694 ER - TY - THES A1 - Bergert, Maria Pamela T1 - Zelluläre und quantitative Verteilung von Glutamattransportern im Kleinhirn der Maus während der postnatalen Ontogenese T1 - Cellular and quantitative distribution of glutamate transporters in the murine cerebellum during postnatal ontogenesis N2 - Zelluläre und quantitative Verteilung von Glutamattransportern im Kleinhirn der Maus während der postnatalen Ontogenese N2 - Cellular and quantitative distribution of glutamate transporters in the murine cerebellum during postnatal ontogenesis KW - Glutamattransporter KW - Kleinhirn KW - Maus KW - Ontogenese KW - Verteilung KW - glutamate transporters KW - cerebellum KW - mouse KW - ontogenesis KW - distribution Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76689 ER - TY - THES A1 - Waider, Jonas T1 - The effects of serotonin deficiency in mice: Focus on the GABAergic system T1 - Die Effekte einer Serotonindefizienz in der Maus: Das GABAerge System im Blickpunkt N2 - Based on genetic association and functional imaging studies, reduced function of tryptophan hydroxylase-2 (TPH2) has been shown to be critically involved in the pathophysiology of anxiety-disorders and depression. In order to elucidate the impact of a complete neuronal 5-HT deficiency, mice with a targeted inactivation of the gene encoding Tph2 were generated. Interestingly, survival of Tph2-/- mice, the formation of serotonergic neurons and the pathfinding of their projections was not impaired. Within this thesis, I investigated the influence of 5-HT deficiency on the γ-amino butyric acid (GABA) system. The GABAergic system is implicated in the pathophysiology of anxiety disorders. Therefore, measurement of GABA concentrations in different limbic brain regions was carried out. These measurements were combined with immunohistochemical estimation of GABAergic cell subpopulations in the dorsal hippocampus and amygdala. In Tph2-/- mice GABA concentrations were increased exclusively in the dorsal hippocampus. In heterozygous Tph2+/- mice concentrations of GABA were increased in the amygdala compared to Tph2-/- and wt control mice, while the reverse was found in the prefrontal cortex. The changes in GABA concentrations were accompanied by altered cell density of GABAergic neurons within the basolateral complex of the amygdala and parvalbumin (PV) neurons of the dorsal hippocampus and by adaptational changes of 5-HT receptors. Thus, adaptive changes during the development on the GABA system may reflect altered anxiety-like and depressive-like behavior in adulthood. Moreover, chronic mild stress (CMS) rescues the depressive-like effects induced by 5-HT deficiency. In contrast, 5-HT is important in mediating an increased innate anxiety-like behavior under CMS conditions. This is in line with a proposed dual role of 5-HT acting through different mechanisms on anxiety and depressive-like behavior, which is influenced by gene-environment interaction effects. Further research is needed to disentangle these complex networks in the future. N2 - Genomweite Assoziationsstudien in Kombination mit bildgebenden Studien zeigten, dass eine verringerte Funktion der Tryptophanhydroxylase-2 (Tph2) eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie von Angststörungen und Depression spielt. Jedoch sind die einer Angststörung oder Depression zugrundeliegenden genauen Mechanismen noch nicht verstanden. Um den Einfluss einer 5-HT Defizienz zu untersuchen, wurden Tph2 ablatierte (Tph2-/-) Mäuse mittels zielgerichteter Mutagenese generiert. Der Verlust des Tph2 Gens hatte interessanterweise keinen Einfluss auf die Entwicklung vormals serotonerger Neurone und das Überleben der Tiere. In vorherigen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass 5-HT das GABAerge System, welches in der Pathophysiologie von Angststörungen eine zentrale Rolle spielt, in seiner Entwicklung beeinflusst. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit in verschiedenen Gehirnregionen des limbischen Systems Konzentrationen von GABA gemessen. Außerdem wurden mittels immunhistologischer Untersuchungen die Auswirkungen einer 5-HT Defizienz auf GABAerge Neuronenpopulationen hin untersucht. In Tph2-/- Mäusen wurden erhöhte Konzentrationen im Vergleich zu Tph2+/- und wt Kontrollen von GABA im Hippocampus festgestellt. In der Amygdala zeigten die Tph2+/- Mäuse dagegen eine erhöhte Konzentration von GABA. Dieser Effekt auf Tph2+/- Mäuse war umgekehrt im PFC Kortex zu finden, der erniedrigte GABA Konzentrationen in Tph2+/- aufwies. Die Veränderungen auf der neurochemischen Ebene wurden begleitet von veränderten GABAergen Zelldichten im basolateralen Komplex der Amygdala und parvalbuminergen GABAergen Neuronen in der CA3 Region des dorsalen hippocampus. Zudem waren 5-HT1A Rezeptoren und ihre Signalwege hochreguliert. Es scheint, dass der Verlust von 5-HT adaptive Veränderungen in der Entwicklung auf das GABAerge System zur Folge hat und die Basis für verändertes angstähnliches und depressionsähnliches Verhalten im Erwachsenenalter darstellt. Zusätzlich scheint eine 5-HT Defizienz den depressiven Phänotyp im Porsolt Test auszugleichen. Demgegenüber scheint 5-HT wichtig für ein erhöhtes angstähnliches Verhalten unter CMS Bedingungen zu sein. Dies unterstützt die Hypothese einer Doppelrolle von 5-HT innerhalb von Signalwegen und Mechanismen des angst- und depressionsähnlichem Verhalten, die durch Umweltfaktoren wie Stress stark beeinflusst werden. Um den Patienten noch besser helfen zu können erfordert dies in der Zukunft weiterhin eine fundierte Entschlüsselung der dahinter verborgenen Mechanismen. KW - Knockout KW - Serotonin KW - Maus KW - Knockout-Maus KW - GABA KW - serotonin deficiency KW - GABA KW - knockout-mice Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74565 ER - TY - THES A1 - Englberger, Eva T1 - Gene regulation in hearts of Hey-mutant mouse embryos and monitoring of sub-cellular Hey1 distribution T1 - Genregulation in Herzen Hey-mutierter Mausembryonen und Darstellung der sub-zellulären Verteilung von Hey1 N2 - Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus. N2 - Am Embryonaltag 14,5 zeigten Herzproben von Hey2-KO-Mäusen eine deutliche Hochregulation mehrerer Gene, die auf das Fehlen von Hey2 zurückzuführen ist, da Kontroll-Tiere gezeigt haben, dass die morphologischen Veränderungen in der Herzstruktur keinen Einfluss auf die Genregulation haben. Vereinzelt wurden die regulierten Gene noch mittels in situ Hybridisierung weiter verdeutlicht. In Immunfloureszenzexperimenten wurde Hey1 im Zellkern lokalisiert. Auf Proteinebene zeigte sich allerdings auch ein Vorhandensein von Hey1 im Cytoplasma der Zellen. Die Kernlokalisaiton von Hey1 veränderte sich während des gesamten Zellzykluses nicht und wurde auch nicht durch die Co-Expression von CaMKII beeinflusst oder die Inhibition oder Stimulation anderer Signalwege in der Zelle. Hey1 scheint nicht mit den Kerntransportproteinen Importin-alpha und -beta zu interagieren, so dass weiterhin nach einem Kernimport-System für Hey1 gesucht werden muss. KW - Maus KW - Herz KW - Embryonalentwicklung KW - Genregulation KW - Herzentwicklung KW - Kerntransport KW - Hey KW - heart development KW - nuclear transport Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73395 ER - TY - JOUR A1 - Kraft, P. A1 - Schwarz, T. A1 - Pochet, L. A1 - Stoll, G. A1 - Kleinschnitz, Christoph T1 - COU254, a specific 3-carboxamide-coumarin inhibitor of coagulation factor XII, does not protect mice from acute ischemic stroke N2 - Background: Anticoagulation is an important means to prevent from acute ischemic stroke but is associated with a significant risk of severe hemorrhages. Previous studies have shown that blood coagulation factor XII (FXII)- deficient mice are protected from pathological thrombus formation during cerebral ischemia without bearing an increased bleeding tendency. Hence, pharmacological blockade of FXII might be a promising and safe approach to prevent acute ischemic stroke and possibly other thromboembolic disorders but pharmacological inhibitors selective over FXII are still lacking. In the present study we investigated the efficacy of COU254, a novel nonpeptidic 3-carboxamide-coumarin that selectively blocks FXII activity, on stroke development and post stroke functional outcome in mice. Methods: C57Bl/6 mice were treated with COU254 (40 mg/kg i.p.) or vehicle and subjected to 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) using the intraluminal filament method. After 24 h infarct volumes were determined from 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride(TTC)-stained brain sections and functional scores were assessed. Hematoxylin and eosin (H&E) staining was used to estimate the extent of neuronal cell damage. Thrombus formation within the infarcted brain areas was analyzed by immunoblot. Results: Infarct volumes and functional outcomes on day 1 after tMCAO did not significantly differ between COU254 pre-treated mice or untreated controls (p > 0.05). Histology revealed extensive ischemic neuronal damage regularly including the cortex and the basal ganglia in both groups. COU254 treatment did not prevent intracerebral fibrin(ogen) formation. Conclusions: COU254 at the given concentration of 40 mg/kg failed to demonstrate efficacy in acute ischemic stroke in this preliminary study. Further preclinical evaluation of 3-carboxamide-coumarins is needed before the antithrombotic potential of this novel class of FXII inhibitors can be finally judged. KW - Schlaganfall KW - Maus KW - COU254 Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68103 ER - TY - THES A1 - Rathod, Reenaben Jagdishbhai T1 - Study of local protein synthesis in growth cones of embryonic mouse motor neurons T1 - Analyse der lokalen Proteinsynthese in Wachstumskegeln von embryonalen Maus Motoneuronen N2 - In cultured motoneurons of a mouse model for the motoneuron disease spinal muscular atrophy (SMA), reduced levels of the protein SMN (survival of motoneurons) cause defects in axonal growth. This correlates with reduced β-actin mRNA and protein in growth cones, indicating that anterograde transport and local translation of β-actin mRNA are crucial for motoneuron function. However, direct evidence that indeed local translation is a physiological phenomenon in growth cones of motoneurons was missing. Here, a lentiviral GFP-based reporter construct was established to monitor local protein synthesis of β-actin mRNA. Time-lapse imaging of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in living motoneurons revealed that β-actin is locally translated in the growth cones of embryonic motoneurons. Interestingly, local translation of the β-actin reporter construct was differentially regulated by different laminin isoforms, indicating that laminins provide extracellular cues for the regulation of local translation in growth cones. Notably, local translation of β-actin mRNA was deregulated when motoneurons of a mouse model for type I SMA (Smn-/-; SMN2) were analyzed. In situ hybridization revealed reduced levels of β-actin mRNA in the axons of Smn-/-; SMN2 motoneurons. The distribution of the β-actin mRNA was not modified by different laminin isoforms as revealed by in situ hybridization against the mRNA of the eGFP encoding element of the β-actin reporter. In case of the mRNA of α-actin and γ-actin isoforms, the endogenous mRNA did not localize to the axons and the localization pattern was not affected by the SMN levels expressed in the cell. Taken together our findings suggest that regulation of local translation of β-actin in growth cones of motoneurons critically depends on laminin signaling and the amount of SMN protein. Embryonic stem cell (ESC)-derived motoneurons are an excellent in vitro system to sort out biochemical and cellular pathways which are defective in neurodegenerative diseases like SMA. Here, a protocol for the differentiation and antibody-mediated enrichment of ESC-derived motoneurons is presented, which was optimized during the course of this study. Notably, this study contributes the production and purification of highly active recombinant sonic hedgehog (Shh), which was needed for the efficient differentiation of mouse ESCs to motoneurons. ESC-derived motoneurons will now offer high amounts of cellular material to allow the biochemical identification of disease-relevant molecular components involved in regulated local protein synthesis in axons and growth cones of motoneurons. N2 - In kultivierten Motoneuronen eines Maus-Models für die Motoneuronen-Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA) verursachen verminderte Mengen des Proteins SMN (survival of motoneurons) Schäden im axonalen Wachstum. Dies korreliert mit einer verminderten Menge an β-Aktin kodierender mRNA und β-Aktin Protein. Dies impliziert, dass anterograder Transport und lokale Translation von β-Aktin mRNA für die Motoneuronfunktion notwendig ist. Bislang gab es jedoch keinen direkten Nachweiß funktioneller lokaler Translation in Wachstumskegeln von Motoneuronen. In dieser Arbeit wurde ein lentivirales GFP-basierendes Reporterkonstrukt etabliert, welches lokale Proteinsynthese von β-Aktin mRNA nachweißt. Zeitraffermikroskopie von GFP-vermittelter Fluoerszenzregeneration nach Fotobleichung (fluorescence recovery after photobleaching; FRAP) in lebenden Motoneuronen zeigte, dass β-Aktin in Wachstumskegeln embryonaler Motoneuronen lokal translatiert wird. Interessanterweise wurde die lokale Translation des β-Aktin Reporterkonstrukts differentiell durch verschiedene Laminin-Isoformen reguliert. Dies gibt einen Hinweis, dass Laminin als extrazelluläres Signalmolekül die Regulation der lokalen Translation in Wachstumskegeln reguliert. Die lokale Translation von β-Aktin mRNA war dereguliert wenn Motoneurone eines Mausmodels für die Typ I SMA (Smn-/-;SMN2) analysiert wurden. In situ Hybridisierung bestätigte eine Reduktion von β-Aktin mRNA in den Axonen von Smn-/-;SMN2 Motoneuronen. Die Verteilung der β-Aktin mRNA wurde von verschiedenen Laminin-Isoformen nicht beeinflusst, wie durch in situ Hybridisierung gegen eGFP kodierende Elemente des β-Aktin Reporters bestätigt werden konnte. Im Fall der mRNA für α-Aktin und γ-Aktin Isoformen wurde keine axonale Lokalisierung der endogenen mRNAs festgestellt und das Lokalisierungsmuster dieser mRNAs war durch reduzierte zelluläre SMN Mengen nicht beeinflusst. Zusammenfassend deuten diese Befunde darauf hin, dass die lokale Translation von β-Aktin in Wachstumskegeln von Motoneuronen von Laminin-Signalgebung und von der Menge an SMN Protein abhängt. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen sind ein etabliertes in vitro System um biochemische und zelluläre Signalwege zu identifizieren, die in neurodegenerativen Erkrankungen wie SMA betroffen sind. Hier wird ein Protokoll zur Differenzierung und Antikörper-gestützten Anreicherung von Motoneuron aus embryonalen Stammzellen präsentiert, welches im Rahmen dieser Arbeit optimiert wurde. Im Besonderen wird die Herstellung und Reinigung von hochaktivem Sonic Hedgehog (Shh) vorgestellt, welches für die effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus notwendig war. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen werden in zukünftigen Studien nun große Mengen an zellulärem Material liefern, und somit auf biochemischer Ebene die Identifizierung von krankheitsrelevanten molekularen Komponenten ermöglichen, die in der Regulation der lokalen Proteinsynthese in Axonen und Wachstumskegeln von Motoneuronen involviert sind. KW - Motoneuron KW - Maus KW - Embryo KW - Proteinsynthese KW - lokale Proteinsynthese KW - embryonale Maus KW - SMN KW - local translation KW - SMN KW - motor neuron KW - beta actin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72045 ER - TY - THES A1 - Reuter, Dajana T1 - Einfluss der Immunkompetenz auf die Etablierung und den Verlauf persistierender viraler Infektionen des zentralen Nervensystems (im Tiermodell Maus/Masernvirus) T1 - Influence of the immune competence on the establishment of persistent viral infections of the central nervous system N2 - Zu den gefährlichen Komplikationen der Masern gehört die selten vorkommende ZNS-Erkrankung subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), die erst mehrere Jahre nach einer akuten Masernvirusinfektion auftritt. Die SSPE verläuft immer tödlich und bis heute gibt es keine spezifische Therapie gegen diese Erkrankung. Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell für eine persistierende, virale ZNS-Infektion entwickelt, in dem 2-Wochen-alte, immunologisch normale C57BL/6-Mäuse mit einem rekombinanten, neurotropen Masernvirus (MV), das das Hämagglutinin eines an Nagern angepassten MV-Stammes enthält, intrazerebral (i.c.) infiziert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle regulatorischer CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen (Treg) in diesem Mausmodell analysiert und untersucht, ob die persistierende ZNS-Infektion durch Manipulation peripherer Treg beeinflusst werden kann. Außerdem wurde ein IFN-y-ELISPOT-Assay etabliert, der CD8+ zytotoxische T-Zellen (CTL) identifiziert, die spezifisch für die MV-Hämagglutinin-Epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) bzw. MVH446-454 (SNHNNVYWL) sind. In Bezug auf das erstgenannte Epitop wurde desweiteren eine Pentamer-Färbung etabliert, um CTLs mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu identifizieren, die H-2Db-gekoppelte MV-H22-30-Epitope erkennen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass sich trotz eines hohen Anteils Masern-spezifischer CTLs und nur sehr wenigen Treg im Gehirn eine persistierende ZNSInfektion ausbildet. Periphere Treg wurden während der persistierenden Phase der ZNS-Infektion expandiert bzw. depletiert und die Konsequenzen für die Virus-spezifische Immunantwort sowie das Ausmaß der persistierenden Infektion wurden analysiert. Die Expansion von Treg mit Hilfe des superagonistischen anti-Maus CD28 Antikörpers D665 verursachte eine transiente Immunsuppression, die die Virus-Replikation sowie -Ausbreitung im Gehirn verstärkte. Im Gegensatz dazu führte die Depletion von Treg in DEREG-Mäusen mittels Diphtherietoxin zu einem erhöhten Anteil Virus-spezifischer CTLs im Gehirn sowie zu einer Reduktion der persistierenden ZNS-Infektion. Diese Daten zeigen, dass Treg die Fähigkeit besitzen, die Persistenz von MV im Gehirn zu kontrollieren und somit möglicherweise Teil eines Therapiekonzeptes gegen ZNS-Infektionen mit dem Masernvirus sein können. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe haben außerdem gezeigt, dass das durch IFN-y induzierbare Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) antivirale Aktivitäten gegen MV aufweist. Dies wurde in dieser Doktorarbeit in vivo in unserem Mausmodell anhand von IDOk.o.-Tieren bestätigt, die nach i.c. Infektion nicht nur eine erhöhte Mortalitätsrate aufwiesen sondern auch in den überlebenden Tieren eine verstärkte persistierende ZNS-Infektion zeigten. N2 - Among the serious complications following a measles virus infection is the CNS disease subacute sclerosing panencephalitis (SSPE), which occurs very late after acute measles and always leads to death within a few years. Unfortunately, there is no specific therapy available till today. Our group earlier established a model of a persistent viral CNS infection using two week old immunologically normal mice and a recombinant neurotropic MV expressing the hemagglutinin of the rodent brain-adapted MV strain CAM/RB. Using this model infection we investigated the role of regulatory CD4+CD25+ Foxp3+ T cells (Treg) as regulators of the immune response in the brain, and assessed whether the persistent CNS infection can be modulated by manipulation of Treg in the periphery. We also established an IFN-y-ELISPOT assay to identify CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) specific for the MV hemagglutinin epitopes MV-H22-30 (RIVINREHL) and MV-H446-454 (SNHNNVYWL). With respect to the first epitope (MV-H22-30) we also established pentamer staining identifying CTLs recognising this epitope linked to H-2Db molecules via FACS analyses. Our results show that in spite of a high number of MV-specific CTLs and only a few Treg in the brain a persistent infection is established. Treg were expanded or depleted during the persistent phase of the CNS infection, and the consequences for the virus-specific immune response and the extent of persistent infection were analyzed. Expansion of Treg after intraperitoneal application of the superagonistic mouse anti-mouse CD28 monoclonal antibody D665 inducing transient immunosuppression caused increased virus replication and spread in the CNS. In contrast, depletion of Treg using diphtheria toxin (DT) in DEREG (depletion of regulatory T cells)-mice induced an increase of virus-specific CTLs in the brain and caused a reduction of the persistent infection. These data indicate that Treg have the capacity to control MV persistence in the CNS which recommend them to be considered as a strategy to combat human MV CNS diseases. Previous studies in our group also showed an anti-MV activity of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an IFN-y inducible enzyme, which was confirmed in this work using IDO knock-out mice resulting in increased decease after intracerebral infection and enhanced persistent CNS infection in surviving animals compared to wild type mice. KW - Masernvirus KW - Zentralnervensystem KW - Maus KW - Subakute Krankheit KW - T-Lymphozyt KW - regulatorische T-Zellen KW - Foxp3 KW - regulatory T cells KW - Foxp3 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71437 ER - TY - THES A1 - Zanucco, Emanuele T1 - Role of oncogenic and wild type B-RAF in mouse lung tumor models T1 - Untersuchungen zur Rolle der onkogenen und wildtypischen B-RAF Kinase in Lungentumormodellen der Maus N2 - Von Wachstumsfaktoren regulierte Signalkaskaden sind Schlüsselelemente in der Gewebeentwicklung und Geweberegeneration. Eine Deregulation dieser Kaskaden führt zu Entwicklungsstörungen und neoplastischen Krankheiten. Für viele humane Krebsformen sind aktivierende Mutationen der Kinasen der RAF Familie verantwortlich. Das erste Projekt dieser Doktorarbeit fokussiert auf der Rolle des B-RAF V600E, welches als eine der am häufigsten vorkommenden Mutantionen in humanen Krebszellen identifiziert worden ist. Um die onkogene Funktion des B-RAF V600E zu untersuchen, haben wir transgene Mauslinien hergestellt, welche das aktivierte Onkogen spezifisch in alveolaren Lungenepithelzellen des Typ II exprimieren. Konstitutive Expression des B-RAF V600E führte zu einer abnormen alveolaren Epithelzellbildung und zu Emphysem-ähnlichen Läsionen. Diese Läsionen wiesen Zeichen einer Gewebsumstrukturierung auf, oft in Assoziation mit chronischer Inflammation und geringer Inzidenz von Lungentumoren. Die Infiltration der entzündlichen Zellen erfolgte erst nach der Entstehung von Emphysem-ähnlichen Läsionen und könnte zur späteren Tumorbildung beigetragen haben. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, in welchem der kontinuierliche regenerative Prozess eine tumorfördernde Umgebung schafft. Dabei induziert die Aktivität des onkogenen B-RAF eine alveolare Störung, welche ursächlich verantwortlich ist für den kontinuierlichen regenerativen Prozess. Das zweite Projekt fokussiert auf die Rolle von endogenem (wildtypischen) B-RAF in einem durch onkogenes C-RAF induzierten Maus Lungentumormodell. Für unsere Untersuchungen haben wir eine Mauslinie geschaffen, in welcher B-RAF in den C-RAF Lungentumoren konditionell eliminiert werden kann. Eine konditionelle Eliminierung des B-RAF hat die Entstehung von Lungentumoren nicht blockiert, aber zu reduziertem Tumorwachstum geführt. Dieses reduzierte Tumorwachstum konnte auf eine reduzierte Zellproliferation zurückgeführt werden. Außerdem konnten wir durch die B-RAF Elimination eine Reduktion der Intensität der mitogenen Signalkaskade beobachten. