TY - JOUR A1 - Ibrahim, Eslam S. A1 - Ohlsen, Knut T1 - The old yellow enzyme OfrA fosters Staphylococcus aureus survival via affecting thiol-dependent redox homeostasis JF - Frontiers in Microbiology N2 - Old yellow enzymes (OYEs) are widely found in the bacterial, fungal, and plant kingdoms but absent in humans and have been used as biocatalysts for decades. However, OYEs’ physiological function in bacterial stress response and infection situations remained enigmatic. As a pathogen, the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus adapts to numerous stress conditions during pathogenesis. Here, we show that in S. aureus genome, two paralogous genes (ofrA and ofrB) encode for two OYEs. We conducted a bioinformatic analysis and found that ofrA is conserved among all publicly available representative staphylococcal genomes and some Firmicutes. Expression of ofrA is induced by electrophilic, oxidative, and hypochlorite stress in S. aureus. Furthermore, ofrA contributes to S. aureus survival against reactive electrophilic, oxygen, and chlorine species (RES, ROS, and RCS) via thiol-dependent redox homeostasis. At the host–pathogen interface, S. aureusΔofrA has defective survival in macrophages and whole human blood and decreased staphyloxanthin production. Overall, our results shed the light onto a novel stress response strategy in the important human pathogen S. aureus. KW - MRSA KW - blood KW - phagocytes KW - quinone KW - ROS KW - stress response KW - electrophilic stress Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-274381 SN - 1664-302X VL - 13 ER - TY - THES A1 - Drayß, Maria T1 - Asymptomatisches Trägertum von Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae bei Senioren T1 - Asymptomatic carriage of Staphylococcus aureus and Haemophilus influenzae in elderly people N2 - Ältere Menschen sind gegenüber invasiven Infektionen und Sepsis besonders vulnerabel mit ungünstiger Prognose. Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae können beide invasive Infektionen verursachen. Oft geht eine asymptomatische Besiedelung einer Infektion voraus und ist ein Risikofaktor für eine invasive Infektion. Daher wurde eine bizentrische Querschnittstudie in den Regionen Aachen und Würzburg durchgeführt, um die Prävalenz von H. influenzae, S. aureus und MRSA (Methicillin resistenter S. aureus) bei asymptomatischen Senioren zu bestimmen, wie auch Risikofaktoren für eine Besiedelung. Von Oktober 2012 bis Mai 2013 wurden 677 Erwachsenen im Alter von 65 Jahren oder älter eingeschlossen, die zu Hause oder in Seniorenheimen lebten. Die Prävalenz von H. influenzae bei älteren Menschen war mit einer Trägerrate von nur 1,9% ([95% CI: 1,0 - 3,3%]; 13/677) sehr niedrig. Trägerisolate waren überwiegend nicht typisierbare H. influenzae, zeigten eine hohe clonale Diversität und waren alle Ampicillin-sensibel. Die Prävalenz von S. aureus war mit 28,5% ([95% CI: 25,1 - 32,1%]; 193/677) hoch, wie für die deutsche Allgemeinbevölkerung bekannt, während MRSA bei weniger als 1% der Teilnehmer gefunden wurde (0,7% [95% CI: 0,2 - 1,7%]; 5/677). Die Prävalenz von H. influenzae, S. aureus und MRSA unterschied sich nicht signifikant zwischen selbständig zu Hause lebenden Senioren und Pflegeheimbewohnern. Ältere, selbständig lebende Menschen mit höherem Bildungsniveau hatten signifikant höhere Kolonisierungsraten mit S. aureus (adjusted OR: 1,905 [95% CI: 1,248 - 2,908]; p = 0,003). Bei Pflegeheimbewohnern war eine Kolonisierung signifikant mit Verheiratet sein assoziiert (adjusted OR: 3,367 [95% CI: 1,502 - 7,546]; p = 0,003). Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von sozio-demographischen Faktoren für eine Kolonisierung mit S. aureus und schließen eine Lücke bei epidemiologischen Daten zu H. influenzae. N2 - Elderly people are especially vulnerable to invasive infections and sepsis with often poor outcome. Staphyloccus aureus and Haemophilus influenzae both can cause invasive infections. Asymptomatic colonization often precedes infection and poses a risk for invasive infection. Therefore, a bi-centric cross-sectional carrier study was conducted in the regions of Aachen and Wuerzburg, Germany, to determine the prevalence of H. influenzae, S. aureus and MRSA (methicillin resistant S. aureus) in asymptomatic elderly people and to identify risk factors for colonization. From October 2012 to May 2013 677 adults aged 65 years and older were included, living at home or in nursing homes. In contrast to children and younger adults the prevalence of H. influenzae was very low among elderly people with a carriage rate of only 1.9% ([95% CI: 1.0 - 3.3%]; 13/677). Carrier isolates were predominantly non typeable H. influenzae, showed a high clonal diversity and were all susceptible to ampicillin. The prevalence of S. aureus was expectedly high as known for the German general population (28.5% [95% CI: 25.1 - 32.1%]; 193/677), while MRSA was found in less than 1% of the individuals (0.7% [95% CI: 0.2 - 1.7%]; 5/677). The prevalence of H. influenzae, S. aureus und MRSA did not differ significantly between community dwellers and nursing home residents. Elderly community-dwellers with higher education level had significantly higher colonization rates with S. aureus (adjusted OR: 1.905 [95% CI: 1.248 - 2.908]; p = 0.003). Among nursing home residents, colonization was significantly associated with being married (adjusted OR: 3.367 [1.502 - 7.546]; p = 0.003). These results underline the importance of socio-demographic factors for colonization with S. aureus and close a gap in epidemiological data on H. influenzae. KW - Staphylococcus aureus KW - Haemophilus influenzae KW - MRSA KW - Senioren KW - Besiedelung KW - Multilocus-Sequenz-Typisierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272276 ER - TY - THES A1 - Eibicht, Sebastian Johannes T1 - Die Kontamination von Flächen mit MRSA in Krankentransport- und Rettungswagen bei Kurzzeittransporten von MRSA-Patienten T1 - Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) contamination of ambulance cars after short term transport of MRSA-colonised patients N2 - Die Innenausbauflächen von Krankentransport- bzw. Rettungswagen unterliegen dem Risiko einer Verunreinigung durch Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA). In der vorliegenden Arbeit wurden Krankentransport- bzw. Rettungswagen unmittelbar nach dem Transport von MRSA-kolonisierten oder -infizierten Patienten auf MRSA untersucht. Zu diesem Zweck wurden an 2 Stellen der Trage und an 3 Stellen der Innenausbauflächen Proben entnommen. 89 von 100 untersuchten Transporten, welche das Einschlusskriterium einer Transportzeit von weniger als 20 Minuten erfüllten, wurden weitergehend analysiert. 8 der untersuchten Kranken- bzw. Rettungswagen (7,1%) wiesen eine Kontamination auf (90% Konfidenzintervall: 4-14 %), wobei die Transportzeit keinen Einfluss auf die Kontamination hatte. MRSA wurde nur an der Trage nachgewiesen und zwar ausschließlich am Kopfteil der Trage und an den Tragegriffen. Die beprobten Stellen der Innenausbauflächen waren nicht kontaminiert. Bei Kurzzeittransporten von MRSA-positiven Patienten sollte daher der Fokus der Desinfektion auf die Oberflächen in unmittelbarer Patientennähe gelegt werden. Eine weitere Untersuchung von 60 Transporten MRSA-negativer Patienten blieb ohne MRSA-Befund. In 12 dieser Krankentransportwagen wurde jedoch Methicillin-sensibler S. aureus nachgewiesen, der sich ebenfalls vorwiegend an Kopfteil und Handgriffen der Trage fand. Auch dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung der Desinfektion patientennaher Flächen unabhängig vom MRSA-Status der transportierten Patienten. N2 - Patients carrying MRSA provide a risk of surface contamination with MRSA in ambulance cars. This study analysed whether surfaces of ambulance cars, in which MRSA-colonised or -infected patients were transported, were contaminated with MRSA and where the contamination occurred. 89 transportation events lasting less than 20 minutes were included in the analysis. 