TY - THES A1 - Dambacher, Helena T1 - Die Etablierung des CRISPR/Cas9-Systems in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zur Untersuchung der Funktion des Kanalproteins Connexin 43 in der Embryonalentwicklung T1 - The establishment of the CRISPR/Cas9 system in human induced pluripotent stem cells to study the function of the channel protein connexin 43 in the embryonic development N2 - Die Rolle von Connexinen und Gap Junction-vermittelter Kommunikation in pluripotenten Stammzellen sowie der frühen Embryonalentwicklung sind bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Mutationen in humanen Connexinen verursachen eine Vielzahl von Krankheiten. Connexin-defiziente iPS Zellen stellen eine gute Basis für die Erforschung der Rolle von Connexinen während der Embryonalentwicklung und bei der Krankheitsentstehung dar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das CRISPR/Cas9-System in pluripotenten Stammzellen erfolgreich anzuwenden und ein Protokoll zur Erstellung verschiedener Cx43-Defektmutanten zu entwerfen. Nach der Etablierung der CRSIPR/Cas9-Methode in HEK293T-Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit darüber hinaus erfolgreich eine Cx43-Defizienz in FSiPS-Zellen erzeugt werden. Weiterhin wurden mehrere Cx43-Mutanten geschaffen und initial auf Pluripotenzmarker und ihr Differenzierungspotential untersucht. Diese Arbeit bildet die Basis für weitere Untersuchungen des Cx43 in iPS-Zellklonen und davon abgeleiteten Zelltypen sowie artifiziellen 3D-Gewebekulturen. Darüber hinaus bildet sie die Grundlage für die Bildung weiterer Connexin-Defektmutanten sowie von iPS-Zellen mit krankheitsrelevanten Mutationen. N2 - The roles of connexins and gap junction-mediated communication in pluripotent stem cells and early embryonic development have not been fully elucidated to date. Mutations in human connexins cause a variety of diseases. Connexin-deficient iPS cells provide a good basis for studying the role of connexins during embryonic development and in disease development. The aim of the present work was to successfully apply the CRISPR/Cas9 system in pluripotent stem cells and to design a protocol to generate different Cx43 defective mutants. Furthermore, after establishing the CRSIPR/Cas9 method in HEK293T cells, a Cx43 deficiency in FSiPS cells was successfully generated. Furthermore, several Cx43 mutants were created and initially screened for pluripotency markers and their differentiation potential. This work forms the basis for further studies of Cx43 in iPS cell clones and derived cell types as well as artificial 3D tissue cultures. Furthermore, it forms the basis for the generation of further connexin defect mutants as well as iPS cells with disease-relevant mutations. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Connexin KW - Genome Editing KW - Knockout KW - Okulodentodigitale Dysplasie KW - Cas9 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240152 ER - TY - THES A1 - Cabello González, Victoria T1 - From behavioral to neurobiological characterization of Rsk2 knockout mice as an animal model for Coffin-Lowry syndrome T1 - Vom Verhalten bis zur neurobiologischen Charakterisierung von Rsk2-defizienten Mäusen, einem Tiermodell für das Coffin-Lowry Syndrom N2 - Coffin-Lowry syndrome is a rare syndromic form of X-linked mental retardation caused by heterogeneous loss-of-function mutations in the gene RPS6KA3 that encodes the RSK2 protein. Clinical features are delayed motor development, small height, progressive skeletal malformations and mental retardation. Rsk2 deficiency affects behavioral, cellular and molecular functions. To characterize and investigate how this deficiency affects these functions, we made a series of experiments using Rsk2-deficient mice as the animal model for Coffin-Lowry syndrome. We applied a battery of behavioral tests and included the use of the IntelliCage for the first time as a behavioral paradigm to study anxiety-like behavior and depression-like behavior in Rsk2-deficient mice. Results from the conventional behavioral tests and from the IntelliCage indicate that Rsk2-deficient mice may have an anti-anxiety and anti-depressive phenotype. We evaluated in Rsk2 deficient mice the relative gene expression of a set of genes coding for proteins related to RSK2 which are involved in fear memory, synaptic plasticity, neurogenesis, learning, emotional behavior and stress. We found gene expression alterations in the prefrontal cortex and striatum. These results suggest that RSK2 may be involved in the expression of the genes. RSK2 is known to be related to monoamine neurotransmitter function. We measured the levels of dopamine, serotonin and noradrenaline/norepinephrine and their metabolites in different brain regions of Rsk2-deficient mice. We found differences in the dopaminergic and noradrenergic systems suggesting an increased or decreased activity of these neurotransmission systems as a result of Rsk2 deficiency. Adult neurogenesis is a form of neuronal plasticity and a multi-step process of cell development. We explored if this form of neuronal plasticity was affected by Rsk2-deficiency. Our results indicate that adult hippocampal neurogenesis is not influenced by lifelong Rsk2 deficiency. It would be worth to analyze in the future other aspects of neuroplasticity. We have confirmed, that behavioral characteristics of Rsk2-deficient mice make them an interesting model to study the Coffin-Lowry syndrome by extending the behavioral characterization on the emotional level. Furthermore, we have extended the characterization of the model on a molecular level, opening new opportunities to study and understand the pathophysiological basis of the Coffin-Lowry syndrome. N2 - Das Coffin-Lowry Syndrom ist eine seltene syndromale Form X-gebunden vererbter geistiger Behinderung, verursacht durch heterogene loss of function Mutationen im RPS6KA3-Gen, welches für das RSK2-Protein kodiert. Klinische Charakteristika sind eine verzögerte motorische Entwicklung, eine geringe Körpergröße, fortschreitende Skelett- Malformationen und geistige Behinderung. Die Rsk2-Mutation hat einen Einfluss auf das Verhalten, auf zelluläre und molekulare Funktionen. Um zu charakterisieren und zu untersuchen, wie diese Defizienz diese Funktionen beeinflusst, führten wir eine Reihe von Experimenten durch und verwendeten Rsk2-defiziente Mäuse als Tiermodell für das Coffin-Lowry Syndrom. Wir wandten eine Reihe von Verhaltens-Tests an, einschließlich erstmals den IntelliCage als ein Verhaltensparadigma, um Angst-ähnliches und Depressions-ähnliches Verhalten in Rsk2-defizienten Mäusen zu untersuchen. Ergebnisse konventioneller Verhaltenstests und aus dem IntelliCage sprechen dafür, dass Rsk2-defiziente Mäuse einen „anti-ängstlichen“ und „anti-depressiven“ Phänotyp haben. Wir haben bei Rsk2-defizienten Mäusen die Expression einer Reihe von Genen untersucht, die für Proteine kodieren, die mit RSK2 in Zusammenhang stehen und darüber hinaus eine Bedeutung für das Angst-Gedächtnis, synaptische Plastizität, Neurogenese, Lernen, emotionales Verhalten und Stress haben. Im präfrontalen Kortex und Striatum konnten wir Genexpressionsunterschiede zwischen Rsk2-Wildtyp- und Knockout-Mäusen detektieren. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass RSK2 eine Rolle bei der Expression dieser Gene spielt. Es ist bekannt, dass RSK2 eine Rolle für die monoaminerge Neurotransmitter-Funktion spielt. Deshalb haben wir die Konzentration von Dopamin, Serotonin und Noradrenalin/Norepinephrin und ihrer Metaboliten in verschiedenen Gehirnregionen von Rsk2-defizienten Mäuse untersucht. Wir haben Unterschiede im dopaminergen und noradrenergen System gefunden, was auf eine gesteigerte oder verminderte Aktivität dieser Neurotransmittersysteme als Folge der Rsk2-Defizienz hinweist. Adulte Neurogenese ist eine Form neuronaler Plastizität und ein mehr-stufiger Prozess zellulärer Entwicklung. Unsere Untersuchungen der adulten Neurogenese im Hippocampus zeigten, dass sie nicht durch eine lebenslange Rsk2-Defizienz beeinflusst wird. In Zukunft wäre es jedoch sinnvoll, andere Aspekte der Neuroplastizität zu analysieren. Durch unsere Verhaltensstudien wurde die Charakterisierung der Rsk2-defizienten Mäuse vor allem im emotionalen Bereich stark erweitert, wodurch wir bestätigen konnten, dass diese Mauslinie ein interessantes Modell zur Untersuchung des Coffein-Lowry Syndroms ist. Darüber hinaus haben wir die Charakterisierung des Modells auf der molekularen Ebene erweitert und damit neue Möglichkeiten eröffnet, die pathophysiologische Grundlage des Coffin-Lowry Syndroms zu studieren. KW - Knockout KW - Maus KW - Coffin-Lowry syndrome KW - Animal behavior IntelliCage system KW - RSK2 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171275 ER - TY - THES A1 - Kaiser, Markus Leonhard T1 - Kardialer Phänotyp und SUDEP durch Knockout des Nav1.1 Kanalgens (SCN1A) in einem Dravet-Mausmodell T1 - Cardiac phenotype and SUDEP in a Dravet mouse model by knock-out of Nav1.1 sodium channel gene SCN1A N2 - SUDEP bezeichnet den plötzlichen und unerwarteten Epilepsietod ohne offensichtliche kausale Todesursache. Junge Patienten, die an der schweren infantilen enzephalo-pathischen Epilepsieform des Dravet-Syndroms (SMEI) leiden, tragen besonderes Risiko an SUDEP zu versterben. Die pathophysiologische Ursache für das Dravet-Syndrom liegt in einem Defekt des brain-type Natriumkanals Nav1.1. Neuere Studien zeigen, dass der ursprünglich als hirnspezifisch geltende Kanal nicht explizit in neuronalem Gewebe, sondern auch im Herzen exprimiert wird. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen des Nav1.1-Defektes auf kardialer Ebene zu evaluieren, um eine mögliche Beteiligung von Herzrhythmusstörungen an der Ätiologie des SUDEP aufzudecken. Dazu wurde ein Knockout-Mausmodell hinsichtlich seines kardialen Phänotyps charakterisiert. Mit Hilfe elektrokardiographischer Untersuchungen (EKG) konnte eine gesteigerte Herzfrequenz unter Stressbedingungen festgestellt werden. Die Frequenz lag sowohl bei den Versuchen unter pharmakologischem Stress mittels Isoproterenol als auch unter induziertem Stress mittels Hyperthermie bei den Dravet-Syndrom-Mäusen höher als in dem wildtypischen Kontrollkollektiv. Elektrophysiologische Untersuchungen (EPU) zeigten neben einem erhöhten Schweregrad der induzierbaren Arrhythmien, gemessen anhand eines Arrhythmie-Scores, auch eine erhöhte Quantität ausgelöster Herzrhythmusstörungen. Sowohl unter Ruhebedingungen als auch nach Induktion von Hyperthermie überwogen die aufgezeichneten Arrhythmien bei Dravet-Syndrom-Mäusen. Die Erkenntnisse dieser Studie helfen die Rolle des Nav1.1-Defektes an einer kardialen Beteiligung im Rahmen von SUDEP bei Dravet-Patienten zu beschreiben. Sie zeigen ver-schiedene kardiale Auswirkungen bei Knockout des primär neuronalen Natrium¬kanalgens SCN1A. Weitere Einsichten in diesen Bereich werden angemessene Risikostratifizierung für Epilepsie-Patienten hinsichtlich Ihres SUDEP-Risikos ermöglichen und moderne The-rapieansätze anregen. N2 - Voltage-gated sodium channels (Nav) are responsible for the initiation of action potentials in excitable cells. In this context distinct isoforms of the Nav sodium channel family seem to be important for both neuronal and cardiac excitation. It is known that mutation or knock out of the so called brain type sodium channel Nav1.1-isoform causes a spectrum of epilepsies including severe myoclonic epilepsy of infancy (SMEI) or Dravet Syndrome which is associated with a high risk of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Previously it was demonstrated that the brain type sodium channel isoform Nav1.1 is not exclusively expressed in the nervous system but also functionally present in cardiac tissue. Therefore, we hypothesize that patients suffering from neurologic Nav1.1-deseases carry an increased cardiac arrhythmia burden that may be responsible for SUDEP. We characterize the cardiac pathophysiology in an established mouse model of Dravet Syndrome. We used classical surface electrocardiogram recordings (ECG) and invasive programmed stimulation (EPU). This was done under stressing conditions by pharmacological adrenergic application (Isoproterenol) and hyperthermia (39°C). We found that heart rate under stressing conditions was elevated by knock out of Nav1.1 gene. Also arrhythmia inducibility was elevated which was seen in quality and quantity as well. This study helps to describe the role of defect Nav1.1 sodium channel in elevated SUDEP risk of Dravet Syndrome by possible cardiac genesis. Further studies will probably lead to stratify the SUDEP risk in order to find new therapies like implantable cardiac devices. KW - Natriumkanal KW - Ionenkanal KW - Elektrophysiologische Untersuchung KW - Elektrokardiografie KW - Knockout KW - Dravet Syndrom KW - Nav1.1 Kanal KW - Ionenkanalopathie KW - SUDEP KW - Herzrhythmusstörung KW - EPU KW - sudden unexpected death in epilepsy KW - sodium channel KW - channelopathie KW - SMEI Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158774 ER - TY - THES A1 - Ullrich, Melanie T1 - Identification of SPRED2 as a Novel Regulator of Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis Activity and of Body Homeostasis T1 - SPRED2 - Ein neuer Regulator der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrindenachse und der Hormonbalance N2 - SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach. An initial phenotypical characterization of KO mice aged up to five months identified SPRED2 as a regulator of chondrocyte differentiation and bone growth. Here, the loss of SPRED2 leads to an augmented FGFR-dependent ERK activity, which in turn causes hypochondroplasia-like dwarfism. However, long term observations of older KO mice revealed a generally bad state of health and manifold further symptoms, including excessive grooming associated with severe self-inflicted wounds, an abnormally high water uptake, clear morphological signs of kidney deterioration, and a reduced survival due to sudden death. Based on these observations, the aim of this study was to discover an elicitor of this complex and versatile phenotype. The observed kidney degeneration in our SPRED2 KO mice was ascribed to hydronephrosis characterized by severe kidney atrophy and apoptosis of renal tubular cells. Kidney damage prompted us to analyze drinking behavior and routine serum parameters. Despite polydipsia, which was characterized by a nearly doubled daily water uptake, the significantly elevated Na+ and Cl- levels and the resulting serum hyperosmolality could not be compensated in SPRED2 KOs. Since salt and water balance is primarily under hormonal control of aldosterone and AVP, we analyzed both hormone levels. While serum AVP was similar in WTs and KOs, even after experimental water deprivation and an extreme loss of body fluid, serum aldosterone was doubled in SPRED2 KO mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. Serum corticosterone, which is like aldosterone released from the adrenal cortex, was more than doubled in SPRED2 KOs, too. Similar to corticosterone, the production of aldosterone is at least in part under control of pituitary ACTH, which is further regulated by upstream hypothalamic CRH release. In fact, stress hormone secretion from this complete hypothalamic-pituitary-adrenal axis was upregulated because serum ACTH, the mid acting pituitary hormone, and hypothalamic CRH, the upstream hormonal inductor of HPA axis activity, were also elevated by 30% in SPRED2 KO mice. This was accompanied by an upregulated ERK activity in paraventricular nucleus-containing hypothalamic brain regions and by augmented hypothalamic CRH mRNA levels in our SPRED2 KO mice. In vitro studies using the hypothalamic cell line mHypoE-44 further demonstrated that both SPRED1 and SPRED2 were able to downregulate CRH promoter activity, CRH secretion, and Ets factor-dependent CRH transcription. This was in line with the presence of various Ets factor binding sites in the CRH promoter region, especially for Ets1. Thus, this study shows for the first time that SPRED2-dependent inhibition of Ras/ERK/MAPK signaling by suppression of ERK activity leads to a downregulation of Ets1 factor-dependent transcription, which further results in inhibition of CRH promoter activity, CRH transcription, and CRH release from the hypothalamus. The consecutive hyperactivity of the complete HPA axis in our SPRED2 KO mice reflects an elevated endogenous stress response becoming manifest by excessive grooming behavior and self-inflicted skin lesions on the one hand; on the other hand, in combination with elevated aldosterone synthase expression, this upregulated HPA hormone release explains hyperaldosteronism and the associated salt and water imbalances. Both hyperaldosteronism and polydipsia very likely contribute further to the observed kidney damage. Taken together, this study initially demonstrates that SPRED2 is essential for the appropriate regulation of HPA axis activity and of body homeostasis. To