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das onkogene Potential von C-RAF in vivo unabhängig von B-RAF ist und eine Kooperation von B-RAF und C-RAF jedoch für die vollständige Aktivierung der mitogenen Signalkaskade wichtig ist. N2 - Growth factor induced signaling cascades are key regulatory elements in tissue development, maintenance and regeneration. Deregulation of the cascades has severe consequences, leading to developmental disorders and neoplastic diseases. As a major function in signal transduction, activating mutations in RAF family kinases are the cause of many human cancers. In the first project described in this thesis we focused on B-RAF V600E that has been identified as the most prevalent B-RAF mutant in human cancer. In order to address the oncogenic function of B-RAF V600E, we have generated transgenic mice expressing the activated oncogene specifically in lung alveolar epithelial type II cells. Constitutive expression of B-RAF V600E caused abnormalities in alveolar epithelium formation that led to airspace enlargements. These lung lesions showed signs of tissue remodeling and were often associated with chronic inflammation and low incidence of lung tumors. Inflammatory cell infiltration did not precede the formation of emphysema-like lesions but was rather accompanied with late tumor development. These data support a model where the continuous regenerative process initiated by oncogenic B-RAF-driven alveolar disruption provides a tumor-promoting environment associated with chronic inflammation. In the second project we focused on wild type B-RAF and its role in an oncogenic-C-RAF driven mouse lung tumor model. Toward this aim we have generated compound mice in which we could conditionally deplete B-RAF in oncogenic-C-RAF driven lung tumors. Conditional elimination of B-RAF did not block lung tumor formation however led to reduced tumor growth. The diminished tumor growth was not caused by increased cell death instead was a consequence of reduced cell proliferation. Moreover, B-RAF ablation caused a reduction in the amplitude of the mitogenic signalling cascade. These data indicate that in vivo B-RAF is dispensable for the oncogenic potential of active C-RAF; however it cooperates with oncogenic C-RAF in the activation of the mitogenic cascade. KW - Lungenkrebs KW - Biochemie KW - Maus KW - Lung cancer KW - RAF Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69603 ER - TY - JOUR A1 - Schramm, Sabine A1 - Fraune, Johanna A1 - Naumann, Ronald A1 - Hernandez-Hernandez, Abrahan A1 - Höög, Christer A1 - Cooke, Howard J. A1 - Alsheimer, Manfred A1 - Benavente, Ricardo T1 - A Novel Mouse Synaptonemal Complex Protein Is Essential for Loading of Central Element Proteins, Recombination, and Fertility N2 - The synaptonemal complex (SC) is a proteinaceous, meiosis-specific structure that is highly conserved in evolution. During meiosis, the SC mediates synapsis of homologous chromosomes. It is essential for proper recombination and segregation of homologous chromosomes, and therefore for genome haploidization. Mutations in human SC genes can cause infertility. In order to gain a better understanding of the process of SC assembly in a model system that would be relevant for humans, we are investigating meiosis in mice. Here, we report on a newly identified component of the murine SC, which we named SYCE3. SYCE3 is strongly conserved among mammals and localizes to the central element (CE) of the SC. By generating a Syce3 knockout mouse, we found that SYCE3 is required for fertility in both sexes. Loss of SYCE3 blocks synapsis initiation and results in meiotic arrest. In the absence of SYCE3, initiation of meiotic recombination appears to be normal, but its progression is severely impaired resulting in complete absence of MLH1 foci, which are presumed markers of crossovers in wild-type meiocytes. In the process of SC assembly, SYCE3 is required downstream of transverse filament protein SYCP1, but upstream of the other previously described CE–specific proteins. We conclude that SYCE3 enables chromosome loading of the other CE–specific proteins, which in turn would promote synapsis between homologous chromosomes. KW - Maus KW - Genetik KW - Cytologie Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68895 ER - TY - JOUR A1 - Kreissl, Michael C. A1 - Stout, David B. A1 - Wong, Koon-Pong A1 - Wu, Hsiao-Ming A1 - Caglayan, Evren A1 - Ladno, Waldemar A1 - Zhang, Xiaoli A1 - Prior, John A1 - Reiners, Christoph A1 - Huang, Sung-Cheng A1 - Schelbert, Heinrich R. T1 - Influence of Dietary Interventions and Insulin on Myocardial, Skeletal Muscle and Brain [18F]-Fluorodeoxyglucose Kinetics in Mice N2 - Background: We evaluated the effect of insulin stimulation and dietary changes on myocardial, skeletal muscle and brain [18F]-fluorodeoxyglucose (FDG) kinetics and uptake in vivo in intact mice. Methods: Mice were anesthetized with isoflurane and imaged under different conditions: non-fasted (n = 7; "controls"), non-fasted with insulin (2 IU/kg body weight) injected subcutaneously immediately prior to FDG (n = 6), fasted (n = 5), and fasted with insulin injection (n = 5). A 60-min small-animal PET with serial blood sampling and kinetic modeling was performed. Results: We found comparable FDG standardized uptake values (SUVs) in myocardium in the non-fasted controls and non-fasted-insulin injected group (SUV 45-60 min, 9.58 ± 1.62 vs. 9.98 ± 2.44; p = 0.74), a lower myocardial SUV was noted in the fasted group (3.48 ± 1.73; p < 0.001). In contrast, the FDG uptake rate constant (Ki) for myocardium increased significantly by 47% in non-fasted mice by insulin (13.4 ± 3.9 ml/min/100 g vs. 19.8 ± 3.3 ml/min/100 g; p = 0.030); in fasted mice, a lower myocardial Ki as compared to controls was observed (3.3 ± 1.9 ml/min/100 g; p < 0.001). Skeletal muscle SUVs and Ki values were increased by insulin independent of dietary state, whereas in the brain, those parameters were not influenced by fasting or administration of insulin. Fasting led to a reduction in glucose metabolic rate in the myocardium (19.41 ± 5.39 vs. 3.26 ± 1.97 mg/min/100 g; p < 0.001), the skeletal muscle (1.06 ± 0.34 vs. 0.34 ± 0.08 mg/min/100 g; p = 0.001) but not the brain (3.21 ± 0.53 vs. 2.85 ± 0.25 mg/min/100 g; p = 0.19). Conclusions: Changes in organ SUVs, uptake rate constants and metabolic rates induced by fasting and insulin administration as observed in intact mice by small-animal PET imaging are consistent with those observed in isolated heart/muscle preparations and, more importantly, in vivo studies in larger animals and in humans. When assessing the effect of insulin on the myocardial glucose metabolism of non-fasted mice, it is not sufficient to just calculate the SUV - dynamic imaging with kinetic modeling is necessary. KW - Insulin KW - Gehirn KW - Skelettmuskel KW - Maus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68775 ER - TY - THES A1 - Erxleben, Franziska T1 - cDNA-Microarray-Analyse von ZNS-Kaliumkanal defizienten Mäusen T1 - cDNA-Microarry-Analysis of CNS-potassium channel deficient mice N2 - Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können. N2 - The aims of this dissertation were the creation of a „potassium channel chip“, the development of adequate measurement method and strategy of analysis, the performance of developmental experiments and the analysis of the status of genexpression and the occurring mechanisms of compensation in a knockout mouse stem. In beginning the selection of the potassium channel genes to be considered as interesting part of the microarray and the compilation of the sequence information was the main part of the work. Starting from this the choice of the adequate cDNA-microarray-technology and the preparation of the implementation was possible. The first experiments performed in the course of the method development have given a hint on the problems connected with every microarray. However they also have shown the great possibilities of the microarray technology. In the ollowing series of measurements like the investigation of variation of expression during the juvenile development and the comparison of different parts of the brain with the whole brain were performed. The studies were completed by the investigation of the TRESK-Knockout mouse stem in comparison to its wild type. The centre of these studies was the question for possible mechanisms of compensation. As a result kcnk16 - being part of the same gene family as TRESK - can be named as an interesting candidate to be investigated for its function and capacity of compensation in the future. In my dissertation I was able to show that the microarray technology is an adequate method for the comparison of genexpression between members of ion channel families. The bases of the microarray analysis of potassium channels with a individually designed microarray are on the one side the knowledge of the genetics and function of the potassium channels and on the other side the technology which allows this kind of analysis. The fact that mammalian organism like mouse and human have developed such a great number of potassium channels and are using these in the regular cell metabolism in a comprehensive way shows the importance of this ion channel family and makes the research on these channels so interesting and important for fundamental research. A multiplicity of diseases can be attributed indirectly or directly to gene malfunctions in potassium channels. With microarray a technology is available, which permits to investigate the expression of these genes directly and to discover possible ways of compensation. By this coherences can be identified being the basis for continuative research which one day will make it possible to really understand and treat diseases like depression. KW - Maus KW - Knockout KW - Kaliumkanal KW - Zentralnervensystem KW - Microarray KW - DNS-Chip KW - Knock-out Maus KW - TRESK KW - Zentralnervensystem KW - Hirnzelle KW - Ionenkanal KW - Spannungskontrollierter Ionenkanal KW - Differentielle Genexpression KW - Potassium channel KW - Microarray KW - CNS KW - Genexpression KW - Knock out Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65640 ER - TY - THES A1 - Göb, Eva T1 - Die Kernhülle in Keimzellen: Strukturelle Besonderheiten, dynamische Prozesse und die Umgestaltung des Zellkerns während der Spermatogenese der Maus T1 - The nuclear envelope in germ cells: structural peculiarities, dynamic processes und the reorganization of the cell nucleus during murine spermatogenesis N2 - Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten. N2 - The nuclear envelope is a double membranous structure enclosing the most typical eukaryotic feature, the cell nucleus. It is composed of an inner and an outer nuclear membrane as well as a nucleoplasmic lamina which is closely connected to the inner nuclear membrane by a number of associated proteins. Thus, besides just separating nuclear and cytoplasmic structures the nuclear envelope is functionally involved in many regulatory processes; i.e. controlling of the genomic activity, nucleo- and cytoplasmic signal transduction and, importantly, nuclear positioning and maintenance of nuclear architecture. Evidence emerges that the nuclear envelope also plays a fundamental role in the differentiation process of germ cells, gametogenesis, likely being responsible for yet unexplained human infertility. In order to expand the knowledge concerning impact and functions of the nuclear envelope for the mammalian germ line selected components and special characteristics of the germ cell nuclear envelope have been investigated in this thesis. Thus, this might help to understand germ line specific dynamic, morphological and other essential processes - particularly in course of meiotic and postmeiotic differentiation in male mice. Of great interest was lamin C2, a meiosis-specific A-type lamin essential for accurate meiosis and fertility of male mice. It has been shown that the targeted depletion of lamin C2 results in a severely defective meiosis and consequently in complete male infertility. Lamin C2-deficient male mice exhibit serious defects concerning pairing and synapsis of the homologous chromosomes. Thus, these mice are characterized by apoptotic spermatocytes and the complete absence of postmeiotic stages. It has been proposed that telomere movements along the nuclear periphery during prophase I might promote homologous but prevent heterologous chromosome association. Lamin C2 in turn is suggested to facilitate those meiotic telomere migrations by providing local flexibility to the telomeres attached to the nuclear envelope. Given that loss of lamin C2 causes decelerated telomere movements and defective homologous pairing afterwards, the situation in lamin C2-deficient spermatocytes could be explained. Another central focus was the investigation of potential LINC complexes in differentiating and morphologically reorganizing postmeiotic cells. LINC complexes are proteinaceous structures formed by SUN-proteins at the inner and nesprins at the outer nuclear membrane that tether the cell nucleus to the surrounding cytoskeleton. Since this structural property is suggested to influence nuclear morphology and shaping, LINC complexes appear to be good candidates for participating in mammalian sperm head shaping. Detailed analysis of LINC complex components relevant for spermiogenesis revealed that two novel uniquely assembled LINC complexes are established in the male post meiotic germ line. Moreover, those LINC complexes were shown to polarize to opposite cell poles in differentiating spermatids probably linking to specialized cytoskeletal elements. Therefore, a model for the LINC complex mediated shaping and elongation of the mammalian sperm head has been proposed in this thesis. Together, the functional analysis of lamin C2 as well as the identification of novel LINC complexes described in this thesis substantiates the fundamental role of the nuclear envelope for entire spermatogenesis. KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Maus KW - Meiose KW - meiosis KW - spermiogenesis KW - nuclear envelope KW - lamina KW - LINC complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56839 ER - TY - THES A1 - Herold, Volker T1 - In vivo MR-Mikroskopie am kardiovaskulären System der Maus T1 - In vivo MR-microscopy of the murine cardiovascular system N2 - Als Tiermodell ist die Maus aus der pharmazeutischen Grundlagenforschung nicht mehr wegzudenken. Aus diesem Grund nimmt besonders die Verfügbarkeit nicht invasiver Diagnoseverfahren für dieses Tiermodell einen sehr hohen Stellenwert ein. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von in vivo MR-Untersuchungsmethoden zur Charakterisierung des kardiovaskulären Systems der Maus. Neben der morphologischen Bildgebung wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Quantifizierung funktioneller Parameter der arteriellen Gefäße wie auch des Herzens gelegt. Durch Implementieren einer PC-Cine-Sequenz mit dreidimensionaler Bewegungskodierung war es möglich, die Charakteristik der Bewegung des gesamten Myokards zu untersuchen. Die Aufnahme von Bewegungsvektoren für jeden Bildpunkt und die Bestimmung des Torsionswinkels innerhalb der Messschichten konnte die systolische Kontraktion als dreidimensionale Wringbewegung des Herzens bestätigen. Um die Qualität der morphologischen Gefäßbildgebung zu verbessern, sollte untersucht werden, inwieweit bestehende Verfahren zur Gefäßwanddarstellung optimiert werden können. Implementieren einer Multi-Schicht-Multi-Spin-Echo-Sequenz an einem 17,6 Tesla Spektrometer erlaubte durch das hohe B0-Feld einen deutlichen Signalgewinn. Erstmals wurde es möglich, die gesunde Gefäßwand darzustellen und so morphologische Veränderungen in einem möglichst frühen Zustand zu untersuchen. Neben der Untersuchung morphologischer Veränderungen sollte vor allem ein Schwerpunkt auf das Studium funktioneller Parameter der Gefäßwand gelegt werden. Dazu wurde in einem ersten Schritt mit einem PC-Cine-Verfahren die Umfangsdehnung in ihrem zeitlichen Verlauf ermittelt. Dabei zeigte sich, dass im Laufe einer arteriosklerotischen Plaqueprogression eine Änderung der Umfangsdehnung vor einer Änderung morphologischer Parameter beobachtet werden kann. Deshalb war es Ziel, im Verlauf dieser Arbeit weitere Verfahren zur Charakterisierung funktioneller Parameter des Gefäßsystems zu entwickeln. Um direkt Elastizitätsparameter ermitteln zu können, fehlt als Bezugsgröße der arterielle Pulsdruck (AP). Die Lösung der inkompressiblen Navier-Stokes-Gleichungen unter Anwendung der Lang-Wellen-Näherung und der Näherung für große Pulswellengeschwindigkeiten (PWV) erlaubte die Bestimmung der komplexen Impedanz und somit des arteriellen Pulsdrucks in der Frequenzdomäne. Dadurch war es möglich, den dynamischen Anteil des arteriellen Druckpulses direkt aus einer Messung der Pulswellengeschwindigkeit sowie aus dem Verlauf des Flusspulses zu bestimmen. Zur Ermittlung des AP muss die Pulswellengeschwindigkeit bestimmt werden. Für die MR-Bildgebung in murinen Gefäßen waren hierzu bisher keine Verfahren verfügbar. Da sich die Gefäßdehnung möglicherweise als Indikator für eine frühe Wandveränderung bei der Plaqueprogression zeigt, bestand ein großes Interesse in der Untersuchung von spezifischen gefäßmechanischen Eigenschaften wie beispielsweise der PWV. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei MR-Methoden für die nicht invasive Bildgebung in der Maus entwickelt werden, die es ermöglichten, die lokale und die regionale Pulswellengeschwindigkeit zu bestimmen. Die Messung der lokalen Pulswellengeschwindigkeit beruht dabei auf der zeitaufgelösten Bestimmung der Gefäßwanddehnung sowie des Blutvolumenflusses. Zur Bestimmung der regionalen Pulswellengeschwindigkeit wurde eine Erweiterung der Zwei-Punkt-Transit-Zeit-Methode verwendet. Durch zeitaufgelöste bewegungskodierte Bildgebung entlang der Aorta konnte anhand von 30 Stützpunkten die Propagation des arteriellen Flusspulses vermessen werden. Die Messzeit gegenüber einer Zwei-Punkt-Methode ließ sich dadurch halbieren. Gleichzeitig bietet die Auswertung von 30 Messpunkten eine größere Sicherheit in der Bestimmung der PWV. Beide Methoden wurden an einem elastischen Gefäßphantom validiert. In vivo Tierstudien an apoE(−/−)-Mäusen und einer Kontrollgruppe zeigten für beide Methoden eine gute Übereinstimmung. Darüber hinaus konnte ein Ansteigen der Pulswellengeschwindigkeit in apoE(−/−)-Mäusen durch arteriosklerotische Veränderungen nachgewiesen werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit grundlegende Verfahren zur Untersuchung des kardiovaskulären Systems der Maus optimiert und entwickelt. Die Vielseitigkeit der MR-Bildgebung ermöglichte dabei die Erfassung von morphologischen und funktionellen Parametern. In Kombination können die beschriebenen Methoden als hilfreiche Werkzeuge für die pharmakologische Grundlagenforschung zur Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Erkankungen in Mausmodellen eingesetzt werden. N2 - The mouse model is considered as an essential animal model for the basic research in pharmacology. Therefore, the availability of non-invasive diagnostic methods for this species has gained important significance. The objective of this study was the development of methods to investigate the characteristics of the cardio-vascular system of mice with MR-technology. In addition to morphological imaging, the study was focused on the quantification of functional parameters of the arterial system as well as the mouse heart. By implementing a PC-Cine-sequence with three-dimensional motion encoding simultaneously with two dimensional spatial encoding, the comprehensive motion encoded datasets provided the access to motion patterns of the entire myocardium. It could be shown that the movement of the murine myocardium during systole is equivalent to a three-dimensional wring movement. To improve the quality of morphological imaging, this study also focused on the optimization of established methods visualizing the arterial wall. Implementing a multi-slice-multi-spin-(MSME)-echo method at 17.6 T allowed for a significant improvement of the SNR due to the high B0-field. For the first time the healthy vessel wall could thus be imaged; enabling the investigation of morphological changes at an early state of the atherosclerotic disease. In addition to the investigation of morphological changes, this paper was focused on the study of functional parameters of the arterial vessel wall. For that purpose, a PC-Cine-method was applied to determine the time course of the circumferential strain. The interim results thereby revealed that during atherosclerotic plaque progression, changes of the circumferential strain precede significant changes of the arterial wall thickness. These findings indicated the potential superiority of functional parameters over morphological properties and have motivated the development of further methods characterizing different functional parameters of the vessel wall. To calculate direct parameters of the vessel wall elasticity the according arterial pulse pressure (AP) is needed. Therefore the solution of the incompressible Navier-Stokes equations was applied using the long-wave approximation and the assumption of a high pulse wave velocity (PWV) compared to the blood flow velocity. Thus the complex impedance could be calculated enabling the computation of the pressure pulse in the frequency domain. The dynamic fraction of the arterial pulse pressure could be calculated by directly measuring the PWV and the time course of the blood flow velocity. To determine the AP the pulse wave velocity has to be known. Since no MR-methods were available for that purpose, two different approaches to calculate the PWV with MR methods were established in the course of this study. The two different approaches to estimate the PWV in the murine aorta allow the determination of the local PWV at a predefined location along the propagation pathway and the estimation of the regional PWV as the averaged value along a certain vessel wall segment. The measurement of the local pulse wave velocity is based on the time-resolved acquisition of the vessel wall strain and the blood volume flow. Both parameters were accessible by using a PC-Cine-sequence incorporating a specific acquisition scheme to sample the time-dependant data at a temporal resolution of 1000 frames per second. To determine the regional PWV an improvement of the two-point-transit-time method was implemented. By using time-resolved motion encoding along the propagation pathway 30 different interpolation points could be used to identify the respective starting time of the systolic pulse wave. Compared to the conventional two-point-measurement scheme, the total measurement time could thus be halved. Additionally, the use of 30 interpolation points significantly increased the accuracy of the calculation of the pulse wave velocity. Both methods were validated using an elastic vessel wall phantom. In vivo experiments with apoE(−/−)-mice and wild-type animals showed a good correlation between both methods. For the apoE(−/−)-mice an increase of the PWV could be identified when compared to the control group. In summary, this study provides the development and the optimization of MR-applications to investigate the cardiovascular system of mice. Measurements of functional parameters in combination with the study of morphological parameters can serve as a helpful tool for pharmacological research. KW - Maus KW - Kardiovaskuläres System KW - NMR-Bildgebung KW - NMR-Tomographie KW - MR-imaging KW - cardiovascular system KW - mice Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54253 ER - TY - THES A1 - Parczyk, Marco T1 - In vivo NMR-methods to study effects of atherosclerosis in mice T1 - In vivo NMR-Methoden zur Untersuchung von atherosklerotischen Veränderungen an Mäusen N2 - Background Transgenic mouse models are increasingly used to study the pathophysiology of human cardiovascular diseases. The aortic pulse wave velocity (PWV) is an indirect measure for vascular stiffness and a marker for cardiovascular risk. Results This work presents three MR-methods that allow the determination of the PWV in the descending murine aorta by analyzing blood flow waveforms, arterial distension waveforms, and a method that uses the combination of flow and distension waveforms. Systolic flow pulses were recorded with a temporal resolution of 1 ms applying phase velocity encoding. In a first step, the MR methods were validated by pressure waveform measurements on pulsatile elastic vessel phantoms. In a second step, the MR methods were applied to measure PWVs in a group of five eight-month-old apolipoprotein E deficient (ApoE(-/-)) mice and an age matched group of four C57Bl/6J mice. The ApoE(-/-) group had a higher mean PWV than the C57Bl/6J group. Depending on the measurement technique, the differences were or were not statistically significant. Conclusions The findings of this study demonstrate that high field MRI is applicable to non-invasively determine and distinguish PWVs in the arterial system of healthy and diseased groups of mice. N2 - Hintergrund Transgene Mausmodelle werden zunehmend für Studien der Pathophysiologie humaner Kardiovaskulärer Erkrankungen herangezogen. Die aortale Pulswellengeschwindigkeit ist ein indirektes Maß für die Gefäßsteifigkeit und ein Messparameter für kardiovaskulares Risiko. Ergebnisse Diese Arbeit präsentiert drei MR-Methoden, welche die Bestimmung der Pulswellengeschwindigkeit in der absteigenden murinen Aorta durch die Analyse von Fluss- und Dehnungswellen und durch eine Kombination beider Techniken ermöglicht. Systoliche Flusspulse wurden durch Phasendifferenzbildgebung mit einer Zeitauflösung von 1 ms aufgenommen. In einem ersten Schritt wurden die MR-Methoden durch druckkathetermessungen an einem pulsatilen