8 ambulance cars (7,1%) were found to be contaminated with MRSA following transport (90% confidence interval: 4-14%). The transport time was not relevant for the contamination rate. MRSA was exclusively found on the stretcher, i.e. the headrest and the handles. This finding sug¬gests that disinfection measures after transport should be focused on the patients' contact surfaces. Consecutive investigation included 60 transport events in the absence of MRSA-notification and demonstrated that MSSA, but not MRSA, could be detected in 12 cars, again mostly at handles and headrests. This study shows the importance of disinfection of surfaces in the vicinity of patients transported in an ambulance irrespective of the patients' MRSA-status KW - MRSA KW - Methicillin-resistenter S. aureus KW - Krankentransportwagen KW - ambulance car KW - MRSA-Kontamination von Oberflächen KW - Cabin surfaces contaminated with MRSA KW - MRSA-kolonisierten Patienten KW - MRSA-colonised patients KW - Kurzzeittransporten KW - Shorttime transport KW - Rettungsdienst KW - rescue service Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207130 ER - TY - JOUR A1 - Stock, Nina Katharina A1 - Petráš, Petr A1 - Melter, Oto A1 - Kapounová, Gabriela A1 - Vopalková, Petra A1 - Kubele, Jan A1 - Vaniš, Václav A1 - Tkadlec, Jan A1 - Bukáčková, Eva A1 - Machová, Ivana A1 - Jindrák, Vlastimil T1 - Importance of Multifaceted Approaches in Infection Control: A Practical Experience from an Outbreak Investigation JF - PLoS ONE N2 - Background This study presents the results of a multidisciplinary, nosocomial MRSA outbreak investigation in an 8-bed medical intensive care unit (ICU). The identification of seven MRSA positive patients in the beginning of 2014 led to the closure of the ward for several weeks. A multidisciplinary, retrospective investigation was initiated in order to identify the reason and the source for the outbreak, describe MRSA transmission in the department and identify limitations in infection control. Methods The investigation comprised an epidemiological description of MRSA cases from 2012 to 2014 and a characterization of MRSA isolates, including phage-, spa- and PFGE-typing. Additionally, MRSA screening was performed from the hospital staff and the environment. To identify the reason for the outbreak, work-related, psychological and behavioral factors were investigated by impartial audits and staff interviews. Results Thirty-one MRSA cases were registered during the study period, and 36 isolates were investigated. Molecular typing determined the outbreak strain (phage type 54/812, PFGE type A4, spa type t003) and identified the probable index case. Nasal carriage in one employee and a high environmental contamination with the outbreak strain was documented. Important gaps in nursing procedures and general management were identified. Elevated stress levels and communication problems preceded the outbreak. Compliance with hand hygiene and isolation procedures was evaluated as appropriate. Conclusion This study demonstrates the complexity of controlling hospital-associated infections. The combined use of different typing methods is beneficial for outbreak investigations. Psychological, behavioral and other work-related factors have an important impact on the spread of nosocomial pathogens. These factors should be addressed and integrated in routine infection control practice. KW - multifaceted approaches KW - infection control KW - Methicillin resistant Staphylococcus aureus KW - MRSA Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166891 VL - 11 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Wermser, Charlotte T1 - Morphology, regulation and interstrain interactions in a new macrocolony biofilm model of the human pathogen \(Staphylococcus\) \(aureus\) T1 - Morphologie, Regulation und stammübergreifende Wechselwirkungen in einem neuen Makrokolonie-Biofilmmodell des Humanpathogens \(Staphylococcus\) \(aureus\) N2 - The role of multicellularity as the predominant microbial lifestyle has been affirmed by studies on the genetic regulation of biofilms and the conditions driving their formation. Biofilms are of prime importance for the pathology of chronic infections of the opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus. The recent development of a macrocolony biofilm model in S. aureus opened new opportunities to study evolution and physiological specialization in biofilm communities in this organism. In the macrocolony biofilm model, bacteria form complex aggregates with a sophisticated spatial organization on the micro- and macroscale. The central positive and negative regulators of this organization in S. aureus are the alternative sigma factor σB and the quorum sensing system Agr, respectively. Nevertheless, nothing is known on additional factors controlling the macrocolony morphogenesis. In this work, the genome of S. aureus was screened for novel factors that are required for the development of the macrocolony architecture. A central role for basic metabolic pathways was demonstrated in this context as the macrocolony architecture was strongly altered by the disruption of nucleotide and carbohydrate synthesis. Environmental signals further modulate macrocolony morphogenesis as illustrated by the role of an oxygen-sensitive gene regulator, which is required for the formation of complex surface structures. A further application of the macrocolony biofilm model was demonstrated in the study of interstrain interactions. The integrity of macrocolony communities was macroscopically visibly disturbed by competitive interactions between clinical isolates of S. aureus. The results of this work contribute to the characterization of the macrocolony biofilm model and improve our understanding of developmental processes relevant in staphylococcal infections. The identification of anti-biofilm effects exercised through competitive interactions could lead to the design of novel antimicrobial strategies targeting multicellular bacterial communities. N2 - Die Rolle von Multizellularität als der vorherrschende mikrobielle Lebensstil wurde durch Studien über die genetische Steuerung von Biofilmen und über Biofilmbildung-fördernde Bedingungen bestätigt. Biofilme sind wichtige Faktoren in der Pathogenese chronischer Infektionen durch das opportunistische Humanpathogen Staphylococcus aureus. Die kürzlich erfolgte Entwicklung eines Makrokolonie-Biofilmmodells für S. aureus eröffnet neue Möglichkeiten evolutionäre Entwicklungen und die physiologische Spezialisierung in bakteriellen Gemeinschaften zu untersuchen. Im Makrokolonie-Biofilmmodell bilden Bakterien komplexe Aggregate, die sich durch eine hochentwickelte räumliche Organisation auf mikroskopischer und makroskopischer Ebene auszeichnen. Die positiven und negativen Hauptregulatoren dieser Organisation sind der alternative Sigmafaktor σB sowie das Quorum sensing System Agr. Dennoch sind weitere Faktoren, die die Morphogenese der Makrokolonien steuern, unbekannt. In dieser Arbeit wurde das Genom von S. aureus im Hinblick auf neue Faktoren, die für die Entwicklung der Makrokoloniearchitektur nötig sind, analysiert. Dabei wurde belegt, dass zentrale Stoffwechselwege eine zentrale Rolle spielen. Störungen der Nukleotid- und Kohlenhydrat-Synthese hatten starke Auswirkungen auf die Makrokoloniearchitektur. Weiterhin wurde anhand eines Sauerstoff-sensitiven Genregulators, der für die Ausbildung von Oberflächenstrukturen nötig ist, demonstriert, wie die Morphogenese der Makrokolonien durch Umweltsignale moduliert wird. Das Makrokolonie-Biofilmmodell fand weitere Anwendung in der Untersuchung von stammübergreifenden Interaktionen. Die Integrität der Makrokolonie-Biofilme wurde durch die Wechselwirkungen in Konkurrenz stehender klinischer Isolate stark herabgesetzt. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zur Charakterisierung des Makrokolonie-Biofilmmodells bei und geben Einsicht in Entwicklungsprozesse, die während Staphylokokken-Infektionen ablaufen. Die Beschreibung der negativen Beeinflussung der Biofilme durch bakterielle Wechselwirkungen könnte zur Entwicklung neuer antimikrobieller Strategien, die gezielt gegen multizelluläre bakterielle Gemeinschaften wirksam sind, beitragen. KW - Staphylococcus aureus KW - Biofilm KW - MRSA KW - macrocolony KW - interactions KW - biofilm architecture KW - Makrokolonie KW - Wechselwirkungen KW - Biofilmarchitektur Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165931 ER - TY - JOUR A1 - Moremi, Nyambura A1 - Claus, Heike A1 - Mshana, Stephen E. T1 - Antimicrobial resistance pattern: a report of microbiological cultures at a tertiary hospital in Tanzania JF - BMC Infectious Diseases N2 - Background Antimicrobial resistance has been declared by the World Health Organization as a threat to the public health. The aim of this study was to analyze antimicrobial resistance patterns of the common pathogens occurring at the Bugando Medical Centre (BMC), Mwanza, Tanzania to provide data for antimicrobial stewardship programmes. Methods A total of 3330 microbiological culture results scripts representing non-repetitive specimens reported between June 2013 and May 2015 were retrieved and analyzed for pathogens and their susceptibility patterns using STATA-11 software. Results Out of 3330 specimens, 439 (13.2%) had positive culture. Staphylococcus aureus (n = 100; 22.8%), Klebsiella pneumoniae (n = 65; 14.8%) and Escherichia coli (n = 41; 9.3%) were the most frequently isolated bacteria. Of 78 Staphylococcus aureus tested, 27 (34.6%) were found to be methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Rates of resistance of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli isolates to third generation cephalosporins were 38.5% (25/65) and 29.3% (12/41) respectively. Staphylococcus aureus and Klesbiella pneumoniae were commonly isolated from bloodstream infections while Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa were the predominant isolates from urinary tract and wounds infections respectively. Of 23 Salmonella species isolated, 22 (95%) were recovered from the blood. Nine of the 23 Salmonella species isolates (39%) were found to be resistant to third generation cephalosporins. The resistance rate of gram-negative bacteria to third generation cephalosporins increased from 26.5% in 2014 to 57.9% in 2015 (p = 0.004) while the rate of MRSA decreased from 41.2% in 2013 to 9.5% in 2015 (p = 0.016). Multidrug-resistant gram-negative isolates were commonly isolated from Intensive Care Units and it was noted that, the majority of invasive infections were due to gram-negative bacteria. Conclusion There is an increase in proportion of gram-negative isolates resistant to third generation cephalosporins. The diversity of potential pathogens resistant to commonly prescribed antibiotics underscores the importance of sustained and standardized antimicrobial resistance surveillance and antibiotic stewardship programmes in developing countries. KW - Tanzania KW - antimicrobial resistance KW - cephalosporin-resistant gram-negative bacteria KW - MRSA Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161185 VL - 16 IS - 756 ER - TY - JOUR A1 - Moremi, Nyambura A1 - Mshana, Stephen E. A1 - Kamugisha, Erasmus A1 - Kataraihya, Johannes B. A1 - Tappe, Dennis A1 - Vogel, Ulrich A1 - Lyamuya, Eligius F. A1 - Claus, Heike T1 - Predominance of methicillin resistant Staphylococcus aureus-ST88 and new ST1797 causing wound infection and abscesses JF - Journal of Infection in Developing Countries N2 - Introduction: Although there has been a worldwide emergence and spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), little is known about the molecular epidemiology of MRSA in Tanzania. Methodology: In this study, we characterized MRSA strains isolated from clinical specimens at the Bugando Medical Centre, Tanzania, between January and December 2008. Of 160 S. aureus isolates from 600 clinical specimens, 24 (15%) were found to be MRSA. Besides molecular screening for the Panton Valentine leukocidin (PVL) genes by PCR, MRSA strains were further characterized by Multi-Locus Sequence Typing (MLST) and spa typing. Results: Despite considerable genetic diversity, the spa types t690 (29.1%) and t7231 (41.6%), as well as the sequence types (ST) 88 (54.2%) and 1797 (29.1%), were dominant among clinical isolates. The PVL genes were detected in 4 isolates; of these, 3 were found in ST 88 and one in ST1820. Resistance to erythromycin, clindamicin, gentamicin, tetracycline and co-trimoxazole was found in 45.8%, 62.5%, 41.6%, 45.8% and 50% of the strains, respectively. Conclusion: We present the first thorough typing of MRSA at a Tanzanian hospital. Despite considerable genetic diversity, ST88 was dominant among clinical isolates at the Bugando Medical Centre. Active and standardized surveillance of nosocomial MRSA infection should be conducted in the future to analyse the infection and transmission rates and implement effective control measures. KW - Tanzania KW - panton-valentine leukocidin KW - field gel-electrophoreresis KW - molecular epidemiology KW - aureus infections KW - MRSA KW - ST88 KW - ST1797 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134746 VL - 6 IS - 8 ER - TY - THES A1 - Kutscher, Marika T1 - Novel Approaches to Antimicrobial Therapy of Pneumonia using Antibiotics and Therapeutic Antibodies T1 - Neue Ansätze zur antimikrobiellen Behandlung von Pneumonien mittels Antibiotika und therapeutischen Antikörpern N2 - Nosocomial pneumonia is mostly caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). However, the standard antibiotic therapy is affected by increasing emergence of bacterial resistance. Therefore, novel therapeutic options are in high demand. New antimicrobial agents alone cannot handle the problem of increasing bacterial resistance but innovative drug delivery strategies and fast identification of infection causing pathogens are required to diminish bacterial resistance development. A very promising approach to improve the therapy of pneumonia is presented by local drug delivery to the lung. This application method enables high local drug concentrations in the lung leading to shorter application of antibiotics and hence reduces the risk of resistance development. Furthermore, the systemic concentration is lowered reducing the emergence of adverse effects. Therefore, in this thesis several approaches to improve the therapy of MRSA pneumonia are studied. One approach to achieve an efficient local delivery of antibiotics are nano-sized drug delivery systems which enable the nebulization of poorly-soluble antibiotics and can lead to even higher local drug concentrations due to their small size since nanoparticles improve mucus penetration and decrease phagocytosis by alveolar macrophages. Here, an analytical setup was developed that facilitates the identification of optimal preparation conditions for drug polyelectrolyte nanoplexes. Another promising approach to support antimicrobial therapy of pneumonia is presented by antibody-based immunotherapy. Since the stability of the antibody and hence its therapeutic activity are endangered during production, transport, storage, and application, a stabilizing formulation was developed for hUK-66, an antibody targeting surface antigens of S. aureus. Furthermore, nebulization of this formulated monoclonal antibody was studied to enable local application. Finally, the immunotherapeutic efficacy of the nebulized hUK-66 formulation was investigated in an animal in vivo study. Furthermore, rapid identification of the infection triggering pathogen is very important. The selective detection of S. aureus was achieved using optical planar Bragg grating sensors functionalized with hUK-66. In addition, the reusability of this system was studied applying a surface functionalization based on the cross-linker SPDP which enables a reversible fixation of the antibody. N2 - Die Behandlung von Infektionen, die durch Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Bakterien hervorgerufen wurden, stellt weltweit noch immer eine schwierige Herausforderung dar. Besonders durch MRSA ausgelöste nosokomiale Pneumonien stehen in direktem Zusammenhang mit erhöhter Morbidität und Mortalität sowie einer Verlängerung des Krankenhausaufenthaltes und der Beatmungsdauer. In Kapitel I dieser Dissertation werden die aktuellen Behandlungsempfehlungen für MRSA-Pneumonien und deren Nachteile diskutiert. Dabei wird in diesem Review aufgezeigt, dass aufgrund der drohenden Gefahr von schweren Nebenwirkungen und des Problems der steigenden Antibiotikakonzentrationen, die zur Bekämpfung von multiresistenten Krankheitserregern nötig sind, die alleinige systemische Anwendung von Antibiotika für eine Therapie der MRSA-Pneumonie mitunter nicht mehr ausreicht. Angesichts des vermehrten Auftretens von Resistenzen gegen die gängigen Antibiotika ist der Bedarf an neuen antimikrobiellen Mitteln sowie innovativen Strategien zur Wirkstoffapplikation hoch. Da die Entwicklung neuer Antibiotika in den letzten Jahrzehnten deutlich nachlässt, stellen Antikörper-basierte immuntherapeutische Ansätze eine vielversprechende Alternative dar. Darüber hinaus soll eine lokale Wirkstoffverabreichung in die Lunge die Pneumonie-Behandlung infolge erhöhter Wirkstoffkonzentration am Ort der Infektion und