further enlighten and compare consequences of SPRED2 deficiency in mice and particularly in humans, two follow-up studies investigating SPRED2 function especially in heart and brain, and a genetic screen to identify human SPRED2 loss-of-function mutations are already in progress. N2 - SPRED-Proteine sind Inhibitoren des hochkonservierten und in allen Geweben verbreiteten Ras/ERK/MAPK-Signalwegs, welcher Proliferation, Differenzierung und das Wachstum von Zellen reguliert. Um physiologische Konsequenzen der SPRED2-Defizienz im lebenden Modellorganismus aufzuklären, haben wir SPRED2-KO-Mäuse mithilfe der „gene trap“-Methode generiert. Eine erste Studie zur phänotypischen Charakterisierung mit KO-Mäusen bis zu einem Alter von fünf Monaten identifizierte SPRED2 als Regulator der Chondrozytendifferenzierung und des Knochenwachstums. So bewirkt der Verlust der SPRED2-Proteinfunktion eine erhöhte FGFR-vermittelte ERK-Aktivität, was wiederum einen Hypochondroplasie-ähnlichen Minderwuchs verursacht. Allerdings offenbarten Langzeitbeobachtungen älterer KO-Mäuse einen im Allgemeinen sehr schlechten Gesundheitszustand und weitere facettenreiche Symptome, darunter exzessives Putzverhalten mit schweren, selbst zugefügten Wunden, einen abnorm hohen täglichen Wasserkonsum, klare morphologische Anzeichen einer Nierenschädigung und eine reduzierte Überlebenswahrscheinlichkeit durch plötzlichen Tod. Ziel dieser Studie war es, basierend auf unseren Beobachtungen, einen Auslöser für diesen komplexen und vielseitigen Phänotyp zu finden. Die beobachtete Nierendegeneration in unseren SPRED2-KO-Mäusen war auf eine Hydronephrose zurückzuführen, welche durch schwere Atrophie des Nierengewebes und Apoptose von Nierentubuluszellen gekennzeichnet war. Aufgrund des Nierenschadens haben wir Trinkverhalten und gängige Serumparameter analysiert. Trotz der Polydipsie, die sich durch eine nahezu verdoppelte tägliche Wasseraufnahme manifestierte, konnten signifikant erhöhte Na+- und Cl--Werte und die daraus resultierende Hyperosmolalität im Serum der SPRED2-KOs nicht kompensiert werden. Weil Salz- und Wasserhaushalt zum größten Teil unter der hormonellen Kontrolle von Aldosteron und ADH stehen, haben wir beide Hormonspiegel untersucht. Während die ADH-Werte im Serum von WT- und KO-Mäusen vergleichbar waren, insbesondere nach experimentellem Wasserentzug und einem extremen Verlust von Körperflüssigkeit, waren die Serumspiegel von Aldosteron in den SPRED2-KO-Mäusen verdoppelt. Die systematische Untersuchung übergeordneter regulatorischer Hormonachsen ergab, dass sich der Hyperaldosteronismus unabhängig von einer erhöhten Aktivität des Renin-Angiotensin-Systems entwickelte, da die Serum-Ang II-Spiegel in den SPRED2-KOs etwa um die Hälfte reduziert waren. Die Expression der Aldosteronsynthase in der Nebenniere war jedoch wesentlich erhöht. Für Kortikosteron, das wie Aldosteron von der Nebennierenrinde freigesetzt wird, konnten wir ebenfalls mehr als doppelt so hohe Werte im Serum der KO-Tiere detektieren. Die Aldosteron-Produktion steht, ähnlich wie bei Kortikosteron, zumindest teilweise unter der Kontrolle des hypophysären Hormons ACTH, dessen Sekretion wiederum übergeordnet durch die Freisetzung von CRH aus dem Hypothalamus geregelt wird. Tatsächlich war die Stresshormon-Sekretion entlang dieser gesamten Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse erhöht, da Serum-ACTH, das mittlere, hypophysäre Hormon, und hypothalamisches CRH, der übergeordnete hormonelle Induktor der HPA-Achse, in den SPRED2-KOs auch um 30% erhöht waren. Zusätzlich waren die ERK-Aktivität ebenso wie die CRH-mRNA-Spiegel im paraventrikulären Nukleus des Hypothalamus in unseren SPRED2-KO-Mäusen deutlich höher. In vitro Studien mit der Hypothalamus-Zelllinie mHypoE-44 zeigten weiterhin, dass sowohl SPRED1 als auch SPRED2 die Aktivität des CRH-Promotors, die CRH-Sekretion und die Ets-Faktor-abhängige CRH-Transkription reduzieren können. Passend dazu enthält die CRH-Promotorregion zahlreiche verschiedene Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren der Ets-Familie, speziell für Ets1. Somit zeigt diese Studie zum ersten Mal, dass die durch SPRED2-vermittelte Hemmung der Ras/ERK/MAPK-Signalkaskade mittels Unterdrückung der ERK-Aktivität zu einer Herunterregulation der Ets1-Faktor-abhängigen Transkription führt, was eine Hemmung der CRH-Promotoraktivität, der CRH-Transkription und der CRH-Freisetzung aus dem Hypothalamus zur Folge hat. Die daraus resultierende Hyperaktivität der gesamten HPA-Achse in unseren SPRED2-KO-Mäusen spiegelt eine erhöhte endogene Stress-Reaktion wider und äußert sich durch übermäßiges Putzverhalten und durch selbst zugefügte Hautläsionen auf der einen Seite; auf der anderen Seite erklärt dies, in Kombination mit der erhöhten Aldosteronsynthase-Expression, den Hyperaldosteronismus und das damit verbundene Ungleichgewicht in Salz- und Wasserhaushalt. Weiterhin tragen sowohl Hyperaldosteronismus als auch Polydipsie sehr wahrscheinlich zu den beobachteten Nierenschädigungen bei. Zusammengefasst ist diese Studie ein erster Hinweis, dass SPRED2 wesentlich an der adäquaten Regulation der HPA-Achsen-Aktivität beteiligt ist und essentiell ist für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper. Um die Folgen von SPRED2-Defizienz in Mäusen und vor allem im Menschen weiter aufzuklären und zu vergleichen, erforschen wir in zwei Folgeprojekten die Funktion von SPRED2 speziell im Gehirn und im Herzen und führen parallel ein genetisches Screening zur Identifikation von funktionellen SPRED2-Mutationen im Menschen durch. KW - Renin-Angiotensin-System KW - Spred-Proteine KW - MAP-Kinase KW - Hypophysen-Zwischenhirn-System KW - Knockout KW - SPRED2 KW - ERK KW - MAP Kinase Signaling KW - HPA Axis KW - Renin Angiotensin System KW - Knockout mouse KW - Spred Protein KW - Hypothalamisch-hypophysäre Achse KW - Renin-Angiotensin-Aldosteron-System KW - MAP-Kinase KW - Gen-Knockout Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107355 ER - TY - THES A1 - Lies, Barbara Christiane T1 - Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen T1 - Investigation of NO/cGMP signaltransduction in smooth muscle of NO-GC-deficient mice N2 - Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte. N2 - The nitric oxide (NO)/cGMP signal transduction has a prominent role in the control of smooth muscle tone. Besides its outstanding function in vascular relaxation NO is a major inhibitory neurotransmitter in the gastrointestinal (GI) tract. It acts predominantly via NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) which consists of two subunits (α and ß). Deletion of the ß1 subunit in the mouse leads to a global NO-GC knockout (GCKO). In the GI tract, expression of NO-GC is detected in smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC) and fibroblast-like cells (FLC). Using cell-specific knock-out mice the impact of NO/cGMP-signaling on regulation of contraction and relaxation in the respective GI cell types was investigated. SMC- and ICC-specific GCKO mice already existed in our lab whereas FLC-specific GCKO mice were generated and then crossed to obtain double and triple mutants. GI smooth muscle from FLC-GCKO mice shows a WT-like relaxation towards NO. Also tissue from FLC/ICC- and FLC/SM-GCKO mice can be relaxed by addition of NO. Only deletion of NO-GC in all three cell types leads to an abolished relaxation as seen in GCKO tissue. Surprisingly, FLC-GCKO mice show an accelerated gut transit time in comparison to WT animals. These results lead to the conclusion that NO-GC in all three GI cell types mediates nitrergic signaling in smooth muscle, even though in different ways. There seems to be an interaction of the three cell types which needs to be further attended to by investigation of the double- and triple-GCKO mutants. The second part of this project engaged in the investigation of NO-GC in the lower urinary (LU) tract. Here, expression of NO-GC is detected in urethra and urinary bladder. Urethral NO-GC is expressed in SMC whereas in the urinary bladder NO-GC expression can only be detected in interstitial cells. As a consequence, NO-induced urethral relaxation is exclusively dependent on SMC. Bladder smooth muscle does not reveal NO-mediated relaxation. The identification and function of the NO-GC expressing interstitial cells remains to be further investigated. Investigation of the NO-GC inhibitors ODQ and NS2028 shows that their efficiency is dependent on three different factors: (1) class of NO donor, (2) incubation time of the inhibitor and the NO donor and (3) the strength of pre-contraction when using smooth muscle tissue. The choice of these parameters determines to which extent ODQ and NS2028 are able to inhibit NO-GC. For that reason use of these inhibitors should not be taken as proof of cGMP-independent effects. KW - Glatte Muskulatur KW - Gastrointestinaltrakt KW - NO-sensitive Guanylyl-Cyclase KW - unterer Harntrakt KW - NO-sensitive guanylyl cyclase KW - lower urinary tract KW - gastrointestinal tract KW - smooth muscle KW - Maus KW - Knockout KW - Stickstoffoxide KW - Cyclo-GMP KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85499 ER - TY - THES A1 - Fischer, Robin T1 - Generating useful tools for future studies in the center of the circadian clock – defined knockout mutants for PERIOD and TIMELESS T1 - Generierung nützlicher Instrumente für zukünftige Studien im Zentrum der Inneren Uhr - definierte knockout Mutanten für PERIOD und TIMELESS N2 - To unravel the role of single genes underlying certain biological processes, scientists often use amorphic or hypomorphic alleles. In the past, such mutants were often created by chance. Enormous approaches with many animals and massive screening effort for striking phenotypes were necessary to find a needle in the haystack. Therefore at the beginning chemical mutagens or radiation were used to induce mutations in the genome. Later P-element insertions and inaccurate jump-outs enabled the advantage of potential larger deletions or inversions. The mutations were characterized and subsequently kept in smaller populations in the laboratories. Thus additional mutations with unknown background effects could accumulate. The precision of the knockout through homologous recombination and the additional advantage of being able to generate many useful rescue constructs that can be easily reintegrated into the target locus made us trying an ends-out targeting procedure of the two core clock genes period and timeless in Drosophila melanogaster. Instead of the endogenous region, a small fragment of approximately 100 base pairs remains including an attP-site that can be used as integration site for in vitro created rescue constructs. After a successful ends-out targeting procedure, the locus will be restored with e.g. flies expressing the endogenous gene under the native promoter at the original locus coupled to a fluorescence tag or expressing luciferase. We also linked this project to other research interests of our work group, like the epigenetic related ADAR-editing project of the Timeless protein, a promising newly discovered feature of time point specific timeless mRNA modification after transcription with yet unexplored consequences. The editing position within the Timeless protein is likewise interesting and not only noticed for the first time. This will render new insights into the otherwise not-satisfying investigation and quest for functional important sequences of the Timeless protein, which anyway shows less homology to other yet characterized proteins. Last but not least, we bothered with the question of the role of Shaggy on the circadian clock. The impact of an overexpression or downregulation of Shaggy on the pace of the clock is obvious and often described. The influence of Shaggy on Period and Timeless was also shown, but for the latter it is still controversially discussed. Some are talking of a Cryptochrome stabilization effect and rhythmic animals in constant light due to Shaggy overexpression, others show a decrease of Cryptochrome levels under these conditions. Also the constant light rhythmicity of the flies, as it was published, could not be repeated so far. We were able to expose the conditions behind the Cryptochrome stabilization and discuss possibilities for the phenomenon of rhythmicity under constant light due to Shaggy overexpression. N2 - Um die Rolle einzelner Gene hinter biologischen Prozessen zu entschlüsseln, bedienen sich Wissenschaftler häufig amorpher oder hypomorpher Allele. Diese wurden in der Vergangenheit oft auf Zufall basierend generiert. Gewaltige Ansätze mit zahllosen Tieren unter enormem Selektionsaufwand bei der Suche nach markanten Phänotypen waren notwendig um sprichwörtlich die Nadel im Heuhaufen zu finden. Zunächst wurden chemische Mutagene oder Strahlung verwendet um Mutationen im Genom zu induzieren. Später kamen P-element Insertionen und induziertes unpräzises Herausspringen der Transposons dazu. Das hatte den Vorteil, dass so unter Umstände größere Deletionen oder Inversionen entstanden. Die Mutationen wurden charakterisiert und die Tiere anschließend in kleinen Populationen gehalten. Dadurch konnten sich zusätzliche Mutationen mit möglichen Hintergrundeffekten unbemerkt ansammeln. Ebenso blieben weitere durchaus mögliche Mutationen aufgrund der Mutagene und dem deutlicheren Phänotyp der primären Mutation oftmals unbemerkt. Die Präzision eines Knockouts durch homologe Rekombination und der Vorteil, zusätzlich im Stande zu sein, jedes entworfene Rettungskonstrukt auf einfache Weise wieder einsetzen zu können, überzeugte uns, eine Ends-out Targeting Prozedur mit den zwei Uhr Basisgenen period und timeless in Drosophila melanogaster durchzuführen. Dabei soll ein geplanter Knockout zu einer kompletten Deletion des gesamten Bereichs durch homologe Rekombination führen. Anstelle der endogenen Region verbleibt lediglich ein kleines Fragment von ungefähr 100 Basenpaaren inklusive einer attP-Stelle, die als Insertionsstelle für in vitro hergestellte Konstrukte genutzt werden kann. Angestrebte Ziele sind beispielsweise Fliegen, die das endogene Gen unter der Kontrolle des ursprünglichen Promoters am originalen Lokus gebunden an einen Fluoreszenzmarker oder aber gekoppelt an Luziferase exprimieren. Wir koppelten dieses Projekt zusätzlich mit anderen Forschungsinteressen unserer Arbeitsgruppe, wie zum Beispiel dem epigenetischen ADAR-Editierungsprojekt des Timeless Proteins, einer vielversprechenden Neuentdeckung zeitpunktspezifischer und posttranskriptionaler Modifizierung der timeless mRNA, mit bisher noch unbekannten Folgen. Die Position der Editierung innerhalb des Timeless Proteins ist ebenfalls sehr interessant und nicht zum ersten Mal im Fokus von Wissenschaftlern. Dies wird neue Einblicke in die sonst bislang nicht zufriedenstellende Suche nach funktionell wichtigen Strukturen von Timeless bringen, welche aufgrund der geringen Homologie zu anderen bisher charakterisierten Proteinen bislang nur unzureichend bestimmt werden konnten. Zuletzt beschäftigten wir uns mit der Frage nach der Rolle von Shaggy bezüglich der inneren Uhr. Der Einfluss einer Überexpression oder Herabregulierung von Shaggy auf die Taktung der Uhr ist eindeutig und wurde schon oft beschrieben. Der Einfluss von Shaggy auf Period und Timeless wurde ebenfalls bereits gezeigt, wird jedoch im Falle des letzteren Proteins noch sehr kontrovers diskutiert. Während einige von einem Cryptochrom stabilisierenden Effekt und rhythmischen Tieren in konstanter Beleuchtung aufgrund von Shaggy Überexpression sprechen, zeigen andere einen Abfall des Cryptochromlevels unter eben genau diesen Umständen. Es war uns möglich die Umstände hinter der Cryptochromstabilisierung aufzudecken. Darüber hinaus zeigen wir mögliche Gründe für das Phänomen des Rhythmus im Dauerlicht von Shaggy Überexpressionstieren auf. KW - Biologische Uhr KW - Circadian clock KW - Period KW - Timeless KW - Genetic engineering KW - Shaggy KW - Taufliege KW - Knockout Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119141 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Traudel T1 - Establishment of Hey-triple-KO-ES cells and characterisation of Bre, a Hey binding partner T1 - Etablierung von Hey-triple-KO ES-Zellen und Charakterisierung von Bre, einem Hey Bindepartner N2 - Hey1, Hey2 and HeyL are downstream effectors of the Notch signalling pathway. Hey genes play decisive roles during embryonic development for example in cardiovascular development. However, the precise transcriptional programmes and genes, which are affected by each single Hey gene, are still poorly understood. One drawback for the analysis of Hey1, Hey2 or HeyL single gene function is that these genes are co-expressed in many tissues and share a high degree of functional redundancy. Thus, it was necessary to establish a system, which is either devoid of Hey expression, or just comprises one single Hey gene family member. For this, Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- as well as