elastischen Gefäßphantom validiert. In einem zweiten Schritt wurden die MR-Methoden angewendet, um die Pulswellengeschwindigkeit in einer Gruppe aus fünf acht Monate alten atherosklerotischen und einer gleichalterigen Gruppe aus vier gesunden Mäusen zu messen. Die atherosklerotische Gruppe hatte eine höhere mittlere Pulswellengeschwindigkeit als die gesunden Tiere. Abhängig von der Messmethode waren die Unterschiede signifikannt, oder nicht signifikant. Schlussfolgerung Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen die Möglichkeit der Messung der arteriellen Pulswellengeschwindigkeit an Mäusen mittels Hochfeld-MRI und die Unterscheidbarkeit gesunder und atherosklerotischer Tiergruppen. KW - Arteriosklerose KW - NMR-Tomographie KW - Maus KW - Pulswellengeschwindigkeit KW - Transitzeitmethode KW - QA-Methode KW - Pulswelle KW - Bauchaorta KW - Brustaorta KW - atherosclerosis KW - pulswave velocity KW - mouse KW - high field MRI Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53302 ER - TY - THES A1 - Grünig, Sebastian T1 - Vergleich zwischen physiologisch vs. pathologischer linksventrikulärer Hypertrophie - Eine Studie an drei Mausmodellen T1 - Relation between physiological vs. pathological left ventricular hypertrophy - A study on three mouse models N2 - Herzerkrankungen sind die Haupttodesursache in den westlichen Nationen. Unter den Herzerkrankungen spielt die linksventrikuläre Hypertrophie mit Entwicklung einer Herzinsuffizienz eine tragende Rolle. In der gängigen Praxis ist es schwierig ein durch körperliches Training physiologisch hypertrophiertes Herz von einem pathologisch hypertrophierten Herz zu unterscheiden. Da sich immer mehr Menschen einem intensiven körperlichen Training unterziehen, hat die Differentialdiagnose im klinischen Alltag erhebliche therapeutische Konsequenzen. Noch herrscht Unklarheit darüber, ob eine physiologische Herzhypertrophie per se nicht auch pathologisch ist. In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Mausmodelle der linksventrikulären Hypertrophie miteinander verglichen: 1. Pathologische Herzhypertrophie durch chronisch adrenergen Streß, bedingt durch 15 fache Überexpression des kardialen ß1- Adrenorezeptor 2. Pathologische Herzhypertrophie durch chronische Druckbelastung mittels Aortenkonstriktion (Aortenbanding) 3. Physiologische Herzhypertrophie durch Lauftraining in einem Käfiginternen Laufrad. Wir konnten zeigen, dass es bei beiden Formen der linksventrikulären Hypertrophie einerseits zu einer signifikanten Kardiomyozytenhypertrophie kommt, sich beim Vergleich mit den pathologischen Formen der Herzhypertrophie bei der physiologischen Form aber andererseits keine signifikanten Veränderungen der volumetrischen Parameter zeigen. Bei den pathologischen Formen der Herzhypertrophie kommt es zu einer interstitiellen Fibrose, die durch Erhöhung der Wandsteifigkeit zu einer Einschränkung der diastolischen Relaxation (dp/dtmin) und systolischen Kontraktion (dp/dtmax) des linken Ventrikels führt. Unsere Studie unterstreicht zudem die Hypothese, dass die Hypertrophie des Sportlers einen physiologischen Anpassungsmechanismus an eine chronische oder intermittierende Druckbelastung darstellt, wenn auch die linksventrikuläre Hypertrophie für sich alleine ein wichtiger Prädiktor für kardiale Ereignisse ist. N2 - The aim of this study was to show the relation between physiological and pathological left ventricular hypertrophy. Therefore we used three mouse models of left ventricular hypertrophy. We could show, that physiological left ventricular hypertrophy illustrates an adjustment to the chronical or intermittent exposure, whether left ventricular hypertrophy illustrates an independent predictor on cardiovascular events. KW - Herzhypertrophie KW - Maus KW - NMR-Tomographie KW - Left ventricular hypertrophy KW - NMR-tomography KW - mice Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48103 ER - TY - THES A1 - Henig, Kristina Miriam T1 - Einfluss verschiedener Knochenmarkszellpopulationen auf linksventrikuläres Remodeling nach Myokardinfarkt T1 - Impact of different bone marrow cell preparations on left ventricular remodeling after myocardial infarction N2 - Knochenmarksstammzellen werden als mögliche Zellquelle zur Verbesserung kardialer Funktion nach Myokardinfarkt angesehen. Um die Rolle und das Potential verschiedener Knochenmarkszellpopulationen auf das linksventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt weiter zu untersuchen, wurde auf das Maus-Infarkt-Modell zurückgegriffen. Nach experimentellem Myokardinfarkt durch Ligation der vorderen absteigenden Koronararterie erfolgte entweder die intramyokardiale Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen oder einer mit Vorläufer- (Lin-) bzw. reifen (Lin+) Zellen angereicherten Knochenmarkszellsubpopulation. Obgleich mit keiner Zellpopulation entscheidend Einfluss auf Überlebensrate und Infarktgröße genommen werden konnte, zeigte sich eine signifikante Verbesserung des linksventrikulären Remodelings nach Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen, welche hingegen durch Behandlung mit Lin- oder Lin+ Zellen ausblieb. Gemessen wurde dies einerseits auf molekularer Ebene, wo der linksventrikuläre Hypertrophiemarker, bestehend aus betaMHC/alphaMHC-Ratio signifikant gesenkt werden konnte, andererseits auf echokardiographischer Ebene, wo sich eine signifikante Verminderung linksventrikulärer Dilatation nachweisen ließ. Da sich die untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich in vitro gemessener Zytokinexpressionslevel teilweise erheblich unterschieden, müssen die beobachteten Resultate im Zusammenhang mit stattgefundener parakrine Zytokinsekretion gesehen werden. N2 - Bone marrow stem cells are considered as a promising cell source to improve cardiac function after myocardial infarction. To further investigate the role and potential of different bone marrow cell preparations on left ventricular remodelling we employed the mouse-infarct-model. After induction of myocardial infarction through ligation of the left descending coronary artery, mice were treated either with intramyocardial injection of unfractionated bone marrow cells, progenitor-enriched (Lin-) or mature (Lin+) cells.Although none of the cell populations showed a pronounced influence on survival rate or infarct size, there was a significant amelioration of left ventricular remodelling after injection of unfractionated bone marrow cells, which could not be accomplished by treatment with Lin- or Lin+ cells. This effect was measured both on molecular basis, where the left ventricular hypertrophie marker, consisting of the betaMHC/alphaMHC-ratio was significantly decreased, and on echocardiographic basis, where a significant reduction of left ventricular dilatation was demonstrated. Considering the substantial differences in in-vitro measured cytokine-levels observed in the investigated cell populations, the results shown could potentially be attributed to paracrine secretion of cytokines. KW - Herzinfarkt KW - Knochenmarkzelle KW - Cytokine KW - Herzerweiterung KW - Herzhypertrophie KW - Adulte Stammzelle KW - Blutstammzelle KW - Remodeling KW - Maus KW - remodelling KW - myocardial KW - infarction KW - bone KW - marrow Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46521 ER - TY - THES A1 - Hochgräfe, Katja T1 - Cre-loxP based mouse models to study prionpathogenesis in the motor nervous system N2 - Prion diseases such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal neurodegenerative disorders characterized by brain lesions and the accumulation of a disease-associated protein, designated PrPSc. How prions proceed to damage neurons and whether all or only subsets of neurons have to be affected for the onset of the clinical disease is still elusive. The manifestation of clinical prion disease is characterized by motor dysfunctions, dementia and death. Furthermore loss of motor neurons (MN) in the spinal cord is a constant finding in different mouse models of prion disease, suggesting that MN are vulnerable cells for triggering the onset of clinical symptoms. To determine whether the protection of MN against prion induced dysfunctions is an approach for holding the disease at the sub-clinical level, we established a novel conditional model for Cre-mediated expression of a dominant-negative PrP mutant (PrPQ167R) in the cells of interest. Dominant-negative PrP mutants provide protection of prion induced dysfunctions by inhibiting prion replication. Transgenic mice were generated carrying a floxed LacZ marker gene followed by the coding sequence of PrPQ167R under control of the human ubiquitin C promoter. Two Cre strains have been used to direct PrPQ167R expression either to a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or to various neuronal cell populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were infected with mouse-adapted prions via different inoculation routes (intranerval, intracerebral and intraperitoneal) and monitored for effects on incubation time and pathology. Tg floxed LacZ-PrPQ167R/NF-L-Cre mice showed about 15% prolonged survival upon intraperitoneal low dose prion infection, whereas survival of Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre mice was comparable to control littermates. The results suggest that the protection of spinal MN prolongs the incubation period but is not sufficient to completely inhibit clinical prion disease. In a second approach, Cre was transferred into the hind limb muscles of transgenic mice via a double-stranded adeno-associated virus vector (dsAAV2-Cre). The goal of this strategy was to target a broader cell population and thus to enhance expression levels of protective PrPQ167R in the spinal cord of Tg floxed-LacZ-PrPQ167R mice. After intramuscular (i.m.) application of dsAAV2-Cre, exhibiting a physical titer of 5x1010 GP/ml, recombinant transgenic DNA was detected only in the muscle tissue, pointing out that functional Cre-recombinase was expressed at the side of virus application. However, dsAAV2-Cre did neither induce recombination of transgenic DNA in the spinal cord or brain nor expression of dominant-negative PrPQ167R. In conclusion the dsAAV2-Cre vectors system needs further improvement to achieve efficient transport from muscle tissue to the central nervous system (CNS). 105 7 SUMMARY The lymphoreticular system (LRS) is an early site of prion replication. In splenic tissue prion infectivity is associated with follicular dendritic cells (FDC) as well as with Band T-lymphocytes. However, it is still unknown if those cell types are able to replicate the infectious agent or if other PrP-expressing cell types are engaged. To investigate if neurons and in particular MN are involved, transgenic mice carrying one allele of floxed Prnp (lox2+=��) and either one allele of Hb9-Cre or NF-L-Cre were generated on a Prnp0=0 background. Therefore a conditional PrP knockout was established in a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or in various neuronal populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were inoculated with prions to study the accumulation of PrPSc and prion infectivity in spleen and spinal cord at an early time point after infection. The findings show that PrPSc accumulation in mice with MN-specific PrP depletion (lox2+=��/ Hb9-Cre) was comparable to control littermates, while pan-neuronal PrP deficient mice (lox2+=��/NF-L-Cre) were not able to accumulate PrPSc in splenic tissue until 50 days post inoculation. Moreover spleens of lox2+=��/NF-L-Cre mice exhibited a clearly reduced prion infectivity titer, suggesting that accumulation of prions in the spleen is dependent on PrP expression in the nervous tissue. N2 - Prionenerkrankungen, wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind letale, neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Typische Merkmale der Erkrankung sind neben Neuronenverlust die Akkumulation des mit der Krankheit assoziierten Proteins PrPSc im Gehirn infizierter Individuen. Wie die Akkumulation von Prionen zu Neurodegeneration führt und welche Regionen des ZNS für die klinische Erkrankung verantwortlich sind, ist bisher unbekannt. Charakteristische, klinische Symptome von Prionenkrankheiten sind motorische Störungen sowie Demenz in einem späten Stadium der Erkrankung. Außerdem ist der Verlust von Motoneuronen (MN) im Rückenmark ein konstanter Befund im Tiermodell, was eine Rolle des motorischen Nervensystems bei der Prionpathogenese vermuten lässt. In dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, ob der Schutz von MN vor Prionen induzierten Dysfunktionen den Ausbruch der klinischen Erkrankung verzögern kann. Dazu wurde ein konditionales Mausmodell mit Cre-induzierbarer Expression einer dom- inant-negativen PrP-Mutante (PrPQ167R) hergestellt. Dominant-negative PrP Mutanten schützen vor Prionen induzierten Schädigungen, indem sie die Replikation von Prionen inhibieren. Das Transgen besteht aus dem humanen Ubiquitin C Promoter, einem „gefloxten” LacZ Markergen und der kodierenden Sequenz von PrPQ167R. Die Kreuzung von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen mit der Hb9-Cre Linie bewirkt eine MNspezifische Expression von PrPQ167R im Rückenmark, während das Einkreuzen eines NF-L-Cre Allels die Expression von PrPQ167R in den meisten Neuronen des Rückenmarks sowie in verschiedenen motorischen Kerngebieten des Gehirns zur Folge hat. Transgenen Mäuse wurden auf verschiedenen Routen (intranerval, intrazerebral und intraperitoneal) mit Maus-adaptierten Prionen infiziert und der Effekt von PrPQ167R auf die Inkubationszeit und Pathologie der Tiere untersucht. Während Tg floxed LacZPrP Q167R/NF-L-Cre Mäuse eine um 15% verlängerte Inkubationszeit aufwiesen, war bei Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre Mäusen kein Überlebensvorteil zu beobachten. Somit verlängert der Schutz von MN des Rückenmarks zwar die Inkubationszeit, ist aber nicht ausreichend, um den klinischen Ausbruch der Erkrankung zu verhindern. Um eine größere Zellpopulation im Rückenmark von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen und so eine stärkere Expression von PrPQ167R zu erreichen, wurde ein viraler Gentransfer von Cre-Rekombinase durchgeführt. Dazu wurden doppelsträngige, Creexprimierende Adeno-assoziierte Virus Vektoren (dsAAV2-Cre) bilateral in die Muskulatur der Hinterbeine von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen injiziert. Die Applikation von dsAAV2-Cre, mit einem physikalischen Virus-Titer von 5x1010 GP/ml, führte ausschließlich im Muskelgewebe zur Expression von enzymatisch aktiver Cre-Rekombinase und folglich zur Rekombination der transgenen DNA. Im Rücken- 107 8 ZUSAMMENFASSUNG mark oder Gehirn war keine rekombinante DNA detektierbar. Auch auf Protein-Ebene konnte die Expression von PrPQ167R weder im Muskel noch im Rückenmark oder Gehirn nachgewiesen werden. Um den Transport von dsAAV2-Cre vom Applikationsort bis in das ZNS zu gewährleisten und Cre stabil zu exprimieren, ist demnach eine weitere Optimierung des dsAAV2-Cre Vektorsystems notwendig. Prionen replizieren im lymphoretikulären System (LRS) bereits in einem frühen Stadium der Erkrankung. In der Milz ist Prionen-Infektiosität in follikulär dendritischen Zellen (FDC) sowie in B- und T-Lymphozyten lokalisiert. Ob noch andere PrP exprimierende Zellen an der Prionen-Replikation im LRS beteiligt sind, ist unklar. Um die Beteiligung von Neuronen und MN an der Akkumulation von Prionen im LRS zu untersuchen, wurden transgene, neuronal PrP defiziente Mäuse generiert. Ein Neuronen-spezifischer bzw. MN-spezifischer Knockout von PrP wurde durch Kreuzung von transgenen lox2+=�� Mäusen, welche ein „gefloxtes“ Prnp Allel Prnp auf einem Prnp0=0 Hintergrund tragen, mit NF-L-Cre oder Hb9-Cre Mäusen erreicht. Nach Prionen-Infektion von lox2+=��/NF-L-Cre und lox2+=��/Hb9-Cre Mäusen wurde die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz und im Rückenmark am Tag 50 nach der Infektion analysiert. Während die Replikation von PrPSc in der Milz von Mäusen mit MN-spezifischem PrP Knockout (lox2+=��/Hb9-Cre) nicht beeinträchtigt war, war in pan-neuronal PrP defizienten Mäusen (lox2+=��/NF-L-Cre) keine Akkumulation von PrPSc nachweisbar. Zudem war die Prionen-Infektiosität in der Milz von lox2+=��/NF-L-Cre Mäusen deutlich reduziert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz abhängig von neuronaler PrP Expression ist. KW - Prionkrankheit KW - Pathogenese KW - Maus KW - Motoneuron KW - Prion KW - pathogenesis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45967 ER - TY - THES A1 - Kriegebaum, Claudia T1 - Spatio-temporal Expression Patterns of the Serotonin Synthesis Enzymes TPH1 and TPH2 and Effects of Acute Stress T1 - Regional-zeitliche Expressionsmuster der beiden Serotoninsynthese-Enzyme TPH1 und TPH2 und Effekte durch akuten Stress N2 - Several lines of evidence implicate a dysregulation of tryptophan hydroxylase (TPH)-dependent serotonin (5-HT) synthesis in emotions and stress and point to their potential relevance to the etiology and pathogenesis of various neuropsychiatric disorders. However, the differential expression pattern of the two isoforms TPH1 and TPH2 which encode two forms of the rate-limiting enzyme of 5-HT synthesis is controversial. Here, a comprehensive spatio-temporal analysis clarifies TPH1 and TPH2 expression during pre- and postnatal development of the mouse brain and in adult human brain as well as in peripheral organs including the pineal gland. Four different methods (real time PCR, in situ hybridization, immunohistochemistry and Western blot analysis) were performed to systematically control for tissue-, species- and isoform-specific expression on both the pre- and posttranslational level. TPH2 expression was consistently detected in the raphe nuclei, as well as in fibres in the deep pineal gland and in the gastrointestinal tract. Although TPH1 expression was found in these peripheral tissues, no significant TPH1 expression was detected in the brain, neither during murine development, nor in mouse and human adult brain. Also under conditions like stress and clearing the tissue from blood cells, no changes in expression levels were detectable. Furthermore, the reuptake of 5-HT into the presynaptic neuron by the serotonin transporter (SERT) is the major mechanism terminating the neurotransmitter signal. Thus, mice with a deletion in the Sert gene (Sert KO mice) provide an adequate model for human affective disorders to study lifelong modified 5-HT homeostasis in interaction with stressful life events. To further explore the role of TPH isoforms, Tph1 and Tph2 expression was studied in the raphe nuclei of Sert deficient mice under normal conditions as well as following exposure to acute immobilization stress. Interestingly, no statistically significant changes in expression were detected. Moreover, in comparison to Tph2, no relevant Tph1 expression was detected in the brain independent from genotype, gender and treatment confirming expression in data from native animals. Raphe neurons of a brain-specific Tph2 conditional knockout (cKO) model were completely devoid of Tph2-positive neurons and consequently 5-HT in the brain, with no compensatory activation of Tph1 expression. In addition, a time-specific Tph2 inducible (i) KO mouse provides a brain-specific knockdown model during adult life, resulting in a highly reduced number of Tph2-positive cells and 5-HT in the brain. Intriguingly, expression studies detected no obvious alteration in expression of 5-HT system-associated genes in these brain-specific Tph2 knockout and knockdown models. The findings on the one hand confirm the specificity of Tph2 in brain 5-HT synthesis across the lifespan and on the other hand indicate that neither developmental nor adult Tph2-dependent 5-HT synthesis is required for normal formation of the serotonergic system, although Tph1 does not compensate for the lack of 5-HT in the brain of Tph2 KO models. A further aim of this thesis was to investigate the expression of the neuropeptide oxytocin, which is primarily produced in the hypothalamus and released for instance in response to stimulation of 5-HT and selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Oxytocin acts as a neuromodulator within the central nervous system (CNS) and is critically involved in mediating pain modulation, anxiolytic-like effects and decrease of stress response, thereby reducing the risk for emotional disorders. In this study, the expression levels of oxytocin in different brain regions of interest (cortex, hippocampus, amygdala, hypothalamus and raphe nuclei) from female and male wildtype (WT) and Sert KO mice with or without exposure to acute immobilization stress were investigated. Results showed significantly higher expression levels of oxytocin in brain regions which are involved in the regulation of emotional stimuli (amygdala and hippocampus) of stressed male WT mice, whereas male Sert KO as well as female WT and Sert KO mice lack these stress-induced changes. These findings are in accordance with the hypothesis of oxytocin being necessary for protection against stress, depressive mood and anxiety but suggest gender-dependent differences. The lack of altered oxytocin expression in Sert KO mice also indicates a modulation of the oxytocin response by the serotonergic system and provides novel research perspectives with respect to altered response of Sert KO mice to stress and anxiety inducing stimuli. N2 - Durch zahlreiche Untersuchungen ist belegt, dass eine gestörte Tryptophan-Hydroxylase (TPH)-abhängige Serotonin (5-HT)-Synthese an einer veränderten emotionalen Reaktion sowie einer veränderten Stress-Antwort beteiligt ist und damit auch in der Ätiologie und Pathogenese psychischer Erkrankungen eine Rolle spielt. Dennoch werden nach wie vor die unterschiedlichen Expressionsmuster der beiden Isoformen TPH1 und TPH2, die für zwei Formen des Schrittmacherenzyms der 5-HT-Synthese kodieren, kontrovers diskutiert. Zentrales Anliegen dieser Arbeit ist daher eine Klärung der TPH1- und TPH2-Expression während der prä- und postnatalen Entwicklung des murinen Gehirns, sowie im adulten humanen Gehirn und in einigen peripheren Organen und der Zirbeldrüse. Durch die Verwendung von vier verschiedenen Methoden (Real time-PCR, In situ-Hybridisierung, Immunhistochemie und Westernblot-Analysen) wurde systematisch die Gewebs- und Isoform-spezifische Expression in Maus und Mensch auf prä- und posttranslationaler Ebene nachgewiesen. TPH2-Expression wurde Spezies-übergreifend in den Raphe-Kernen des Hirnstamms wie auch in Fasern zur Zirbeldrüse und im Gastrointestinaltrakt detektiert. Auch TPH1 konnte in diesen peripheren Organen (die Zirbeldrüse eingeschlossen) nachgewiesen werden, jedoch fand sich keine signifikante TPH1-Expression im Gehirn, weder während der Entwicklung des Maus-Gehirns noch im humanen und murinen adulten Gehirn. Auch durch veränderte Bedingungen wie der Entfernung von Blutzellen aus dem Gewebe oder der Anwendung von akutem Immobilisierungsstress konnte keine Änderung der Expression gemessen werden. Sert Knockout-Mäuse, stellen ein geeignetes Tiermodell für affektive Erkrankungen dar, insbesondere um eine lebenslang veränderte 5-HT-Homöostase in Verbindung mit belastenden Lebensereignissen zu untersuchen. Um die Bedeutung der TPH-Isoformen und deren korrekte Expression weiter zu untersuchen, wurde die Tph1- und Tph2-Expression in den Raphe-Kernen von Sert Knockout (KO)-Mäusen unter normalen Bedingungen und nach akutem Stress getestet. Interessanterweise konnten keine statistisch signifikanten Expressionsänderungen entdeckt werden. Mehr noch, relativ zu Tph2 konnte unabhängig von Behandlung, Geschlecht oder Genotyp keine relevante Tph1-Expression im Gehirn gemessen werden, was wiederum die Expressionsdaten aus nativen Tieren unterstützt. Die Raphe-Neurone eines Gehirn-spezifischen konditionalen Tph2 KO-Modells zeigten weder Tph2-positive Zellen noch 5-HT, wiesen aber auch keine kompensatorische Aktivierung der Tph1-Expression im Gehirn auf. Zusätzlich repräsentiert eine zeit-spezifische, induzierbare KO-Maus ein Gehirn-spezifisches Tph2 Knockdown-Modell ab dem Erwachsenenalter, das eine stark reduzierte Anzahl an Tph2-positiven Zellen und 5-HT im Gehirn aufweist. Expressionsuntersuchungen zeigten interessanterweise, dass diese Gehirn-spezifischen Tph2 Knockout- und Knockdown-Modelle keine sichtliche Änderung in der Expression von 5-HT-System-assoziierten Genen aufweisen. Diese Ergebnisse bestätigen zum einen, dass die 5-HT-Synthese im murinen Gehirn während der kompletten Lebensspanne ausschließlich durch Tph2 katalysiert wird und weisen außerdem darauf hin, dass eine Tph2-abhängige 5-HT-Synthese weder während der Entwicklung noch im Erwachsenalter für die Ausbildung eines normalen serotonergen Systems benötigt wird, obwohl Tph1 den Verlust des 5-HT-Vorkommens im Gehirn der Tph2 KO-Mäuse nicht kompensiert. Weiterhin beschäftigt