TY  - THES
A1  - Hausmann, Dominikus
T1  - Die Bedeutung von cFLIPlong für die Todesrezeptor-abhängige Regulation der Apoptose in HaCaT-Keratinozyten
T1  - Significance of cFLIPlong in death-receptor-dependent regulation of apoptosis in HaCaT
N2  - Die Todesrezeptoren der TNF-Familie sind neben der Vermittlung von Apoptosesignalen auch in der Lage, nicht-apoptotische intrazelluläre Signalwege zu beeinflussen. Der Caspase-8-Inhibitor cFLIPlong inhibiert dosisabhängig die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 am TRAIL-DISC (death inducing signalling complex) und hemmt die Aktivierung des NF-kappa-B-Signalweges über die Modulation der Rekrutierung und Spaltung des für die NF-kappa-B-Aktivierung notwendigen RIP (receptor interactin protein)am DISC.
N2  - TNF-derived death-receptors are not only involved in transducing apoptosis-signalling but also modulate non-apoptotic pathways. Cellular FLICE-inhibitory protein cFLIPlong is able to block processing of initiator-caspases in the TRAIL-DISC dependent on the FLIP/Casp-8- level. It also interacts with NF-kappa-B-signalling pathways by modulating the recruitment and processing of receptor-interacting-protein RIP in the TRAIL-DISC-complex.
KW  - Apoptosis
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
KW  - Interferon
KW  - Bcl-2-Proteinfamilie
KW  - Caspasen
KW  - Fas-Ligand
KW  - Onkologie
KW  - HaCaT
KW  - TRAIL
KW  - RIP
KW  - TRAIL-Rezeptor
KW  - cFLIP
KW  - Nuklearfaktor
KW  - apoptosis
KW  - NF-kappa-B
KW  - cFLIP
KW  - RIP
KW  - TRAIL-receptor
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75892
ER  - 
TY  - THES
A1  - Czisch, Michael
T1  - Die Rolle von Bcl-2 bei der UV- und TRAIL-induzierten Keratinozytenapoptose
T1  - The role of Bcl-2 in UV- and TRAIL-induced keratinocyte apoptosis
N2  - In Keratinozyten wird sowohl durch UVB als auch durch PUVA-Bestrahlung Apoptose induziert. Wir untersuchten die in Keratinozyten durch UVB, PUVA, UVA und Todesliganden wie TRAIL ausgelösten Apoptosewege näher. UVB und PUVA, nicht aber UVA-Bestrahlung lösen in vitro Keratinozytenapoptose aus. 2-4 h nach UVB beobachteten wir die Aktivierung von Caspasen. Nach PUVA setzt die Aktivierung von Caspasen wesentlich später ein, nämlich erst 12 h nach Bestrahlung. Passend dazu, ist ein Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials 6-8 h nach UVB und 12-14 h nach PUVA detektierbar. Die Überexpression des Proteins Bcl-2 verhindert den Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach UVB, und vermittelt auch einen klonogen Schutz, unabhängig von der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale. Im Gegensatz dazu verzögert es den Verlust des Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach PUVA nur und verhindert sie nicht. PUVA-bestrahlte Zellen können sich nicht weiter teilen, sind also durch Bcl-2 nicht klonogen geschützt.