Hey-triple- knock out (KO)-ES cells (embryonic stem cells) were generated in this work, because ES cells and their differentiation as EBs (embryoid bodies) represent a valuable tool for the in vitro analysis of embryonic developmental processes. After the establishment of Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells, it could be seen by ALP staining and pluripotency marker expression that loss of Hey expression did not affect ES cell pluripotency features. Thus, these ES cells represent bona fide ES cells and could be further used for the differentiation as EBs. Here, differences in gene expression between Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells (after the loss of Hey1) could be observed in realtime-RT-PCR analysis for the endodermal marker AFP as well as for neural and myogenic markers in d10 EBs. However, the establishment of inducible Hey1, Hey2 or HeyL ES cell lines will be essential to confirm these findings and to search for novel Hey target genes. To get further insight into the mode of Hey action, the analysis of Hey interaction partners is necessary. One such binding partner, the Bre protein, has previously been found in a yeast-two-hybrid screen. Bre has been described to be a member of two distinct complexes (i.e. the nuclear BRCA1-A complex with a function in DNA damage response and the cytoplasmic BRISC complex), to directly interact with the TNF-receptor and Fas and to interfere with apoptotic signalling. The Hey-Bre interaction could be further corroborated in this work; yet, it was not possible to narrow down the interaction site of Bre with Hey1. It rather seems that non-overlapping parts of the Bre protein may bind to Hey. This interaction may be direct– pointing to more than one interaction site inside the Bre protein – or via a common binding partner such as the endogenous Bre protein itself. Besides the interaction studies, functional assays were performed for a more detailed characterisation of Hey1 and Bre interaction. Here, it could be shown that Hey1 over-expression did not have any influence on Bre sub-cellular localisation. Interestingly, it could be demonstrated that Bre positively interfered with Hey1 repressive function in luciferase assays at three of four promoters analysed. Moreover, interaction with Bre seems to lead to a stabilisation of Hey1. As Bre has been described to modulate the E3-ligase activity intrinsic to the BRCC complex it was analysed whether Bre over-expression results in an ubiquitination of Hey1. Yet, this could not be observed in the present work. Furthermore, an interaction of Bre with ubiquitinated proteins could not be demonstrated in an ubiquitin binding assay. To obtain a better insight into Bre function, Bre LacZ gene trap-ES cells and animals were generated. However, realtime-RT-analyses revealed that these cells and mice did not show a loss of Bre expression on mRNA level indicating that insertion mutagenesis did not occur as expected. However, embryos derived from these mice could nevertheless be used for the detection of tissues with Bre expression by β-galactosidase staining. Bre deficiency on mRNA levels was only achieved after the deletion of the floxed exon 3 resulting in the generation of Bre del-mice. Bre del-mice were fertile and without any obvious phenotype and they were used for the generation of Bre del- and wt-MEFs (murine embryonic fibroblasts). Characterisation of these cells showed that proliferation was not affected after loss of Bre (neither under normal nor under stress conditions). However, loss of Bre notably resulted in a reduction in the BRCA1 DNA damage response, in a slightly increased sensitivity towards apoptosis induction by FasL treatment and in an increase in the K63-poly-ubiquitin content in Bre del-cytoplasmic fractions, probably linked to a change in the BRISC de-ubiquitinase activity. Even though these results have the same tendencies as observed in former studies, the effects in the present work are less striking. Further studies as well as intercrossing of Bre del- to Hey KO-animals will be necessary to further understand the functional relevance of Hey and Bre interaction. N2 - Hey1, Hey2 und HeyL sind Zielgene des Notch Signalwegs und spielen eine entscheidende Rolle während der Embryonalentwicklung, z. B. bei der Bildung des kardiovaskulären Systems. Die genauen Effekte eines jeden einzelnen Hey Gens auf Transkriptionsprogramme und einzelne Gene sind allerdings noch relativ unbekannt. Einer der Gründe hierfür liegt vermutlich in der Koexpression von Hey-Proteinen in vielen Geweben bzw. in der daraus resultierenden funktionellen Redundanz. Daher sollte in dieser Arbeit ein System entwickelt werden, in dem entweder keines oder jeweils nur eines der Hey-Gene intakt ist. Hierzu wurden Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/- und Hey-triple-knock out (KO) ES-Zellen (embryonale Stammzellen) etabliert. ES-Zellen stellen ein hervorragendes Modellsystem für die Embryonalentwicklung dar, weil ihre in vitro Differenzierung als sog. „embryoid bodies“ (EBs) embryonale Entwicklungsprozesse widerspiegelt. Der Verlust der Hey-Genexpression hatte keinen Einfluss auf den Stammzellcharakter der etablierten Zellen, da sowohl die generierten Hey-triple-KO- als auch die Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/--ES-Zellen eine positive ALP-Färbung sowie eine hohe Expression von Pluripotenzmarkern zeigten. Daher konnten die Zellen im Folgenden als EBs differenziert und auf Genexpressionsunterschiede während der Differenzierung untersucht werden. Zwischen Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/-- (mit intakter Hey1-Expression) und Hey-triple- KO- ES Zellen konnten an EB Tag 10 mittels realtime-RT-PCR Unterschiede in der Genexpression für den endodermalen Marker AFP, sowie für neurale und myogene Marker festgestellt werden. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, aber auch, um neue Hey Zielgene ausfindig machen zu können, ist jedoch die Etablierung induzierbarer ES-Zellen (für Hey1, Hey2 bzw. HeyL) notwendig. Um einen tieferen Einblick in die Funktionsweise der Hey-Gene gewinnen zu können ist die Untersuchung von Hey Interaktionspartnern wichtig. Das Bre-Protein ist ein solcher Bindepartner und wurde zuvor in einem Yeast-two-hybrid Assay gefunden. Bre ist in zwei verschiedenen Komplexen beschrieben worden: dem nukleären BRCA1-A-Komplex, der eine Rolle bei der Detektion von DNA-Schäden spielt und dem cytoplasmatischen BRISC-Komplex. Es ist außerdem bekannt, dass Bre direkt mit dem TNF-Rezeptor und mit Fas interagiert und die apoptotische Antwort in der Zelle beeinflusst. Die Interaktion zwischen Bre und Hey1 konnte in dieser Arbeit zunächst bestätigt werden; in weiteren Ko-immunpräzipitations-Experimenten war es aber nicht möglich, den Bereich des Bre-Proteins zu bestimmen, der die Interaktion mit Hey1 vermittelt, da verschiedene nicht überlappende Bereiche des Bre-Proteins eine Interaktion mit Hey1 zeigten. Ob es sich hierbei um direkte Interaktionen handelte und Bre somit mehrere Bindestellen für Hey1 aufweist oder ob die Interaktion indirekt über einen gemeinsamen Bindepartner wie z.B. das endogene Bre-Protein selbst vermittelt wird, ist noch nicht geklärt. Für eine weitere Charakterisierung der Interaktion zwischen den beiden Proteinen wurden funktionelle Versuche durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von Hey1 keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation des Bre Proteins hat. Mit Hilfe von Luziferase Assays konnte aber interessanterweise nachgewiesen werden, dass Bre bei drei von vier untersuchten Promotern positiv auf die Repression durch Hey1 einwirkte. Außerdem scheint die Überexpression von Bre möglicherweise eine Stabilisierung des Hey1-Proteins zu bewirken. Da Bre eine Verstärkung der E3-Ligasefunktion des BRCC-Komplexes zugeschrieben wird, wurde außerdem untersucht, ob die Überexpression von Bre zu einer Ubiquitinylierung von Hey1 führt. Dies konnte allerdings nicht festgestellt werden. Desweiteren konnte in einem Ubiquitin-Bindeassay keine Interaktion von Bre mit anderen ubiquitinylierten Proteinen gezeigt werden. ... KW - Embryonale Stammzelle KW - Zeitdifferenzierung KW - Gen notch KW - Knockout KW - Hey KW - Bre KW - Hey KW - embryonic stem cells KW - differentiation KW - interaction KW - Bre-knockout KW - Interaktion Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85459 ER - TY - THES A1 - Araragi, Naozumi T1 - Electrophysiological investigation of two animal models for emotional disorders - serotonin transporter knockout mice and tryptophan hydroxylase 2 knockout mice T1 - Elektrophysiologische Untersuchung bei zwei Tiermodellen für emotionale Störungen - Serotonin Transporter knockout Mäuse und Tryptophan Hydroxylase 2 knockout Mäuse N2 - Serotonin (5-HT) has been implicated in the regulation of emotions as well as in its pathological states, such as anxiety disorders and depression. Mice with targeted deletion of genes encoding various mediators of central serotonergic neurotransmission therefore provides a powerful tool in understanding contributions of such mediators to homeostatic mechanisms as well as to the development of human emotional disorders. Within this thesis a battery of electrophysiological recordings were conducted in the dorsal raphe nucleus (DRN) and the hippocampus of two murine knockout lines with deficient serotonergic systems. Serotonin transporter knockout mice (5-Htt KO), which lack protein responsible for reuptake of 5-HT from the extracellular space and tryptophan hydroxylase 2 knockout (Tph2 KO) mice, which lack the gene encoding the neuronal 5-HT-synthesising enzyme. First, 5-HT1A receptor-mediated autoinhibition of serotonergic neuron firing in the DRN was assessed using the loose-seal cell-attached configuration. Stimulation of 5-HT1A receptors by a selective agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), showed a mild sensitisation and a marked desensitisation of these receptors in Tph2 KO and 5-Htt KO mice, respectively. While application of tryptophan, a precursor of 5-HT and a substrate of Tph2, did not cause autoinhibition in Tph2 KO mice due to the lack of endogenously produced 5-HT, data from 5-Htt KO mice as well as heterozygous mice of both KO mice lines demonstrated the presence of autoinhibitory mechanisms as normal as seen in wildtype (WT) controls. When the Tph2-dependent step in the 5-HT synthesis pathway was bypassed by application of 5-hydroxytryptophan (5-HTP), serotonergic neurons of both Tph2 KO and 5-Htt KO mice showed decrease in firing rates at lower concentrations of 5-HTP than in WT controls. Elevated responsiveness of serotonergic neurons from Tph2 KO mice correspond to mild sensitisation of 5-HT1A receptors, while responses from 5-Htt KO mice suggest that excess levels of extracellular 5-HT, created by the lack of 5-Htt, stimulates 5-HT1A receptors strong enough to overcome desensitisation of these receptors. Second, the whole-cell patch clamp recording data from serotonergic neurons in the DRN showed no differences in basic electrophysiological properties between Tph2 KO and WT mice, except lower membrane resistances of neurons from KO mice. Moreover, the whole-cell patch clamp recording from CA1 pyramidal neurons in the hippocampus of 5-Htt KO mice showed increased conductance both at a steady state and at action potential generation. Lastly, magnitude of long-term potentiation (LTP) induced by the Schaffer collateral/commissural pathway stimulation in the ventral hippocampus showed no differences among Tph2 KO, 5-Htt KO, and WT counterparts. Taken together, lack and excess of extracellular 5-HT caused sensitisation and desensitisation of autoinhibitory 5-HT1A receptors, respectively. However, this may not directly translate to the level of autoinhibitory regulation of serotonergic neuron firing when these receptors are stimulated by endogenously synthesised 5-HT. In general, KO mice studied here showed an astonishing level of resilience to genetic manipulations of the central serotonergic system, maintaining overall electrophysiological properties and normal LTP inducibility. This may further suggest existence of as-yet-unknown compensatory mechanisms buffering potential alterations induced by genetic manipulations. N2 - Serotonin (5-HT) ist an der Regulation von der Emotionen, sowie ihrer pathologischen Zustände, wie Angststörungen und Depressionen beteiligt. Mäuse denen, mittels einer zielgerichteteten Deletion von Genen, die verschiedenste Proteine involviert in der zentralen serotonergen Nerotransmission fehlen, dienen daher als ein nützliches Tiermodell, um die Rolle dieser Mediatoren bei Homöostasemechanismen und der Entwicklung emotionaler Störungen beim Menschen zu verstehen. Im Rahmen dieser Thesis wurde eine Batterie von elektrophysiologischen Ableitungen im Hippocampus sowie in der dorsalen Raphe Nucleus (DRN) zweier Knockout-Mauslinien mit einem defizienten serotonergen Systems durchgeführt. Serotonintransporter Knockout-Mäuse (5-Htt KO), denen das Protein zur Wiederaufnahme von 5-HT aus dem extrazellulären Raum fehlt und Tryptophanhydroxylase 2 Knockout-Mäuse (Tph2 KO), denen das Gen für das 5-HT-synthetisierende Enzym im Gehirn fehlt. Zunächst wurde mittels der “loose-seal cell-attached” Aufnahmemethode die Eigenhemmung der serotonergen Neuronen untersucht, die durch 5-HT1A Rezeptoren in der DRN vermittelt wird. Stimulierung der 5-HT1A Rezeptoren durch einen selektiven Agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), zeigte eine milde Sensibilisierung und eine deutliche Desensibilisierung dieser Rezeptoren in Tph2 KO bzw. in 5-Htt KO Mäusen. Während die Anwendung von Tryptophan, eine Vorstufe von 5-HT und ein Substrat der Tph2, keine Eigenhemmung, aufgrund des Mangels an endogen produziertem 5-HT, in Tph2 KO Mäusen verursachte, wiesen Daten von 5-Htt KO Mäusen sowie von heterozygoten Mäusen beider KO Mauslinien die Existenz der Eigenhemmungsmechanismen wie in den Wildtypen (WT) nach. Wurde der Tph2-abhängige Schritt im 5-HT Syntheseweg durch Anwendung von 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) umgangen, zeigten sowohl Tph2 KO als auch 5-Htt KO Mäuse eine Verminderung der serotonergen neuronalen Feuerungsrate bei niedrigeren Konzentrationen von 5-HTP im Vergleich zu den WT. Die erhöhte Reaktionsfähigkeit der serotonergen Neuronen von Tph2 KO Mäusen entsprechen der milden Sensibilisierung der 5-HT1A Rezeptoren. Stattdessen deuten die Reaktionen der serotonergen Neuronen von 5-Htt KO Mäusen darauf hin, dass das überschüssige Niveau von extrazellularem 5-HT, welches durch den Mangel an 5-Htt verursacht wird, 5-HT1A Rezeptoren stark genug stimuliert, um eine Desensibilisierung dieser Rezeptoren zu überwinden. Zweitens zeigten die Daten der whole-cell Patch Clamp Ableitung von serotonergen Neuronen im DRN keine Unterschiede in grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften zwischen Tph2 KO und WT, außer niedrigen Membranwiderständen in KO Mäusen. Darüber hinaus zeigte die whole-cell Patch Clamp Ableitungen von CA1 Pyramidenzellen im Hippocampus der 5-Htt KO Mäuse eine erhöhte Leitfähigkeit sowohl bei Ruheständen als auch bei Aktionspotentialerzeugungen. Schließlich zeigte die Stärke der Langzeitpotenzierung (long-term potentiation: LTP) durch die Stimulation der Schaffer-Kollateralen/kommissuralen Fasern im ventralen Hippocampus keine Unterschiede zwischen Tph2 KO, 5-Htt KO, und jeweiligen WT. Zusammengefasst verursachten der Mangel und der Überschuss von extrazellularen 5-HT eine Sensibilisierung bzw. Desensibilisierung der autoinhibitorischen 5-HT1A Rezeptoren. Dies kann jedoch nicht direkt in die Regulierung von serotonergen Neuronen Feuerung umgesetzt werden, wenn die 5-HT1A Rezeptoren durch endogen synthetisiertes 5-HT stimuliert werden. Im Allgemeinen zeigten die hier untersuchten KO Mäuse, ein erstaunliches Maß an Widerstandskraft, die die allgemeinen elektrophysiologischen Eigenschaften und die normale LTP Induzierbarkeit trotz genetischer Manipulationen des zentralen serotonergen Systems aufrechterhielt. Weiterhin deutet dies auf die Existenz noch unbekannter Kompensationsmechanismen hin, die diese potentiellen Veränderungen abzudämpfen scheinen. KW - Serotonin KW - Elektrophysiologie KW - Tryptophan hydroxylase 2 KW - Knockout KW - Serotonin transporter KW - Depression KW - Anxiety KW - Knockout KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83265 ER - TY - THES A1 - Groneberg, Dieter T1 - Funktion der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in der glatten Muskulatur T1 - The function of NO-sensitive guanylyl cyclase in smooth muscle N2 - Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskulären Faktoren für die Relaxation der Blutgefäße sowie für die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt hauptsächlich über die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen führt zu einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-Mäuse zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskulären und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die Mäuse zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verlängerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion mündet. Allerdings erlaubt eine vollständige Deletion der NO-GC in den Mäusen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der für den erhöhten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gestörten Darm-Motilität zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-Mäuse für die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-Mäuse entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen völlig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. Überraschenderweise ist die Darm-Motilität der SM-GCKO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen unverändert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus für ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Phänotyp dieser Doppel-Knockouts ähnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verlängert. Zusammenfassend führt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollständigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt. N2 - The nitric oxide (NO)-cGMP signaling pathway plays a prominent role in the control of smooth muscle tone. NO is one of the main vascular factors responsible for the relaxation of blood vessels, regulation of blood pressure and also acts as major inhibitory neurotransmitter in the gastrointestinal (GI) tract. It acts predominantly via NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) which is made up of 2 different subunits (α and ß). Deletion of the ß1 subunit in the mouse leads to a global NO-GC knockout (GCKO). GCKO mice do not reveal NO-induced relaxation of vascular and GI smooth muscle. They show hypertension and an increased gut transit time resulting in GI dysfunction. However, global deletion of NO-GC in mice does not allow identification of the cell/tissue type responsible for the elevated blood pressure and GI dysfunction. To determine the relative contribution of smooth muscle cells to the hypertension and GI dysfunction seen in NO-GC knockout mice were generated smooth muscle–specific knockout mice for the ß1 subunit of NO-GC (SM-GCKO) using a tamoxifen-inducible system. SM-GCKO animals develop hypertension over time in combination with a loss of NO-induced smooth muscle relaxation. In sum, these data provide evidence that deletion of NO-GC solely in smooth muscle is sufficient to cause hypertension. Surprisingly, NO-induced relaxation of GI smooth muscle was only slightly reduced in SM-GCKO mice and gut motility was unchanged compared to wild-type mice. Taken together, lack of NO-GC in smooth muscle cells does not impair NO induced relaxation of GI tissues or GI motility. To determine the cell type expressing NO-GC we used immunhistochemistry. We found that, in addition to smooth muscle, interstitial cells of Cajal (ICC) express NO GC. With a Cre specific mouse model for ICC we generated a mouse line lacking NO-GC in both smooth muscle and ICC. In these double knockouts we observed a phenotype similar to that seen in total GCKO mice including lack of nitrergic relaxation and increased gut transit time. In conclusion, lack of NO-GC in both SMC and ICC totally abolishes nitrergic signaling in GI tract. KW - Knockout KW - Glatte Muskulatur KW - Hypertonie KW - Motilität KW - Maus KW - knockout KW - smooth muscle KW - hypertension KW - motility KW - mouse Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67689 ER - TY - THES A1 - Vetter, Sebastian T1 - Elektrophysiologische Charakterisierung von STIM2-Knock-Out-Mäusen T1 - Electrophysiological characterization of STIM2 knockout mice N2 - Um eine mögliche elektrophysiologische, kardiale Ursache für den plötzlichen Tod von STIM2 Knock-Out Mäusen zu prüfen, wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung mittels Ruhe- und Stress-EKG, telemetrischem Langzeit-EKG sowie Elektrophysiologischer Untersuchung durchgeführt. Hierbei konnte keine kardial-elektrophysiologische Grundlage für den plötzlichen Tod dieser Tiere gefunden werden. N2 - For testing a possible electrophysiological, cardiac reason for the sudden death of STIM2 knockout mice, a electrophysiological characterization was performed by use of resting and stress ecg, telemetric long-term ecg and electrophysiology study. In this study couldn't be found any cardiac electrophysiological cause for the sudden death of these animals. KW - Knock-Out KW - Knockout KW - Elektrophysiologie KW - Maus KW - Maus KW - Kardiologie KW - Elektrophysiologische Untersuchung KW - STIM2 KW - STIM2 KW - electrophysiology study KW - electrocardiography KW - telemetry KW - ecg Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77005 ER - TY - THES A1 - Waider, Jonas T1 - The effects of serotonin deficiency in mice: Focus on the GABAergic system T1 - Die Effekte einer Serotonindefizienz in der Maus: Das GABAerge System im Blickpunkt N2 - Based on genetic association and functional imaging studies, reduced function of tryptophan hydroxylase-2 (TPH2) has been shown to be critically involved in the pathophysiology of anxiety-disorders and depression. In order to elucidate the impact of a complete neuronal 5-HT deficiency, mice with a targeted inactivation of the gene encoding Tph2 were generated. Interestingly, survival of Tph2-/- mice, the formation of serotonergic neurons and the pathfinding of their projections was not impaired. Within this thesis, I investigated the influence of 5-HT deficiency on the γ-amino butyric acid (GABA) system. The GABAergic system is implicated in the pathophysiology of anxiety disorders. Therefore, measurement of GABA concentrations in different limbic brain regions was carried out. These measurements were combined with immunohistochemical estimation of GABAergic cell subpopulations in the dorsal hippocampus and amygdala. In Tph2-/- mice GABA concentrations were increased exclusively in the dorsal hippocampus. In heterozygous Tph2+/- mice concentrations of GABA were increased in the amygdala compared to Tph2-/- and wt control mice, while the reverse was found in the prefrontal cortex. The changes in GABA concentrations were accompanied by altered cell density of GABAergic neurons within the basolateral complex of the amygdala and parvalbumin (PV) neurons of the dorsal hippocampus and by adaptational changes of 5-HT receptors. Thus, adaptive changes during the development on the GABA system may reflect altered anxiety-like and depressive-like behavior in adulthood. Moreover, chronic mild stress (CMS) rescues the depressive-like effects induced by 5-HT deficiency. In contrast, 5-HT is important in mediating an increased innate anxiety-like behavior under CMS conditions. This is in line with a proposed dual role of 5-HT acting through different mechanisms on anxiety and depressive-like behavior, which is influenced by gene-environment interaction effects. Further research is needed to disentangle these complex networks in the future. N2 - Genomweite Assoziationsstudien in Kombination mit bildgebenden Studien zeigten, dass eine verringerte Funktion der Tryptophanhydroxylase-2 (Tph2) eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie von Angststörungen und Depression spielt. Jedoch sind die einer Angststörung oder Depression zugrundeliegenden genauen Mechanismen noch nicht verstanden. Um den Einfluss einer 5-HT Defizienz zu untersuchen, wurden Tph2 ablatierte (Tph2-/-) Mäuse mittels zielgerichteter Mutagenese generiert. Der Verlust des Tph2 Gens hatte interessanterweise keinen Einfluss auf die Entwicklung vormals serotonerger Neurone und das Überleben der Tiere. In vorherigen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass 5-HT das GABAerge System, welches in der Pathophysiologie von Angststörungen eine zentrale Rolle spielt, in seiner Entwicklung beeinflusst. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit in verschiedenen Gehirnregionen des limbischen Systems Konzentrationen von GABA gemessen. Außerdem wurden mittels immunhistologischer Untersuchungen die Auswirkungen einer 5-HT Defizienz auf GABAerge Neuronenpopulationen hin untersucht. In Tph2-/- Mäusen wurden erhöhte Konzentrationen im Vergleich zu Tph2+/- und wt Kontrollen von GABA im Hippocampus festgestellt. In der Amygdala zeigten die Tph2+/- Mäuse dagegen eine erhöhte Konzentration von GABA. Dieser Effekt auf Tph2+/- Mäuse war umgekehrt im PFC Kortex zu finden, der erniedrigte GABA Konzentrationen in Tph2+/- aufwies. Die Veränderungen auf der neurochemischen Ebene wurden begleitet von veränderten GABAergen Zelldichten im basolateralen Komplex der Amygdala und parvalbuminergen GABAergen Neuronen in der CA3 Region des dorsalen hippocampus. Zudem waren 5-HT1A Rezeptoren und ihre Signalwege hochreguliert. Es scheint, dass der Verlust von 5-HT adaptive Veränderungen in der Entwicklung auf das GABAerge System zur Folge hat und die Basis für verändertes angstähnliches und depressionsähnliches Verhalten im Erwachsenenalter darstellt. Zusätzlich scheint eine 5-HT Defizienz den depressiven Phänotyp im Porsolt Test auszugleichen. Demgegenüber scheint 5-HT wichtig für ein erhöhtes angstähnliches Verhalten unter CMS Bedingungen zu sein. Dies unterstützt die Hypothese einer Doppelrolle von 5-HT innerhalb von Signalwegen und Mechanismen des angst- und depressionsähnlichem Verhalten, die durch Umweltfaktoren wie Stress stark beeinflusst werden. Um den Patienten noch besser helfen zu können erfordert dies in der Zukunft weiterhin eine fundierte Entschlüsselung der dahinter verborgenen Mechanismen. KW - Knockout KW - Serotonin KW - Maus KW - Knockout-Maus KW - GABA KW - serotonin deficiency KW - GABA KW - knockout-mice Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74565 ER - TY - THES A1 - Pleiser, Sandra T1 - Mouse genetic analyses of Spir functions T1 - Maus-genetische Analysen zur Funktion von Spir N2 - Das Aktin-Zytoskelett ist für viele zelluläre Funktionen unerlässlich, dazu gehören der strukturelle Aufbau von Zellen, die Zellwanderung und Vesikeltransportprozesse. Die funktionelle Vielfalt der Aktinstrukturen spiegelt sich in einer Vielzahl verschiedener molekularer Mechanismen wieder, welche die Polymerisierung von Aktinfilamenten regulieren. Die sponante Aktinpolymerisierung wird jedoch verhindert aufgrund der Instabilität von kleinen Aktin Oligomeren und durch Aktin Monomer bindende Proteine, welche die Bildung solcher Oligomere unterbinden. Aktinnukleationsfaktoren helfen diese kinetische Barriere der Filamentbildung zu überwinden und sind wesentlich für die Erzeugung von neuen Aktinfilamenten an bestimmten subzellulären Kompartimenten. Spir Proteine sind die ersten beschriebenen Mitglieder der neuen Klasse von WH2 Domänen Aktinnukleationsfaktoren. Sie leiten die Polymerisierung von Aktin ein, indem sie Aktinmonomere an die vier WH2 Domänen im Zentrum des Proteins binden. Trotz ihrer Eigenschaft Aktinpolymerisation in vitro selber zu nukleieren, bilden Spir Proteine einen regulatorischen Komplex mit anderen Aktinnukleatoren der formin Untergruppe von forminen. Spir hat eine Funktion bei der Regulierung von vesikulär erzeugten filamentösen Aktinstrukturen, Vesikeltransportprozessen und der Bildung der Teilungsfurche während der asymmetrischen meiotischen Zellteilung. Das Säugetiergenom kodiert zwei spir Gene, spir-1 und spir-2. Die entsprechenden Proteine haben einen identischen strukturellen Aufbau und sind zu einem großen Teil homolog zueinander. Um die Spir Funktion im sich entwickelnden und adulten Nervensystem zu untersuchen, wurde die bisher unbekannte Expression des Maus spir-2 Gens analysiert. Real-time PCR Analysen haben ergeben, dass spir-2 in adulten Mäusen in Oozyten, dem Gehirn, im Gastrointestinaltrakt, den Hoden und der Niere exprimiert wird. In situ Hybridisierungen wurden durchgeführt um die zelluläre Natur der spir Expression nachzuweisen. Während der Embryogenese haben in situ Hybridisierungen gezeigt, dass spir-2 im sich entwickelnden Nervensytem und Darmtrakt exprimiert wird. In adulten Mausgeweben, wurde die höchste Expression von spir-2 in Epithelzellen des Verdauungstraktes, in neuronalen Zellen des Nervensystems und in Spermatocyten gefunden. Im Gegensatz zur eher begrenzten Expression des Maus spir-1 Gens, welches überwiegend im Nervensystem, den Oozyten und Hoden zu finden ist, zeigen die hier aufgeführten Daten ein breiteres Expressionsmuster des spir-2 Gens und unterstützen damit eine allgemeinere zellbiologische Funktion der neuen Aktinnukleatoren. Um die Funktion des Spir Proteins im sich entwickelnden und adulten Nervensystem zu untersuchen, wurden Spir-1 defiziente Mäuse mit Hilfe der gene trap Methode generiert. Spir-1 defiziente Mäuse sind lebensfähig und eignen sich daher perfekt um die Neurobiologie des Spir-1 Aktinnukleators zu untersuchen. Die Analyse von primären kortikalen Neuronen von Spir-1 defizienten Mäusen zeigte eine Reduktion dendritischer Verzweigungen und ist die erste Beschreibung einer neuronalen Funktion von Spir-1. Desweiteren wurde eine transgene Mauslinie (thy1-GFP-M) eingesetzt, die das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) unter der Kontrolle von Neuronen-spezifischen Elementen des thy1 Promoters exprimiert. GFP ist dabei nur in einer Teilmenge von Neuronen exprimiert, färbt diese Neuronen jedoch in ihrer Gesamtheit an. Spir-1 defiziente Mäuse, die das GFP Transgen exprimieren wurden generiert und analysiert. Es wurde herausgefunden, dass Spir-1 defiziente Mäuse eine reduzierte Anzahl an dendritischen Dornen im entorhinalen Kortex im Vergleich zu Wildtyp- Geschwistertieren aufweisen. Zusammengefasst gibt diese Studie neue Erkenntnisse über die zellbiologische Funktion von Spir und liefert Einsichten wie das neuronale Netzwerk sturkturiert wird. N2 - The actin cytoskeleton is essential for many cellular functions, such as the regulation of cell morphology, cell migration and vesicle transport processes. The functional diversity of actin structures is reflected in a variety of distinct molecular mechanisms regulating the polymerization of actin filaments. The spontaneous polymerization of actin however is inhibited, by both the instability of small actin oligomers and by actin monomer binding proteins, which prevent the formation of such oligomers. Actin nucleation factors help to overcome this kinetic barrier of filament initiation and are essential for the generation of novel actin filaments at specified subcellular compartments. Spir proteins are the founding members of the novel class of WH2 domain containing actin nucleation factors. They initiate actin polymerization by binding of actin monomers to four WH2 domains in the central part of the protein. Despite their ability to nucleate actin polymerization in vitro by themselves, Spir proteins form a regulatory complex with the distinct actin nucleators of the formin subgroup of formins. Spir functions in the regulation of vesicular originated filamentous actin structures, vesicle transport processes and the assembly of the cleavage furrow during asymmetric meiotic cell divisions. The mammalian genome encodes two spir genes, spir-1 and spir-2. The corresponding proteins have an identical structural array and share a high degree of homology. In order to elucidate the Spir function in developing and adult mouse tissues, the yet unknown expression of the mouse spir-2 gene was addressed. Real-time PCR analysis revealed highest expression of spir-2 in oocytes, the brain, throughout the gastrointestinal tract, testis and kidney of adult mice. In situ hybridizations were performed to substantiate the cellular nature of spir gene expression. During embryogenesis in situ hybridizations show spir-2 to be expressed in the developing nervous system and intestine. In adult mouse tissues highest expression of spir-2 was detected in the epithelial cells of the digestive tract, in neuronal cells of the nervous system and in spermatocytes. In contrast to the more restricted expression of the mouse spir-1 gene, which is mainly found in the nervous system, oocytes and testis, the data presented here show a distinct and broader expression pattern of the spir-2 gene and by this support a more general cell biological function of the novel actin nucleators. In order to address the function of Spir proteins in the developing and adult nervous system, Spir-1 deficient mice were generated by a gene trap method. Spir-1 deficient mice are viable and provide a perfect tool to address the neurobiological function of the Spir-1 protein. Analyses of primary cortical neurons from Spir-1 deficient mice revealed a specific reduction of dendritic branchpoints and are the first description of a neuronal Spir-1 function. Further, a transgenic mouse line (thy1-GFP-M) was employed that expresses the green fluorescent protein (GFP) under the control of neuron specific elements from the thy1 promoter. GFP is thereby expressed in only a subset of neurons and labels the neurons in their entirety. Spir-1 deficient mice carrying the GFP transgene were