sich diese Arbeit mit der Expression von Oxytocin, das hauptsächlich im Hypothalamus produziert. Oxytocin ist maßgeblich bei Angst-lösenden Effekten sowie einer verringerten Stressantwort beteiligt. In dieser Studie wurde die Expression von Oxytocin in verschiedenen Gehirnregionen (Cortex, Hippocampus, Amygdala, Hypothalamus und Raphe Nuclei) von weiblichen und männlichen Wildtyp- (WT) und Sert KO-Mäusen getestet, die entweder unter normalen Bedingungen gehalten wurden oder eine Stunde lang akutem Immobilisierungsstress ausgesetzt waren. Die Ergebnisse zeigten eine signifikant höhere Oxytocin-Expression in Gehirnregionen, die für die emotionale Reizverarbeitung zuständig sind (Amygdala und Hippocampus) in gestressten männlichen WT-Mäusen, während männliche Sert KO-Mäuse sowie weibliche WT- und Sert KO-Mäuse diese Stress-bedingten Unterschiede nicht aufwiesen. Diese Befunde sind im Einklang mit der Hypothese, dass Oxytocin eine schützende Rolle bei Stress, depressiver Stimmung und Angst übernimmt, weisen jedoch auf einen Geschlechterunterschied hin. Ferner legt das Fehlen einer veränderten Oxytocin-Expression in Sert KO-Mäusen eine Modulation der Oxytocin-Expression durch das serotonerge System nahe, was neue Forschungsperspektiven über eine veränderte Reaktion auf Stress und Angst-auslösende Reize in Sert KO-Mäusen eröffnet. KW - Serotonin KW - Neurotransmitter KW - Chemische Synthese KW - Stress KW - Enzym KW - Genexpression KW - Maus KW - serotonin KW - mouse KW - acute stress KW - gene expression KW - enzymatic synthesis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40839 ER - TY - THES A1 - Meyer, Klaus T1 - Erhöhte Anfälligkeit von Creatinkinase-defizienten Mausherzen gegenüber Ischämie und Reperfusionschaden bei veränderter Calcium-Homöostase T1 - Creatine Kinase-Deficient Hearts exhibit Increased Susceptibility to Ischemia/Reperfusion Injury and Impaired Calcium Homeostasis N2 - Durch die Konzeption des Versuchsaufbaus und der Wahl der Komponenten konnte die aktuelle Arbeit an intakten isolierten Mäuseherzen zeigen, dass unter weitgehend physiologischen in-vitro-Bedingungen die Möglichkeit besteht, mit Hilfe des Biolumineszenzproteins Aequorin Messungen der intrazytoplasmatischen Ca2+- Konzentration während eines einzelnen Herzschlages mit einer Frequenz von 420 Schlägen pro Minute zu gewinnen und diese gleichzeitig in die linksventrikuläre Funktion integrieren zu können. Das wesentliche Ergebnis dieser Arbeit ist dabei, dass während moderater Arbeitsbelastung der Verlust eines effizienten CK-Systems transgener CK-defizienter- Herzen (CKM/Mito-/) hinsichtlich des intramyokardialem Calciumstoffwechsels und der linksventrikulären Funktion durch Adaptionsmechanismen offensichtlich gut kompensiert wird. Allerdings wird in Situationen des Ungleichgewichtes zwischen Energieversorgung und Energieverbrauch, ausgelöst durch Ischämie und anschließende Reperfusion, eine signifikante Verschlechterung der linksventrikulären Funktion und gleichzeitig der Ca2+-Homöostase sichtbar, was einen weiteren Beweis für die enge Beziehung zwischen myokardialer Energetik und des Ca2+-Haushaltes insbesondere in CK-defizienten Herzen unter metabolischem Stress darstellt. Schließlich zeigt die simultane Aufzeichnung des Ca2+-Signals und die Druckentwicklung des linken Ventrikels, dass es schon vor der Entwicklung der ischämischen Kontraktur zur intrazytoplasmatischen Veränderung der Ca2+-Homöostase kommt, die durch eine unzureichende Bereitstellung durch ATP ausgelöst wird und maßgeblich durch das Fehlen eines effizienten Energietransportsystem in Form der Kreatinkinase bedingt sein könnte. N2 - In conclusion, the present study demonstrates that, during moderate workload, loss of an efficient CK system in transgenic CK deficient hearts is well compensated by adaptational mechanisms. However, during more pronounced mismatches in energy supply and demand, such as induced by ischemia/reperfusion injury, significant alterations in LV performance and Ca2+ homeostasis become unmasked, providing further evidence for a key function of an intact CK system for maintenance of calcium homeostasis under metabolic stress conditions. KW - Kreatin Kinase KW - Calcium KW - Aequorin KW - Ischämie KW - Maus KW - Herz KW - Kreatin Kinase KW - Calcium KW - Aequorin KW - Ischämie KW - Maus KW - Herz KW - creatin kinase KW - calcium KW - mouse KW - ischemia KW - heart Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35015 ER - TY - THES A1 - Kampfinger, Katja T1 - Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen T1 - Evidence of a mismatch repair deficiency in L5178Y Tk+/--3.7.2C mouse lymphoma cells N2 - Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann. N2 - The development and approval of pharmaceuticals as well as the evaluation of xenobiotics require several test systems for the detection of genotoxicity. There is a number of established genotoxicity test systems, which are often based on cancer cell lines. In addition to mutations that are essential for genotoxicity testing, cancer cell lines may also carry mutations that might cause reactions not occurring in the primary cells of the organism. Therefore the knowledge of the genetic background of the cell line used is important for the evaluation of test results and the subsequent genotoxicity risk assessment. Among test systems that are based on cancer cells the mouse lymphoma cell line L5178Y adopts a very prominent position due to its worldwide application for genotoxicity testing. The dissertation on hand provides evidence that there are mutations in the L5178Y cell line that are related to the mismatch-repair system (MMR system). MMR participates in safeguarding the genomic integrity. In MMR-proficient cells, DNA defects that arise during replication, homologous recombination or as a result of genotoxic effects are either recognized and repaired or the genetically altered cells are eliminated by induction of apoptosis. MMR-deficient cells, however, survive despite serious DNA defects and accumulate them. The accumulation of DNA damage as result of treatment with alkylating agents had been observed in L5178Y cells while other cell lines had reacted with an induction of apoptosis. The induction of apoptosis after treatment with alkylating agents is described in the literature as a typical behaviour for MMR-deficient cells. From this the hypothesis was established, that L5178Y-cells might exhibit a MMR-deficient phenotype. This MMR-deficient phenotype was proven by selective treatment of L5178Y cells and cells with known MMR status with the alkylating agent MNNG followed by the subsequent comparison of the different reactions. The comparison was carried out by the detection of genotoxic effects using the micronucleus test and the comet assay. On the protein level there was not an indication that the observed MMR-deficiency was related to the the three most important MMR-proteins MSH2, MLH1 and MSH6: All proteins demonstrated expression levels that were comparable to the levels of the MMR-proficient control cells. On the DNA level, however, several mutations were detected by sequence analysis of the coding regions of all genes known to be involved in MMR. The most important among these mutations was an insertion mutation (964(insC)) in pms2, that caused a frameshift after 260 amino acids. By this frameshift, a stop-codon was introduced, leading to an interruption of the sequence after 313 amino acids. While the information of the N-terminal region of pms2 containing the DNA-binding domain as well as the ATPase active sites is still present, the information of the C-terminus is lost. This region is responsible for the dimerisation with the MMR-protein MLH1. Therefore, the MMR-function that is due to this complex, is missing. In conclusion, a MMR-deficiency of L5178Y cells was demonstrated. This MMR-deficiency is explained by an insertion-mutation in pms2 (964(insC)). Consideration of this MMR-deficiency enhances the meaningfulness of the evaluation of test results with L5178Y mouse lymphoma cells in risk assessment. KW - Maus KW - Zelle KW - L5178Y-Zellen KW - MMR-Reparatur KW - pms2 KW - Genotoxizität KW - Alkylantien KW - L5178Y cells KW - mismatch repair KW - pms2 KW - genotoxicity KW - alkylating agent Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023 ER - TY - THES A1 - Afify, Samar T1 - Drug targeting delivery systems for treatment of Raf-1 induced lung tumors in mice T1 - Trägersystem der Medikamente für Raf1- induzierte Lungentumor in Mäusen anzuzielen N2 - The aim of the present study was to design different dosage forms as carrier systems to deliver sorafenib to the lung of BXB-23 transgenic mice using different routes of administration. Three dosage forms were used one of them was an oil-in-water emulsion and the oral route was chosen for this experiment. The other delivery system was a liposome preparation for intratracheal instillation. In this case the oral route was considered as a control experiment. The last dosage form was PLGA microspheres. Before sorafenib administration it was important to develop a HPLC method to assess sorafenib absorption after its administration and to determine its concentrations in mouse serum. The HPLC method allowed sorafenib quantification in small volumes (30 µl) of mouse serum and tissues. The developed HPLC method was validated resulting in satisfactory selectivity, good linearity, good accuracy and precision over the concentration range examined. Sorafenib was successfully incorporated in a fat emulsion (o/w) using a traditional method resulting in a white homogenous emulsion and no particle aggregation was observed. Sorafenib exhibited antitumor activity on the lung adenoma in BXB-23 transgenic mice when administered orally (2 mg sorafenib per mouse) in the emulsion preparation. The determined effect was an approximately 29 % reduction in the tumor area of the adenoma foci and a proliferation reduction. In order to improve the pharmacological effects of sorafenib on the lung adenoma in BXB-23 mice, the targeting of sorafenib directly to the site of action (the lung) was an attractive concept. For this purpose the intratracheal route was used. Since sorafenib administration by instillation required incorporation of sorafenib in a dosage form suitable for its lipophilic nature, a liposome suspension was the second dosage form used. A lyophilization method was employed for sorafenib liposome preparation utilizing dilauroylphosphatidylcholine (DLPC) which is safe and tolerable for the lung. Incorporation of sorafenib in the liposomes did not influence the particle size and its distribution. The sorafenib liposomes showed high encapsulation efficiency, good stability at 4 °C for one month and satisfactory in vitro release properties and inhibited Raf-1 mediated activation of ERK in cell culture assay. In a pharmacokinetic experiment sorafenib loaded liposomes were instilled directly into the lung. The results revealed that a significant level of sorafenib was achieved in the lung tissues after 2 hours and then reduced after 48 h and remained nearly constant for one week. On the other hand, only traces of sorafenib were found in the mice serum up to 48 h. Subsequently, the pharmacological activity of sorafenib (1 mg per mouse) was studied when delivered in a liposomal suspension intratracheally to treat the lung adenoma of BXB-23 mice. The data of this experiment demonstrated that sorafenib intratracheal instillation resulted in a reduction of tumor area of adenoma foci (67 %) and an elevation of the percent of apoptotic cells. In contrast, prolongation of the treatment period did not further enhance sorafenib activity on the lung adenoma. This previous finding suggested a development of multidrug resistance (MDR) by the adenoma foci cells against sorafenib instillation, which was examined by immunohistochemistry staining. The percent of MDR positive cells was higher after two and three weeks sorafenib liposome instillation treatment than that after one week treatment. The last dosage form used for sorafenib was microspheres, which were prepared by emulsion-diffusion-evaporation method using biodegradable PLGA 50:50 resulting in a white lyophilized powder. The system was characterized physicochemically and revealed a good microspheres yield, high encapsulation efficiency, a homogenous particle size distribution and slow in vitro release of sorafenib. The other strategy studied in the present research project was gene delivery to target the lung bearing tumor of BXB-23 mice using a non-viral vector (polyethylenimine). Polyethylenimine (PEI) was used to investigate its efficiency in transfecting lung bearing tumor of BXB-23 mice model and its ability to transfect the adenoma foci cells. LacZ, which encodes Beta-galactosidase was used in the present study as a reporter gene and was complexed with PEI before delivered intravenously. A high LacZ expression in the alveolar region with some expression in the adenoma foci was observed. On contrary, a low LacZ expression in the alveoli and in the adenoma foci was achieved after instillation of the same polyplex intratracheally. N2 - Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, verschiedene galenische Darreichungsformen als Trägersystem für Sorafenib zu entwickeln, um den direkten Transport des Arzneistoffes zum Zielorgan Lunge von BXB-23 transgenen Mäusen zu ermöglichen. Für die verschiedenen Applikationswege wurden drei Darreichungsformen gewählt. Eine Öl-in-Wasser-Emulsion sollte oral verabreicht werden. Für die intratracheale Instillation wurde ein liposomales Präparat gewählt. Die letzte Darreichungsform stellten PLGA Mikrosphären dar. Um die Absorption von Sorafenib nach Administration bestimmen zu können, wurde die Konzentration des Arzneistoffes im Mäuseserum gemessen. Zur Quantifizierung von Sorafenib in einem geringen Volumen Serum und in Gewebe wurde eine HPLC-Methode entwickelt und validiert. Sorafenib wurde erfolgreich in eine Fettemulsion (o/w) mittels einer traditionellen Methode eingearbeitet. Nach oraler Verabreichung der Emulsion (2 mg/Maus) zeigte Sorafenib auf Lungenadenome eine Antitumor-Aktivität, wobei eine Reduktion der Tumorfläche der Adenomfoci um etwa 29 % und eine Reduktion der Proliferation verzeichnet werden konnte. Zur Verbesserung der pharmakologischen Effekte von Sorafenib auf die Lungenadenome in BXB-23 Mäusen zu verbessern, sollte Sorafenib direkt dem Zielorgan Lunge zugeführt werden. Zu diesem Zweck wurde der intratracheale Administrationsweg gewählt. Da die Instillation von Sorafenibaufgrund seiner lipophilen Natur nur durch Einschluß in eine andere Darreichungsform zu erreichen ist, wurde für die zweite Darreichungsform eine Liposomen-Suspension verwendet. Für die Zubereitung von Sorafenib in Liposomen wurde eine Lyophilisierungsmethode unter Verwendung von DPLC erarbeitet. Die Einschluss-Effektivität der Sorafenib-beladenen Liposomen war hoch und zeigte bei 4°C eine gute Stabilität für einen Monat. Die erzielten Effekte bei der in vitro Freisetzung und die Hemmung der von Raf1-induzierten Aktivierung von ERK in Zellkulturexperimenten lieferten zufrieden stellende Ergebnisse. In einem pharmakokinetischen Experiment wurden mit Sorafenib beladenen Liposomen direkt in die Lunge appliziert. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 2 h eine signifikante Konzentration von Sorafenib im Lungengewebe erreicht wurde. Nach 48 h nahm diese Konzentration ab und blieb dann für eine Woche fast konstant. Andererseits wurden bis zu 48 h nach Gabe des Arzneistoffes nur Spuren von Sorafenib im Mäuseserum gefunden. Folglich wurde die pharmakologische Aktivität von Sorafenib (1 mg/Maus) bei intratrachealer Verabreichung in einer liposomalen Suspension untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die intratracheale Gabe von Sorafenib eine Reduktion der Tumorfläche der Adenomfoci um 67 % bewirkte, sowie eine Erhöhung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen. Eine Verlängerung der Behandlungszeit zeigte keine zusätzliche Verbesserung der Effekte. Dies lies vermuten, dass hier eine Entwicklung von Multidrug-Resistenz in den Adenomfocizellen gegenüber der Instillation von Sorafenib erfolgte. Dies wurde in immunochemischen Anfärbe-Experimenten untersucht. Die Prozentzahl von MDR-positiven Zellen war nach zwei und drei Wochen Instillation von Sorafenib-Liposomen höher als nach einer Woche. Die letzte verwendete Darreichungsform für Sorafenib waren Mikrosphären, die durch Emulsions-Diffusions-Evaporations-Methoden in biologisch abbaubarem PLGA 50:50 hergestellt wurden. Dies ergab ein weißes, lyophilisiertes Pulver. Das System wurde physiochemisch charakterisiert und ergab ein gutes Mikrosphären-Ergebnis, hohe Einschluss-Effektivität, eine homogene Verteilung der Partikelgrößen und eine langsame in vitro Freisetzung von Sorafenib. Die andere untersuchte Strategie war Gen-Delivery, um den Lungentumor von BXB-23 Mäusen mittels eines nicht-viralen Vektors (Polyethylenimin, PEI) anzuzielen. PEI wurde verwendet, um die Effektivität der Transfektion des Lungentumors zu untersuchen und seine Fähigkeit, die Adenomfocizellen zu transfizieren. LacZ, das Beta-Galactosidase codiert, diente bei diesem Experiment als Reportergen und wurde vor intravenöser Gabe mit PEI komplexiert. Eine hohe LacZ-Expression in der alveolaren Region, aber nur eine geringe Expression in den Adenomfoci wurde beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde eine geringe Expression von LacZ in den Alveolen und den Adenomfoci nach intratrachealer Instillation des gleichen Polyplex erreicht. KW - Maus KW - Transgene Tiere KW - Targeted drug delivery KW - Lungenkrebs KW - Sorafenib KW - Liposomen KW - MDR KW - Mikrosphären KW - Antitumor KW - Sorafenib KW - liposomes KW - MDR KW - microspheres KW - Antitumor Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22249 ER - TY - THES A1 - Porsche, Christian T1 - Neuronale Plastizität im Hippocampus der Maus : Die Rolle von Neurotrophine und Cytokinen N2 - Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als Überlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizität. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizität und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zunächst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum für die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bezüglich BDNF keine Veränderungen in Hippocampi CNTF-defizienter Mäuse gegenüber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten Mäusen eine eingeschränkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verständnis der – laut LTP-Untersuchungen – veränderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-Färbung nachweisbar. Zur Klärung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout Mäusen durchgeführt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in ähnlichem Maße hochreguliert, was für alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF&LIF-defizienten Mäusen, wobei LIF-defiziente Tiere keine veränderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorläuferzellen bestätigten die Hypothese, wonach cortikale Vorläuferzellen zunächst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorläuferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo für die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist. N2 - Neurotrophic factors are central to many facets of CNS function. They act as survival factors during embryonic development, mediate proliferation, differentiation and survival also in the adult nervous system and play an important role for activity-dependent forms of synaptic plasticity. The first part of this work was addressed to neurotrophic factors as modulators of synaptic plasticity and examined their role for BDNF-regulation within the hippocampal formation. Initially our polyclonal BDNF-immune serum was optimized for the use in immunohistochemistry and Western blot-analysis. No differences concering BDNF-protein in hippocampi of CNTF-deficient mice compared with wildtype were found. Previous data, showing decreased hippocampal BDNF-level in CNTF-deficient mice, could therefore not be verified. Interestingly an impaired LTP and LTD was observed in CNTF-deficient mice.To understand the changed situation at hippocampal CA1-synapse in these mice, leading to an impaired LTP, we used electronmicroscopy, but no apparent differences were seen. In Stratum radiatum of CA1 region no specific CNTF-staining was detectable. To address the question, whether IGF mediates the effect of physical training resulting in BDNF-upregulation within the hippocampus, we performed voluntary running experiments with conditional IGF1-receptor-knockout and with wildtype mice and analysed the BDNF-levels. It was shown that BDNF-upregulation after physical training occurred in both genotypes to a similar extent, suggesting alternative ways of BDNF-upregulation. The second part dealt with the influence of neurotrophic factors on proliferation and differentiation in hippocampus and cortex. Via BrdU-incorporation experiments the different proliferation rates in the subgranular zone of the dentate gyrus were analysed. CNTF-deficient mice and CNTF&LIF-deficient mice showed increased proliferation rates compared with wildtype, whereas LIF-deficient mice had normal proliferation rates. Precursor cells of the embryonic cortex sequentially generate neurons and then glial cells, but the mechanisms regulating this neurogenic-to-gliogenic transition were unclear. Using cortical precursor cultures, which temporally mimic this in vivo differentiation pattern, we demonstrated that cortical neurons synthesize and secrete the neurotrophic cytokine CT-1, which is essential for the timed genesis of astrocytes in vitro. Our data indicate that a similar phenomenon also occurs in vivo. KW - Maus KW - Hippocampus KW - Neuronale Plastizität KW - Neurotropher Faktor KW - Cytokine KW - neuronale Plastizität KW - Hippocampus KW - neurotrophe Faktoren KW - BDNF KW - LTP Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21968 ER - TY - THES A1 - Ritter, Christian Oliver T1 - Langzeitverlauf der linksventrikulären Hypertrophie von Mäuseherzen nach Aortenbanding - nichtinvasive Charakterisierung mittels schneller hochauflösender in vivo Magnetresonanztomographie - T1 - Long term study of left ventricular hypertrophy in mice hearts after aortic banding -non invasive characterization with fast high-resolution in vivo magnetic resonance imaging- N2 - Diese Arbeit zeigt den zeitlichen Verlauf der geometrischen und funktionellen kardialen Änderungen während chronischer Druckinduktion des Mäuseherzens nach kontrollierter Banding-Operation der Aorta thoracalis im Langzeitverlauf von insgesamt 26 Wochen. Als Kontrollgruppe dienten Tiere, die sich zum gleichen Zeitpunkt einer Pseudo-Operation (Sham-Operation) unterzogen. Zur Erfassung der kardialen Funktionsparameter sowie der Dynamik wurde schnelle hochauflösende MR-Kinobildgebung in einem 7 Tesla Magneten mit Hilfe eines Mikroskopie-Gradientensystems unter Isofluran-Narkose durchgeführt. Erfasst wurden hierbei die Parameter enddiastolisches Volumen (EDV), endsytolisches Volumen (ESV), Schlagvolumen (SV), Auswurffraktion (EF), Herzminutenvolumen (HMV), Herzindex (CI), linksventrikuläre (LV) Masse, LV-Massenindex, LV-Wanddicke endsytolisch und enddiastolisch sowie LV-Entleerungs- und Füllungsrate. Zusätzliche Zeit-Volumen-Kurven wurden berechnet. Zu jedem Untersuchungszeitpunkt wurde eine histologische Aufarbeitung des linken Ventrikels durchgeführt. Die Kardiomyozytengröße wurde nach einer Hämalaun-Eosin-(HE)-Färbung planimetrisch lichtmikroskopisch bestimmmt. Der Grad der einsetzenden Fibrose wurde mit einer Picro-Sirius-Rot(PSR)-Färbung und nachfolgender Mikroskopie mit zirkulär polarisiertem Licht bestimmt. Es zeigten sich die typischen linksventrikulären Veränderungen der druckinduzierten Hypertrophie, die sich in vier Stufen einteilen lässt: Akutphase bis sieben Tage nach Operation, Kompensationsphase bis zwei Wochen nach Operation, Umbauphase bis sieben Wochen nach Operation und die Dekompensationsphase ab sieben Wochen nach Operation. Die Kollagendichte hatte sich zum Beispiel 26 Wochen nach Operation verdoppelt im Vergleich zur Erstuntersuchung. Die zeitliche, funktionelle und histologische Erfassung der linksventrikulären Hypertrophie ist eine wichtige Grundlage für die Planung weiterer Studien, besonders in Hinblick auf den Einsatz von Modellen mit transgenen Tieren sowie Tieren mit Gen-Knockout. Vorteil der kardialen mikroskopischen Magnetresonanztomographie (MRT) ist der Einsatz als Kontrollmethode der Auswirkungen der genetischen Manipulation nahezu direkt nach der Geburt. Entscheidend ist die umfassende kardiovaskuläre Phänotyp-Charakterisierung der Maus als Schlüssel für die Anwendung der experimentell gewonnen Erkenntnisse zum weiteren Verständnis der Morphologie und funktionellen Abläufe des Herzen