N2  - An important response of keratinocytes to UVB or PUVA irradiation is the induction of apoptosis. In order to understand the apoptotic responses of keratinocytes, we compared UVB, PUVA, UVA irradiated and TRAIL-treated keratinocytes for the activation of major apoptosis signalling pathways. UVB and PUVA, but not UVA irradiation induced keratinocyte apoptosis in vitro. Activation of caspases was detectable within 2 – 4 h after UVB irradiation. Interestingly, caspase activation following PUVA was delayed, beginning by 12 hours post irradiation. In line, mitochondrial transmembrane potential (MTP) decreased 6 – 8 hours after UVB, whereas PUVA mediated MTP loss started only 12 - 14h post irradiation. Interestingly, Bcl-2 overexpression protected against UVB induced early MTP loss and caspase activation. Moreover, Bcl-2 also protected clonogenic survival following UVB irradiation independent of the UV-induced generation of reactive oxygen species. In marked contrast, although Bcl-2 delayed PUVA induced MTP loss and caspase activation, Bcl-2 overexpressing keratinocytes failed to protect clonogenic survival following PUVA. Interestingly, similar levels of ROS were produced by UVA and PUVA irrespective of the expression of Bcl-2, suggesting that ROS generation does not have a major role in PUVA induced activation of apoptosis signalling. We conclude that distinct pathways independent of caspases are employed to exert the cell death program in PUVA and UVB induced apoptosis. While PUVA-induced cell death overcomes Bcl-2 protected mitochondrial pathways of apoptosis, UVB induced cell death is dose-dependently protected by Bcl-2. Our data suggest that PUVA-induced DNA damage rather than ROS generation plays the key role for PUVA induced apoptosis.
KW  - Bcl-2
KW  - Apoptose
KW  - UV
KW  - UVB
KW  - UVA
KW  - PUVA
KW  - Keratinozyten
KW  - HaCaT
KW  - TRAIL
KW  - Zytochrom c
KW  - Caspasen
KW  - ROS
KW  - Mitochondrium
KW  - Bcl-2
KW  - apoptosis
KW  - UV
KW  - UVB
KW  - UVA
KW  - PUVA
KW  - keratinocytes
KW  - HaCaT
KW  - TRAIL
KW  - cytochrome c
KW  - caspases
KW  - reactive oxygen species
KW  - mitochondria
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10903
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kilic, Mehtap
T1  - Formation of  caspase activating complexes  and activation of caspase-12 during apoptosis in AKR-2B mouse fibroblasts
T1  - Formation des Caspase Aktivierenden Komplexes und Aktivierung von Caspase-12 wahrend der Apoptose von AKR-2B Maus Fibroblasten
N2  - Der Zelltod kann in Dichte-arretierten AKR-2B Mausfibroblasten durch Entzug des Serums oder Behandlung mit Anisomycin induziert werden. Der Zelltod zeigt zwar die für die Apoptose typischen morphologischen Veränderungen der Zelle wie Zellfragmentierung und Chromatinkondensation jedoch fehlen andere apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder Änderung des Membranpotentials der Mitochondria. Während der Apoptose wurde eine beachtliche DEVDase Aktivität nach- gewiesen, die einem einzelnen Enzym zugeordnet werden konnte. Dieses Enzym hatte typische Eigenschaften von Effektor-Caspasen, wie die der Caspase-3, besaß jedoch einen ungewöhnlich hohen KM Wert von 100 µM, und die Molmasse der großen Untereinheit betrug 19 kDa anstelle der erwarteten 17 kDa. Mit Hilfe des rekombinanten mCaspase-3 Proteins wurde dieses Enzym in der vorliegenden Untersuchung als Caspase-3 identifiziert. Die N-terminale Sequenzierung des mCaspase-3 Proteins ergab, daß sich die Spaltstelle seiner Prodomäne von der des humanen homologen Proteins unterschied (Asp-9 