generated and analyzed. It was found that Spir-1 deficient mice exhibit a reduced number of dendritic spines in the entorhinal cortex compared to wildtype littermates. All together this study gives novel information about the cell biological function of Spir and provides insights how cytoskeletal functions structure the mammalian neuronal network. KW - Actin-bindende Proteine KW - Knockout KW - Spir KW - Aktinnukleation KW - neuronale Differenzierung KW - Spir KW - Actin nucleation KW - knock-out mouse KW - neuronal differentiation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73634 N1 - Die Dissertation wurde an der Uni Regensburg geschrieben (externe Promotion) ER - TY - THES A1 - Erxleben, Franziska T1 - cDNA-Microarray-Analyse von ZNS-Kaliumkanal defizienten Mäusen T1 - cDNA-Microarry-Analysis of CNS-potassium channel deficient mice N2 - Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können. N2 - The aims of this dissertation were the creation of a „potassium channel chip“, the development of adequate measurement method and strategy of analysis, the performance of developmental experiments and the analysis of the status of genexpression and the occurring mechanisms of compensation in a knockout mouse stem. In beginning the selection of the potassium channel genes to be considered as interesting part of the microarray and the compilation of the sequence information was the main part of the work. Starting from this the choice of the adequate cDNA-microarray-technology and the preparation of the implementation was possible. The first experiments performed in the course of the method development have given a hint on the problems connected with every microarray. However they also have shown the great possibilities of the microarray technology. In the ollowing series of measurements like the investigation of variation of expression during the juvenile development and the comparison of different parts of the brain with the whole brain were performed. The studies were completed by the investigation of the TRESK-Knockout mouse stem in comparison to its wild type. The centre of these studies was the question for possible mechanisms of compensation. As a result kcnk16 - being part of the same gene family as TRESK - can be named as an interesting candidate to be investigated for its function and capacity of compensation in the future. In my dissertation I was able to show that the microarray technology is an adequate method for the comparison of genexpression between members of ion channel families. The bases of the microarray analysis of potassium channels with a individually designed microarray are on the one side the knowledge of the genetics and function of the potassium channels and on the other side the technology which allows this kind of analysis. The fact that mammalian organism like mouse and human have developed such a great number of potassium channels and are using these in the regular cell metabolism in a comprehensive way shows the importance of this ion channel family and makes the research on these channels so interesting and important for fundamental research. A multiplicity of diseases can be attributed indirectly or directly to gene malfunctions in potassium channels. With microarray a technology is available, which permits to investigate the expression of these genes directly and to discover possible ways of compensation. By this coherences can be identified being the basis for continuative research which one day will make it possible to really understand and treat diseases like depression. KW - Maus KW - Knockout KW - Kaliumkanal KW - Zentralnervensystem KW - Microarray KW - DNS-Chip KW - Knock-out Maus KW - TRESK KW - Zentralnervensystem KW - Hirnzelle KW - Ionenkanal KW - Spannungskontrollierter Ionenkanal KW - Differentielle Genexpression KW - Potassium channel KW - Microarray KW - CNS KW - Genexpression KW - Knock out Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65640 ER - TY - THES A1 - Wölke, Stefan T1 - Funktionelle Analyse von bakteriellen W-xxx-E Rho GTPasen GEF Mimetika mittels Typ 3 Sekretionssystems von Yersinia enterocolitica T1 - Functional analysis of bacterial W-xxx-E Rho GTPase GEF mimetics using the type 3 secretion system of Yersinia enterocolotica N2 - Die zellulären Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorgänge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrität. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenitätsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie gehörenden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden über ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox“ führte. Damit können heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zunächst die Gene für die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminosäurereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kulturüberstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivität der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles“ (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes“ (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der Stämme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-Stämme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen lässt, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP für RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse bestätigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abhängig Membranporen-bedingte Zellschädigungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernfärbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembranschädigung / Zytotoxizität nachgewiesen werden, nicht aber mit den Stämmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verstärkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrität über Adhäsionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-Stämmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Schädigung der Zellschichtintegrität führt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unverändert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu können und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden Mäuse mit deletierten Genen für RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt. N2 - Phagocytosis, migration and regulation of epithelial integrity are central cellular aspects that are controlled by the cellular Rho GTPases. In this regard, Rac1, RhoA and Cdc42 have important regulatory roles mediating various cytoskeletal rearrangements in many cell types including epithelial cells as well as professional phagocytes. Because of the central role of the Rho GTPases in cellular integrity and function, bacterial cytotoxins and modulins targeting these cellular switches are very efficient pathogenicity factors. Recently, the T3SS effectors, IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (pathotype EHEC/EPEC) were assembled in one protein family sharing the common motif W-xxx-E. Members of this protein family are described to act as GEF mimics for the cellular Rho GTPases. In this study the effector functions of IpgB1, IpgB2 and Map were analyzed with the Yersinia (Ysc)-T3SS which led to the development of the “Yersinia-Toolbox”. Yersinia enterocolitica is very suitable to be used as “T3SS-Toolbox” because (1) a plasmid solely carrying the DNA fragment encoding the Ysc-T3SS without T3SS-effectors is available, (2) in difference to Salmonella and E. coli (EPEC/EHECH) the Ysc-T3SS-effector genes of Yersinia are not localized on the chromosome and (3) heterologous proteins fused to the Ysc-T3SS-effector YopE are secreted and translocated into cells. This allows the analysis of single heterologous effectors without simultanous injection of other (unknown/redundant) T3SS-effectors in a physiological context during the interaction of Yersinia with cells. To develop the Yersinia-Toolbox, the genes of the GTPase modulating effectors IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (EHEC) were fused to different long sections of the N-Terminus of the Yersinia-Ysc-T3SS-effector YopE (hybrid proteins: YopEi-X: i = 18, 53 or 138 amino acid residues, X = IpgB1, IpgB2 or Map). This study demonstrates the secretion to the culture supernatent and the injection into target cells of the hybrid proteins YopE53-X and YopE138-X (X = IpgB1, IpgB2 and Map). Furthermore, cell biologic activity was detected for the YopE-X hybrid proteins by fluorescence microscopy as membrane ruffles (Rac1 activation), stress fibres (RhoA activation) and micro spikes (Cdc42 activation) occurred after injection of YopE138-IpgB1,.YopE138-IpgB2 and YopE138-Map, in respective. Invasion studies showed that YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) induced invasion of Yersinia, whereas YopEi-IpgB2 reduced invasion of the strains WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i = 53, 138) compared to the strain WA (pT3SS). Combination of different Yersinia-Toolbox strains in the co-infection model with HeLa cells showed that (1) YopE138-IpgB2 reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2, (2) YopT also reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion (inhibitory function on Rac1) and (3) that YopE as GAP for RhoG/Rac1 (predominantly RhoG) did not inhibit the YopE138-IpgB1 induced invasion. Because of the construction of two different compatible plasmids carrying the genes for either YopE138-IpgB1 or YopE138-IpgB2, simultanous translocation of the hybrid proteins of one single strain was possible. These studies confirmed the results of the co-infection studies. It has been reported that the Ysc translocation pore YopB/YopD induces Rho dependent membrane pores in cells which leads to cellular damage (LDH release, PI-staining of the nucleus). In this study cellular damage / cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strain WA (pT3SS). In contrast to that no cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strains WA (pT3SS, pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 and Map. Additionally, co-infections with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB1) resulted in an increased LDH release whereas a co-infection with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB2) led to the decrease of LDH release compared to single infections with WA (pT3SS), again suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2. These results are contrary to published data, which suggest a correlation between RhoA activation dependent actin polymerisation and pore formation. The cellular Rho GTPases are involved in the maintenance of epithelial integrity of polarized cells. Infections of polarized MDCK cell layers with different Yersinia-Toolbox strains resulted in a decrease of the transepithelial electric resistance (TER) indicating a damage of the epithelial integrity after injection of YopE138-IpgB1 or YopE138-Map. The TER value was not altered after injection of YopE138-IpgB2 indicating an intact epithelial integrity. To study bacterial Rho GTPase modulating proteins in more detail and to get a deeper insight to the role of Rho GTPases in the murine infection model with Yersinia enterocolitica and Salmonella, mice with gene deletions for RhoA, Rac1 or Cdc42 in macrophages were constructed. KW - Actin KW - Yersinia enterocolitica KW - Shigella flexneri KW - EHEC KW - CRE KW - Knockout KW - Guanosintriphosphatasen KW - T3SS KW - Rho GTPasen KW - GEF KW - GAP KW - Mimetika KW - Proteinsekretion KW - T3SS KW - Rho GTPases KW - GEF KW - GAP KW - Mimics Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55010 N1 - die Arbeit wurde hauptsächlich am Max-von-Pettenkofer-Inst. der LMU München als externe Dissertation erstellt und vom Lehrstuhl für Mikrobiologie der Fakultät für Biologie an der Universität Würzburg betreut. ER - TY - THES A1 - Nietzer, Sarah T1 - Gene and environment interactions in serotonin transporter knockout mice – how stress influences gene expression and neuronal morphology T1 - Gen-Umwelt-Interaktionen in Serotonin-Transporter-Knockout-Mäusen - Wie Stress die Genexpression und die neuronale Morphologie beeinflusst N2 - Serotonin (5-HT) is an important modulator of many physiological, behavioural and developmental processes and it plays an important role in stress coping reactions. Anxiety disorders and depression are stress-related disorders and they are associated with a malfunction of the 5-HT system, in which the 5-HT transporter (5-HTT) plays an important role. 5-Htt knockout (KO) mice represent an artificially hyperserotonergic environment, show an increased anxiety-like behaviour and seem to be a good model to investigate the role of the 5-HT system concerning stress reactions and anxiety disorders. As synaptic proteins (SPs) seem to be involved in stress reactions, the effect of acute immobilization stress on the expression of the three SPs Synaptotagmin (Syt) I, Syt IV and Syntaxin (Stx) 1A was studied in the 5-Htt KO mouse model as well as the expression of the two immediate early genes (IEGs) FBJ osteosarcoma oncogene (c-Fos) and fos-like antigen 2 (Fra-2). Additionally, the expression of the corticotrophin releasing hormone (CRH) and its two receptors CRHR1 and CRHR2 was investigated as part of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) stress system. Based on gender- and genotype-dependent differences in corticosterone levels, expression differences in the brain were investigated by performing a quantitative real time-PCR study using primer pairs specific for these SPs and for the IEGs c-Fos and Fra-2 in five different brain regions in 5-Htt KO and 5-Htt wild-type (WT) mice. Mainly gender-dependent differences could be found and weaker stress effects on the expression of SPs could be demonstrated. Regarding the expression of IEGs, stress-, gender- and genotype-dependent differences were found mainly in the hypothalamus. Also in the hypothalamus, gender effects were found concerning the expression of CRH and its both receptors. Additionally, in a second study, male 5-Htt WT and male 5-Htt deficient mice were subjected to a resident-intruder-paradigm which stresses the animals through a loser experience. The morphological changes of neurons were subsequently analyzed in Golgi-Cox-stained sections of limbic brain areas in stressed and unstressed animals of both genotypes using the computer-based microscopy system Neurolucida (Microbrightfield, Inc.). While no differences concerning dendritic length, branching patterns and spine density were found in the hippocampus and no differences concerning dendritic length and branching patterns could be shown in the cingulate cortex (CG), pyramidal neurons in the infralimbic cortex (IL) of stressed 5-Htt WT mice displayed longer dendrites compared to unstressed 5-Htt WT mice. The results indicate that, although in this model drastic alterations of neuronal morphology are absent, subtle changes can be found in specific brain areas involved in stress- and anxiety-related behaviour which may represent neural substrates underlying behavioural phenomena. N2 - Serotonin (5-HT) ist ein wichtiger Modulator vieler physiologischer, verhaltensbiologischer und entwicklungsbiologischer Vorgänge und spielt zudem eine wichtige Rolle bei der Stressbewältigung. Angsterkrankungen und Depression sind stressbedingte Störungen und sie sind mit einer Dysfunktion des serotonergen Systems assoziiert, in dem der Serotonintransporter (5-HTT) eine wichtige Funktion einnimmt. 5-Htt Knockout (KO)-Mäuse haben reduzierte Serotoninkonzentrationen im Gehirn, zeigen erhöhtes Angst-ähnliches Verhalten und scheinen ein gutes Modell für die Erforschung der Rolle des serotonergen Systems in Bezug auf Stress-Reaktionen und Angsterkrankungen darzustellen. Da synaptische Proteine (SPs) in die Stress-Reaktion involviert zu sein scheinen, wurden die Auswirkungen von akutem Immobilizierungsstress auf die Expression der drei SPs Synaptotagmin (Syt) I, Syt IV und Syntaxin (Stx) 1A in diesem 5-Htt KO-Maus-Modell untersucht. Ebenso wurde die Expression der zwei „immediate early genes“ (IEGs) FBJ osteosarcoma oncogene (c-Fos) and fos-like antigen 2 (Fra-2) unter die Lupe genommen. Außerdem wurde die Expression des „Corticotrophin Releasing Hormone“ (CRH) sowie seiner beiden Rezeptoren CRHR1 and CRHR2, als Teil des Hypothalamus- Hypophysen-Nebennieren-(HPA)-Systems, analysiert. Basierend auf Geschlechts- und Genotyp-spezifischen Unterschieden der Kortikosteron-Konzentrationen im Blut der Tiere wurden die Expressionslevel dieser SPs und der beiden IEGs mittels quantitativer Real-Time (qRT)-PCR in fünf verschiedenen Gehirnregionen von 5-Htt KO- und 5-Htt-Mäusen mit wildtypischer (WT) Gen-Konstitution untersucht. Dabei konnten vor allem Geschlechts-spezifische Unterschiede in der Genexpression gezeigt werden und es konnte ein im Vergleich dazu schwächerer Einfluss des akuten Immobilisierungs-Stresses auf die Genexpression nachgewiesen werden. Die Expression der IEGs wurde durch Stress, Geschlecht und Genotyp vor allem im Hypothalamus beeinflusst. Ebenfalls im Hypothalamus konnte der Einfluss des Geschlechts auf die Expression des CRH und seiner beiden Rezeptoren gezeigt werden. In einer zweiten Studie wurden männliche 5-Htt KO-Mäuse sowie 5-Htt WT-Mäuse dem „Resident-Intruder-Paradigma“ unterzogen, in welchem die Tiere mittels einer mehrfachen Verlierer-Erfahrung gestresst wurden. Morphologische Veränderungen von Neuronen limbischer Gehirnareale wurden daraufhin an Golgi-Cox-gefärbten Gehirnschnitten dieser gestressten und ungestressten 5-Htt KO- und 5-Htt WT-Tiere mittels des Computer-gestützten Mikroskop-Systems Neurolucida (Microbrightflield, Inc.) analysiert. Während keine Unterschiede bezüglich der Länge des dendritischen Materials, des Verzweigungsmusters und der Spinedichte im Hippocampus gefunden werden konnten und keine Unterschiede in Länge des dendritischen Materials und des Verzweigungsmusters in der Area cinguli (CG) gezeigt werden konnten, wiesen Pyramidenzellen im infralimbischen Kortex (IL) von gestressten 5-Htt WT-Mäusen längere Dendriten auf als die entsprechenden Zellen in den ungestressten Tieren desselben Genotyps. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obwohl in diesen Tieren keine drastischen stressbedingten Änderungen der neuronalen Morphologie vorliegen, doch subtile Änderungen der neuronalen Morphologie stress- und angstinvolvierter Gehirnareale gefunden werden können. Diese Änderungen können die neuronale Basis verschiedenster Verhaltens-Phänomene darstellen. KW - Serotonin KW - Stressreaktion KW - Knockout KW - Genexpression KW - Neuromorphologie KW - Neurolucida KW - Sozialer Stress KW - Stress KW - neuromorphology KW - neurolucida Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54391 ER - TY - THES A1 - Reichert, Nina T1 - The Role of LIN9 in Mouse Development T1 - Die Rolle von LIN9 in der Mausentwicklung N2 - LINC, the human homologue of an evolutionary conserved complex, regulates the transcription of a set of genes essential during the G2/M transition (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). One component of the LINC core module is LIN-9. LIN-9 is essential for the transcriptional activation of LINC target genes and also promotes differentiation in association with pRB (Gagrica et al., 2004). However, nothing is known about its function in vivo. Histological and molecular analysis revealed that Lin9 is ubiquitously expressed throughout embryonic development and in all examined adult organs. Additionally, Lin9 mRNA is expressed in ES cells and blastocysts. Moreover the analogous distribution of the other LINC components suggested that they all function in the same cells and most likely in the same pathway. To deeper investigate the role of LIN9 in cell cycle and differentiation in vivo, a Lin9 gene trap mouse model (GT) was successfully generated and examined. Heterozygouse Lin9GT/+ mice were inconspicuous and develop normally. However, homozygouse knockout embryos were never obtained. The Lin9GT/GT embryos die at peri-implantation, probably due to a defect in the development of the epiblast, which could be shown with in situ hybridization with specific lineage markers. In vitro, the ICM of Lin9-deficient blastocysts did not develop properly. These data suggest that the loss of Lin9 leads to embryonic lethality at peri-implantation, and indicates that LIN9 is required for proper formation of the epiblast. In parallel, the first conditional Lin9 mouse model based on the Cre-loxP technology was generated. The Lin9fl/fl allele can be deleted by Cre-recombinase, in vivo and in vitro. Therefore an inducible system with Lin9fl/fl mice harboring Cre-ERT2 was established. The MEFs generated from these transgenic mice carried a nearly complete knockout upon induction with tamoxifen. Deletion of LIN9 in MEFs had a major impact upon the cell cycle and growth rates. Specifically, they arrested in G2/M phase and stopped to proliferate. Taken together, I was able to generate a lin9 gene trap and a lin9 conditional knockout mouse model. All results obtained so far demonstrate, that Lin9 is an essential gene for embryonic development and cell cycle control. It will be of great interest to further investigate Lin9-deficiency to gain insights into the mechanism of cell cycle control in early embryonic development and cell differentiation. N2 - LINC, das humane Homolog eines evolutionär konservierten Komplexes, reguliert die Transkription von Genen, die essentiell für die G2/M Transition sind (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). Eine Komponente des LINC Komplexes ist LIN-9. LIN-9 ist für die transkriptionelle Aktivierung LINC spezifischer Zielgene essentiell und kann, in Assoziation mit pRB, die Differenzierung humaner Zellen fördern (Gagrica et al., 2004). Bisher ist jedoch nichts über die in vivo Funktion LIN9s bekannt. Histologische und molekulare Analysen der Maus machen deutlich, dass Lin9 während der embryonalen Entwicklung und in allen untersuchten adulten Organen ubiquitär exprimiert wird. Zusätzlich wird Lin9 mRNA in ES Zellen und in Blastocysten exprimiert. Außerdem legt die analoge Verteilung anderer LINC Komponenten nahe, dass sie sehr wahrscheinlich gemeinsam in den gleichen Zellen und Signalwegen agieren. Um die Funktion des LIN9 Proteins im Zellzyklus und der Differenzierung in vivo genauer zu erforschen, wurde ein Lin9 „Gene Trap“ Maus Modell (GT) generiert und untersucht. Heterozygote Lin9GT/+ Mäuse sind unauffällig und entwickeln sich normal. Allerdings wurden keine Lin9 knockout Embryonen erhalten. Lin9GT/GT Embryonen sterben in der peri-Implantationsphase, vermutlich auf Grund eines Entwicklungsdefekts des Epiblasten, was mit in situ Hybridisierung von Abstammungslinien spezifischen Markern gezeigt werden konnte. Die ICM Lin9 defizienter Blastocysten entwickelte sich in vitro nicht richtig. Diese Daten machen deutlich, dass der Verlust von Lin9 zu embryonaler Letalität im Peri-Implantations-stadium führt, und zeigt dass Lin9 für die richtige Ausbildung des Epiblasten benötigt wird. Gleichzeitig wurde das erste konditionelle Lin9 Maus Modell, basierend auf der Cre-loxP Technologie, generiert. Das Lin9fl/fl Allele kann in vivo und in vitro mit der Cre-Recombinase deletiert werden. Deshalb wurde ein induzierbares System mit Lin9fl/fl Mäusen, die zusätzlich Cre-ERT2 tragen, etabliert. Die MEFs dieser transgenen Mäuse trugen nach Induktion mit Tamoxifen einen kompletten Lin9 Knockout. Die Deletion von LIN9 hat dramatische Auswirkung auf den Zellzyklus und die Wachstumsrate der MEFs. Neben der Akkumulation in der G2/M Phase des Zellzyklus kommt es zu einem vollständigen Proliferationsstop. Zusammenfassend war es möglich, ein Lin9 „Gene Trap“ und ein konditionelles Knockout Maus Modell zu generieren. Beide Mausmodelle belegen, dass Lin9 ein essenzielles Gen für die Embryonalentwicklung und die Kontrolle des Zellzyklus ist. Die weitere Erforschung der LIN9 Defizienz wird dazu beitragen, grundlegende Mechanismen der frühen Zellzykluskontrolle und der embryonalen Entwicklung zu verstehen. KW - Zellzyklus KW - Knockout KW - Cell cyle KW - Knockout Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30889 ER - TY - THES A1 - Erro, Alejandro Berna T1 - Generation and Characterization of Stromal Interaction Molecule 2 (STIM2)-deficient Mice T1 - Generierung und Charakterisierung von Stromal Interaction Molecule 2 (STIM2)-defizienten Mäusen N2 - An increase in cytosolic Ca2+ levels ([Ca2+]i) is a key event that occurs downstream of many signaling cascades in response to an external stimulus and regulates a wide range of cellular processes, including platelet activation. Eukaryotic cells increase their basal [Ca2+]i allowing extracellular Ca2+ influx into the cell, which involves different mechanisms. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) is considered the main mechanism of extracellular Ca2+ influx in electrically non-excitable cells and platelets, and comprises an initial Ca2+ depletion from intracellular Ca2+ stores prior to activation of extracellular Ca2+ influx. Although the close relation between Ca2+ release from intracellular stores and extracellular Ca2+ influx was clear, the nature of the signal that linked both events remained elusive until 2005, when Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1) was identified as an endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ sensor essential for inositol (1,4,5)-trisphosphate (IP3)-mediated SOCE in vitro. However, the function of its homologue STIM2 in Ca2+ homeostasis was in general unknown. Therefore, mice lacking STIM2 (Stim2-/-) were generated in this work to study initially STIM2 function in platelets and in cells of the immune system. Stim2-/- mice developed normally in size and weight to adulthood and were fertile. However, for unknown reasons, they started to die spontaneously at the age of 8 weeks. Unexpectedly, Stim2-/- mice did not show relevant differences in platelets, revealing that STIM2 function is not essential in these cells. However, STIM2 seems to be involved in mammary gland development during pregnancy and is essential for mammary gland function during lactation. CD4+ T cells lacking STIM2 showed decreased SOCE. Our data suggest that STIM2 has a very specific function in the immune system and is involved in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) at early stages of the disease progression. Stim2-/- neurons were also defective in SOCE. Surprisingly, our results evidenced that STIM2 participates in mechanisms of neuronal damage after ischemic events in brain. This is the first time that the involvement of SOCE in ischemic neuronal damage has been reported. This finding may serve as a basis for the development of novel neuroprotective agents for the treatment of ischemic stroke, and possibly other neurodegenerative disorders in which disturbances in cellular Ca2+ homeostasis are considered a major pathophysiological component. N2 - Der Anstieg des cytosolischen Ca2+-Spiegels ([Ca2+]i) ist ein Schlüsselereignis, das vielen Signalkaskaden, durch extrazellulären Stimulus ausgelöst werden, nachgeschalten ist, und eine große Reihe zellulärer Prozesse reguliert, z.B. die Aktivierung von Blutplättchen. Eukaryotische Zellen erhöhen ihren basalen ([Ca2+]i) durch Einstrom von extrazellulärem Ca2+ in die Zelle hinein, was durch verschiedene Mechanismen geschehen kann. Store-operated Ca2+-entry (SOCE), wird als der Hauptmechanismus für den Einstrom von extrazellulärem Ca2+ in nicht elektrisch-erregbaren Zellen sowie Plättchen angesehen und beinhaltet einen initialen Ca2+-Ausstrom aus intrazellulären Speichern der dem Ca2+-Einstrom aus der Extrazellulärraum vorrausgeht. Obwohl die Beziehung zwischen Ca2+-Ausstrom aus intrazellulären Speichern und extrazellulärem Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran viele Jahre bekannt war, so blieb doch das beide Ereignisse verknüpfende Element unbekannt. Im Jahre 2005 jedoch wurde Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1) als Ca2+-Sensor des endoplasmatischen Retikulums (ER) und als essentieller Bestandteil für inositol(1,4,5)-triphosphat (IP3)-vermittelten SOCE in vitro identifiziert. Die Funktion seines Homologs, STIM2, in der Ca2+ Homeostase blieb jedoch unklar. Aus diesem Grund generierten wir STIM2-defiziente (Stim2-/-) Mäuse um die Funktion dieses Proteins in Blutplättchen und Immunzellen untersuchen zu können. Bis zum Erwachsenenalter entwickelten sich Stim2-/- Mäuse normal in Bezug auf Größe und Gewicht und waren fertil. Jedoch sterben die Tiere spontan aus unbekannten Gründen, beginnend ab einem Alter von 8 Wochen. Unerwarteter Weise, zeigten Stim2-/- Mäuse keine maßgeblichen Funktionsunterschiede in Plättchen, was eine essentielle Funktion von STIM2 in diesen Zellen ausschließt. Jedoch scheint STIM2 in die Entwicklung der Brustdrüsen während der Schwangerschaft involviert und essentiell für die Brustdrüsenfunktion während der Säugephase zu sein. Darüberhinaus zeigten STIM2 defiziente CD4+ T-Zellen einen verminderten SOCE. Weiter deuten unsere Daten auf eine spezifische Funktion von STIM2 im Immunsystem hin, mit einem Einfluss auf die frühen Phasen und das Fortschreiten der Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE). Stim2-/- Neuronen wiesen ebenso wie CD4+ T-Zellen einen gestörten SOCE auf. Desweiteren belegen unsere Ergebnisse, dass STIM2 überrascherweise an den Neuronen zerstörenden Mechanismen nach ischämischen Ereignissen des Gehirns mitwirkt. Dies ist die erste Studie, die von einer Beteiligung von SOCEan ischämischen neuronalen Schäden berichtet. Diese Entdeckungen können vielleicht als Basis für die Entwicklung neuer neuroprotektiver Medikamente bei ischämischen Schlaganfall dienen - und möglicherweise auch bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen Störungen der zellulären Ca2+ Homöostase als hauptsächliche pathophysologische Komponente angesehen werden. KW - Calcium-bindende Proteine KW - Intrazellulärraum KW - Thrombozyt KW - Knockout KW - STIM2 KW - SOC KW - SOCE KW - STIM2 KW - SOC KW - SOCE KW - Store-Operated KW - knockout Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47301 ER - TY - THES A1 - Jung, Susanne T1 - Myokardialer Ischämie- und Reperfusionsschaden bei 5-Lipoxygenase-Knockout-Mäusen T1 - Myocardial ischemia-reperfusion injury in 5-lipoxygenase-knockout-mice N2 - Leukotriene sind, neben anderen Arachidonsäuremetaboliten, wichtige Mediatoren in Entzündungsprozessen. Um ihre Rolle bei den pathophysiologischen Prozessen nach Ischämie und Reperfusion des Herzmuskels aufzuklären, wurden Wildtyp-Mäuse und 5-LOX-KO-Mäuse, die keine Leukotriene produzieren können, untersucht. Die linke vordere Herzkranzarterie wurde für 30min ligiert und 24h in vivo reperfundiert. Bei den KO-Mäusen fand sich zwar eine signifikant höhere Anzahl eingewanderter Neutrophiler im reperfundierten Gewebe, dagegen ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen Wildtyp- und KO-Mäusen bezüglich der resultierenden Infarktgröße und bezüglich der im Gewebe gemessenen Menge an TNF-a. Demnach lässt sich kein Einfluss der 5-Lipoxygenase-Ausschaltung auf den Entzündungsprozess nach Myokardischämie und die Entstehung eines Reperfusionsschadens feststellen. N2 - Leukotrienes are arachidonic acid derivatives that function as important mediators in inflammatory response reactions. To investigate their role in the pathophysiological processes after ischemia and reperfusion of the heart, wildtype mice and 5-LOX-KO-mice that cannot produce leukotrienes were compared using a mouse model of myocardial ischemia and reperfusion. The left anterior coronary artery was ligated for 30 minutes and then reperfused for 24 hours. This yielded no significant difference between wildtype and KO mice with regard to infarct size and amount of TNF-a measured in the heart tissue, even though there was a significantly larger number of infiltrating neutrophiles in the heart tissue of the KO mice. We conclude that there is no effect of the 5-lipoxygenase-knockout on the inflammatory response following myocardial ischemia or on the developing reperfusion injury. KW - Lipoxygenase <5-> KW - Knockout KW - Postischämiesyndrom KW - Myokardischämie KW - Mausmodell KW - Myocardial ischemia KW - lipoxygenase knockout Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35003 ER - TY - THES A1 - Klengel, Torsten T1 - Molekulare Charakterisierung der Carboanhydrase Nce103 im Kontext des CO2 induzierten Polymorphismus in Candida albicans T1 - Molecular characterisation of the carbonic anhydrase Nce103 in the context of carbon dioxide induced polymorphism in Candida albicans N2 - Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe. N2 - Detection of environmental signals and subsequently directed reaction is essential for the survival of all living organisms. Candida albicans, as the predominant human fungal pathogen is exposed to severely different physical and chemical conditions, which influence cell morphology as well as virulence in human. In the present work, the influence of carbon dioxide as ubiquitous gaseous molecule on virulence and cell morphology was analysed. Elevated concentrations of carbon dioxide are a robust signal to induce the morphological transition from yeast growth to an elongated hyphal growth form, which is believed to be one of the main virulence factors in Candida albicans. The role of the putative carbonic anhydrase Nce103p in carbon dioxide signalling is reviewed by generating knockout mutant strains, which exhibited a carbon dioxide dependent phenotype. Growth under aerobic conditions (0,033 % carbon dioxide) is inhibited but feasible in 5% carbon dioxide. Therefore, Nce103p is essential for growth in host niches with aerobic conditions. Analysis of the biochemical properties of Nce103p by stopped – flow kinetics revealed carbonic anhydrase activity. It is hypothesised, that Nce103p is essential for fixation of carbon dioxide and bicarbonate within the cell in order to sustain basic metabolic reactions. Furthermore, the induction of hyphal growth was independent of aquaporine-mediated