sowie der sich daraus ableitenden Therapiemöglichkeiten am menschlichen Herzen. Eine Anwendung dieser Bildgebungsmethode an der Maus ist in der Zukunft zum Beispiel auch denkbar für die Untersuchung von Remodeling-Prozessen nach Myokard-Infarkt, regionaler Herzmuskelfunktion unter Verwendung der Stress-Cinematographie, MR-Tagging- sowie Phasenkontrast-Bildgebung und der myokardialen First-Pass-Perfusionsbildgebung in Kombination mit dem späten Kontrastmittel-Enhancement nach Myokardinfarkt. N2 - This study shows the temporal changes of cardiac geometry and functional parameters after aortic banding in eight C57Bl6-mice. Pressure induced left-ventricular hypertrophy was monitored over 26 weeks. As control we examined the same number of sham-operated mice. A fast, high-resolution microscopic magnetic-resonance imaging (MRI) cine-imaging technique has been applied at each of the six different examination timepoints using a 7 Tesla magnet and Isofluran-anesthesia. We evaluated the following parameter: enddiastolic volume (EDV), endsytolic volume (ESV), stroke volume (SV), ejection fraction (EF), cardiac output (CO), cardiac index (CI), left ventricular (LV) mass, LV-mass index, endsytolic and enddiastolic LV-wall thickness as well as time-resolved LV-volume-time-curves. At each timepoint we sacrificed mice for a histological work-up of the left ventricle. Manual planimetry of the cardiomyocyte size has been performed after hemalaun-eosin (HE) staining. The grade of fibrosis was shown after picro-sirius-red (PSR) staining using circular-polarized light microscopy. Typical changes of left ventricular pressure induced hypertrophy could be depicted and a four step scheme was established: acute phase within seven days after surgery, compensation phase within two weeks, remodelling till seven weeks and decompensation phase starting seven weeks after surgery. The documentation of temporal, functional and histologic changes of left ventricular hypertrophy is an essential base for the planning of further studies, especially respecting its use in models with transgen animals and animals with gen-knockout. The advantage of cardiac microscopic MRI is its use as a control method monitoring genetic changes directly already after birth. Main target is a comprehensive cardiovascular phenotyp-characterization of the the mouse in terms of morpology and function, and the resulting therapy options for humans. In the future, implementation of cardiac microscopic imaging in mice might be applied to study the process of remodeling after myocardial infarction, regional functional parameters using stress-cinematography, MR-tagging- as well as phase-contrast-imaging, and myocardial first-pass-perfusion (FPP) imaging in combination with late contrast ehnhancement after myocardial infarction. KW - Linksventrikuläre Hypertrophie KW - Maus KW - Herz KW - Magnetresonanztomographie KW - left ventricular hypertrophy KW - high-resolution MRI KW - microscopic MRI KW - mouse KW - heart Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20940 ER - TY - THES A1 - Valchanova, Stamatova Ralitsa T1 - Functional analysis of the murine cytomegalovirus genes m142 and m143 N2 - Human cytomegalovirus (HCMV) infection causes clinical symptoms in immunocompromised individuals such as transplantant recipients and AIDS patients. The virus is also responsible for severe complications in unborn children and young infants. The species specificity of HCMV prevents the direct study of mechanisms controlling the infection in animal models. Instead, the murine cytomegalovirus (MCMV) is used as a model system. Human and murine CMVs have large double-stranded DNA genomes, encoding nearly 170 genes. About 30% of the genes are committed to essential tasks of the virus. The remaining genes are involved in virus pathogenesis or host interaction and are dispensable for virus replication. The CMV genes are classified in gene families, based on sequence homology. In the present work, the function of two genes of the US22 gene family was analyzed. The MCMV genes m142 and m143 are the only members of this family that are essential for virus replication. These genes also differ from the remaining ten US22 gene family members in that they lack 1 of 4 conserved sequence motifs that are characteristic of this family. The same conserved motif is missing in the HCMV US22 family members TRS1 and IRS1, suggesting a possible functional homology. To demonstrate an essential role of m142 and m143, the genes were deleted from the MCMV genome, and the mutants were reconstituted on complementing cells. Infection of non-complementing cells with the deletion mutants did not result in virus replication. Virus growth was rescued by reinsertion of the corresponding genes. Cells infected with the viral deletion mutants synthesized reduced amounts of viral DNA, and viral late genes were not expressed. However, RNA analyses showed that late transcripts were present, excluding a role of m142 and m143 in regulation of gene transcription. Metabolic labelling experiments showed that total protein synthesis at late times postinfection was impaired in cells infected with deletion mutants. Moreover, the dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) and its target protein, the translation initiation factor 2α (eIF2α) were phosphorylated in these cells. This suggested that the m142 and m143 are required for blocking the PKR-mediated shut-down of protein synthesis. Expression of the HCMV gene TRS1, a known inhibitor of PKR activation, rescued the replication of the deletion mutants, supporting the observation that m142 and m143 are required to inhibit this innate immune response of the host cell. N2 - Die Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) kann bei immunsupprimierten Personen wie Transplantatempfängern oder AIDS Patienten, aber auch bei Neugeborenen klinische Symptome hervorrufen. Die Spezies-Spezifität des humanen CMV lässt keine Untersuchung viraler Mechanismen im Tiermodell zu, jedoch steht mit dem murinen CMV (MCMV) ein geeignetes und verbreitetes Modell zur Verfügung. Beide CMVs besitzen große doppelsträngige DNA Genome, die ca. 170 Gene beinhalten. Hiervon sind ca. 30% essentiell für die virale Replikation. Die anderen Gene sind für die Pathogenesse und Interaktion mit den Wirtszellen von Bedeutung. Die Gene des CMV werden auf Grund von Sequenzhomologien in Familien gruppiert. In der vorliegenden Arbeit wird die Funktion der Gene m142 und m143 des MCMV analysiert. Beide Gene sind die einzigen für die Virusreplikation essentiellen Mitglieder der US22 Genfamilie. Darüber hinaus unterscheiden sie sich von den anderen 10 US22 Mitgliedern darin, daß ihnen eine von vier konservierten Sequenzmotiven fehlt. Dieses fehlende Motiv kommt auch bei den HCMV US22 Mitgliedern TRS1 und IRS1 nicht vor, was einen möglichen Hinweis auf eine funktionelle Homologie gibt. Um die essentielle Rolle der m142 und m143 Gene zu belegen, wurden letztere aus dem MCMV Genom entfernt und die Virusmutanten auf komplimentierenden Zellen rekonstituiert. Die Infektion nicht komplimentierender Zellen mit den Virusmutanten erzeugte keine Infektion, konnte jedoch mit der Reinsertion der Gene wieder hergestellt werden. Infizierte Zellen, die mit den Virusmutanten infiziert wurden, produzierten geringere Mengen viraler DNA. Obwohl die Expression später viraler Gene nicht stattfand, konnten späte virale Transkripte nachgewiesen und somit eine Rolle von m142 und m143 bei der Regulation der viralen Transkription ausgeschlossen werden. In Experimenten, in denen Zellen metabolisch markiert wurden, wurde gezeigt, daß die Gesamtproteinsynthese zu späten Zeitpunkten nach Infektion mit den Virusmutanten gehemmt war. Des weiteren wurde eine Phosphorylierung der dsRNA-abhängigen Proteinkinase R (PKR) sowie des Zielproteins, des Translations Initiationsfaktors 2α (eIF2α), nachgewiesen. Dies läßt vermuten, daß m142 und m143 die PKR-vermittelte Stillegung der Proteinsynthese verhindern. Durch Expression des HCMV TRS1 Gens, einem bekannten Inhibitor der PKR-Aktivierung, konnte die Replikation der Virusmutanten wieder hergestellt werden. Dies unterstützt die Ansicht, daß m142 und m143 für die Inhibition der Angeborenen Immunanwort der infizierten Wirtszelle erforderlich sind. KW - Maus KW - Cytomegalie-Virus KW - Genanalyse KW - murine cytomegalovirus KW - essential genes KW - US22 gene family KW - PKR KW - protein synthesis shut down KW - innate immune response Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20215 ER - TY - THES A1 - Gogishvili, Tea T1 - Immunotherapy of allergic disorders in a mouse model of allergic airway inflammation T1 - Immuntherapie allergischer Erkrankungen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen N2 - Allergische Erkrankungen sind Störungen, bei denen es zu Immunfehlregulationen kommt und die bei empfänglichen Individuen zur Entstehung von Allergen spezifischen T-Helfer 2 (TH2) Immunantworten führen. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die für Soforttypallergien charakteristischen TH2 Immunantworten sowohl durch natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T Zellen (Treg) als auch durch Antigen induzierte IL-10-secreting CD4+ regulatorische T Zellen kontrolliert werden können. Weiterhin gibt es Hinweise, dass eine erfolgreiche Allergen spezifische Immuntherapie über die Induktion von IL-10 sezernierenden T reg Zellen vermittelt wird. In ersten Teil der Arbeit wird die Effizienz einer Allergen spezifischen Immuntherapie (SIT) in einem Mausmodel für allergische Atemwegsentzündung demonstriert. Als Allergieparameter wurden Allergen spezifisches IgE im Serum, verschiedene TH1 und TH2 Cytokine in der brochoalveolären Lavage Flüssigkeit und nach in vitro Restimulation in Milzzellen untersucht. Weiterhin wurden Histologien von Lungengewebe angefertigt, um das eosinophile Entzündungsinfiltrat und die Asthma typische Becherzellmetaplasie darzustellen. Weiterhin wurden durch FACS Untersuchungen regulatorische T Zellen nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass im Mausmodell die intranasale Applikationsform der SIT die allergischen Symptome effizienter bekämpfen konnte, als die beim Menschen etablierte subcutane Applikationsform. Um Mechanismen zu definieren die eine SIT effizienter machen könnten wurde ein IL-4/IL13 Inhibitor (QY) als Adjuvans für die SIT benutzt. Für den Zytokininhibitor konnte gezeigt werden, dass bei einer Applikation während der allergischen Sensibilisierung die Entstehung einer TH2 Immunantwort und die Ausbildung allergischer Symptome verhindert wird. Die Applikation des Inhibitors zusammen mit einer SIT zeigte jedoch keine zusätzlichen signifikanten antiallergischen Effekte im Vergleich zur Durchführung der SIT als Monotherapie. Diese Ergebnisse deuten möglicherweise daraufhin , dass der bekannte Wechsel einer TH2 Immunantwort zu einer TH1 Antwort während der SIT nicht der Schlüsselmechanismus zu einer erfolgreichen Behandlung ist. Insbesondere weil unter der SIT auch in unserem Mausmodell die Induktion von IL-10 sezernierenden CD4+ T regulatorischen Zellen mit der Suppression der allergischen Atemwegsentzüdnung vergesellschaftet waren, so dass möglicherwiese diese Zellen für den Therapieerfolg relevant sind . Um die Rolle regulatorischer T Zellen im Allergiemodell näher zu beleuchten wurde im 2. Teil der Arbeit ein monoklonaler superagonistischer anti-CD28 Antikörper benutzt, von dem bekannt ist dass T regulatorische Zellen in vivo induziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation des Antikörpers während der allergischen Sensibilisierung die Etablierung einer TH2 Immunantwort verstärkte. Im Gegensatz dazu wurden durch die therapeutische Applikation des anti CD28 Antikörpers in einer etablierten Allergie, IL-10 sezernierende CD4+CD25+ T Zellen induziert, welches mit einer Abschwächung der gemessenen Allergieparameter einherging. N2 - Allergic disease are inflammatory disorders in which aberrant immune regulation occurs, and susceptible individuals mount allergen specific T helper 2 (Th2) responses, which drives disease pathology. Recent studies indicate that Th2 responses that are characteristic of allergic manifestations can be regulated by both naturally occurring CD4+CD25+ regulatory (Treg) cells and antigen-driven IL-10-secreting CD4+ regulatory T cells. Evidence is also emerging that successful Allergen specific immunotherapy (SIT) might work through the induction of IL-10-secreting regulatory T cells. In the first part of this work, I demonstrated the efficiency of allergen specific immunotherapy in the mouse model for allergic airway inflammation. Here I could show that intranasal administration of SIT abrogates allergic symptoms more efficiently, than the subcutaneous treatment. Furthermore, an IL-4/IL-13 (QY) inhibitor was used as an adjuvant for SIT, which has been demonstrated to have an anti-allergic potential, when administered prophylactically during allergic sensitization. However, the combination therapy with SIT and the inhibitory molecule QY did not show any significant enhancement in regards to all measured allergic parameters, when compared to monotherapy with SIT. These results provide the evidence, that shift from Th2 to Th1 cytokine profile might not be a key event in successful SIT. Subsequently, the investigation of immune mechanisms under successful SIT demonstrate that the increase of IL-10 secreting CD4+ T regulatory cells is associated with the suppression of airway inflammation in our mouse system, suggesting that these T cell subsets might be involved in the regulatory mechanisms of allergic disorders. In agreement with these findings is the second part of this work, where superagonistic a-CD28 mAb´s were used for the expansion of T regulatory cell subsets in our murine model for allergic airway inflammation. Here I could show, that the application of a-CD28 mAb during allergic sensitization, resulted in the establishment of a Th2 state, rather than a stimulation of a Treg cell population, supporting the Th2 promoting role of a-CD28 mAb together with TCR engagement. However, interesting findings were obtained by application of the superagonistic a-CD28 mAb in the challenge phase in established allergy. Conversely to the previous experiment, therapeutic administration of a-CD28 mAb lead to the generation of IL-10 secreting CD4+CD25+ T cell population in line with the induction of anti-allergic effects. Taking together the results of this study argue for the anti-inflammatory properties of T regulatory cells in allergic disease and highlights importance of these T cell subsets in the suppression of Th2 cell-driven response to allergen. Moreover, these observations suggest that the induction of IL-10 in vivo by T regulatory cells may represent a novel treatment strategy for allergic disorders. KW - Bronchialasthma KW - Allergie KW - Maus KW - Immuntherapie KW - Allergy KW - asthma KW - IL-4/IL-13 inhibitor KW - Mouse model of allergic airway inflammation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19304 ER - TY - THES A1 - Glückert, Eva-Katharina T1 - Charakterisierung eines Antiserums gegen BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und Optimierung von Methoden zum immunhistochemischen Nachweis von BDNF im Hippocampus der Maus T1 - Characterization of an antibdoy against BDNF (brain-derived neurotrophic factor) and optimizing of methods for immunohistochemical proof of BDNF in mouse hippocampus N2 - Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF gehört neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle für Überleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich für die Regulation synaptischer Plastizität. Besonders im Hippocampus, dem Ort der höchsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorgängen von Lernen und Gedächtnis mit, welches als Phänomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-Techniken im Gehirn der Maus oder Ratte nur sehr schwer gelungen. In den meisten Arbeiten gelang die Lokalisation von BDNF über den Nachweis von mRNA oder im Western Blot, die Gruppe von Conner et al. konnte einen qualitativen Nachweis von BDNF-Protein mittels eines eigens hergestellten Antiserums erbringen (Conner et al. 1997). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Antiserums gegen BDNF zur subzellulären Lokalisation mittels Immunhistochemie. Durch die Verwendung von Immunfluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörpern sollte zum einen eine quantitative Bestimmung von BDNF möglich sein, zum anderen sollte durch die Möglichkeit einer nahezu dreidimensionalen Darstellung des Gewebes mittels Vibratomschnitten auch eine Aussage über eine genauere Lokalisation von BDNF gemacht werden können. Um den immunhistochemischen Nachweis von BDNF-Protein im Hippocampus der Maus mittels Immunfluoreszenz führen zu können, wurde zunächst ein geeignetes Anti-serum benötigt. Zwei zu Vergleichszwecken ausgetestete kommerzielle Antikörper zeigten keine Färbung. Nach dem Vorbild zweier Arbeitsgruppen (Yan et al. 1997b und Conner et al. 1996, 1997) wurde ein Antiserum gegen humanes rekombinantes BDNF in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum erhielt den Namen „BDNF RabbitB“. Die Spezifität des Antiserums wurde mittels Western Blot und in der Zellkultur anhand von Hühnchen-DRGs überprüft. Im Western Blot zeigte das Antiserum eine spezifische Anfärbung von rekombinantem BDNF sowie im Hippocampus-Proteinextrakt. In der Kontrolle mit Präimmunserum zeigte sich keine Anfärbung. In der Zellkultur mit Hühnchen-DRGs konnte eine blockierende Wirkung des Antiserums in Gegenwart von BDNF als neurotrophem Wachstumsfaktor im Zellkulturmedium nachgewiesen werden, es zeigte sich eine signifikante Reduktion des Überlebens von Zellen bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:1.000. Das Präimmunserum zeigte keine Wirkung. Eine Kreuzreaktivität mit NGF als strukturähnlichem Protein konnte ausgeschlossen werden, da das Antiserum in Gegenwart von NGF im Kulturmedium keine Wirkung zeigte. Anschließend galt es, die Methoden für die Immunhistochemie mit diesem Antiserum zu optimieren, da es Hinweise gab, daß gerade die Immunhistochemie neurotropher Faktoren sehr sensibel auf verschiedene Methoden reagiert. Daher wurden sowohl die Fixierungsmethode, unterschiedliche Gewebeschnitte, verschiedene Puffersysteme und immunhistochemische Färbemethoden untersucht und verglichen. Die Standard-Fixierungsmethode mit Phosphat-Puffer, modifiziert nach der Methode nach Yan et al. 1997b mit maximal 2 h Nachfixierung stellte sich als beste Methode heraus. Eine Kombination zweier verschiedener Puffer (TBS und PB) innerhalb der Fixierung ist ungünstig. Daher sollte innerhalb einer Methode immer bei einem Puffersystem geblieben werden, wobei hier insgesamt bei dem Vergleich von PBS, TBS und TRIS-Puffer sowohl in der Fixierung als auch in der Färbemethode dem Phosphat-Puffer der Vorzug gegeben wird, welches auch das Standard-System darstellt. Bei den Gewebeschnitten sind, wie ursprünglich geplant Vibratomschnitte zu bevorzugen. Insgesamt konnten jedoch mögliche Ursachen für die Anfälligkeit der BDNF-Immunreaktivität bei Fixierungs- und Färbemethoden hier nicht abschließend erklärt werden. Problematisch war die ausgeprägte Hintergrundfärbung des Antiserums v.a. in der Immunhistochemie, die nicht ausreichend behoben werden konnte. Insofern sollte das Antiserum für die Verwendung bei immunhistochemischen Färbungen noch weiter optimiert werden. Für die Verwendung in der Zellkultur ist das Antiserum auf Grund seiner BDNF-blockierenden Eigenschaften gut einsetzbar. Im Western Blot sollte „BDNF RabbitB“ in einer Verdünnung von 1:5.000, in Zellkultur mit 1:1.000 und in der Immunhistochemie mit Vibratomschnitten mit 1:2.000 eingesetzt werden. KW - BDNF KW - Hippocampus KW - Maus KW - Immunhistochemie KW - BDNF KW - hippocampus KW - mouse KW - immunohistochemical Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18696 ER - TY - THES A1 - Löffler, Daniela Inge Martina T1 - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell T1 - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo N2 - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. N2 - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice. KW - Listeria monocytogenes KW - Attenuierung KW - Impfstoff KW - Maus KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - Mausmodell KW - Listeria monocytogenes KW - vaccines KW - in vivo Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728 ER - TY - THES A1 - Steidl, Christian T1 - Funktionsanalyse des notch-Zielgens heyL und verwandter bHLH-Transkriptionsfaktoren in der Entwicklung der Maus T1 - Functional analysis of the notch target gene heyL and related transcription factors in mouse development N2 - In der Embryonalentwicklung von Insekten, Nematoden und Vertebraten reguliert der delta-notch-Signalweg vielfältige Zelldifferenzierungsvorgänge wie die laterale Inhibierung, Zelllinien-Entscheidungen und die Bildung von Grenzen. In Vertebraten aktivieren die transmembranen Liganden delta-like 1, 3 oder 4, bzw. jagged 1 oder 2 einen notch-Rezeptor (notch1, 2, 3 oder 4). Dessen intrazelluläre Domäne bildet im Zellkern mit rbp-j und weiteren Proteinen einen Aktivator-Komplex, der an den Promotor der notch-Zielgene bindet. Neben drei hes-Genen zählen dazu die Gene hey1, hey2 und heyL, die alle eng verwandt sind mit hairy und den Genen des Enhancer of Split-Komplexes (E(spl)) bei Drosophila melanogaster. Die hey-Gene sind in der Maus unter anderem während der Entwicklung von Niere, Arterien, Herz, Nervensystem, Thymus und Somiten spezifisch exprimiert. Um die Bedeutung des heyL-Gens für die Bildung dieser Organe zu untersuchen, wurden heyL-Knockoutmäuse generiert, bei denen jedoch keine morphologischen Veränderungen oder Erkrankungen erkennbar waren. Die durch entsprechende Verpaarung erhaltenen heyL/1-Doppelknockoutmäuse wiesen in der F9-Rückkreuzungsgeneration einen Ventrikel-Septum-Defekt (VSD) auf und verstarben größtenteils ein bis zwei Tage nach der Geburt. Ähnliche Krankheitssymptome zeigen die mit anderen Komponenten des delta-notch-Signalweges in Verbindung gebrachten Erbkrankheiten „Fallot´sche Tetralogie“ (ToF) und das Alagille Syndrom (AGS). Vergleichbare VSDs treten auch bei hey2-Knockoutmäusen auf. Es stellte sich daher die Frage, welche Zielgene des hey2-Transkriptionsfaktors an der Herzbildung beteiligt sind. Literaturbekannte HEY2-Zielgen-Kandidaten sind beim Menschen Follistatin (FST), Keratin 2-7 (KRT2-7) und das epitheliale V-ähnliche Antigen (EVA1). Durch antisense RNA in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmausschnitten konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster entdeckt werden. Eigene Microarray-Analysen mit RNA aus hey2-überexprimierenden, humanen 293-Zelllinien identifizierten das Neurofilamentgen NEFL als HEY2-Zielgenkandidat. Bei der in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmäusen mit einer Probe für das nefl-Gen konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster erkannt werden, so dass nefl in vivo vermutlich komplexer reguliert wird. Neben den Ventrikel-Septum-Defekten zeigen die heyL/1-Doppelknockoutmäuse einen zweiten abnormalen Phänotyp. Die embryonalen Thymi dieser Tiere sind kleiner als die der wildtypischen Mäuse. Die detaillierte Analyse der Thymozyten-Subpopulationen erbrachte, dass die niedrigere Zellzahl vor allem zu Lasten der doppelt positiven Thymozyten geht. Grund hierfür könnte eine teilweise Blockierung der Entwicklung zwischen der zweiten und dritten Phase des zuvor durchlaufenen doppelt negativen Stadiums sein, denn die absolute Zahl der DN3-Thymozyten ist um über 90 Prozent verringert. Die Blockierung des delta-notch-Signalweges durch Zugabe eines -Sekretase-Inhibitors führte ebenfalls zu einer Verringerung der DN3-Zellen in der gleichen Größenordnung, jedoch im Gegensatz zu den heyL/hey1-Doppelknockout-Thymi gleichzeitig zur Verdreifachung der absoluten Zahl der DN2-Zellen. Diese Unterschiede unterstreichen die Bedeutung weiterer notch-Zielgene wie beispielsweise hes1. Ob die beobachteten Veränderungen in der Entwicklung der Thymozyten Folgen für die Immunabwehr haben, wurde im Rahmen von Immunisierungen mit Trinitrophenyl (TNP)-Ovalbumin untersucht. Hierbei zeigte sich eine Erhöhung der IgG2a und IgG2b Werte und eine Reduktion der IgG1 Produktion bei den heyL/hey1-Doppelknockoutmäusen, während die IgM-Werte zwischen den verschiedenen Mausgenotypen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Die IgG-Veränderungen deuten darauf hin, dass die T-Zellen vermehrt in die TH1-Zelldifferenzierungsrichtung getrieben werden und die TH2-Cytokinproduktion verringert ist. Bei den hey-Knockoutmäusen waren aufgrund des Expressionsprofils der hey-Gene nicht nur Veränderungen in der Herzentwicklung und im Thymus erwartet worden, sondern auch in der Somitogenese. Dies gilt im Besonderen für die bereits zuvor