gleichzeitiger geringer systemischer Wirkstoffbelastung begünstigen, was das Risiko einer Resistenzentwicklung verringern kann. Verneblung ist hierbei ein direkter und einfacher Weg, Wirkstoffe bei intubierten Patienten an ihren Wirkort zu bringen und ist für die pulmonale Verabreichung von Antibiotika sowie Antikörpern gut erforscht. Zwar wurden weitere Fortschritte in der Weiterentwicklung der Gerätetechnologie und Wirkstoff-verabreichung für die Verneblung von Antibiotika und Antikörpern gemacht, diese wurden aber bisher kaum in der Behandlung von MRSA-Pneumonien umgesetzt. Deshalb konzentriert sich das erste Kapitel auf eine Übersicht über die Fortschritte in der lokalen Wirkstoffapplikation, welche potentiell auf die Behandlung von MRSA-Pneumonie mittels Antikörpern und Antibiotika übertragbar wären. Kapitel II beschäftigt sich mit „Drug Delivery“-Systemen für Antibiotika in Nanometergröße, welche eine Umgehung des Löslichkeitsproblems von schwer wasserlöslichen Wirkstoffen ermöglichen. Außerdem kann eine durch Nanopartikel verbesserte Mucuspenetration die Wirkstoffkonzentrationen am Wirkort erhöhen, was als Möglichkeit angesehen wird, das Auftreten von Antibiotikaresistenz zu vermindern. Nanopartikel-Komplexe (Nanoplexe), welche durch Selbst-Zusammenlagerung eines Wirkstoffs und eines entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyts hergestellt werden, erlauben eine noch höhere Wirkstoffbeladung als herkömmliche Nanopartikel. In diesem Kapitel wurde unter Verwendung von Ciprofloxacin (CIP) und Dextransulfat (DS) als Modellkomponenten ein analytisches Setup evaluiert, das geeignet sein soll, optimale Herstellungsbedingungen für die Bildung von Nanoplexen zu identifizieren. Hierbei wurde die Eignung von Isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) zusammen mit anderen analytischen Methoden als Selektions-Hilfsmittel für eine rationale Formulierungsoptimierung bewertet, indem der Einfluss von unterschiedlichen Salzen und verschiedenen ionischen Stärken auf die CIP/DS-Nanoplexbildung untersucht wurde. Die Anwesenheit von Salz führte hierbei zu kleineren und zahlreicheren Partikeln mit größerer Einheitlichkeit, hatte aber keinen Einfluss auf die Freisetzung von CIP aus den Nanoplexen. Bedeutsam ist auch, dass die Bindungsaffinität mit Partikelform und Morphologie korrelierte, was möglicherweise eine Optimierung entscheidender Qualitätseigenschaften basierend auf ITC-Daten ermöglicht. Insgesamt erwies sich ITC zusammen mit den ergänzenden Methoden als nützliches Instrument für die Evaluierung von Bedingungen für Mischungsverhältnis, Art des Salzes und ionische Stärke für die Bildung von Nanoplexen. In Kapitel III wird der Rahmen der Behandlungsmöglichkeiten für MRSA-Infektionen auf Antikörper-basierte Immuntherapien erweitert. Einen vielversprechenden Ansatz, die Abtötung der Bakterien zu fördern, stellt der zielgerichtete Angriff auf Komponenten der Bakterienoberfläche mit immunogenen Eigenschaften durch den humanisierten monoklonalen Antikörper hUK-66 dar. Allerdings werden therapeutische Proteine während ihrer Herstellung und bis zum Ende ihrer Aufbrauchsfrist mit einer Vielzahl von externen Einflüssen konfrontiert, die ihre Konformation und somit Stabilität beeinträchtigen können. Um eine wirksame Wirkstoffverabreichung zu ermöglichen und ungewollte Reaktionen des Immunsystems aufgrund Aggregation des Proteinmoleküls zu vermeiden, erstrebt dieses Kapitel die Identifizierung einer Formulierung für hUK-66, welche dessen physikalische und chemische Proteinstabilität bewahrt. Mit Hilfe von Ergebnissen der Charakterisierung des Antikörpers wurde ein optimaler pH-Wert für die Formulierung in einer Stabilitätsstudie mit kurzer Laufzeit evaluiert. In direktem Anschluss wurden verschiedene Kombinationen von Hilfsstoffen und Darreichungsformen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Antikörperstabilität zu bewahren, analysiert, indem unterschiedliche flüssige und gefriergetrocknete Formulierungen in einer Langzeitstabilitätsstudie bei verschiedenen Lagerungstemperaturen untersucht wurden. Eine Lyophilisierung von hUK-66 in Histidinpuffer, pH 6, zusammen mit den Stabilisatoren Saccharose und Polysorbat 20 konnte die Stabilität dieses Antikörpers während des gesamten Formulierungsprozesses und einer Langzeit-Einlagerung bei 2-8°C nachweislich bewahren. Um therapeutische Proteine über die Lunge zu applizieren, ist es nötig, ein inhalierbares Aerosol zu erzeugen. Da sich jedoch während des Verneblungsprozesses die Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche erheblich vergrößert, werden die Biomoleküle einem Grenzflächen-stress ausgesetzt. Deshalb werden in Kapitel IV die zuvor entwickelten hUK 66-Formulierungen hinsichtlich ihrer Eignung untersucht, den Antikörper während der Verneblung durch einen Düsenvernebler zu stabilisieren. Da zum Vernebeln eine sehr große Probenmenge benötigt wird, wurde zuerst ein In-vitro-Ersatzverfahren entwickelt, welches den Verneblungsstress simuliert, um den Wirkstoffverbrauch zu reduzieren. Die hUK-66-Formulierung mit Saccharose und Polysorbat 20 bewies, dass sie die Stabilität dieses Proteins sowohl im Vorversuch als auch bei der eigentlichen Verneblung bewahren konnte. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass eine Verneblung keinen nachteiligen Effekt auf die chemische Stabilität des Antikörpers ausgeübt hat. Zuletzt konnte die immuntherapeutische Wirksamkeit der vernebelten hUK-66-Formulierung bewiesen werden, da die Überlebensrate von Mäusen, die intranasal mit S. aureus infiziert worden waren, durch Inhalation der Antikörper-formulierung verlängert werden konnte. Für diese In-vivo-Studie wurde ein spezieller Aufbau erfolgreich entwickelt, der die Applikation des Aerosols an wache und normal atmende Mäuse ermöglicht. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Aufbaus war, dass die Mäuse dem Aerosol nur mit der Nase ausgesetzt waren, was die Nachteile einer Ganzkörperverneblung, wie Absorption über die Haut und Bedarf an großen Mengen an Aerosol, verringerte. Insgesamt gefährdeten die vielfache Verneblung und Rezirkulation der Proteinlösung innerhalb des Reservoirs die Konformation des formulierten Antikörpers unwesentlich. Somit konnte in dieser Arbeit die Stabilität von hUK-66 in einer optimierten Formulierung während einer Verneblung bewiesen sowie sein immuntherapeutisches Potential für eine effektive Behandlung von S. aureus Infektionen bei pulmonaler Verabreichung gezeigt werden. Ein weiterer wichtiger Punkt für eine effektive und schnelle Behandlung von Pneumonien ist die umgehende Detektion und Identifikation derjenigen Krankheitserreger, welche die Infektion auslösen. Eine anschließende geeignete Wahl der Medikation ist entscheidend, um eine systemische Verbreitung und Fortdauer der Infektion genauso wie das Auftreten von Antibiotikaresistenzen zu vermeiden. Deshalb sind effiziente Detektionsmethoden für Pathogene im Bereich der klinischen Diagnostik sehr gefragt. In Kapitel V wurden Biosensoren als vielversprechende Alternative zur Verbesserung der Pathogendetektion untersucht, da sie eine sensitive, spezifische und schnelle Analyse diverser Proben erlauben. Durch Immobilisierung von hUK-66-Antikörpern auf der Oberfläche eines optischen planaren Bragg-Gitter-Sensors konnte eine selektive Detektion von S. aureus erreicht werden. Um weiterhin die Wiederverwendbarkeit der Sensoren zu verbessern sowie Installationszeit, Kosten und Vorbereitungsaufwand zu reduzieren, wurde eine Sensoroberflächen-funktionalisierung dahingehend evaluiert, ob sie eine wiederholte Verwendung des Sensors für die Antikörper-basierte Detektion von lebenden Bakterien ermöglicht. Die Anbindung von hUK-66, einem Fänger-Antikörper spezifisch für S. aureus, auf der Sensoroberfläche mit Hilfe eines spaltbaren Linkers sowie die anschließende spezifische Bindung von S. aureus konnten in Echtzeit nachverfolgt werden, was die Anwendbarkeit von optischen Sensoren für eine spezifische und schnelle Detektion von großen biologischen Strukturen hervorhebt. Die Wiederverwendbarkeit der mit Bakterien gesättigten Sensoren konnte erfolgreich durch eine Abspaltung des Antikörpers zusammen mit den angebundenen Bakterien mittels Reduktion der Disulfidbindungen und anschließender Refunktionalisierung mit aktiviertem Antikörper gezeigt werden und führte zu einer vergleichbaren Sensitivität gegenüber S. aureus. KW - Lungenentzündung KW - Monoklonaler Antikörper KW - MRSA KW - protein nebulization Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138475 SN - 978-3-8439-2784-0 PB - Verlag Dr. Hut CY - München ET - 1. Aufl. ER - TY - THES A1 - Blättner, Sebastian T1 - The role of the non-ribosomal peptide synthetase AusAB and its product phevalin in intracellular virulence of Staphylococcus aureus T1 - Die Rolle der nicht-ribosomalen Peptidsynthetase AusAB und ihres Produktes Phevalin in der intrazellulären Virulenz von Staphylococcus aureus N2 - Staphylococcus aureus is a prevalent commensal bacterium which represents one of the leading causes in health care-associated bacterial infections worldwide and can cause a variety of different diseases ranging from simple abscesses to severe and life threatening infections including pneumonia, osteomyelitis and sepsis. In recent times multi-resistant strains have emerged, causing severe problems in nosocomial as well as community-acquired (CA) infection settings, especially in the United States (USA). Therefore S. aureus has been termed as a superbug by the WHO, underlining the severe health risk originating from it. Today, infections in the USA are dominated by S. aureus genotypes which are classified as USA300 and USA400, respectively. Strains of genotype USA300 are responsible for about 70% of the CA infections. The molecular mechanisms which render S. aureus such an effective pathogen are still not understood in its entirety. For decades S. aureus was thought to be a strictly extracellular pathogen relying on pore-forming toxins like α-hemolysin to damage human cells and tissue. Only recently it has been shown that S. aureus can enter non-professional phagocytes, using adhesins like the fibronectin-binding proteins which mediate an endocytotic uptake into the host cells. The bacteria are consequently localized to endosomes, where the degradation of enclosed bacterial cells through phagosome maturation would eventually occur. S. aureus can avoid degradation, and translocate to the cellular cytoplasm, where it can replicate. The ability to cause this so-called phagosomal escape has mainly been attributed to a family of amphiphilic peptides called phenol soluble modulins (PSMs), but as studies have shown, they are not sufficient. In this work I used a transposon mutant library in combination with automated fluorescence microscopy to screen for genes involved in the phagosomal escape process and intracellular survival of S. aureus. I thereby identified a number of genes, including a non-ribosomal peptide synthetase (NRPS). The NRPS, encoded by the genes ausA and ausB, produces two types of small peptides, phevalin and tyrvalin. Mutations in the ausAB genes lead to a drastic decrease in phagosomal escape rates in epithelial cells, which were readily restored by genetic complementation in trans as well as by supplementation of synthetic phevalin. In leukocytes, phevalin interferes with calcium fluxes and activation of neutrophils and promotes cytotoxicity of intracellular bacteria in both, macrophages and neutrophils. Further ausAB is involved in survival and virulence of the bacterium during mouse lung pneumoniae. The here presented data demonstrates the contribution of the bacterial cyclic dipeptide phevalin to S. aureus virulence and suggests, that phevalin directly acts on a host cell target to promote cytotoxicity of intracellular bacteria. N2 - Staphylococcus aureus ist ein weit verbreitetes kommensales Bakterium, welches zugleich einer der häufigsten Verursacher von Krankenhausinfektionen ist, und eine Reihe verschiedener Krankheiten, angefangen bei simplen Abszessen, bis hin zu schweren Erkrankungen wie Lungenentzündung, Osteomylitis und Sepsis verursachen kann. Das Risiko durch nosokomiale sowie epidemische S. aureus Infektionen ist in den vergangenen Jahren weiter gestiegen. Dazu beigetragen hat das Auftreten multiresistenter und hoch cytotoxischer Stämme, vor allem in den USA. Als Konsequenz hat die WHO S. aureus inzwischen als „Superbug“ tituliert und als globales Gesundheitsrisiko eingestuft. Bei CA-Infektionen dominieren die Isolate der Klassifizierung USA300 und USA400, wobei den Erstgenannten bis zu 70% aller in den USA registrierten CA-MRSA Infektionen der letzten Jahre zugesprochen werden. Lange Zeit wurde angenommen, dass S. aureus strikt extrazellulär im Infektionsbereich vorliegt und die cytotoxische Wirkung von z.B. α-Toxin für Wirtszelltod und Gewebeschädigungen verantwortlich ist. Erst vor kurzem wurde festgestellt, dass S. aureus auch durch fakultativ phagozytotische Zellen, wie Epithel- oder Endothelzellen, mittels zahlreicher Adhäsine aufgenommen wird. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt zunächst in ein Phagoendosom, in dem die Pathogene durch antimikrobielle Mechanismen abgebaut würden. Um dies zu verhindern, verfügt S. aureus über Virulenzfaktoren, welche die endosomale Membran schädigen. Die Bakterien gelangen so in das Zellzytoplasma, wo sie sich vervielfältigen können, bevor die Wirtszelle schließlich getötet wird. Eine wichtige Funktion in diesem Vorgang konnte bereits in mehreren Studien den Phenol löslichen Modulinen (PSM) zugesprochen werden, Arbeiten unserer Gruppe deuten jedoch darauf hin, dass diese nicht alleine für den phagosomalen Ausbruch von S. aureus verantwortlich sind. In dieser Arbeit verwendete ich eine Transposon Mutantenbibliothek des S. aureus Stammes JE2 (USA300) in Verbindung mit automatisierter Fluoreszenzmikroskopie, um Gene zu identifizieren, die den phagosomalen Ausbruch von S. aureus beeinflussen. Unter den Mutanten, welche eine Minderung der Ausbruchsraten zeigten, fanden sich auch Mutanten in beiden Genen eines Operons, welches für die nicht-ribosomale Peptidsynthetase AusA/B codiert, die die beiden Dipeptide Phevalin und Tyrvalin produziert. Verminderte Ausbruchsraten konnten sowohl durch genetische Komplementation als auch mittels des Zusatzes synthetischen Phevalins wiederhergestellt werden. In Leukozyten verhindert Phevalin effizienten Calcium-Flux und die Aktivierung von Neutrophilen. Zudem fördert Phevalin die Cytotoxizität intrazellulärer Bakterien sowohl in Makrophagen, als auch Neutrophilen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NRPS AusAB und ihre Produkte eine Rolle beim Überleben der Bakterien während einer Infektion im Tiermodell einnehmen. Die hier präsentierten Daten hinsichtlich des Einflusses von Phevalin auf Virulenz und der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen lassen den Schluss zu, dass Phevalin direkt auf einen Wirtszellfaktor wirkt, um die Cytotoxicität intrazellulärer Bakterien zu stärken. KW - Staphylococcus aureus KW - MRSA KW - Virulenz KW - Intracellular virulence KW - Non-ribosomal peptide synthetase KW - USA300 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146662 ER - TY - THES A1 - Grosz, Magdalena Urszula T1 - Identification of phagosomal escape relevant factors in Staphylococcus aureus infection T1 - Untersuchung von ausbruchsrelevanten Faktoren bei einer Staphylococcus aureus Infektion N2 - Staphylococcus aureus is a facultative Gram-positive human pathogen which can cause different severe infections. Staphylococci are phagocytosed by professional and non-professional phagocytes; they are strongly cytotoxic against eukaryotic cells and have been proposed to play a role in immune evasion by spreading within migrating phagocytes. This study investigated the post invasive events upon S. aureus infection. Strains which are able to escape the phagosome were identified and the responsible toxins were determined. Thereby innovative insights into host pathogen interaction were obtained. A novel class of small amphipathic peptides with strong surfactant-like properties, the phenol soluble modulins, particularly PSMα as well as the leukocidin LukAB, are involved in phagosomal escape of the clinical S. aureus strains LAC, MW2 and 6850 in non-professional and professional phagocytes. Whereas, PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin or phosphatidyl inositol-dependent phospholipase C did not affect phagosomal escape. By blocking the bacterial DNA-dependent RNA polymerase with rifampicin phagosomal escape is determined to start approximately 2.5 hours post infection. Phagosomal escape further was required for intracellular replication of S. aureus. Strains which are not able to escape cannot replicate in the acidic vacuole, whereas, the host cytoplasm offers a rich milieu for bacterial