transport of carbon dioxide. Bicarbonate rather carbon dioxide activates directly the adenylyl cyclase Cdc35p generating cyclic AMP as second messenger and influencing the transcription of hyphal specific genes in Candida albicans thus promoting the morphological transition from yeast growth to elongated hyphal growth. This signal transduction cascade is present in Candida albicans as well as Cryptococcus neoformans and it is believed to be a pan fungal signal transduction cascade. The specific inhibition of carbon dioxide mediated polymorphism may serve as a new target for antifungal therapeutic agents. KW - Candida KW - Candida albicans KW - Kohlendioxid KW - Kohlendioxidfixierung KW - Virulenz KW - Morphologie KW - Signaltransduktion KW - Cyclo-AMP KW - Soor KW - Carboanhydrase KW - Cryptococcus neoformans KW - Morphogenese KW - Hyphe KW - Hefeartige Pilze KW - Knockout KW - Aquaporin KW - Candida albicans KW - Morphology KW - carbon dioxide KW - carbonic anhydrase KW - aquaporine Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34573 ER - TY - THES A1 - Haneke, Torsten T1 - Die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen und der Einfluss des Immunsystems auf die Abwehr von Tumoren in Mismatch Reparatur-(MMR-) defizienten Mäusen T1 - The tumorigenesis in Mlh1 deficient mice and the influence of the immune system for the rejection of tumors in mismatch repair- (MMR-) deficient mice N2 - Das DNA-Mismatch-Reparatur-(MMR-) System ist das einzig bekannte postreplikativ arbeitende DNA-Reparatur-System. Es wurde gezeigt, dass die MMR-Aktivität für den Erhalt der genomischen Stabilität in Prokaryoten und Eukaryoten notwendig ist. Defekte in Genen des MMR-Systems (wie beispielsweise MLH1 oder MSH2) wurden als Ursache für die Entstehung des hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinoms (HNPCC) und anderen Tumorarten beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen (Mlh1-/-) untersucht und eine umfassende Charakterisierung der hier auftretenen Lymphome vorgenommen und die Bedeutung des Immunsystems für die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen durch Einkreuzen zusätzlicher Immundefizienzen erruiert. Die auf einen reinen genetischen Hintergrund zurückgekreuzten Mlh1-/--Mäuse zeigten eine in zwei Wellen ablaufende Tumorgenese: Eine frühe Phase, in der Mäuse lymphoide Tumoren entwickelten und eine spätere Phase, in der die Mlh1-/--Tiere vorwiegend an Gastrointestinaltumoren erkrankten. Wir konnten zeigen, dass die Mlh1 defizienten Mäuse ein breiteres Lymphomspektrum, als beispielsweise Msh2 defiziente Tiere aufweisen. Eine Vielzahl der untersuchten Lymphome Mlh1 defizienter Mäuse war mikrosatelliteninstabil (MSI). Die Tatsache, dass mikrosatellitenstabile (MSS) Lymphome in den Mlh1-/--Tieren vorkamen, impliziert aber auch, das MMR-Defizienz nicht zwingend durch Mikrosatelliteninstabilität gekennzeichnet sein muss. Es ist möglich, dass sich eine Mikrosatelliteninstabilität erst zu einem späteren Zeitpunkt der Tumorentwicklung in MMR-defizienten Zellen manifestiert. Darauf deuten auch die MSI-Analysen der in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen frühzeitiger als in Mlh1-/--Mäusen auftretenden Gastrointestinaltumoren hin. Einige dieser untersuchten Gastrointestinaltumoren in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen waren mikrosatellitenstabil, wohingegen sämtliche Gastrointestinaltumoren der Mlh1 defizienten Mauspopulation Mikrosatelliteninstabilität aufwiesen. In einigen der untersuchten Lymphome fehlte die MHC Klasse I-Molekülexpression, was auf deutet den Einfluss des Immunsystems auf die Erkennung und Eliminierung von (durch MMR-Defizienz entstandenen) Tumoren hindeutet. Um die Art der Immunantwort und die verantwortlichen Komponenten des Immunsystems für die Abwehr MMR-defizienter Tumoren einzugrenzen, wurden verschiedene immunkompromitierte oder immundefiziente Mauslinien in Mlh1 defiziente Mäuse eingekreuzt. Dieses waren Mauslinien mit beta2Mikroglobulin- (b2m-/--), Perforin- (pfp-/--), beta2Mikroglobulin/Perforin- (b2m-/-/pfp-/--) und Recombination activation gene- (Rag-/--) Defizienz. Häufig wurde in diesen Tieren eine Verschiebung im Tumorspektrum und ein beschleunigtes zeitliches Auftreten der Tumoren beobachtet. Anhand dieser Modelle konnten wir demonstrieren, dass insbesondere die Regulierung der MHC Klasse I-Molekülexpression ein bedeutsamer Schritt für die Ausprägung verschiedener Lymphomarten ist, welcher das „Überleben“ der Tumorzellen gewährleistet. Auch die Notwendigkeit einer balancierten Expression von NK-Zell-stimulatorischen und –inhibitorischen Liganden auf der Tumorzelloberfläche, welche die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen durch Nicht-MHC Klasse I-abhängige Immunzellen (wie z.B. den Natürliche Killerzellen) reguliert, liess sich mit Hilfe der beta2Mikroglobulin- und Perforin-Mausmodelle aufzeigen. Offensichtlich sind für die in Mlh1 defizienten Mäusen vorkommenden verschiedenen Tumorarten unterschiedliche zelluläre Komponenten und Abwehrmechanismen des Immunsystems für die Erkennung und Eliminierung verantwortlich. So beeinflussen insbesondere cytotoxische T-Zellen (CTLs) die Entstehung von Gastrointestinaltumoren in Mlh1 defizienten Mäusen. Für die lymphoiden Tumoren ergab sich ein divergentes Bild. Hier beschränkte sich der Einfluss der CTLs bei der Lymphomabwehr auf die Erkennung und Eliminierung disseminierter T- und B-Zell-Lymphome. Die in den Mlh1-/--Mäusen nachgewiesenen thymischen T-Zell Lymphome dagegen unterlagen der perforin-vermittelten Zellabwehr durch Nicht-MHC Klasse I-beschränkte Immunzellen (z.B. Natürlichen Killerzellen). Die Relevanz der vorliegenden Mausmodelle wird deutlich, wenn man sich die Situation von immunsupprimierten Posttransplantationspatienten und immundefizienten HIV-Patienten vor Augen führt. Häufig beobachtet man in diesen Patientengruppen das Auftreten lymphoider Tumoren. Diese sind oftmals Mikrosatelliteninstabil, was auf eine vorliegende MMR-Defizienz hindeutet. Zudem zeigen diese Lymphome ähnliche Merkmale, wie die durch Mlh1-Defizienz entstandenen lymphoiden Tumoren. Insbesondere für Studien solcher Lymphome stellt die Mlh1-defiziente Maus mit den verschiedenen eingekreuzten Immundefizienzen ein geeignetes in vivo Model dar. N2 - The DNA-Mismatch-(MMR-) Repair System is the only postreplicative working DNA repair system known so far. It was shown, that MMR activity is necessary for maintaining the genomic stability in prokaryotes and eukaryotes. Defects in MMR genes such as MLH1 or MSH2 were described in the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma (HNPCC) and other tumors. The aim of this thesis was the analysis of the tumorigenesis and a detailed characterization of the lymphoid tumors of Mlh1 deficient mice. Additionally, by crossing the Mlh1-/--mice with different immune compromised animals, the impact of the immune system on the tumorigenesis in Mlh1 deficient mice was studied. The tumorigenesis in the Mlh1-/--mice (crossed on a pure genetic background) occurred in two waves: one early phase with predominant development of lymphoid tumors and a later phase characterized by mainly gastrointestinal tumors. The majority of lymphomas were histologically defined as lymphomas of a lymphoblastic T- and B-cell type. The lymphoma types grouped by immunophenotyping were different, depending on their expression of surface molecules (MHC class I, Rae-1) and genes that are relevant for the development of lymphoid cells (like TdT, Rag, Pax5, E2a). Based on these findings, and subgrouping the lymphomas according to their location (thymus-located and disseminated lymphomas) we found a broad spectrum of lymphoid tumors. In comparison to Msh2 deficient mice which exclusively developed thymic T cell lymphomas (and gastrointestinal tumors) we observed an additional appearance of disseminated T cell and B cell lymphomas in the Mlh1 deficient mouse population. The analysis of microsatellite instability (MSI) as a hallmark of the human hereditary colorectal carcinoma (HNPCC) has been shown to represent an appropriate method for other tumor entities, as the majority of lymphomas in Mlh1 deficient mice were microsatellite instable. On the other hand, the finding of microsatellite stable (MSS) lymphomas implies that Mismatch Repair- (MMR-) deficiency is not necessarily characterized by microsatellite instability. One possible explanation might be that MSI in MMR deficient cells are manifested at a later timepoint of tumorigenesis. This notion is supported by the occurence of microsatellite stabile (MSS) gastrointestinal tumors found in Rag-/-/Mlh1-/--animals. All of the gastrointestinal tumors analyzed in Mlh1-/--mice were microsatellite instable (MSI) and arised later. Frequently, lymphomas in Mlh1-/--mice were lacking the expression of MHC class I molecules. This finding suggests a possible influence of immune recognition and elimination of the MMR deficient tumors by the immune system. To narrow down the kind of immune response and the responsible components of the immune system involved in the recognition of MMR deficient tumors, we crossed immunocompromised or immunodeficient mouse strains into Mlh1 deficient mice. This were the beta2microglobulin-(b2m-/--), perforin-(pfp-/--), beta2micro-globulin/perforin-(b2m-/-/pfp-/--), and recombination activation gene-(Rag-/--) deficient strains. The additional immunodeficiencies, frequently led to a shifted spectra and onset of the tumors in the Mlh1-/--mice. The crucial importance of MHC class I molecule expression for the development of different lymphoma entities was shown by using these additional models. A regulation of MHC class I molecules is important for the tumor cells survival. Consequently, crossing immunodeficiencies (b2m-/-- and/or pfp-/-) into the Mlh1-/--mice revealed the importance of a balanced expression of natural killer-(NK-) cell stimulatory and inhibitory ligands on the surface of tumor cells. Obviously the different tumor entities observed in Mlh1 deficient mice are controlled by different cellular components and mechanisms exerted through the immune system. The cytotoxic T cells (CTLs) had a strong impact on the gastrointestinal tumorigenesis in Mlh1 deficient mice. A divergent situation was observed in the group of lymphoid tumors: the recognition and elimination by CTLs seemed to be restricted to the subgroups of disseminated T and B cell lymphomas, whereas the thymic T-cell lymphomas were eliminated by the Non-MHC class I-restriced immune cells (e.g. NK cells) via the perforin-mediated (granzyme) pathway. The relevance of these mouse models becomes evident by a comparison of human lymphomas that are frequently found in immune-suppressed postransplantation patients and in HIV-patients. These lymphomas are mostly microsatellite instable, indicating an MMR deficiency. Thus, these tumors are displaying similar features compared to the lymphoid tumors of Mlh1-/--mice, with the additional immunodeficiencies crossed in as described here representing an appropriate in vivo model for further studies. KW - Lymphom KW - Gastrointestinaler Tumor KW - Immunsystem KW - Tumorimmunologie KW - Knockout KW - Mismatch Reparatur System KW - Lymphomagenese KW - Mikrosatelliten Instabilität KW - Immundefizienz KW - Mlh1 KW - mismatch repair system KW - lymphomagenesis KW - microsatellite instability KW - immune deficiency KW - Mlh1 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28737 ER - TY - THES A1 - Zürn, Christina Anika T1 - Charakterisierung des Mitochondrialen Tumorsuppressor-Gens 1 (MTUS1) anhand von In-vitro-Untersuchungen und Etablierung eines Knockout-Maus-Modells T1 - Characterisation of the Mitochondrial Tumor Suppressor Gene 1 (MTUS1) using in vitro investigations and generation of a knock out mouse N2 - Das kürzlich publizierte MTUS1-Gen zeigt Eigenschaften eines Tumorsuppressor-Gens. So liegt die MTUS1-Expression in verschiedenen Tumorzelllinien vermindert vor und bei rekombinanter Expression in der schnell wachsenden Pankreaskarzinomzelllinie MiaPaCa-2 konnte die Proliferation signifikant reduziert werden. Darüber hinaus interagiert MTUS1 mit dem AT2-Rezeptor und scheint durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs die Zellproliferation zu regulieren. Nach den Untersuchungen der MiaPaCa-2-Zelllinie konnte eine Mutation in der Exonsequenz und der vorhergesagten Promotorregion als Ursache der niedrigen MTUS1-Expression ausgeschlossen werden. Die Analyse des Promotorbereichs hinsichtlich des Methylierungsmusters der CpG- und CpNpG-Inseln brachte deutliche Methylierungsunterschiede in den CpNpG-Inseln der MiaPaCa-2-Zellen gegenüber HUVEC-Zellen zu Tage. Die anschließende Untersuchung der vorhergesagten Promotorregion mit Hilfe eines Promotor-Assays brachte die Gewissheit, dass es sich bei der untersuchten Sequenz um einen Transkription regulierenden Genabschnitt handelt. Durch die Transfektion von HUVEC-Zellen mit MTUS1-siRNA konnten nachweislich Zellen mit einem funktionellen MTUS1-Knockout hergestellt werden. Diese Zellen zeigten mit der verminderten MTUS1-Expression ein signifikant erhöhtes Wachstum. Die Ergebnisse der Zellversuche legen die Vermutung nahe, dass MTUS1 deshalb als Tumorsuppressor-Gen agieren kann, weil es die Zellproliferation reguliert und so der funktionelle MTUS1-Knockout mit einem erhöhten Zellwachstum einhergeht. Als Mechanismus der Geninaktivierung kommt die Hypomethylierung der vorhergesagten Promotorsequenz in Frage. Die Untersuchung der Colontumorgewebe und Normalgewebe von zehn Patienten mit Colonkarzinom zeigte eine deutliche Reduktion der MTUS1-Protein-Expression in 50% der Tumorgewebe. Bei diesen Patienten konnte ebenfalls eine signifikant reduzierte mRNA-Expression nachgewiesen werden. Wie bereits bei den MiaPaCa-2-Zellen nachgewiesen, zeigte sich eine Hypomethylierung der CpNpG-Inseln in den Geweben mit geringer MTUS1-Expression. Diese veränderte Methylierung könnte die Erklärung für die verminderte Transkription des MTUS1-Gens sein. Mit dem MTUS1-Knockout-Maus-Modell wurde die Grundlage für das bessere Verständnis der Funktion von MTUS1 in vivo geschaffen. Nach erfolgreicher Blastozysteninjektion und Zucht der homozygoten Knockout-Mäuse, konnte auf DNA-, mRNA- und Protein-Ebene die geglückte Ausschaltung des MTUS1-Gens bestätigt werden. Bei der Langzeituntersuchung der Tiere zeigten sich vor allem Abweichungen im Blutbild, wonach die homozygoten und heterozygoten Tiere auffallend hohe Werte an Leukozyten und Lymphozyten aufwiesen. Durch die pathologische Untersuchung konnte eine extramedulläre Hämatopoese und lymphatische Infiltrate in verschiedenen Organen nachgewiesen werden und gaben Hinweise auf eine Bluterkrankung. Nach diesen pathologischen Ergebnissen zeigten 23% der homozygoten und 17% der heterozygoten Tiere Symptome eines B-Zell-Lymphoms. Bei den Wildtyp-Tieren konnten keine pathologischen Auffälligkeiten gezeigt werden. Fast ein Viertel der homozygoten Mäuse wiesen eine Herzhypertrophie auf, oft einhergehend mit einer chronischen Glomerulonephritis und einer Atelektase der Lunge. Eine denkbare Erklärung für die blutdruckunabhängige Entstehung der Herzhypertrophie wäre eine Beeinflussung von Wachstumsfaktoren, da bereits nachgewiesen wurde, dass eine durch MTUS1 vermittelte Inhibierung von Insulin-, bFGF- und EGF-gesteuerten Signalkaskaden eine Inaktivierung von ERK2 zur Folge hatte. Mit Hilfe einer X-Gal-Färbung von verschiedenen Organen einer Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten Maus konnten Erkenntnisse über die Genaktivität von MTUS1 in den verschiedenen Organen gewonnen werden. Zusammenfassend lässt sich von einer hohen MTUS1-Expression in den meisten Epithelzellen und Endothelzellen sprechen, außerdem weisen die Kardiomyozyten im Herz und die Purkinjefasern im Gehirn eine hohe Expression auf. Bei der Untersuchung von homozygoten und Wildtyp-Bauchhautfibroblasten wurde schließlich eine geringere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten festgestellt. Mit der X-Gal-Färbung konnte nachgewiesen werden, dass das MTUS1-Protein vorwiegend in der Nähe des Zellkerns lokalisiert ist. Eine der untersuchten homozygoten Fibroblastenlinien zeigte gegenüber den anderen Fibroblasten eine deutlich erhöhte Proliferation. Das könnte ein Hinweis auf eine antiproliferative Wirkung von MTUS1 und eine Erklärung für die kleinere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten sein. Als Zusammenfassung aller hier gezeigten Ergebnisse konnte die Hypothese untermauert werden, dass es sich bei MTUS1 um ein Tumorsuppressor-Gen handelt, das seine antiproliferativen Eigenschaften wahrscheinlich in Kooperation mit dem AT2-Rezeptor durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs vermittelt. N2 - The recently published MTUS1 gene exhibits characteristics of a tumor suppressor gene. Thus the MTUS1 expression is decreased in different tumor cell lines and the recombinant expression of MTUS1 could reduce the proliferation in the fast growing pancreatic tumor cell line