generierten hey2-Knockoutmäuse, denn hey2 ist im präsomitischen Mesoderm zyklisch exprimiert. Im Gegensatz zu den Knockoutmäusen des verwandten und ebenfalls zyklisch exprimierten hes1-Gens, litten jedoch weder die heyL/hey1-Doppelknockoutmäuse, noch die hey2-Knockoutmäuse an Defekten in der Somitogenese. Während die Bedeutung der Genexpression der hey-Gene in der Somitogenese weiterhin unklar sind, konnten Erkenntnisse über die Funktionen von heyL und hey1 in der Herzentwicklung und bei der Ausreifung der Thymozyten gewonnen werden. Die Identifizierung von hey-Zielgenen in diesen Entwicklungsprozessen kann das Verständnis des delta-notch-Signalweges erweitern, die Ursachen von Erbkrankheiten aufklären helfen und möglicherweise Therapiestrategien aufzeigen. N2 - The delta-notch signaling pathway regulates numerous cell differentiation processes like lateral inhibition, cell lineage decisions and the formation of borders in the embryonic development of insects, nematodes and vertebrates. In vertebrates the transmembrane ligands delta-like 1, 3 or 4 and jagged 1 or 2 activate a notch-receptor (notch 1 – 4). In the nucleus its intracellular domain forms an activator-complex together with rbp-j and other proteins that binds to the promoter of notch target genes. Besides three hes genes these include the genes hey1, hey2 and heyL, all of which are closely related to hairy and Enhancer of Split-complex (E(spl)) genes of Drosophila melanogaster. In the mouse hey-genes are specifically expressed during the development of the kidney, arteries, heart, nervous system, thymus, and somites. In order to elucidate the significance of the heyL gene for the formation of these organs, heyL knockout mice were generated. However, these mice did not exhibited morphological changes or diseases. HeyL/1 double knockout mice, that were obtained by appropriate mating, showed ventricle septum defects (VSD) in the F9 backcross generation and most of them died within one or two days after birth. Similar symptoms are seen in the human congenital diseases Tetralogy of Fallot (ToF) and the Alagille Syndrome (AGS), which are associated with other components of the delta-notch signaling pathway. Similar ventricle septum defects also occur in hey2 knockout mice. This raises the question, which of the target genes of the hey2 transcription factor are involved in the formation of the heart? Published human HEY2-candidate target genes are Follistatin (FST), Keratin 7 (KRT2-7) and the Epithelial V-like Antigen (EVA1). Yet, antisense RNA in situ hybridisation of wildtype and hey2 knockout mouse sections did not reveal any differential expression patterns. Own micro array analysis with RNA from hey2 overexpressing human 293 cell lines identified the neurofilament gene NEFL as a HEY2-target gene candidate. However, in situ hybridisation of wildtype and heyL/1-double knockout mice with a probe for the nefl gene did not reveal differential expression patterns. Thus, the regulation of the nefl expression in vivo is presumably more complex. In addition to the VSD, heyL/1 double knockout mice show a second abnormal phenotype. The embryonic thymus of these animals was smaller than that of the wildtype mice. Detailed analysis of the thymocyte subpopulations revealed, that the low cell number is mainly due to the douple positive thymocytes. The reason for this could be a partial block of the development between the second and third phase of the previous double negative stage since the absolute number of DN3 thymocytes is reduced by over 90 percent. Blocking of the delta-notch signaling pathway by the addition of a -secretase inhibitor also led to a reduction of the DN3 cells to the same extent. Yet in contrast to the heyL/hey1 double knockout thymi, a tripling of the absolute number of DN2 cells is observed. These differences underscore the importance of other notch target genes like for example hes1. To investigate if the observed changes in the development of the thymocytes have any consequences for the immune defence, immunisations with trinitrophenyl (TNP)-ovalbumine were performed. In these experiments an elevation of the IgG2a and IgG2b values and a reduction of the IgG1 production in heyL/hey1 double knockout mice was detected. IgM values did not vary significantly between the different mouse genotypes. The IgG changes indicate that the T-cells are increasingly driven towards the TH1 cell differentiation and that TH2-cytokine production is reduced. Based on the expression profiles of hey genes, developmental changes were expected for hey-knockout mice not only during development of the heart and thymus, but also during somitogenesis. This particularly applies to the previously generated hey2 knockout mice because hey2 is expressed in the presomitic mesoderm in an oscillating manner. Yet, in contrast to the knockout mice of the related and also cyclically expressed hes1 gene, neither the heyL/hey1 double knockout mice nor the hey2 knockout mice suffered from defects during somitogenesis. While the relevance of hey gene expression during somitogenesis remains unclear, new insights in the function of heyL and hey1 during heart development and during the maturation of thymocytes were gained. The indentification of hey target genes in these developmental processes can enhance the understanding of the delta-notch signaling pathway. It may also help to explain the causes of inherited diseases and potentially point out therapeutic strategies. KW - Gen notch KW - Maus KW - Ventrikelseptumdefekt KW - notch KW - hey KW - Herz KW - VSD KW - T-Zellen KW - notch KW - hey KW - heart KW - VSD KW - T-cells Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18557 ER - TY - THES A1 - Xiang, Chaomei T1 - The role of B-RAF in embryonic development of mouse forebrain T1 - Die Rolle von B-RAF in der Embryonalentwicklung des Maus-Vorderhirns N2 - Die Familie der RAF-Kinasen umfasst drei Mitglieder, A-RAF, B-RAF und C-RAF. Nur für die B-RAF-Isoform wurde eine wichtige Funktion für die Entwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) gefunden. Das Fehlen von B-RAF führt bei neu generierten embryonalen Neuronen zum Zelltod, weil sie in vitro nicht auf überlebensfaktoren reagieren können. Bei einer zweiten Zelllinie, die durch die Abwesenheit von B-RAF beeinträchtigt ist, handelt es sich um endotheliale Zellen. Ihr Zelltod führt zu inneren Blutungen und zu Letalität von B-RAF-/--Mäusen zwischen Tag 10.5 (E10.5) und 12.5 (E12.5) der Embryonalentwicklung. Dies verhinderte bisher weitere Untersuchungen der neuralen B-RAF-Funktion bei späteren Stadien. Im Gegensatz zu B-RAF-/--Mäusen überleben B-RAFKIN/KIN-Mäuse die Mitte der Embryonalentwicklung, da ihre Endothelzellen vor Apoptose geschätzt sind. Diese Tiere besitzen kein B-RAF, stattdessen wird im B-RAF-Locus ein chimäres Protein exprimiert, das den N-Terminus von B-RAF sowie alle Domänen von A-RAF umfasst. Der Schutz vor abnormaler neuraler Apoptose im Vorderhirn macht diese Tiere zu einem potentiellen Modell zur Untersuchung der Proliferations- und Differenzierungsfunktion von B-RAF, die die Kinase neben der Überlebensfunktion in der ZNS-Entwicklung ausübt. Die detaillierte Untersuchung der B-RAFKIN/KIN-Tiere konzentrierte sich auf die Entwicklung der Hirnrinde. Augenscheinlich waren kortikale Defekte im B-RAFKIN/KIN Vorderhirn: Der Verlust von B-RAF führte zu einer starken Reduzierung von Brn-2 exprimierenden pyramidalen Projektions-Neuronen begleitet von einer Störung der Dendritenbildung mit weniger und dünneren Dendriten in diesen oberen Schichten. Weitere Untersuchungen mit BrdU-Markierungsexperimenten zeigten in der ventrikulären Schicht reduzierte Zellproliferation für E14.5-E16.5 der Mutantenembryonen und ein Migrationsdefizit der spätgebideten kortikalen Neuronen. Während der Proliferationsdefekt der Hirnrinden-Vorläuferzellen mit einer reduzierten ERK-Aktivierung einherging, bleibt der Mechanismus der gestörten neuralen Migration zu erklären. Unsere Hypothese ist, dass die subzelluläre Lokalisation von Phospho-ERK in den wandernden Hirnrinden-Neuronen der B-RAFKIN/KIN-Mäuse verändert sein könnte. Zur Bestäigung der in vivo-Funktion von B-RAF und weiteren Studien zu ihrer unbekannten Rolle in der embryonalen Neurogenese sowie anderen Morphogenesen wäre die konditionale B-RAF Inaktivierung erforderlich. Durch die Deletion des genetischen Materials bzw. die Inaktivierung der Genfunktion in ausgew�hlten Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt ließen sich die Embryo-Letalität sowie unerwünschte pleiotrope Nebeneffekte vermeiden und akkumulierende, kompensierende Entwicklungsveränderungen von Beginn an ausschließen. Um die Cre Rekombinase-Methode einsetzen zu können, wurden floxed B-RAF embryonale Stammzell (ES)-Zelllinien generiert. Außerdem wurde ein auf dem Tetrazyklin Operator basierendes Schaltallel in den B-RAF Genort von embryonalen Stammzellen integriert, so dass die B-RAF Expression konditional und reversibel durch die Zugabe von Doxyzyklin angeschaltet werden konnte. Bisher wurden hochgradige chimäre Mäuse nach Blastozysten-Injektion geboren. Die Keimbahnübertragung dieser chimären Mäuse wird momentan untersucht. Wenn beide konditionale Mauslinien bereit sind, k�nnte die Entwicklung ihres Zentralnervensystems untersucht werden, um die Rolle von B-RAF in der Entwicklung des Nervensystems herauszufinden. N2 - The RAF family of protein kinases consists of three members, A-RAF, B-RAF and C-RAF. Unlike the other isotypes, B-RAF has been found to have an important function for normal development of the central nervous system (CNS), because newly generated embryonic neurons lacking B-RAF cannot respond to survival factors and undergo cell death in vitro. A second cell lineage affected by the absence of B-RAF are endothelial cells and their death leads to internal bleedings and lethality of B-RAF-/- mice between embryonic day 10.5 (E10.5) and E12.5 precluding an opportunity to further analyze neural B-RAF function at a later stage. In contrast to B-RAF-/- mice, B-RAFKIN/KIN mice, which are B-RAF deficient but express a chimeric protein consisting of the unique N terminus of B-RAF and all the domains of A-RAF in the B-RAF gene locus, survive after midgestation because their endothelial cells are protected from apoptosis. More importantly, overall prevention of abnormal neural apoptosis in the forebrain allows us to study proliferation- or differentiation-oriented function of B-RAF other than its survival effects in CNS development. The detailed investigation of B-RAFKIN/KIN animals was concentrated on cortical development. There were apparent cortical defects in B-RAFKIN/KIN forebrain: Loss of B-RAF led to severe reduction of Brn-2 expressing pyramidal projection neurons accompanied by a disruption of dendrite formation in the upper layers. In further analysis, BrdU labelling experiments showed that from E14.5 to E16.5 cell proliferation in the ventricular zone of the mutant mice was reduced and that the late-born cortical neurons failed to migrate properly. While the proliferation defect of cortical progenitors was associated with reduced ERK activation, the mechanism causing impaired neuronal migration remains to be determined. Our hypothesis is that the subcellular localization of phospho-ERK may be altered in migrating cortical neurons in B-RAFKIN/KIN mice. To confirm in vivo function of B-RAF and further study unknown roles in embryonic neurogenesis as well as other morphogenesis, conditional B-RAF knockouts would be the ideal models, which can efficiently avoid embryonic lethality, prevent unwanted pleiotropic side effects and exclude accumulative compensatory developmental changes from the earliest developmental stage on, through the deletion of genetic material/gene function in selected cells at a specific time. The use of site-specific recombinases such as Cre and the successful development of the reversible tetracycline-based switch have provided powerful venues for creating conditional loss-of-function mouse models. Generation of tetracycline-regulated B-RAF and floxed B-RAF mouse embryonic stem (ES) cell lines was performed. Up to now, high-grade chimeric mice were obtained after blastocyst injection of the modified ES cell clones. The germline transmission from these chimeric mice is currently under investigation. When either of conditional mouse lines is ready, detailed examination in their CNS development would be done to reveal how B-RAF plays a real role for normal development of the nervous system. KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - Vorderhirn KW - B-RAF KW - neurale Migration KW - Hirnrinden KW - Vorderhirn KW - B-RAF KW - neuronal migration KW - neocortex KW - forebrain Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18326 ER - TY - THES A1 - Schütz, Wolfgang T1 - Postmeiotische Expression und funktionelle Charakterisierung von Lamin B3 in der Spermatogenese der Maus T1 - Postmeiotic expression and functional characterisation of lamin B3 in mouse spermatogenesis N2 - Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3. N2 - Lamins are members of a protein family that are the main structural elements of the nuclear envelope in eukaryotic cells. Differentiated mammalian somatic cells express lamins A, C, B1 and B2. The composition and structural organisation of the nuclear lamina in spermatogenic cells differ significantly from that of somatic cells: among the somatic lamins they only express lamin B1 but, additionally, two germ line-specific isoforms could be found, namely lamins C2 and B3. This study contains a detailed investigation of the expression pattern and localisation of lamin B3 during mouse spermatogenesis. By combining RT-PCR, immunoblotting, and immunofluorescence microscopy, it turned out, that lamin B3 is selectively expressed in postmeiotic stages during spermiogenesis. In round spermatids, lamin B3 is distributed in the nuclear periphery and, notably, also in the nucleoplasm. In the course of spermiogenesis, lamin B3 becomes redistributed as it concentrates progressively to the posterior pole of spermatid nuclei. The results show that during mammalian spermiogenesis the nuclear lamina is composed of B-type isoforms only, namely lamin B1 and the germ line-specific lamin B3. Lamin B3 is the first example of a mammalian lamin that is selectively expressed during postmeiotic stages of spermatogenesis. When ectopically expressed in culture cells, lamin B3 causes severe deformation of nuclei which adopt a hook-like configuration. Transfection experiments in COS-7 cells could prove that the observed nuclear deformations are due to the shortened rod domain of lamin B3. Cell fractionation experiments revealed that lamin B3 can be solubilised more easily than lamin B2. In addition, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) analyses of transfected COS-7 cells showed that considerable amounts of lamin B3 molecules exhibit a significantly increased mobility compared to lamin B2. The increased solubility of lamin B3 compared to lamin B2 as well as the mobility of that protein is only determined by its shortened rod domain. Taken together, these data lead to the conclusion that lamin B3 reduces the stability of the nuclear periphery, what might be an important prerequisite for some reorganisation processes during spermiogenesis to occur. Via a pull-down assay using a fusion protein containing GST and the 84 amino acid long N-terminal domain of lamin B3 a screen for interaction partners of lamin B3 was performed. With MSY2, MSY2a and MSY4 three interesting candidates were found. These proteins belong to the large family of Y-box containing proteins, which are DNA and RNA binding proteins. They are involved in storage and subsequent translation of various mRNAs, e.g. the mRNA of protamine 1 (this mechanism for regulation of gene expression is a major principle in spermatogenesis). The interaction between lamin B3 and the Y-box proteins has to be verified but it would provide an additional link between reorganisation of chromatin and the nuclear envelope as it has already been reported for other proteins of the nuclear envelope like GCL or LBR. Besides that it could be a first evidence for a specific function of the lamin B3 N-terminal domain. KW - Maus KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamin B KW - Genexpression KW - Spermatogenese KW - Kernlamina KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Lamin B3 KW - Spermiogenese KW - spermatogenesis KW - nuclear lamina KW - nuclear envelope KW - lamina KW - lamin B3 KW - spermiogenesis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17110 ER - TY - THES A1 - Toben, Catherine Gisela T1 - Generation and analysis of transgenic mice expressing ovalbumin as a neo-self antigen under control of the myelin basic protein promoter T1 - Generation and analysis of transgenic mice expressing ovalbumin as a neo-self antigen under control of the myelin basic protein promoter N2 - In this project two novel murine autoimmune models were to be established in an attempt to further investigate the nervous system disorders of Multiple Sclerosis and Guillain Barré Syndrome. Previous experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and experimental autoimmune neuritis (EAN) models have demonstrated that T cells play a major role in these diseases. Which roles CD4 and CD8 T cells specifically have in the initiation, propagation and termination of an autoimmune nervous system disorder remains controversial. To this end two transgenic mice specifically expressing the neo-antigen (Ag) ovalbumin (OVA) in either the central nervous system (CNS) or peripheral nervous system (PNS) were to be generated. The myelin basic protein (MBP) is a major component of the myelin sheath both within the CNS and the PNS. Therefore the MBP promoter was employed for its distinct regulatory elements to facilitate exclusive CNS or PNS OVA expression. The adoptive transfer of OVA specific MHCI restricted (OT-I) and MHCII restricted (OT-II) TCR Tg T cells extended the OVA Tg mouse model by allowing potentially encephalitogenic T cells to be tracked in vivo. Specificity for the target Ag should enable the dynamic role of antigen specific T cells in neuroinflammatory diseases to be revealed in more detail. N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei neue Mausmodelle für Autoimmunerkrankungen etabliert, um weitere Fortschritte bei der Aufklärung der zellulären und molekularen Interaktionen bei den Erkrankungen des Nervensystems Multiple Sklerose und Guillain Barré Syndrom zu erzielen. In früheren Experimenten mit EAE (experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis) und EAN (experimentelle autoimmune Neuritis) konnte bereits gezeigt werden, dass T-Zellen eine Hauptrolle bei diesen Erkrankungen spielen, wobei jedoch die Bedeutung von CD4 bzw. CD8 T-Zellen im Einzelnen noch nicht aufgeklärt ist. Zu diesem Zwecke sollten zwei transgene (Tg) Mauslinien generiert werden, die speziell entweder im peripheren (PNS) oder im zentralen (ZNS) Nervensystem das Zielantigen OVA exprimieren. MBP ist eine Hauptkomponente der Myelinscheide sowohl im ZNS als auch im PNS. Daher kam der Myelin Basic Protein (MBP) Promoter zum Einsatz, dessen unterschiedliche regulatorischen Elemente eine Expression von intaktem OVA ausschließlich im ZNS bzw. ausschließlich im PNS steuern können. Eine Erweiterung dieser OVA tg Mausmodelle stellte der adoptive Transfer von OVA spezifischen MHCI-restringierten OTI und MHCII-restringierten OTII T-Zellen dar, da es so möglich wurde, potentiell enzephalitogene T-Zellen in vivo zu verfolgen. Dadurch sollte ebenfalls eine detailliertere Darstellung der dynamischen Rolle von antigenspezifischen T-Zellen bei neuroinflammatorischen Erkrankungen ermöglicht werden. KW - Multiple Sklerose KW - Transgene Tiere KW - Maus KW - Antigen CD4 KW - Antigen CD8 KW - Guillain-Barré-Syndrom KW - Ovalbumin KW - Myelin Basic Protein Promoter KW - Transgen KW - T-Zelle KW - Ovalbumin KW - Myelin Basic Protein Promoter KW - Transgene KW - T cell Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16708 ER - TY - THES A1 - Bundschu, Karin T1 - Generation and characterization of spred-2 knockout mice T1 - Generierung und Charakterisierung von Spred-2 Knockout Mäusen N2 - Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (β-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable. N2 - Spreds gehören zu einer neuen Sprouty-verwandten Familie Membran-assoziierter Proteine, welche den MAPK Signalweg hemmen, indem sie mit Ras und Raf-1 interagieren. In Zellkultur-Systemen haben mehrere Studien bereits die hemmende Funktion von Spred gezeigt, aber die in vivo Funktion im Gesamtorganismus blieb bisher noch ungeklärt. In dieser Arbeit wurden deshalb Spred-2 Knockout Mäuse mithilfe eines Gene-trap Ansatzes generiert. Die Spred-2 Eliminierung konnte auf RNA- und Protein-Ebene bestätigt werden, und der Verlust des funktionsfähigen Spred-2 Proteins führte zu einem Achondroplasie-ähnlichen Zwergenwuchs, der häufigsten Form des menschlichen Zwergenwuchses. Die Spred-2-/- Mäuse waren insgesamt kleiner und hatten ein vermindertes Körpergewicht. Im Vergleich zu Wildtyp Mäusen war die Tibia-Länge verkürzt und die Wachstumsfugen verschmälert. In Knorpelzellen wurde sowohl die Aktivität des Spred-2 Promoters, als auch eine Spred-2 Proteinexpression detektiert, was auf eine wichtige Funktion in Knorpelzellen und bei der Knochenentwicklung schließen lässt. Im Vergleich zu Spred-2+/+ Knorpelzellen zeigte die Stimulierung von Spred-2-/- Knorpelzellen mit verschiedenen FGF-Konzentrationen eine frühere und verstärkte ERK-Phosphorylierung. Diese Beobachtungen deuten auf einen Mechanismus hin, bei dem der Verlust von Spred-2 das Knochenwachstum hemmt, indem die Knorpel-Differenzierung durch eine Hochregulation des MAPK Signalweges gehemmt wird. Spred-2-/- Mäuse zeigten nach Verletzungen eine erhöhte Blutungsneigung, wobei das verlorene Blutvolumen extrem vergrößert und die Blutungszeit signifikant verlängert war. Bislang konnte Bluthochdruck als Ursache ausgeschlossen werden, aber die verschiedenen Stufen der Blutstillung und Gerinnungskaskade müssen noch weiter untersucht werden, um die physiologischen Ursachen dieses Phänotyps ausfindig machen zu können. Untersuchungen der Spred-2 Promotoraktivität zeigten eine starke und spezifische Expression von Spred-2 in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigten vorhergehende Studien eine Interaktion von Spreds mit RhoA, einem Hauptregulator der Kontraktion glatter Gefäßmuskelzellen. Diesen Beobachtungen zufolge scheint die Regulation der Kontraktilität glatter Gefäßmuskelzellen ein guter Kandidat für dieses Phänomen zu sein. Weiterhin wurden Spred-1 und Spred-2 spezifische Antikörper hergestellt, die als elementares Werkzeug zur Untersuchung der Proteinexpression in der Maus notwendig waren. Bisher gab es noch keine Informationen über die Region und Regulation des Spred-2 Promotors. In dieser Arbeit wurde eine detaillierte in situ Analyse des physiologischen Promotoraktivitätsprofils in der Spred-2 defizienten Mauslinie gezeigt, die mit Hilfe des Gene-trap Vektors generiert wurde. In diesen Mäusen wurde das beta-Galaktosidase/Neomycin-Resistenz Fusionsgen (β-geo) des Gene-trap Vektors unter die Kontrolle des endogenen Spred-2 Promotors gebracht, und lieferte damit die Möglichkeit, die Spred-2 Promotoraktivität in praktisch jedem Organ und den zugehörigen Teilstrukturen beobachten zu können. X-Gal Färbungen von Gewebeschnitten neugeborener und erwachsener Mäuse zeigten 1) eine sehr starke Spred-2 Promotoraktivität in Nervengeweben und verschiedenen Drüsen; 2) eine starke Aktivität in glatten Muskelzellen des Uterus und Verdauungstraktes, sowie der Nieren; 3) eine geringe Aktivität in Herz, Hoden, Lunge und Leber; 4) eine fast fehlende Aktivität in Skelettmuskeln und Milz; und 5) interessanterweise eine starke und eindeutige Aktivität in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigte der Vergleich zwischen Organen von neugeborenen und erwachsenen Mäusen ein fast identisches Aktivitätsmuster. Diese detaillierten Daten liefern hilfreiche Informationen für weitere Untersuchungen der physiologischen Funktionen von Spred-2 vor allem in Organen mit starker Spred-2 Promotoraktivität, die in den meisten dieser Organe bisher noch immer ungeklärt sind. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch Gene-targeting Vektoren für Spred-1 und Spred-2 kloniert, die zur Generierung von embryonalen Stammzellen mit gefloxtem Exon 2 des Spred-1 bzw. Spred-2 Gens genutzt wurden. Diese embryonalen Stammzellen stehen nun als wertvolle Grundlage zur Etablierung von konditionalen Knockout Mäusen zur Verfügung. Dies ist von großem Interesse, um die physiologischen gewebespezifischen Funktionen von Spred-1 und Spred-2 zu untersuchen, vor allem wenn die Doppel-Knockout Mäuse nicht lebensfähig sein sollten. KW - Spred Protein KW - Knockout KW - Maus KW - Spred KW - Knockout Mäuse KW - Zwergenwuchs KW - EVH-1 KW - MAP Kinase KW - Spred KW - knockout mice KW - dwarfism KW - EVH-1 KW - MAP kinase Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14333 ER - TY - THES A1 - Rabie, Tamer T1 - Cellular regulation of platelet glycoprotein VI : in vivo and in vitro studies in mice T1 - Zelluläre Regulation von Plättchen Glykoprotein VI : in vivo und in vitro Studien in der Maus N2 - Platelet interaction with the subendothelium is essential to limit blood loss after tissue injury. However, upon rupture of atherosclerotic plaques, this interaction may result in blood vessel occlusion leading to life threatening diseases such as myocardial infarction or stroke. Among the subendothelial matrix proteins, collagen is considered to be the most thrombogenic component as it directly activates platelets. Platelets interact with collagen, either indirectly through glycoprotein (GP) Ib-V-IX receptor complex, or directly through the major collagen receptor on the platelet surface, GPVI. The work presented here focused on studying the cellular regulation of GPVI. In addition, a possible role for GPVI in thrombus formation induced by atherosclerotic plaque material was investigated and it was found that GPVI plays an important role in this process. Using a recently published mitochondrial injury model, it was found that GPVI contains a cleavage site for a platelet-expressed metalloproteinase. Further studies showed that platelet activation by CRP, or thrombin induced down-regulation of GPIb, but not GPVI. In parallel, cellular regulation of GPV was studied and it was found that GPV is cleaved in vitro by the metalloproteinase ADAM17. In previous studies it was shown that injection of mice with the anti-GPVI mAb, JAQ1, induces GPVI down-regulation, which is associated with a strong, but transient, thrombocytopenia. Using new anti-GPVI mAbs, which bind different epitopes on the receptor, it is shown in this study that GPVI down-regulation occurs in an epitope-independent manner. Further experiments showed that antibody treatment induces a transient, but significant increase in bleeding time. Using different genetically modified mice, it is shown that, upon antibody injection, GPVI is both, shed from the platelet surface and internalized into the platelet. Signaling through the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) of the FcR chain is essential for both processes, while LAT and PLC2 are essential for the shedding process only. Antibody-induced increase in bleeding time and thrombocytopenia were absent in LAT deficient mice, showing that it is possible to uncouple the associated side effects from the down-regulation process. As antibody-induced GPVI internalization still occurs in LAT and PLC2 deficient mice, this suggests a novel signaling pathway downstream of GPVI that has not been described so far. N2 - Plättchen Interaktion mit dem Subendothel ist für die Blutstillung essentiell. Dies kann jedoch nach dem Aufbrechen atherosklerotischer Plaques zu lebensbedrohlicher Erkrankungen wie Infarkt oder Schlaganfall führen. Kollagen, welches die Plättchen dirket aktiviert, ist der thrombogenste Bestandteil der Extrazellularmatrix (EZM). Die Bindung zwischen Plättchen und Kollagen wird sowohl indirekt durch den Glykoprotein (GP) Ib-V-IX Rezeptorkomplex, als auch direkt durch den Kollagenrezeptor GPVI, auf der Plättchenoberfläche vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Regulation von GPVI untersucht. Des Weiteren wurde die Rolle von GPVI in durch atheroklerotisches Plaquematerial induzierter Thrombusbildung studiert. Hierbei wurde festgestellt, dass GPVI eine wichtige Funktion in diesem Prozess spielt. Mittels eines jüngst publizierten mitochondrialen Verletzungsmodels, konnte gezeigt werden, dass GPVI eine Erkennungsstelle für eine in den Plättchen exprimierte Metalloproteinase besitzt. Mehrere Versuche haben gezeigt, dass Plättchenaktivierung durch CRP, und Thrombin zur Runterregulierung von GPIb aber nicht von GPVI führt. Parallellaufende Untersuchungen zeigten, dass GPV durch die Metalloproteinase ADAM17 in vitro abgespalten wird. Vorherige Studien ergaben, dass die in vivo Behandlung von Mäusen mit dem anti-GPVI Antikörper, JAQ1, zur Runterregulierung des Rezeptors führt. Dieses ist mit einer starken, transienten Thrombozytopenie assoziiert. Mittels neu generierte anti-GPVI Antikörper (JAQ2, 3), die unterschiedliche Bindungsstellen auf GPVI erkennen, konnte demonstriert werden, dass die Antikörper vermittele GPVI Runterregulierung Epitop unabhängig ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass Anitkörperinjektion eine transiente Erhöhung der Blutungszeit verursacht. Mittels genetisch modifizierter Mäuse konnte dargestellt werden, dass die Antikörpergabe GPVI sowohl von der Plättchenoberfläche abgespalten, als auch internalisiert wird. Während die Signaltransduktion durch das ITAM Motif der FcR Kette essentiell für beide Prozesse ist, sind LAT und PLC2 nur für das Abspalten wichtig. Antikörper induzierte Erhöhung der Blutungszeit und Thrombozytopenie sind abwesend in LAT-defizienten Mäuse, was zeigt, dass möglicherweise die GPVI Runterregulierung von den assoziierten Nebenwirkungen zu trennen ist. Da die GPVI Runterregulierung in LAT und –PLC2 defizienten Mäusen weiterhin stattfindet, zeigt dies einen neuen GPVI Signalweg, der bisher noch nicht beschrieben wurde. KW - Maus KW - Thrombozyt KW - Glykoproteine KW - Regulation KW - Biologie KW - Plättchen KW - Maus KW - Thrombose KW - Kardiovaskulär KW - maus KW - platelets KW - thrombosis KW - cardiovascular Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14267 ER - TY - THES A1 - Brand, Normen T1 - Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine T1 - Localization, regulation and interactions of murine DNA replication proteins N2 - Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert. N2 - Eukaryotic DNA replication is a crucial event in the cell cycle ensuring precise duplication of the genome by the coordinated action of a multitude of proteins. To cope with this enormous logistical challenge DNA replication is organized in multiple steps comprising initiation processes, elongation and DNA repair. The initiation step is characterized by the chromatin association of the hexameric ORC (origin recognition complex) which selects controversely discussed DNA sequences as replication origins and serves as a landing pad for further protein components. The MCM complex consisting of the six subunits Mcm2-7 accomplishes the pre-RC in a Cdc6- and Cdt1-dependent manner and is supposed to be released from the origin following initiation to act as DNA helicase, triggering the unwinding of the DNA double helix. This allows the proteins of the elongation machinery to accurately synthezise DNA at distinct microscopically visible sites termed replication foci. A major component of replication foci, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) acts as a sliding clamp tethering the DNA polymerases and further replication factors to DNA. Within the scope of this thesis, the distribution of ORC, MCM and PCNA proteins was investigated in murine L fibroblasts by dual-color immunofluorescence (IF) studies. It could be shown that the proteins of the ORC, the MCM complex and the elongating machinery constitute locations for three different mechanistical events involved in DNA replication which occur at distinct and spatially separated sites, i. e. initiation, helicase activity and elongation. Additionally, IF studies suggest, that histone acetylation is involved in the selection of origins and the recruitment of the pre-RC to chromatin. The assembly of the pre-RC begins in mitosis and is regulated by the activity of multiple protein kinases. To test whether the key regulator of mitotic events, POLO-like kinase1 (Plk1), is capable of phosphorylating pre-RC components, in vitro kinase assays were carried out using full-length Plk1 and a kinase-deficient mutant Plk1 (K82M) as a negative control together with bacterially expressed target proteins. Orc2, Cdc7 and Cdc45 were found to be in vitro substrates of the Plk1 kinase. Furthermore, IF studies using specific antibodies against Orc2, Cdc7 and Cdc45 revealed conspicuous staining patterns for the Plk1 substrates in mitosis. While Orc2 was accumulated in the midbody region in telophase, Cdc7 was localized at the centrosomes and micotubules in anaphase. Cdc45 was found at the centrosomes and the microtubules from prometaphase to anaphase, and in the midbody region during telophase, strikingly matching the mitotic localization patterns of Plk1. The detection of protein-protein interactions is crucial for the understanding of the course of events in DNA replication. By using the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique interactions among components of the pre-RC were analyzed in living mammalian cells. The BRET studies revealed direct interactions between Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 and Plk1 & Dbf4. Furthermore, the influence of histone hyperacetylation, as well as the depletion of cyclin-dependent kinases (CDK) on the interaction between Orc2 and Orc3 was investigated. Orc2 and Orc3 were found to be localized in the nucleus and the cytoplasm. To investigate, whether nuclear import of Orc3 is a prerequisite for the interaction of Orc2 with Orc3 to occur, a putative nuclear localization signal (NLS) in the aminoterminal region of Orc3 was truncated in an EGFP-ORC3 fusion construct. Expression of this mutant in L fibroblasts and HEK293T cells resulted in exclusive cytoplasmatic localization. BRET assays using ORC2-Rluc and the NLS-deficient EGFP-ORC3 mutant were performed. In this experiment, a BRET signal was obtained which was indistinguishable from that obtained with wild-type EGFP-ORC3. Together, these findings strongly suggest that the interaction between Orc2 and Orc3 is not restricted to the nucleus. The nuclear as well as the cytoplasmatic distribution of the localization between Orc2 and Orc3 could furthermore be confirmed with a recently developed BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assay. FLIP (fluorescence loss in photobleaching) studies with BiFC-positive cells showing exclusive nuclear distribution revealed decreased mobility of Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) compared with EGFP fusion proteins of Orc2 (t ½ = 8 s) and Orc3 (t ½ = 6 s), suggesting that the association with its binding partner leads to an enhanced capability of Orc2 and Orc3 to bind to chromatin. Additionally, the influence of point mutations on the subcellular localization and intranuclear dynamics of a Cdc6-EGFP fusion protein, previously shown to be localized in replication foci, was analyzed. Further, the mobility of promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) and PML-associated proteins was investigated. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - Interaktion KW - Regulation KW - DNA-Replikation KW - Zellzyklus-Kontrolle KW - präreplikativer Komplex KW - Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer KW - DNA replication KW - cell cycle control KW - pre-replicative complex KW - bioluminescence resonance energy transfer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057 ER - TY - THES A1 - Klein, Jörg T1 - Verwendung von Gene-Targeting-Techniken zur Etablierung neuer Mauslinien mit Mutationen in B-Zell-Signalwegen T1 - Usage of Gene Targeting techniques for establishing new mouse lines with mutations in B-cell signaling N2 - Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberflächenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialinsäure bindende Igähnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazelluläre Immunoglobulin-ähnliche Domänen und kann über die äußerste V-set Domäne seine Liganden: α2,6 verknüpfte Sialinsäuren binden. CD22 hat eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente Mäuse zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdomäne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdomäne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Phänotyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adhäsions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenhängen. Der „Targeting“ Vektor für die „Gene Targeting“ Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Ursprünglich wurde ein „Targeting“ Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir für ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchimäre Mäuse erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie für neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verlängerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5’-Richtung verlängert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erhöhen, durchgeführt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot bestätigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten fünf chimäre Tiere gewonnen werden. Ein 80 %ig chimäres Männchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie für die Gene Targeting Experimente für einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c Mäusen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilität ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Domäne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor führte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der ursprünglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universität Würzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-β Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene näher zu untersuchen. Von Erwin Böttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-β Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-β Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Veränderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erhöhung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der für TGF-β beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- Mäuse hingegen nicht beeinträchtigt. N2 - The main topic of this thesis dealt with the B cell-specific transmembrane protein CD22, a member of the Siglec (Sialic-acid binding Ig-like lectin) protein family. This transmembrane protein posseses seven extracellular domains and is capable to bind α2,6 sialic acids via its most outer V-set domain. Furthermore there are one transmembrane domain and six potential tyrosine-based phosphorylation motifs, three of which match ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) consensus sequences. CD22 deficient mice clearly showed that the Siglec CD22 is a negativ modulator of BCR signalling. BCR engagement causes tyrosine phosphorylation of CD22, now the inhibitory tyrosine phosphatase SHP-1 is able to bind, is then getting activated and is thus inhibiting the BCR Ca2+ signal. To elucidate the function of the CD22 adhesion domain in vivo, especially concerning the connection with CD22 signalling, one main topic of this work was to generate a CD22 knock in mouse (CD22R130E), in order to functionally eliminate the CD22 adhesion domain through a point mutation. The resulting new mouse line should give the opportunity to investigate B-cell development, signal transduction and the immune status ot the CD22R130E mouse. The comparison between the phenotypes of the CD22R130E mouse and the CD22 deficient mouse should resolve the interplay of adhesion and signalling of CD22. The cloning of the targeting vector for the gene targeting experiments was done in the laboratory of Dr. Anton van der Merwe (by Christina Piperi). Basically, the idea was to keep the C57BL/6 genetic background, which was already used to generate the CD22 deficient mouse by Dr. Lars Nitschke (Nitschke et al. 1997). This vector was used by me for the ES cell transfection experiments with the C57Bl/6-III ES cell line. Finally, two ES-cell clones could be identified from gene targeting experiments with the C57BL/6 ES-cell line, which carried a correct homologous integrated target vector. With one Cre-deleted C57BL/6 subclone it was possible to generate six chimaeric animals from one injection experiment, although none of these animals could give rise to germline transmission. Since occurence of crucial problems with the germline transmission of C57BL/6-III ES-cell clones, the BALB/c and E14Tg2a ES-cell lines were used for new gene targeting experiments. With the following gene targeting experiments using the BALB/c ES-cell line no homologous recombinants were obtained. This was probably due to the non-isogenic background. All following experiments performed with the E14Tg2a ES-cell line (genetic background: 129/ola) were carried out with the elongated R130E-targeting vector (targeting vector 2). This vector was created by using a genomic 129/ola template, in order to gain a new isogenetic 2.3 kb 5’- fragment. These experiments gave rise to two ES-cell clones with a correct homologous recombination event confirmed by southern blot. It was now possible to generate five chimaeric animals out of three injection experiments with these two EScell clones. One male animal, with 80 % chimaerism, produced offspring with germline transmission. The analysis of these animals with germline transmission showed that all of them possessed a wildtype like genotype. This thesis dealt with a further member of the Siglec protein family, the murine SiglecG (an ortholog to human Siglec10). In collaboration with the laboratory of Dr. Paul Crocker a SiglecG knock out mouse was to be generated. The strategy to do the gene targeting experiments was based on the usage of the BalbI ES-cell line (from BALB/c mice), since it possesses well known stability concerning pluripotential and germline transmission potential. In the laboratory of Paul Crocker (by Sheena Kerr) a control and target vector was cloned, which should eliminate a large part of the first and second Ig-domain of SiglecG. I performed different ES-cell transfection experiments with this vector. Within the timecourse of my work it was not possible to gain any ES-cell clones with correct homologous integration events. Later on ES-cell clones, germline transmission and generation of the SiglecG deficient mouse was achieved with the original strategy by the following Phd student. Another collaboration was evolved by Dr. Burkhard Kneitz (Department of Physiological Chemistry I, Würzburg). His intention was to investigate the meaning of the TGF-β signalmediator SMAD2 in a B-cell specific manner. From Erwin Böttinger we received a mouse line with a floxed Smad2 gene, which was crossed with a CD19-Cre mouse line (Rickert et al. 1997). Thus a B-cell specific SMAD2 knock out mouse (bSmad2-/-) was generated. I had to analyse the B-cell compartments and the immune responses of the B-cell specific SMAD2 knock out mouse. Taking together all data gained with the newly generated B-cell specific SMAD2 knock out mouse showed that the signalmediator SMAD2 is a crucial downstream component of TGF-β signalling in B-cell biology. The crucial differences of bSmad2-/- animals in comparison to control animals were given in an increase of cells of Payers Patches (PP) and B1 cells of peritoneal lavages. The IgA immune response was strongly reduced in bSmad2-/- animals. The well known effect of TGF-β concerning inhibition of proliferation with activated B-cells (Kehrl et al. 1986; 1989; 1991) was not impaired with activated B-cells of bSmad2-/- animals. KW - B-Lymphozyt KW - Signaltransduktion KW - Antigen CD22 KW - CD22 KW - Maus KW - B-Zellen KW - Homologe Rekombination KW - Signaltransduktion KW - Zelladhesion KW - Gene Targeting KW - B-cell signaling KW - Siglecs KW - CD22 KW - Adhesion Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13615 ER - TY - THES A1 - Auth, Tanja T1 - Funktionelle Analyse der Interaktion und Lokalisation von Replikationsfaktoren und replikationsrelevanten Proteinen in Mauszellen T1 - Functional analysis of the interaction and localization of replicationfactors and replicationrelevant proteins in murine cells N2 - Zeil dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die mit Bestandteilen des für die DNA-Replikation essentiellen präreplikativen Komplexes in der Maus wechselwirken. Hierbei konnten Interkationen des Heterochromatin Proteins 1a mit den Replikationsfaktoren ORC1, ORC2 und CDC6 sowohl in Two Hybrid-Studien als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden. Darüberhinaus konnten signifikante Kolokalisationen dieser Proteine mit HP1a an heterochromatischen Regionen in murinen NIH3T3-Zellen nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte hier erstmals eine Lokalisation von HP1a am Centrosom demonstriert werden. Ein siRNA-vermittelter Knock Down von HP1a zeigte jedoch keinen direkten Einfluß auf die Replikation. Es konnte hingegen gezeigt werden, daß ein Knock Down von HP1a in signifikatnen Defekten in der Cytokinese und einer deutlich verlangsamten Zellproliferation resultiert. So konnten häufig multinukleäre Zellen und eine Arretierung in der G1-Phase beobachtet werden. Weiterhin wurde der Einfluß der Phosphorylierung von HP1a durch die Casein Kinase II mithilfe von Phosphorylierungsmutanten untersucht. Im Gegensatz zu Drosophila-Zellen zeigten sich in murinen Zellen jedoch keine Auswirkungen dieser Mutationen auf die Lokalisation von HP1a an Heterochromatin. Wieterhin konnten Interaktionen des Replikationsinhibitors Geminin mit den Replikationsproteinen ORC1, ORC2 und CDC7 sowohl im Two Hybrid-System als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden, die unterschiedliche Zellzyklusabhängigkeiten aufwiesen. In murinen NIH3T3-Zellen zeigte eine Knock Down von Geminin jedoch im Gegensatz zu anderen Zellinien keinen Einfluß auf die Replikation. In weiteren Teilen dieser Arbeit konnten Interaktionen des Retinoblastoma Proteins mit ORC2 und MCM7 sowohl in Two Hybrid- als auch in Immunpräzipitations-Experimenten gezeigt werden. Darüberhinaus wies Pescadillo Interaktionen mit den Replikationsproteinen ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 und CDC45 im Two Hybrid-System und Interaktionen mit MCM2 und MCM3 in Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten auf. Eine Kolokalisation von Pescadillo und ORC6 in den Nukleoli läßt auf eine Funktion beider Proteinen bei der Ribosomen Biogenese schließen. Es konnten ebenfalls Interaktionen der Untereinheit E1 des humanen Papillomavirus Subtyp 11 mit den Replikationsfaktoren ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb und Pescadillo im Two Hybrid-System beobachtet werden. N2 - The identification of proteins, which interact with members of the for the initiation of DNA replication necessary prereplicative complex in murine cells was of greatest interest for this work. Thereby, interactions of the heterochromatin protein 1a with the replication proteins ORC1, ORC2 and CDC6 were demonstrated in the two-hybrid system as well as in immunoprecipitations. Furthermore, significant colocalisation of these proteins with HP1a could be observed at heterochromatic regions in murine NIH3T3 cells. In NIH3T3 cells HP1a is also localisized on the centrosome. Knock down of HP1a by siRNAs showed however no direct influence on DNA- replication. Though, a knock down of HP1a resulted in significant defects in cytokinesis and reduced cell proliferation. Thus, frequntly cells with several nuclei and an arrest of the cells in G1 phase could be observed. Furthermore, the influence od phosphorylation of HP1a by Casein kinase II was analysed with phosphorylationssite In contrast to Drosophila cells there were no differences of the localization of Hp1a on heterochromatin in murine NIH3T3 cells. Also interactions of the replication inhibitor Geminin with the replication factors ORC1, ORC2 und CDC7 were found in two-hybrid analyses as well as in immunoprecipitations, which showed several cell cycle dependence. However, in murine NIH3T3 cells a knock down of Geminin showed in contrast to several other cell lines no influences on DNA replication. In a furthe part of this work interactions of the Retinoblastoma protein with ORC2 and MCM7 were observed in two-hybrid experiments as well as in immunoprecipitations.Furthermore, Pescadillo showed interaction with the replication proteins ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 and CDC45 in the two-hybrid system as well as interactions with MCM2 and MCM3 in bioluminescence resonance energytransfer experiments. The coloalization of Pescadillo and ORC6 in nucleoli points to a function of these proteins in ribosome biogenesis. In a further part of this work there were also interactions of the protein E1 of the human Papilloma virus 11 with the replication proteins ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb and Pescadillo observed in two-hybrid screenings. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - Replikation KW - Heterochromatin Protein 1 KW - Geminin KW - Retinoblastoma Protein KW - Pescadillo KW - replication KW - heterochromatin protein 1 KW - Geminin KW - retinobalstoma protein KW - Pescadillo Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13082 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Thomas T1 - Sequenz-spezifische Interaktion des murinen präreplikativen Komplexes mit Origin-DNA T1 - Sequence specific interaction of the murine prereplicative Complex with origin DNA N2 - Mit Hilfe von in vivo ChIP-Experimenten identifizierten wir eine präRC Bindungsstelle von -2519 bis -2152 (Fragment B) innerhalb eines „origin of bidirectional replication (OBR)“ der 44 kb langen Maus-rDNA-Einheit. Diese Bindungsstelle befindet sich ungefähr 2,3 kb ubstream des Transkriptionsstartpunktes der RNA-Poymerase I. An dieser Bindungsstelle konnte in der G1-Phase der komplette ORC-Komplex sowie Geminin, MCM3 und -6 nachgewiesen werden. Für den G1/S-Phasenübergang deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich ORC6 und Geminin von Fragment B ablösen, während sich CDC6 und -45 an den ORC-Komplex anlagern. Mit Erreichen der S-Phase konnte gezeigt werden, dass sich CDC6 und -45 sowie ORC1 wieder ablösen und ein Core-Komplex von ORC2-5 sowie MCM3 und -6 gebunden bleibt. Außerdem konnte an Fragment B eine spezifische Bindung eines aus FM3A-Zellkernprotein angereicherten präRC-Komplexes (Komplex A) auch in vitro mit Hilfe von EMSA-Experimenten beobachtet werden. Die Bindungsaktivität von Komplex A an Fragment B konnte durch ATP verstärkt werden. N2 - Using chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) we identified in vivo a preRC binding site located from -2519 to –2152 (fragment B) within a previously mapped origin of bidirectional replication of the murine rDNA locus located approximately 2.3 kb upstream of the transcription start site of RNA polymerase I. At this sequence, ORC1, -2, -3, -4, -5 -6 as well as Geminin, MCM3 and -6 are bound in G1 phase; at the G1/S transition also CDC6, and -45 interact whereas ORC6 as well as Geminin dissociates. In S phase, ORC1, CDC6 and -45 are released from the preRC. We have reproduced an ATP-dependent assembly of the preRC at origin DNA in vitro using EMSA-Experiments with partially purified proteins from murine nuclear extracts. KW - Maus KW - Zellzyklus KW - Replikation KW - Replikationsursprung KW - präRC KW - Zellzyklus KW - ATP-Abhängigkeit KW - Maus KW - Origin of Recognition KW - preRC KW - Cell cycle KW - ATP-dependent KW - murine KW - Origin of Recognition Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11241 ER - TY - THES A1 - Schulz, Carsten T1 - Analyse des Replikationsprozesses der Maus T1 - Analysis of the murine replication process N2 - Die Initiation der DNA-Replikation ist in Eukaryonten ein hochkonservierter Prozess. Zuerst bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsstartpunkte chromosomaler DNA und stellt das Startsignal für die Assemblierung des präreplikativen Komplexes (pre-RC) dar. Anschließend assoziieren die Initiationsfaktoren CDC6 und CDT1 mit dem ORC. Durch die Rekrutierung des MCM-Komplexes wird der pre-RC schließlich vervollständigt. Die Aktivität der CDC7/DBF4-Kinase und die Anlagerung von CDC45 lizensiert den Origin für die DNA-Replikation. Ein Ziel dieser Arbeit war, den vollständigen murinen ORC rekombinant darzustellen. Um den gesamten Komplex durch Copräzipitation zu isolieren, wurden ORC1, 3, 4, 5 und 6 als Wildtyp-Proteine und ORC2 mit einer N-terminalen Poly-His-Domäne mit Hilfe von Baculoviren koexprimiert. Nach der Aufreinigung konnten, mit Ausnahme von ORC3, alle ORC-Untereinheiten in den Elutionsfraktionen immundetektiert werden. Eine Gelfiltration der Fraktionen ließ auf die Isolierung eines 450 kD großen Komplexes schließen, der mindestens fünf der sechs ORC-Untereinheiten enthielt. Dies zeigt, dass der murine ORC als Holokomplex rekombinant isoliert werden kann. In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte die Rolle des MCM-Komplexes bei der Termination der DNA-Replikation am 3'-Ende muriner rDNA-Transkriptionseinheiten untersucht werden. Durch polare Replikationsgabelbarrieren im 3'-Bereich der ribosomalen Gene wird über die Kontrahelikaseaktivität von TTF-I die Bewegungsrichtung der Replikation auf die Richtung der Transkription limitiert. In dieser Arbeit sollte festgestellt werden, ob dies auch bei der murinen MCM4/6/7-Helikase der Fall ist. Um MCM4/6/7-Hexamere zu isolieren, wurden die Untereinheiten MCM4 und 7 in Wildtyp-Form und MCM6 mit einem N-terminal fusionierten HA-Tag mittels Baculoviren koexprimiert. Zur Durchführung der Kontrahelikasestudien musste die Helikaseaktivität der isolierten Komplexe ermittelt werden. Bereits mit kurzen partiell doppelsträngigen M13-Substraten (17 nt) zeigte sich eine geringere Entwindungsfähigkeit als in der Literatur beschrieben. Bei weiteren Helikasestudien wurden DNA-Substrate (30 nt) mit einem 5'-Überhang sowie SSB bzw. RPA eingesetzt. Zwar konnte so eine Steigerung der Helikaseaktivität von MCM4/6/7 verzeichnet werden, jedoch fand diese nicht in ausreichendem Maße statt. Zudem war das entwundene Oligonukleotid einem Abbau unterworfen, dessen Ursache nicht aufgeklärt werden konnte. Aufgrund der zu geringen Helikaseaktivität im Hinblick auf die TTF-I-Kontrahelikasestudien wurden diese Arbeiten eingestellt. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war der Transport von MCM-Proteinen in den Zellkern. Der MCM-Komplex ist in fast allen Organismen konstitutiv im Zellkern lokalisiert. Die Überexpression einzelner exogener MCM-Proteine zeigte allerdings, dass nur MCM2 und 3 mit Hilfe ihrer ihrer NLS-Motive in den Kern transportiert werden, während dies bei MCM4 bis 7 nicht erfolgt. Two-Hybrid-Studien unserer Arbeitsgruppe ließen auf paarweise Wechselwirkungen der MCM4 bis 7-Untereinheiten mit MCM2 bzw. MCM3 schließen. Deshalb wurden EGFP-MCM-Proteine zusammen mit Wildtyp-MCM-Proteinen in Mauszellen koexprimiert. Dabei zeigte sich, dass MCM2 die Proteine MCM4, 6 und 7 in den Kern transportiert, während MCM3 nur MCM5 in den Zellkern einschleust. Weitere Interaktionen zwischen MCM6 und 4 sowie zwischen MCM6 und 7 konnten bei MCM4/6/7-Aufreinigungen beobachtet werden. Zuletzt wurde noch die Lokalisation von CDT1 in der OBR-Region des murinen rDNA-Cistrons untersucht. Bislang wurde nur in S. cerevisiae eine sequenzspezifische ORC-Bindung an ACS-Bereiche identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe konnte im murinen rDNA-Cluster stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes ein Origin charakterisiert und die Bindungstelle verschiedener Initiatorproteine um die Position -2500 eingegrenzt werden. Die Assoziation von CDT1 mit derselben Region würde die Assemblierung eines pre-RC in dem untersuchten Bereich zusätzlich bestätigen. Zur Umsetzung von ChIP-Studien wurden CDT1-Antikörper hergestellt. Um die Assemblierung von CDT1 mit dem Origin in Abhängigkeit des Zellzyklus zu untersuchen, wurden FM3A-Mauszellen in früher G1-, später G1-, G1/S-, S- und in der G2/M-Phase arretiert. Die Auswertung der ChIP-Analysen, die den zu analysierenden Bereich von -2837 bis -1820 umspannten, zeigte, dass CDT1 ausschließlich während der G1-Phase mit dem Chromatin assoziiert ist. Dies ist konsistent mit der Aktivität von CDT1 während des Zellzyklus in Säugern. Der höchste Anteil an DNA-gebundenem CDT1 konnte in dem Bereich -2519 bis -2152 festgestellt werden. Eine Sequenzanalyse des OBR der murinen rDNA lieferte keine Homologie zu anderen bekannten Origins. Jedoch wurden diverse DNA-Strukturelemente, wie z.B. HSS, DUEs oder CpG-Inseln, sowie verschiedene Protein-Bindungsstellen gefunden, die potentiellen Einfluss auf die Festlegung des murinen OBR haben könnten. N2 - The eukaryotic initiation of DNA replication is a highly conserved process. In the first step the binding of the "origin recognition complex" (ORC) to replication origins of chromosomal DNA acts as a start signal for the assembly of the pre-replicative complex (pre-RC). Subsequently the initiation factors CDC6 and CDT1 associate with ORC. The following recruitment of the MCM complex finally completes the pre-RC. The activity of the CDC7/DBF4 kinase and the binding of CDC45 license the origin and allow the initiation of DNA replication. One aim of this work was to purify a recombinant murine ORC. In order to isolate the entire complex by co-precipitation, wild-type ORC1, 3, 4, 5 and 6 and ORC2 that contained a His6 epitope tag at its N-terminus were co-expressed by means of baculoviruses. After the following purification, all ORC subunits with the exception of ORC3 were detected in the isolated fractions by immunoplotting. Analysis of the fractions after gel filtration indicated the isolation of a large complex corresponding to a molecular mass of 450 kD, which contained at least five of the six ORC subunits. Therefore, we assume that the recombinant murine ORC was isolated as a holo-complex. A further part of this work deals with the role of the MCM complex in the termination of DNA replication at the 3' end of murine rRNA transcription units. Polar replication fork barriers in the 3' region of ribosomal genes limit progression of DNA replication to the same direction as rDNA transcription by the contrahelicase activity of TTF-I. In this study it should be determined whether murine MCM4/6/7 helicase activity is impaired in the same manner. In order to isolate hexameric MCM4/6/7 complexes wild-type MCM4 and MCM7 proteins and MCM6 with an N-terminal fused HA epitope tag were coexpressed by means of baculoviruses. For contrahelicase experiments, the helicase activity of the isolated complexes had to be obtained. The unwinding activity of short partial duplex M13-substrates (17 nt) was lower than described in literature. For subsequent contrahelicase studies DNA substrates (30 nt) with a 5' tail as well as SSB or RPA were applied. Though it was possible to increase the helicase activity of MCM4/6/7 by forked DNA substrates, this was not sufficient for our studies. Moreover, the unwound oligonucleotide was subjected to degradation, the cause of which could not be explained. The work on this topic was stopped since the helicaseactivity of MCM4/6/7 was insufficient regarding further TTF-I contrahelikase studies. A further aspect of this work was the transport of MCM proteins into the nucleus. The MCM complex is constitutively located in the nucleus of almost all organisms. However, the overexpression of individual ectopically expressed MCM proteins showed that only MCM2 and 3 are transported into the nucleus due to their NLS motives, while this is not possible for MCM4 to 7. Two-hybrid studies of our group suggested pairwise interactions of MCM4, 6, 5 and 7 with MCM2 and/or MCM3. Therefore, various EGFP-MCM proteins were coexpressed together with wild-type MCM proteins in mice cells. It was shown that MCM2 directs MCM4, 6 and 7 into the nucleus, whereas MCM3 transfers only MCM5 into the nucleus. This behaviour reflects possible pairwise interactions within MCM subcomplexes. Further interactions of MCM6 with MCM4 and MCM7 were observed at MCM4/6/7 purifications described above. Further the cell cycle-dependent localization of CDT1 in the OBR region of the murine rRNA transcription unit was examined. So far only in S. cerevisiae a sequence-specific ORC assembly at the ACS region has been identified. In our group a murine OBR has been characterized upstream to the rDNA transcription start site und the binding site of various initiation factors has been localized around position -2500. The association of CDT1 within the same region would confirm the assembly of a pre-RC. For ChIP studies monospecific antibodies against CDT1 have been produced. In order to examine the cell cycle-dependent assembly of CDT1 within the initiation site, FM3A cells were arrested in early G1 phase, in late G1 phase, at the G1/S transition, in S phase and in the G2/M phase. The evaluation of the ChIP studies, which encompassed the range from -2837 to -1820 revealed, however, that CDT1 is associated with the chromatin exclusively during the G1-Phase. This is consistent with the activity of CDT1 during the cell cycle in mammalian cells. The major part of DNA-bound CDT1 was observed within the range -2519 to -2152. The sequence of the murine OBR exhibits no homology to other origins described in the literature. But sequence analysis revealed various DNA structure elements, e.g. HSS, DUEs or CpG islands, as well as several protein binding sites of potential importance for determination of the murine OBR. KW - Maus KW - Replikation KW - Replikationsursprung KW - Replikation KW - Initiation KW - ORC KW - MCM KW - CDT1 KW - replication KW - initiation KW - ORC KW - MCM KW - CDT1 Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11199 ER - TY - THES A1 - Faul, Thomas T1 - Lokalisation und Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes T1 - Localization and dynamics of replication proteins of the murine pre-replicative complex N2 - Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-Übergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und während der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzelluläre Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 % von CDC6-EGFP während der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen für Cyclin-abhängige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste für die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern führt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilität von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilität des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erhöht. In der G1-Phase wurde die Mobilität von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilität von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelförmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. Während ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifität der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-Übergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody während der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilität des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleolären Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 %igen immobilen Fraktion vorlag während das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar. N2 - One task of this work was to analyze the localization and the dynamics of murine replication proteins in murine fibroblasts in vivo. Therefore, these proteins were expressed as EGFP fusion proteins and analyzed with a confocal laser scanning microscope in vivo. During G1 phase CDC6-EGFP was diffusely distributed throughout the cell. At entry into S phase an increased intensity of CDC6-EGFP staining was found throughout the nucleus, concurrent with the appearance of numerous foci. CDC6-EGFP localized during S phase in replication foci. Endogenous Cdc6p showed an identical cell cycle-specific distribution pattern as CDC6-EGFP in transfected cells. The distribution pattern of fusion proteins of human Cdc6p in HEK-293T was identical to that of murine CDC6-EGFP in L cells. FRAP experiments demonstrated that ~80-90% of CDC6-EGFP were stably associated with the replication apparatus during S phase. To investigate the influence of the phosphorylation status of the three Cdk sites on subcellular localization of CDC6-EGFP in vivo, these sites were mutated. Mutation of conserved serine residues within these consensus sites to nonphosphorylatable alanine residues had no effect on localization of corresponding mutants in replication factories, indicating that phosphorylation of these Cdk sites is dispensable for localization of CDC6-EGFP in replication factories. Mutation of serine residues to aspartates to mimic the negative charge of a phosphate indicated that phosphorylation of serine residue 102 mediates cytoplasmatic localization of CDC6-EGFP. FRAP studies of CDC6-EGFP mutants documented that serine residue 82 of CDC6-EGFP in replication factories was phosphorylated while serine residue 102 was non-phosphorylated. Interestingly, no colocalization of replication foci and acetylated proteins was observed, indicating hypoacetylation of chromatin in replication foci during DNA replication. Treatment of cells expressing CDC6-EGFP with TSA had no influence on localization and dynamics of CDC6-EGFP in replication foci. However, the mobility of the nucleoplasmatic pool of CDC6-EGFP was enhanced. The dynamics of CDC6-EGFP were reduced after TSA treatment during G1 phase. ORC1-EGFP accumulated in globular structures in the nucleus while ORC2-EGFP was diffusely distributed throughout the cells. ORC3-EGFP was localized in “PML nuclear bodies”. ORC4-EGFP and ORC5-EGFP were found to be localized at the centrosome. ORC6-EGFP accumulated in nucleoli. EGFP fusion proteins of Cdc45p, DNA ligase I and PCNA were diffusely distributed in the nucleus. Another task of this work was the identification of in vitro substrates of murine Cdc7p/Dbf4p kinase. Recombinant in Sf9 cells expressed Cdc7p/Dbf4p phosphorylated Orc2p, Orc6p, Cdc45p and Mcm6p in vitro. Phosphopeptide maps of phosphorylated Cdc7p revealed, that Cdc7p was phosphorylated by CyclinE/Cdk2 at one site, whereas CyclinA/Cdk2 phosphorylated Cdc7p at two different sites. CDC7-EGFP was diffusely distributed in the nucleus during G1 phase, G1/S and S phase. Using FISH chromosomal localization of mouse Cdc7 gene was mapped to chomosome 5, band 5E. To identify in vitro substrates of murine Plk1p, kinase assays were performed using pre-RC proteins as substrate. Recombinant in Sf9 cells expressed Plk1 kinase phosphorylated Cdc7p, Orc2p and Orc6p in vitro. Immunofluorescence studies indicated a colocalization of Plk1p with Cdc7p and Orc6p at midbody in telophase of mitosis. In the last part of this work, the mobility of murine transcription termination factor TTF-I was analyzed by FRAP. EGFP-tagged full-length TTF-I and EGFP-NRD were distributed throughout the whole nucleolus. The localization of EGFP-TTFdeltaN185, on the other hand, was more distinct. FRAP experiments with cells expressing EGFP-TTFdeltaN185 indicated the presence of a immobile fraction of ~10% while full-length EGFP-TTF-I was 100% mobile. The nucleolar protein TIP5 interacts with TTF-I. EGFP-TIP5 was freely distributed in the nucleus, whereas nucleolar regions were excluded from nuclear localization. Cotransfections of EGFP-TIP5 with EYFP-TTFdeltaN185 demonstrated, that EGFP-TIP5 was not coimported into nucleoli by EYFP-TTFdeltaN185. By use of BRET, protein-protein interactions between Orc6p and TTF-I were detected while interaction between Orc6p and TTFdeltaN185 were not observed. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - DNA-Replikation KW - Cdc6 KW - FRAP KW - FLIP KW - BRET KW - DNA-replication KW - Cdc6 KW - FRAP KW - FLIP KW - BRET Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10473 ER - TY - THES A1 - Frydrychowicz, Alex T1 - Hochaufgelöste cine-Magnetresonanz-Bildgebung des Mäuseherzens zur Bestimmung rechtsventrikulärer Morphologie und funktioneller Parameter : Validierung der Methode und Etablierung an zwei Modellen der Herzinsuffizienz T1 - High-resolution cardiac cine-MR-Imaging of the murine right ventricle:Quantification of morphological and functional parameters and results from two models of induced heart failure N2 - Die Rolle des rechten Ventrikels in der Entwicklung der Herzinsuffizienz ist bis heute umstritten. Vor dem Hintergrund neuer transgener Mausmodelle war es Ziel dieser Studie, die MR-basierte Volumenquantifizierung für den rechten Ventrikel der Maus zu validieren und auf zwei Mausmodell mit Rechtsherzinsuffizienz anzuwenden. Gesunde Mäuse unterschiedlichen Alters wurden mittels MR-Bildgebung bei 7T untersucht. Zur Generierung der Herzinsuffizienz wurde eine Infarzierung durch Banding der LAD, zur Erzeugung einer isolierten Rechtsherzinsuffizienz eine Pulmonalarterienstenose operativ induziert. Die Schnittführung der MR-Aufnahmen lag orthogonal zum Ventrikelseptum, um Partialvolumen-Fehler zu minimieren. Die MR-Daten wurden von 2 unabhängigen Auswertern zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit analysiert. Der Vergleich linksventrikulärer (LV) und rechtsventrikulärer (RV) Volumina zeigte eine enge Korrelation für die Schlagvolumina (SV) (r=0.97, p<0.0001). Die Bland-Altman-Analyse bestätigte diese enge Übereinstimmung (mittlere Differenz 0.4µl). Wiederholte Messung der RV Parameter zeigte ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit (intraobserver- und interobserver-Variabilität jeweils <7%). Die MR-Messung 4 Wochen nach Pulmonalbanding ergab einen signifikanten Anstieg des RV enddiastolischen Volumens (+44%, p<0.005) und vor allem RV endsystolischen Volumens (+133%, p<0.0001). Die RV Ejektionsfraktion war signifikant reduziert (31.2±6.2 % vs. 57.0±2.3 %, p<0.001). Die LV Volumina sowie EF waren unverändert zum Normalkollektiv und bestätigten den Befund der isolierten Rechtsherzinsuffizienz. Neben LV Volumina erlaubt die 3D MR-Datenakquisition auch eine reproduzierbare Analyse des deutlich komplexeren rechten Ventrikels der Maus. Die Studie belegt eindrucksvoll des Potential von hochauflösender MR-Bildgebung zur Aufklärung von Pathomechanismen rechtsventrikulärer Erkrankungen. N2 - The predictive importance of the right ventricle (RV) in the failing heart is constantly discussed and MR-Imaging as a uniquely precise method is used to evaluate the underlying processes. The results from left ventricular (LV) murine cardiac MR-Imaging (MRI) led to the interest in assessing the RV by in vivo 7.05T cine-MRI and to demonstrate its potency on two models of heart failure. To demonstrate the feasibility of RV measurements RV volumes and parameters were compared to LV correlates and validated by inter- and intraobserver comparison. The method was then transferred to mice infarcted by LAD-banding as a model of heart failure and to a relatively unknown model of right heart failure by banding of the pulmonary artery. LAD-banding was performed as previously described by open-chest surgery. For pulmonary banding the pulmonary artery was dissected from other vascular structures and then banded against a prepared 25G needle for reproducibility of results1. All mice were given 4 weeks to recreate from the operation and to develop heart failure. MR studies were done by the known setup of our workgroup on a 7.05T experimental MR scanner (BRUKER Biospec, Germany) with a horizontal bore and a microscopy gradient insert. Adjacent planes were planned orthogonal to the interventricular septum as to depicture both RV and LV in a single measurement with highest possible precision and low geometric assumptions. Volume calculation was achieved by determining endsystolic and enddiastolic slices in every plane. Endo- and epicardial borders were then manually delineated for both left and right ventricle and added up for total ventricular volume (see figures 1-4). After comparison of LV and RV EDV, ESV, SV, CO and EF for validation of the method by one observer, a different observer repeatedly assessed RV volumes of each mouse for determination of inter- and intraobserver variability. After RV evaluation was thereby validated, the method was transferred onto the above models. Comparison of LV and RV in healthy mice showed close correlations (r=0.97, p<0.0001) between SV and CO as expected from human physiology. LV and RV EDV, ESV and EF differed as expected: RV EDV and ESV were significantly higher, RV EF lower than LV correlates (for all p<0.05). Repeated RV assessment for demonstration of inter- and intraobserver variability was done by a different observer: Calculations revealed low differences as shown in tables 1 and 2. Findings in the LAD-banding model were consistent with expectations from human pathophysiological changes with an obvious decrease of RV and LV SV, EF and CO. The relatively unknown banding of the pulmonary artery revealed unsignficantly altered LV parameters whereas RV EF was significantly lower. However, RV SV and CO were only slightly diminished which could be due to a slower progress of RV alterations than expected. We were able to demonstrate the feasibility of high-resolution MRI of the murine right ventricle with good results in direct RV and LV comparison. Inter- and Intraobserver validation of this method showed reasonably low differences which enabled us to successfully transfer this technique on two models of heart failure. These findings open new perspectives to further investigate RV changes both in healthy mice as well as in genetically or surgically engineered mice. Evaluation of the murine RV by MR-Imaging may therefore lead to a better understanding of the development of RV changes under pathophysiological circumstances. KW - Herzinsuffizienz KW - Kernspintomographie KW - Maus KW - RV KW - Model KW - Heart failure KW - murine KW - mri KW - mouse KW - pulmonal banding Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10207 ER -