replication. Additionally, phagosomal escape, with intracellular bacterial replication induces the subsequent host cell death. This could be confirmed by an infection assay including S. aureus knockout mutants in psmα or lukAB which were significantly less cytotoxic, compared with those infected with escape-positive wild type strains. Further, this study showed that phagosomal escape is not only mediated by bacterial toxins. Since, the phagocyte-specific cognate receptors for both escape relevant toxins, FPR2 (PSMα receptor) and CD11b (LukAB receptor) are produced in epithelial and endothelial cells only after infection with S. aureus in a calcium dependent fashion. The knockdown of both receptors using siRNA prevents S. aureus to escape the phagosome. Furthermore, blocking intracellular calcium release with the inositol trisphosphate receptor (IP3R) inhibitor 2-APB prohibits upregulation of fpr2 and cd11b and subsequently phagosomal escape of S. aureus. To conclude, the current study clarifies that phagosomal escape and host cell death are interplay of both, bacterial toxins and host cell factors. Staphylococcus aureus ist ein fakultativ Gram-positives Humanpathogen, dass verschiedene schwerwiegende Infektionen verursachen kann. Staphylokokken werden von professionellen und nicht-professionellen Phagozyten (Fresszellen) zu gleich aufgenommen. Desweitern sind sie stark zytotoxisch für eukaryotische Zellen. Außerdem wird vermutet, dass sie sich mittels migrierender Phagozyten dem angeborenen Immunsystem entziehen können. In dieser Studie werden die post-invasiven Ereignisse während einer Staphylokokken Infektion untersucht. Im Detail wurden Stämme identifiziert die aus den Phagosomen entkommen können und die dafür verantwortlichen Toxine. Im Zuge dessen wurden neue Erkenntnisse der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtszellen gewonnen. Eine neue Klasse von kleinen amphiphatischen Peptiden mit starken grenzflächenaktiven Eigenschaften (Surfactant), die sogenannten Phenol soluble modulins (PSMs) im Besonderen PSMα sowie das Leukozidin LukAB, sind am phagosomalen Ausbruch der klinisch relevanten S. aureus Stämmen LAC, MW2 und 6850 in nicht professionellen und professionellen Phagozyten involviert. Hingegen, sind PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin oder Phosphatidylinositol abhängige Phospholipase C nicht am phagosomalen Ausbruch beteiligt. Durch die Hemmung der bakteriellen DNA-abhängigen RNA Polymerase mit Rifampicin wurde der Zeitpunkt für den Ausbruch auf etwa 2,5 Stunden nach der Infektion eingegrenzt. Der phagosomale Ausbruch ist weiterhin für die intrazelluläre Replikation von S. aureus notwendig. Während Stämme, die nicht ausbrechen können in der angesäuerten Vakuole nicht replizieren können, bietet das Zytoplasma ein reichhaltiges Milieu für die Vermehrung. Zudem wird der Pathogen induzierte Zelltod erst nach dem phagosomalen Ausbruch und mit anschließender Vermehrung ermöglicht. Nachgewiesen wurde dies mittels psmα und lukAB defizienten Mutanten welche signifikant weniger zytotoxisch waren als der Wildtyp Stamm. Diese Studie zeigt darüber hinaus, dass der phagosomale Ausbruch nicht nur durch bakterielle Toxine vermittelt wird. Sondern, dass die Phagozyten-spezifischen Rezeptoren für beide relevanten Toxine, FPR2 (PSMα Rezeptor) und CD11b (LukAB Rezeptor), in Epithel- und Endothelzellen nach Infektion mit S. aureus calciumabhängig produziert werden und für den Ausbruch notwendig sind. Der knockdown beider Rezeptoren mittels siRNA verhindert den Ausbruch. Wird der intrazelluläre Calciumstrom mittels des Inositoltrisphosphat Rezeptor (IP3R) Inhibitor 2-APB blockiert können die Gene fpr2 und cd11b nicht hochreguliert werden und der Ausbruch wird ebenfalls verhindert. Folglich zeigt diese Studie, dass der phagosomale Ausbruch und Pathogen induzierte Zelltod sowohl durch bakterielle Toxine als auch Wirtsfaktoren vermittelt wird. N2 - Staphylococcus aureus ist ein fakultativ Gram-positives Humanpathogen, dass verschiedene schwerwiegende Infektionen verursachen kann. Staphylokokken werden von professionellen und nicht-professionellen Phagozyten (Fresszellen) zu gleich aufgenommen. Desweitern sind sie stark zytotoxisch für eukaryotische Zellen. Außerdem wird vermutet, dass sie sich mittels migrierender Phagozyten dem angeborenen Immunsystem entziehen können. In dieser Studie werden die post-invasiven Ereignisse während einer Staphylokokken Infektion untersucht. Im Detail wurden Stämme identifiziert die aus den Phagosomen entkommen können und die dafür verantwortlichen Toxine. Im Zuge dessen wurden neue Erkenntnisse der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtszellen gewonnen. Eine neue Klasse von kleinen amphiphatischen Peptiden mit starken grenzflächenaktiven Eigenschaften (Surfactant), die sogenannten Phenol soluble modulins (PSMs) im Besonderen PSMα sowie das Leukozidin LukAB, sind am phagosomalen Ausbruch der klinisch relevanten S. aureus Stämmen LAC, MW2 und 6850 in nicht professionellen und professionellen Phagozyten involviert. Hingegen, sind PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin oder Phosphatidylinositol abhängige Phospholipase C nicht am phagosomalen Ausbruch beteiligt. Durch die Hemmung der bakteriellen DNA-abhängigen RNA Polymerase mit Rifampicin wurde der Zeitpunkt für den Ausbruch auf etwa 2,5 Stunden nach der Infektion eingegrenzt. Der phagosomale Ausbruch ist weiterhin für die intrazelluläre Replikation von S. aureus notwendig. Während Stämme, die nicht ausbrechen können in der angesäuerten Vakuole nicht replizieren können, bietet das Zytoplasma ein reichhaltiges Milieu für die Vermehrung. Zudem wird der Pathogen induzierte Zelltod erst nach dem phagosomalen Ausbruch und mit anschließender Vermehrung ermöglicht. Nachgewiesen wurde dies mittels psmα und lukAB defizienten Mutanten welche signifikant weniger zytotoxisch waren als der Wildtyp Stamm. Diese Studie zeigt darüber hinaus, dass der phagosomale Ausbruch nicht nur durch bakterielle Toxine vermittelt wird. Sondern, dass die Phagozyten-spezifischen Rezeptoren für beide relevanten Toxine, FPR2 (PSMα Rezeptor) und CD11b (LukAB Rezeptor), in Epithel- und Endothelzellen nach Infektion mit S. aureus calciumabhängig produziert werden und für den Ausbruch notwendig sind. Der knockdown beider Rezeptoren mittels siRNA verhindert den Ausbruch. Wird der intrazelluläre Calciumstrom mittels des Inositoltrisphosphat Rezeptor (IP3R) Inhibitor 2-APB blockiert können die Gene fpr2 und cd11b nicht hochreguliert werden und der Ausbruch wird ebenfalls verhindert. Folglich zeigt diese Studie, dass der phagosomale Ausbruch und Pathogen induzierte Zelltod sowohl durch bakterielle Toxine als auch Wirtsfaktoren vermittelt wird. KW - Phagosom KW - MRSA KW - Bakterielle Infektion KW - Zelltod KW - Phagosomal escape KW - Intracellular replication Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121981 ER - TY - THES A1 - Weiß, Matthias T1 - Die Bedeutung nosokomialer Infektionen bei der Therapie von chirurgischen und anästhesiologischen Intensivpatienten T1 - The significance of hospital acquired infections in the therapy of surgical and medical ICU-patients N2 - Beobachtung nosokomialer Infektionen bei intensivhospitalisierten Patienten im Rahmen einer einjährigen prospektiven, multizentrischen Kohortenstudie. Besondere Beachtung von Komplikationen wie Sepsis und Peritonitis sowie des Auftretens multiresistenter Keime bei der Infektentstehung. N2 - Surveillance of nosocomial ICU-acquired infections in intensive care unit patients in a 1-year prospective multicenter cohort study. Monitoring of complications like sepsis and peritonitis and acquisition of multi-resistant infectious agents. KW - Sepsis KW - MRSA KW - Bauchfellentzündung KW - Hygiene KW - Allgemeine Entzündungsreaktion KW - Lungenentzündung KW - Sekundärkrankheit KW - Multimorbidität KW - Antibiose KW - Peritonitis KW - nosokomial KW - SIRS KW - Intensivstation KW - Komorbidität KW - ICU KW - HAI KW - mortality KW - SIRS KW - comorbidities Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80565 ER - TY - THES A1 - Menzel, Thomas Michael T1 - Studien zum Wirkungsmechanismus neuer antiinfektiver Bisnaphthalimide gegen Staphylococcus aureus und Transkriptomanalysen zur Auswirkung von Antibiotika auf S. epidermidis T1 - Mode-of-action studies of novel antiinfective bisnaphthalimides on Staphylococcus aureus and transcriptional analysis of the effect of