von Asp-28). Somit betrug die Molmasse der großen Untereinheit der aktiven Caspase-3 19 kDa. Darüberhinaus stimmte der KM-Wert der rekombinanter mCaspase-3 von ~100 µM mit der überein, die in Zellextrakten bestimmt wurde. Die Affinitätmarkierung in Kombination mit einer 2D-Gelelektrophorese bestätigte, daß tatsächlich Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase in AKR-2B-Zellen während der Apoptose aktiviert wird. Im Folgenden wurde untersucht, welcher Signalwege in AKR-2B-Zellen, denen Serum aus dem Nährmedia entzogen wurden war oder die mit Anisomycin behandelt worden waren, zur Aktivierung der Caspase-3 führt. Da eine Beteiligunug des Rezeptor-vermittelte Signalweges bereits zuvor ausgeschlossen worden war,wurde überprüft, ob der mitochondrial vermittelte Signalweg bei der Aktivierung von Caspase-3 ein Rolle spielt. Gelfiltrations- experimente ergaben, daß Caspase-3 als freies Enzym und nur in geringen Mengen innerhalb unterschiedlich große Komplexe der Molmassen 600 kDa und 250 kDa eluiert wird. Obwohl die apparenten Molmassen der Caspase-3-haltigen Komplexe mit kürzlich veröffentlichten Daten übereinstimmten, enthielten sie weder Apaf-1 noch Caspase-9. Dies deutet daraufhin, daß der mitochondrial-vermittelte Signalweg ebenfalls nicht an der Caspase-3 Aktivierung beteiligt ist. Darüberhinaus wurde ein neuer Caspase-6 enthaltender Komplex (450 kDa) nach Serumentzug in AKR-2B-Zellen gefunden, der sich deutlich von Caspase-3 haltigen Komplexen unterscheidet. Caspase-3 ist für die meisten morphologische Veränderungen während der Apoptose verantwortlich. Wahrend der Apoptose in der AKR-2B-Zellen zwar Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase identifiziert worden war, jedoch keine intranukleosomale Fragmentierung nachgeweisen werden konnen, da bei wurde die intrazelluläre Lokalisation der Caspase-3 untersucht. Durch Überexpression eines Caspase-3-GFP Fusionskonstruktes in AKR-2B Zellen wurde die Procaspase-3 im Cytoplasma lokalisiert, während die aktive Caspase-3 vorwiegend in membranumhüllten Vesikeln und zum Teil im Cytoplasma aktiviert wurde. Ebenfalls wurde eine mögliche Beteiligung von Caspase-12 und eine ER-Streß vermittelte Signalleitung an der Apoptose in AKR-2B-Zellen untersucht. Kinetische Untersuchungen zeigten, daß Caspase-12 im Fall von Serumentzug oder Behandlung mit Anisomycin zeitgleich mit Caspase-3 aktiviert wurde, was zur Bildung von zwei Spaltprodukte der Molmassen 47 kDa und 35 kDa führte. Gelfiltrationsexperimente ergaben, daß Caspase-12 als freies Enzym während der Apoptose auftritt. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde in allen Publikationen beschrieben, daß Caspase-12 in Folge von ER-Streß aktiviert wird. Nach Serumentzug oder Zugabe von Anisomycin zu AKR-2B-Zellen wurde jedoch kein Anstieg der Synthese des Chaperon-Proteins Grp78, einem Marker für ER-Streß, beobachtet. Dies zeigt, daß beide Behandlungen nicht zur ER-Streß führen. Im Gegensatz dazu erzeugten bekannte Indikatoren von ER Streß wie Thapsigargin und A23187 (ionophor) ER-Streß in AKR-2B-Zellen, was zu unspezifischem Abbau der Caspase-12 führte. Darum ist es unwahrscheinlich, daß in AKR-2B- Zellen Caspase-12 bei ER-Streß aktiviert wird. Zusammenfassend zeigten diese Daten, daß Caspase-12 in AKR-2B-Zellen über Signalwegen aktiviert wird, die ER stress un- abhängig sind und zeigen daß Caspase-3 bei der Aktivierung von Caspase-12 beteiligt ist somit liefern die vorliegenden Untersuchungen einen Hinweis darauf daß neben den klassischen Signalwege weitere Signalwege existieren, die zur Apoptose führten.