MiaPaCa-2. Beyond that, MTUS1 interacts with the AT2 receptor and seems to regulate the cell proliferation by the inhibition of the RTK signaling pathway. After the investigations of the MiaPaCa-2 cell line, a mutation in the exon sequence or the predicted promoter region could be excluded as a cause of the low MTUS1 expression. The analysis of the promoter range regarding the methylation pattern of the CpG and CpNpG islands did not reveal differences in the methylation of the CpG islands, but clear discrepancies in the CpNpG islands of the MiaPaCa-2 cells in contrast to the HUVEC cells. The subsequent investigation of the predicted promoter sequence with a promoter assay approved the hypothesis that the examined sequence has properties for the regulation of gene transcription. HUVEC cells with a functional MTUS1 knockout could be obtained by the transfection with MTUS1 siRNA. The experiment with these cells exhibited that cells without MTUS1 expression can proliferate significantly faster. The assumption that MTUS1 could act like a tumor suppressor gene by affecting the regulation of the cell proliferation is thereby confirmed. The investigation of the tumor tissue and normal tissue of ten patients with colorectal carcinoma revealed a clear reduction of the MTUS1 protein expression in 50% of the tumor tissues. In these tissues a significantly reduced MTUS1 mRNA expression could also be proven. The methylation pattern of the CpG islands showed no differences between tumor and normal tissue, but there was a hypomethylation of the CpNpG islands in the tissue with less MTUS1 Expression. This methylation pattern could be the explanation for the decreased transcription of the MTUS1 gene. With the MTUS1 knockout mouse model the basis for a better understanding of the MTUS1 function in vivo has been created. After successful injection of stem cells into blastocysts and breeding of the homozygote knockout mice, the elimination of the MTUS1 gene could be proven on DNA, mRNA and protein level. The long-term investigation showed discrepancies in the haemogram of the wildtype, heterozygote and homozygote mice. The homozygote and heterozygote animals had remarkably high values of leukocytes and lymphocytes, while the values of the erythrocytes and the thrombocytes decreased. The pathological investigation could detect extramedullary haematopoiesis in spleen, lymph node and kidneys of the heterozygote and homozygote mice, in addition lymphocytic infiltrates in spleen, kidneys, lung, liver, lymph node and salivary gland were discovered, probably referring to a blood illness. To these pathological results 23% of the homozygote and 17% of the heterozygote animals showed symptoms of a B-cell-lymphoma. The wildtype animals showed no abnormality regarding the extramedullary haematopoiesis or the lymphocytic infiltration in organs. Nearly a quarter of the homozygote mice exhibited a hypertrophy of the heart, often accompanied with a chronic glomerulonephritis and an atelectasis of the lung. The interaction with growth factors could be an explanation for the blood pressure independent hypertrophy because MTUS1 can inhibit the insulin, bFGF and EGF signaling cascades. With the help of the X-gal staining of different organs from wildtype, heterozygote and homozygote mice, informations about the MTUS1 activity could be gathered. In summary MTUS1 showed a high expression in epithelial and endothelial cells, in the cardiomyocytes in the heart and the pukinje cells in the brain. During the analysis of the homozygote and wildtype fibroblasts a smaller height of the homozygote fibroblasts was determined. With the X-gal staining it could be proven that the MTUS1 protein is located predominantly in the perinuclear region. One of the examined homozygote fibroblast lines showed a significant higher proliferation rate in comparison to the wildtype and two other homozygote fibroblast lines. This could be again a reference of the antiproliferative effect of MTUS1 and an explanation for the smaller cell height of the homozygote fibroblasts. The summary of all results supports the hypothesis that MTUS1 has characteristics of a tumor suppressor gene. For the antiproliferative effect MTUS1 seems to cooperate with the AT2 receptor to inhibit the RTK signaling pathway. KW - Tumorsuppressor-Gen KW - Mitochondrium KW - Knockout KW - MTUS1 KW - Tumorsuppressor-Gen KW - MTUS1 KW - tumor suppressor gene Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18951 ER - TY - THES A1 - Bundschu, Karin T1 - Generation and characterization of spred-2 knockout mice T1 - Generierung und Charakterisierung von Spred-2 Knockout Mäusen N2 - Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (β-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable. N2 - Spreds gehören zu einer neuen Sprouty-verwandten Familie Membran-assoziierter Proteine, welche den MAPK Signalweg hemmen, indem sie mit Ras und Raf-1 interagieren. In Zellkultur-Systemen haben mehrere Studien bereits die hemmende Funktion von Spred gezeigt, aber die in vivo Funktion im Gesamtorganismus blieb bisher noch ungeklärt. In dieser Arbeit wurden deshalb Spred-2 Knockout Mäuse mithilfe eines Gene-trap Ansatzes generiert. Die Spred-2 Eliminierung konnte auf RNA- und Protein-Ebene bestätigt werden, und der Verlust des funktionsfähigen Spred-2 Proteins führte zu einem Achondroplasie-ähnlichen Zwergenwuchs, der häufigsten Form des menschlichen Zwergenwuchses. Die Spred-2-/- Mäuse waren insgesamt kleiner und hatten ein vermindertes Körpergewicht. Im Vergleich zu Wildtyp Mäusen war die Tibia-Länge verkürzt und die Wachstumsfugen verschmälert. In Knorpelzellen wurde sowohl die Aktivität des Spred-2 Promoters, als auch eine Spred-2 Proteinexpression detektiert, was auf eine wichtige Funktion in Knorpelzellen und bei der Knochenentwicklung schließen lässt. Im Vergleich zu Spred-2+/+ Knorpelzellen zeigte die Stimulierung von Spred-2-/- Knorpelzellen mit verschiedenen FGF-Konzentrationen eine frühere und verstärkte ERK-Phosphorylierung. Diese Beobachtungen deuten auf einen Mechanismus hin, bei dem der Verlust von Spred-2 das Knochenwachstum hemmt, indem die Knorpel-Differenzierung durch eine Hochregulation des MAPK Signalweges gehemmt wird. Spred-2-/- Mäuse zeigten nach Verletzungen eine erhöhte Blutungsneigung, wobei das verlorene Blutvolumen extrem vergrößert und die Blutungszeit signifikant verlängert war. Bislang konnte Bluthochdruck als Ursache ausgeschlossen werden, aber die verschiedenen Stufen der Blutstillung und Gerinnungskaskade müssen noch weiter untersucht werden, um die physiologischen Ursachen dieses Phänotyps ausfindig machen zu können. Untersuchungen der Spred-2 Promotoraktivität zeigten eine starke und spezifische Expression von Spred-2 in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigten vorhergehende Studien eine Interaktion von Spreds mit RhoA, einem Hauptregulator der Kontraktion glatter Gefäßmuskelzellen. Diesen Beobachtungen zufolge scheint die Regulation der Kontraktilität glatter Gefäßmuskelzellen ein guter Kandidat für dieses Phänomen zu sein. Weiterhin wurden Spred-1 und Spred-2 spezifische Antikörper hergestellt, die als elementares Werkzeug zur Untersuchung der Proteinexpression in der Maus notwendig waren. Bisher gab es noch keine Informationen über die Region und Regulation des Spred-2 Promotors. In dieser Arbeit wurde eine detaillierte in situ Analyse des physiologischen Promotoraktivitätsprofils in der Spred-2 defizienten Mauslinie gezeigt, die mit Hilfe des Gene-trap Vektors generiert wurde. In diesen Mäusen wurde das beta-Galaktosidase/Neomycin-Resistenz Fusionsgen (β-geo) des Gene-trap Vektors unter die Kontrolle des endogenen Spred-2 Promotors gebracht, und lieferte damit die Möglichkeit, die Spred-2 Promotoraktivität in praktisch jedem Organ und den zugehörigen Teilstrukturen beobachten zu können. X-Gal Färbungen von Gewebeschnitten neugeborener und erwachsener Mäuse zeigten 1) eine sehr starke Spred-2 Promotoraktivität in Nervengeweben und verschiedenen Drüsen; 2) eine starke Aktivität in glatten Muskelzellen des Uterus und Verdauungstraktes, sowie der Nieren; 3) eine geringe Aktivität in Herz, Hoden, Lunge und Leber; 4) eine fast fehlende Aktivität in Skelettmuskeln und Milz; und 5) interessanterweise eine starke und eindeutige Aktivität in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigte der Vergleich zwischen Organen von neugeborenen und erwachsenen Mäusen ein fast identisches Aktivitätsmuster. Diese detaillierten Daten liefern hilfreiche Informationen für weitere Untersuchungen der physiologischen Funktionen von Spred-2 vor allem in Organen mit starker Spred-2 Promotoraktivität, die in den meisten dieser Organe bisher noch immer ungeklärt sind. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch Gene-targeting Vektoren für Spred-1 und Spred-2 kloniert, die zur Generierung von embryonalen Stammzellen mit gefloxtem Exon 2 des Spred-1 bzw. Spred-2 Gens genutzt wurden. Diese embryonalen Stammzellen stehen nun als wertvolle Grundlage zur Etablierung von konditionalen Knockout Mäusen zur Verfügung. Dies ist von großem Interesse, um die physiologischen gewebespezifischen Funktionen von Spred-1 und Spred-2 zu untersuchen, vor allem wenn die Doppel-Knockout Mäuse nicht lebensfähig sein sollten. KW - Spred Protein KW - Knockout KW - Maus KW - Spred KW - Knockout Mäuse KW - Zwergenwuchs KW - EVH-1 KW - MAP Kinase KW - Spred KW - knockout mice KW - dwarfism KW - EVH-1 KW - MAP kinase Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14333 ER - TY - THES A1 - Danzer, Claus-Peter T1 - Generierung von chimären Mäusen mit Mutationen in der Signalleitungs-Domäne von CD22 und Untersuchungen zur Funktion von CD22 in Knockout-Mäusen T1 - Generation of Chimaeric mice with mutations in the signaling domain of CD22 and analysis of the function of CD22 in knockout mice N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialinsäure-bindende Immunglobulin-ähnliche Lectine). Mit der äußersten der 7 extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialinsäure interagieren. In der cytoplasmatischen Domäne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungeklärt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerstörte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Domäne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren für CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. Für beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingeführten Mutationen vollständig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chimäre Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank ermöglichte die Verlängerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch öffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Veränderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerstörten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalität des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig für die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialinsäure auf der selben Zelloberfläche (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellulären Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialinsäure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-Mäusen, aber nur ca. 4,5% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- Mäusen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialinsäure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zurückzuführen. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In Übereinstimmung damit führte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abhängiger Demaskierung. 4. FACS-Färbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- Mäusen um ca. 70-80% gegenüber wt-Mäusen verkleinert ist. In Bestätigung früherer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabhängige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- Mäusen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant stärker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- Mäusen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zurückzuführen ist. N2 - Aim of this thesis was to investigate aspects of the function of CD22, a B-cell specific member of the Siglec-family (sialic acid binding immunoglobulin–like lectins). CD22 can specifically bind a2,6-sialic acid with the outermost of its 7 extracellular Ig-domains. There are 6 conserved tyrosine residues in the cytoplasmic domain, 3 of which lie within ITIMs (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs). Following BCR engagement, CD22 becomes tyrosine-phosphorylated. Consecutively, the cytosolic tyrosin-phosphatase SHP-1 binds to the phosphorylated ITIMs, becomes activated and inhibits the BCR-signal. There are also some positive modulators of the BCR-signal which bind to CD22 (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2). The role of these molecules in the context of CD22 remains to be elucidated. 1. One main goal of this work was the generation of two new knockin mouse lines. In the first line (CD22-ITIM-KO), the ITIMs of CD22 were to be destroyed. A second line in which CD22 lacks its cytoplasmic tail was to be generated (CD22-Tailless). Both models were supposed to serve the in vivo investigation of the role of the positive modulators of the BCR-signal and the interrelation of CD22 signaling and ligand binding. Cloning of the targeting vectors pCD22-ITIM-KO and pCD22-tailless was completed. Using control vectors, which were also cloned, screening-PCRs for the identification of homologous recombined ES-cell clones were established. C57BL/6 ES-cells were transfected with the targeting constructs, and homologous recombinants were identified with PCR and Southern blot. The introduced mutations were confirmed by sequencing. Following cre/lox-mediated deletion of the selection cassette, fully characterised CD22-ITIM-KO clones were injected into BALB/c-blastocysts. Five chimaeras were obtained, none of which transmitted the mutations through the germline. No homologous recombinants were obtained upon injection of the C57BL/6 targeting constructs into other, non-isogenic ES-cell lines. Finding of the genomic sequence of murine CD22 in a database made it possible to extend pCD22-ITIM-KO by 4 kb with DNA from a 129/ola mouse strain. The new construct was used to transfect 129/ola ES-cells, which are generally known to be kariotypically more stable than C57BL/6 ES-cells. No homologous recombinants were obtained. The now known sequence of the CD22 gene will make it possible to reconstruct pCD22-ITIM-KO based on 129-DNA or to modify and improve the already existing C57BL/6-constructs. 2. To investigate the consequences of the destroyed ITIMs on tyrosine-phosphorylation and SHP-1 association of CD22 in vitro, a CD22-ITIM-KO expression-vector was constructed and sialyl-transferase/CD22-ITIM-KO double-transfectants of the murine plasmocytoma-line J558L were generated. CD22 tyrosine-phosphorylation after BCR-stimulation was completely abolished in CD22-ITIM-KO transfectants. Accordingly, SHP-1 couldnt associate with CD22-ITIM-KO. The results prove the funcionality of the CD22-ITIM-KO construct with respect to ITIM-phosphorylation and binding of SHP-1. Furthermore the results show that the ITIM-tyrosines are also important for the phosphorylation of the non-ITIM-tyrosines. 3. Interaction of CD22 with its ligand a2,6-sialic acid on the surface of the same cell (in cis) plays an important role in cell-cell-interaction and intracellular signal transduction. In this work B-cells on which the ligand binding site of CD22 is not occupied by endogenous a2,6-sialic acid (demasked CD22) were identified by FACS for the first time. 10,5% of all B220+ spleen cells from wild type mice, in contrast to only 4,5% B220+ spleen cells from CD22-/- mice were able to bind exogenous a2,6-sialic acid. This effect is mainly due to the presence or absence of CD22, respectively. Detailed FACS-analyses revealed that cells with demasked CD22 are enriched in the fraction of the transitional B-cells type 2 (T2 cells) and show signs of activation. Accordingly, in vitro activation of B-cells with LPS or IL4 resulted in CD22-dependent demasking. 4. FACS-analyses showed that the marginal zone (MZ) B-cell compartment in CD22-/- mice is strongly reduced (by about 70-80%). Earlier results showing that the immune response against i.p.-injected TI2-antigens is about 2-fold reduced in CD22-/- mice could be confirmed. However, the response was significantly more impaired (3-4-fold) when the same dose of antigen was applied i.v., a situation where preferentially the MZ B-cells of the spleen come in contact with antigen carried along with the blood flow. The known deficiency in TI2-responses in CD22-/- mice is likely due to non-sufficient MZ B-cell numbers in these animals. KW - B-Lymphozyt KW - Signaltransduktion KW - Knockout KW - Antigen CD22 KW - B-Zellen KW - Signaltransduktion KW - Knockout Mäuse KW - CD22 KW - B-Cells KW - Signaltransduction KW - Knockout Mice KW - CD22 Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4966 ER -