antibiotics on S. epidermidis N2 - Die Therapie von bakteriellen Infektionen beruht heutzutage zum Großteil auf dem Einsatz von Antibiotika. Die schnelle Entwicklung und rasche Verbreitung von resistenten Stämmen mancher Erreger gegen diese Antibiotika stellt ein enormes Problem für das Gesundheitswesen dar. Da momentan zur Antibiotikatherapie keine Alternativen bestehen, kommt der Erforschung neuer potenzieller Wirkstoffe eine sehr große Bedeutung zu. In einem Screening-Verfahren lagen die minimalen Hemmkonzentrationen einiger bisquartärer Bisnaphthalimide gegen Staphylococcus aureus und S. epidermidis im Bereich von 0,6 bis 2,5 µg/ml. Die Substanz mit den geringsten minimalen Hemmkonzentrationen war MT02. Daraufhin wurde das Wirkungsspektrum von MT02 gegen Bakterien detaillierter untersucht und gefunden, dass die Substanz vorwiegend gegen Gram-positive Erreger und nicht gegen Gram-negative Bakterien wirksam ist. Zytotoxizitätstests ergaben eine geringe bis nicht nachweisbare Toxizität gegen verschiedene Zelllinien im Bereich von 73 bis mehr als 150 µg/ml. Um die Wirkungsweise von MT02 genauer zu untersuchen wurden zunächst DNA-Microarray-Untersuchungen an S. aureus durchgeführt. Deren Ergebnisse ließen einen Einfluss der Substanz auf viele Gene des DNA-Metabolismus erkennen. Inkorporationsstudien mittels radioaktiver Ganzzellmarkierung bestätigten die Auswirkung von MT02 auf den DNA-Stoffwechsel. Durch kompetitive Inkubation wurde festgestellt, dass MT02 in der Lage ist Ethidiumbromid von DNA zu verdrängen bzw. dessen Bindung zu verhindern. Genauere Untersuchungen mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz ergaben, dass MT02 konzentrationsabhängig, reversibel und sequenzunspezifisch an DNA bindet. Die thermodynamischen Dissoziationskonstanten lagen im Mittel bei ca. 4 x 10-8 mol/l und beschrieben somit eine relativ starke Bindung von MT02 an DNA. Neben diesem primären Wirkungsmechanismus der DNA-Bindung gaben mehrere Befunde Hinweise auf einen sekundären Wirkmechanismus, der die Zellwand-Struktur bzw. Zellwand-Biosynthese beinhaltet. Eine MT02-resistente Mutante von S. aureus HG001 konnte durch vielfaches Passagieren in MT02-haltigem Medium generiert werden. Diese erzeugte bei Wachstum mit hohen Konzentrationen an MT02 einen roten Phänotyp. Die Natur dieses roten Farbstoffes konnte bislang nicht aufgeklärt werden, jedoch gibt es Hinweise, dass dieser auf Abbauprodukte von MT02 zurückzuführen ist. In einem weiteren Projekt wurde mittels Transkriptionsstudien die Auswirkung von verschiedenen bekannten Antibiotika sowie von neuen Wirkstoffen auf das Transkriptom von S. epidermidis untersucht. Die Ergebnisse dieser Studien können durch vergleichende Analysen als Grundlage für die Einordnung des Wirkmechanismus neuer Substanzen dienen. N2 - The treatment of bacterial infections is nowadays mostly accomplished by the application of antibiotics. However, the rapid development and vast distribution of resistant strains of some pathogens against a variety of antibiotics form an enormous challenge for public health care systems worldwide. As until now there are no applicable alternatives to antibiotic therapy against most pathogens, there is an urgent need for the discovery of new antibacterial substances. Screening several newly synthesized compounds, the minimal inhibitory concentrations of some bisquaternary bisnaphthalimides ranged from 0.6 to 2.5 µg/ml against Staphylococcus aureus and S. epidermidis. Thereof one substance, designated MT02, revealed the lowest minimal inhibitory concentrations of this compound class. Following these susceptibility tests, the antibacterial spectrum of MT02 was determined and revealed a broad spectrum against Gram-positive bacteria but almost no activity against Gram-negative species. In cytotoxicity tests with several cell lines MT02 exhibited low or undetectable toxicity in concentrations ranging from 73 to more than 150 µg/ml. Microarray studies were conducted to further elucidate the mode of action of MT02 against S. aureus. The results suggested that MT02 has an impact on the bacterial DNA-metabolism. To verify this, radioactive whole cell labeling experiments were performed which clearly provided evidence for the inhibition of incorporation of [3H]-thymidine into bacteria by MT02 and thus for an interference of MT02 with DNA-metabolism. Coincubation and gel retardation studies showed that MT02 is able to directly interact with DNA and to displace ethidiumbromide which has intercalated into the DNA before. Surface plasmon resonance experiments pinpointed the binding of MT02 to doublestranded DNA and revealed binding constants in the range of 4 x 10-8 mol/l describing a strong binding affinity of MT02 to DNA. In addition to this primary mode of action, several results suggested a secondary mode of action comprising the structure and / or the biosynthesis of the bacterial cell wall. By passaging S. aureus HG001 in broth with increasing concentrations of MT02, a MT02-resistant mutant could be obtained. This mutant produced a red phenotype when grown with high concentrations of MT02. Studies to determine the nature of this red dye are still in progress. However, first results indicate that the red color is a degradation product of MT02. Another project dealt with the comparative analysis of transcriptomes of S. epidermidis under the influence of antibiotics with known modes of action as well as new active compounds. The results of these studies can be the basis for the assignment of new antibacterial substances to classes of antibiotics with known modes of action. KW - MRSA KW - Naphthalinderivate KW - Quartäre Bisnaphthalimide KW - MT02 KW - Antibiotikum KW - MRSA KW - Antibiotic KW - Quaternary Bisnaphthalimide KW - MT02 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56362 ER - TY - THES A1 - Raspe, Matthias Eduard T1 - Zelluläre Invasivität und molekulare Marker von kolonisierenden und Infektions-assoziierten Methicillin resistenten Staphylococcus aureus-Isolaten T1 - Cellular invasiveness and molecular markers of colonizing and infection-associated Methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates N2 - Hintergrund: Zunehmend wird der Eigenschaft von Staphylococcus aureus als fakultativ intrazellulärem Erreger Bedeutung zugemessen. Ein direkter Nachweis der in vivo Relevanz von fakultativ intrazellulärem S. aureus bleibt allerdings bisher aus. Der Mechanismus zellulärer Invasivität ist bekannt und korreliert mit verschiedenen molekularen Markern (spa-Typ, SCCmec-Typ und pls/Pls). In dieser Studie wurde die Zuverlässigkeit und Ausweitbarkeit dieser Marker getestet. Des Weiteren wurde überprüft, ob sich die zelluläre Invasivität von kolonisierenden und Infektions-assoziierten MRSA-Isolaten unterscheidet und, ob die alleinige Bestimmung molekularer Marker in vitro die Virulenz eines Isolats in vivo abzuschätzen vermag. Methoden:Insgesamt wurden 109 MRSA-Isolate gesammelt, molekular charakterisiert (spa-Typ, BURP-Analyse, SCCmec-Typ, pls, agr-Typ, Hämolyseverhalten) und das Potential zellulärer Invasivität in vitro ermittelt. Die Assoziation eines Isolates mit einer Infektion in vivo wurde nachverfolgt (93 Kolonisierer versus 16 Infektions-assoziierte-Isolate). Zusätzlich wurde eine Referenzgruppe aus 13 S. aureus-Isolaten etabliert, die klinisch mit vergleichsweise invasiven Infektionen assoziiert waren (12 Osteomyelitis-Isolate und 1 Endokarditis-Isolat). Ergebnisse: Die bekannten molekularen Marker zellulärer Invasivität korrelieren zuverlässig in einer Population klinischer MRSA-Isolate und lassen sich auch auf bisher nicht bekannte (spa- und SCCmec-) Typen ausweiten. Das Hämolyseverhalten korrelierte nicht mit der zellulären Invasivität. Der agr-Typ wurde als weiterer molekularer Marker identifiziert. Die zelluläre Invasivität war unabhängig von der Etablierung einer Infektion in vivo (mediane Invasivität der Kolonisierer 100% versus 108% der Infektions-assoziierten Studienisolate und 110% der externen Referenzisolate). Des Weiteren waren die molekularen Marker spa- und agr-Typ nicht in der Lage, die Virulenz eines MRSA-Isolats in vivo abzuschätzen. Diskussion: Die zelluläre Invasivität klinischer MRSA-Isolate korreliert zuverlässig mit molekularen Markern. Allerdings vermögen weder die zelluläre Invasivität, noch mit ihr assoziierte molekulare Marker die Etablierung einer Infektion in vivo vorherzusagen. Beide scheinen also als Surrogat-Parameter zur