N2  - Density arrested AKR-2B cells die rapidly in response to serum starvation or treatment by Anisomycin. Cell death is associated with typical hallmarks of apoptosis including membrane blebbing and chromatin condensation but lacks energy dissipation in mitochondria and intranucleosomal fragmentation. During apoptosis a considerable DEVDase activity has been detected which seemed to be represented by a single enzyme. This enzyme had typical effector caspase characteristics, like caspase-3, but exhibited an unusual high KM values of ~100 µM and its large subunit exhibited a molecular weight of 19 kDa, instead of expected 17 kDa. In the present study, this enzyme was identified to be caspase-3 with the help of the generation of recombinant mcaspase-3 protein. N-terminal sequencing of the recombinant mcaspase-3 protein revealed that its prodomain cleavage site differs from that in the human homologue (Asp-9 instead of Asp-28). Thus the large subunit of active caspase-3 was found to be 19 kDa. Furthermore the KM value of recombinant mcaspase-3 was ~100 µM in perfect agreement with that found in cell extracts. Affinity labeling in combination with 2D-GE confirmed that indeed caspase-3 is activated as the main executioner in AKR-2B cells during apoptosis. Since the receptor mediated pathway has already been excluded previously [129], a possible involvement of mitochondria mediated pathway in the activation of caspase-3 was examined. Gel filtration experiments revealed that caspase-3 is mainly eluted as free enzyme and in lower levels within the differently sized high molecular weight complexes of ~600 kDa and 250 kDa in response to serum starvation or Anisomycin treatment. Though the apparent molecular weight of the complexes containing caspase-3 are in accordance with recently published data, they were devoid of Apaf-1 and caspase-9. Apparently, mitochondria mediated pathway is also not involved since neither formation of high molecular weight complexes of Apaf-1 nor cleavage of caspase-9 was observed. Thus, the activation of caspase-3 is caused by a noncanonical pathway during apoptosis. In addition a new 450 kDa complex containing activated caspase-6 was found in response to serum starvation which is clearly separated from caspase-3 containing complexes. Generally caspase-3 has been found to be responsible for most of the morphological changes during apoptosis. One of those is intranucleosomal fragmentation. Although caspase-3 was found to be the main executioner caspase in AKR-2B cells the lack of the intranucleosomal fragmentation led to examine its localization. As detected by overexpression of the Caspase-3-GFP fusion construct in AKR-2B, procaspase-3 was localized in the cytoplasm, wheras the active caspase-3 was mainly found in the membrane blebs and partially in the cytoplasm. Clearly no nuclear localization of active caspase-3 was detected. These data gave first hints on the mechanism of degradation of AKR-2B cells demonstrating that cytoplasmic membrane is the primary site of activation of caspase-3. The possible role of caspase-12 and ER stress mediated pathway of apoptosis was also examined in AKR-2B cells. Kinetic studies showed that caspase-12 is activated at the same time together with caspase-3 in response to serum starvation or Anisomycin treatment resulting in two cleavage products of 47 kDa and 35 kDa, respectively. It was therefore examined whether these two caspases were eluted in the same complexes. Gel filtration experiments revealed that caspase-12 is released as free enzyme during apoptosis. To date all the studies have identified that caspase-12 is specifically activated in response to ER stress. After serum starvation or Anisomycin addition there was no increase of the protein expression level of the chaperone protein Grp 78 which is known to be higly elevated in response to ER stress indicating that both treatments did not lead to ER stress. In contrast treatment with ER stressor substances i.e. Thapsigargin, A23187 (ionophore) induced an ER stress in AKR-2B which lead to unspecifically degradation of caspase-12. Thus it is unlikely that caspase-12 is activated in response to ER stress in AKR-2B cells. However, after the in vitro addition of recombinant caspase-3 to cytosolic extracts caspase-12 is cleaved into 47 kDa and 35 kDa fragments similiar to those observed in vivo. In conclusion the present data demostrated that caspase-12 is activated in AKR-2B cells during apoptosis triggered through pathways that do not involve (the) ER stress and provided evidence that caspase-3 might be involved in activation of caspase-12. Thus the present study in AKR-2B cells gives hints for the existence of additional pathways for apoptosis other than the classical ones.
KW  - Apoptosis
KW  - Caspasen
KW  - Apoptose
KW  - Casapse
KW  - AKR-2B
KW  - Fibroblasten
KW  - Apoptosis
KW  - Caspases
KW  - AKR-2B
KW  - fibroblasts
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7190
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kuß, Andreas
T1  - Untersuchungen zur CD40 induzierten Expression von A1 in B-Lymphozyten der Maus
T1  - Investigations concerning the CD40 induced expression of A1 in murine B lymphocytes
N2  - Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung.
N2  - Engagement of the antigen receptor on murine immature B lymphocytes leads to growth arrest followed by apoptosis. Concomitant signalling through CD40 rescues the cells from apoptosis and sustains proliferation. It is shown here, that in primary murine B cells crosslinking of CD40 stimulates the expression of A1, an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family. CD40 dependent stimulation of A1 was confirmed in WEHI 231 cells, an immature B cell lymphoma line. WEHI 231 cells were transduced with A1 and a chimeric selection marker comprising the enhanced yellow fluorescent protein and the zeocin resistance protein via recombinant replicationdefective retroviruses. Expression of A1 and marker proteins was coupled through an internal ribosomal entry site. A1 transduced WEHI 231 cells showed a significantly enhanced survival rate after engagement of the antigen receptor whereas constitutive expression of A1 did not abrogate c-myc downregulation and activity-loss of a NFkB-dependent luciferase reporter, both of which were induced by BCR-crosslinking. Expression of inducible cMyc-ER in A1 transduced cells did not restore proliferation in these populations. In contrast, upon induction cMyc-ER itself caused growth arrest and apoptosis of these cells despite the presence of A1. Studies of functional properties of A1 revealed that it was able to suppress BCR-induced degradation of the caspase substrate PARP as well as activation of Caspase 7. The generation of reactive oxigen species, a further consequence of BCR signalling, was also significantly reduced by A1. Taken together these result suggest that upstream of A1 the CD40 signal is divided into two major components, one of which is responsible for the upkeep of proliferation whereas the other secures cell survival. It seems that for the latter A1 is of major importance.
KW  - Apoptosis
KW  - B-Lymphozyt
KW  - Proteasen
KW  - CD40
KW  - Bcl-2
KW  - Unreife B-Zelle
KW  - Apoptose
KW  - Wachstumsstopp
KW  - Caspasen
KW  - CD40
KW  - bcl-2
KW  - Immature B cell
KW  - Apoptosis
KW  - Growth Arrest
KW  - Caspases
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1669
ER  - 
TY  - THES
A1  - Goebel, Stefan
T1  - Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien
T1  - Mechanisms of Toxoplasma gondii-mediated inhibition of apoptosis in human-derived host cell lines
N2  - Als obligat intrazellulärer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier dürfte Toxoplasma gondii von der Integrität seiner Wirtszelle in besonderem Maße abhängig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren können. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das führt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen könnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazelluläres Überleben sichern.
N2  - As an obligate intracellular parasite that causes persistent infections in humans and animals Toxoplasma gondii may rely on the integrity of its host cells. We investigated the effect of the parasite on host cell apoptosis. T. gondii inhibits the in vitro induced apoptosis in human-derived HL-60 and U937 cells. For this effect it is necessary that the parasite is able to invade its host cell actively but not to replicate. T. gondii interferes with at least two different components of the apoptosis-inducing signaling cascade: Firstly, it partially abrogates the down-regulation of Mcl-1 expression after induction of apoptosis. As a result, the translocation of cytochrome c from the mitochondria into the cytoplasm is inhibited and the activiation of caspases 9 and 3 and their substrates is diminished. Secondly, the expression of poly (ADP-ribose)polymerase (PARP) is down-regulated by the parasite. Both mechanisms may contribute to the inhibition of host cell apoptosis by T. gondii and may facilitate intracellular survival of the parasite.
KW  - Toxoplasmase gondii
KW  - Apoptosis
KW  - Molekularbiologie
KW  - Toxoplasma gondii
KW  - Apoptose
KW  - Poly-(ADP-Ribose)Polymerase
KW  - Mcl-1
KW  - Parasit
KW  - Signaltransduktion
KW  - Caspasen
KW  - Toxoplasma gondii
KW  - apoptosis
KW  - poly-(ADP-ribose)polymerase
KW  - Mcl-1
KW  - parasite
KW  - signal transduction
KW  - caspases
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1325
ER  -