Abschätzung der klinischen Virulenz eines Isolats ungeeignet. Zur Klärung der Frage, ob molekulare Marker zellulärer Invasivität in anderen Abschnitten der Pathogenese von S. aureus- Infektionen eine Rolle spielen, bedarf es weiterer Studien. N2 - Background: Fibronectin-binding of S. aureus is reported to correlate with the propensity to cause invasive infections. Cellular invasion of S. aureus is Fn dependent and clusters with molecular markers (spa type, SCCmec, Pls). Here, we tested the hypothesis that cellular invasiveness and corresponding molecular markers predict the propensity to cause infections in a prospective cohort. Methods: 109 clinical MRSA isolates were characterized (agr, spa, BURP, SCCmec, pls) and cellular invasiveness was determined. Association with clinical infection was assessed (93 colonizing vs. 16 infecting isolates). Further 13 S. aureus isolates from patients with severe S. aureus infections served as an external comparison. Results: The agr type was identified as a new marker for invasiveness and known molecular markers were corroborated. Establishment of infection was independent from cellular invasiveness of MRSA (mean colonizing vs. infecting isolates 100% and 89%, respectively; external infecting isolates: 109%). Furthermore agr and spa types were unable to predict clinical behavior. Conclusion: Cellular invasiveness of MRSA isolates clusters reproducibly with molecular markers. However, cellular invasiveness and molecular markers cannot predict establishment of infection. This suggests that both criteria may not be used as surrogate parameters for the virulence potential of human MRSA isolates. KW - MRSA KW - Staphylococcus aureus KW - Invasivität KW - spa KW - agr KW - SCCmec KW - pls KW - invasiveness KW - spa KW - agr KW - SCCmec KW - pls Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69444 ER - TY - THES A1 - Bourdet, Patric T1 - Entwicklung einer auf Antikörpern basierten Therapie von chirurgischen Infektionen verursacht durch methicillinresistente und -sensible Staphylococcus aureus (MRSA und MSSA) T1 - Development of an antibody based therapy of surgical infections caused by methicillinresistant and -sensitive Staphylococcus aureus (MRSA and MSSA) N2 - Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Diese grampositiven Bakterien verursachen neben harmlosen oberflächlichen Hautinfektionen auch lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika wird zukünftig wahrscheinlich nicht ausreichen, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. Ziel dieser Arbeit war es, zunächst zwei Proteine IsaA und IsaB herzustellen, um diese Proteine für Immunisierungsstudien zu nutzen. Zunächst wurde das gereinigte IsaA-Protein verwendet, um ein Kaninchen zu immunisieren. Mit den daraus gewonnenen Antikörpern wurden dann erste Tierversuche begonnen, um die Bedingungen für den therapeutischen Einatz von gegen IsaA-gerichteten Antikörpern zu ermitteln und die Wirksamkeit einer Antikörper-Behandlung zu evaluieren. Für die Herstellung der gewünschten Proteine wurden die Gensequenzen zunächst aus verschiedenen S. aureus-Stämmen mittels PCR amplifiziert und in den kommerziellen Expressionsvektor pQE30 kloniert. Die amplifizierte Gensequenz stammt aus den klinischen Stämmen 418 (IsaA) bzw. 134 (IsaB). Nach der Klonierung wurden geeignete Expressions- und Reinigungsstrategien entwickelt. Dabei wurden folgende Bedingungen als optimal für Wachstum und Überexpression herausgearbeitet: IsaA: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 3 h Wachstum bei 37°C. IsaB: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 4 h Wachstum bei 37°C. Es stellte sich auch heraus, dass IsaA zunächst in nur unzureichender Quantität vorhanden bzw. exprimiert worden war. Die Vermutung, dass IsaA überwiegend im Pellet in sogenannten Einschlusskörpern (inclusion bodies) eingeschlossen war, erklärte dieses Phänomen. Das Protein konnte erfolgreich aus dem Pellet isoliert werden. Die Produktion und Aufreinigung beider Proteine IsaA und IsaB unter optimierten Bedingungen ergab, dass beide Proteine nun in ausreichender Menge und Konzentration für die folgende Immunisierung und die weiteren Arbeiten vorlagen. Aus Kaninchen, die mit IsaA immunisiert wurden, konnten polyklonale Antikörper gewonnen werden, die die Grundlage für einen ersten Tierversuch mit 24 Ratten bildeten. Hierbei zeigte sich, dass die Tiere, die mit 1.000.000.000 Bakterien infiziert worden waren deutlich stärkere Infektionszeichen aufwiesen als diejenigen, die mit 100.000.000 Bakterien infiziert worden waren. Weiterhin wurde deutlich, dass die Tiere, die Serum (mit Antikörper gegen IsaA) erhalten hatten, gegenüber den Vergleichstieren mit Placebo einen deutlichen Vorteil hinsichtlich Infektionszeichen und Immunantwort hatten. Somit belegen die tierexperimentiellen Ergebnisse in dieser Arbeit erstmalig den therapeutischen Nutzen von Antikörpern gegen IsaA. IsaA ist demnach ein geeignetes Target für eine Immuntherapie gegen S. aureus. N2 - Staphylococcus aureus is one of the most common pathogens of nosocomial infections. These grampositive bacteria not only cause harmless superficial skin infections but also life threatening systemic infections. A huge problem in therapy of S. aureus infections is the increasing rate of multiresistance. The development of new antibiotics will probably not be sufficient in the future because new resistance in bacteria is to expect. Therefore there is urgent need for alternative therapies fighting multiresistant bacteria such as S. aureus. One approach is immunotherapy, e.g. by production of monoclonal antibodies against adequate targets of S. aureus. The purpose of this paper was to produce two proteins, IsaA and IsaB, to use these for immunisation studies. First purified IsaA was used to immunise a rabbit. The extracted antibodies were used for early animal experiments to evaluate conditions for the therapeutic use and efficiency of antibodies against IsaA. For production of the wanted proteins gene sequences from various S. aureus strains were amplified by PCR and cloned into pQE30, a commercial expression vector. The amplified gene sequences come from strain 418 (IsaA) and strain 134 (IsaB). After cloning appropriate conditions for expression and purifiing were elaborated: IsaA: induction of overexpression with 100 µM IPTG, 3 h growth at 37°C. IsaB: induction of overexpression with 100 µM IPTG, 4 h growth at 37°C. First IsaA emerged to be present respectively expressed of low quantity only. The presumption that IsaA was predominantly enclosed in so called inclusion bodies explained this phenomenon. The protein could successfully isolated from the pellet. Production and purification of both proteins IsaA and IsaB under optimised conditions led to sufficient quantitiy and concentration for the immunisation following and further research. From a rabbit, immunised with IsaA, polyclonal antibodies were obtained and provided a basis for the first animal experiment with 24 rats. It showed that animals infected with 1.000.000.000 bacteria had considerably more signs of infection than those infected with 100.000.000 bacteria. It could also be shown that animals treated with serum (with antibodies against IsaA) had clear advantage regarding signs of infections and immune response compared to those animals treated with placebo. These results of the animal experiment document the therapeutic benefit of antibodies against IsaA for the first time. Therefore IsaA is an adequate target for immunotherapy against S. aureus. KW - MRSA KW - Staphylococcus aureus KW - Immuntherapie KW - Antikörper KW - Infektion KW - Target KW - IsaA KW - IsaB KW - IsaA KW - IsaB Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56199 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Katrin T1 - Untersuchung zum in vitro Wachstumsverhalten ausgesuchter MRSA-Stämme T1 - In vitro Analysis of the Growth Rate of selected MRSA-Clones N2 - In dieser Arbeit wurde das in vitro Wachstumsverhalten ausgesuchter MRSA in Konkurrenz zu Bakterien der Standortflora unter Optimalbedingungen und unter Mangelbedingungen getestet. Es lässt sich für alle getesteten MRSA-Stämme zusammenfassend sagen, dass ihre klinische Prävalenz nicht mit dem Wachstum in vitro korreliert, d.h. das häufige Spa-Typen nicht besser unter unseren Versuchbedingungen gewachsen sind als seltene. In vitro konnte kein verdrängendes Wachstum des Methicillin sensiblen S. aureus gegenüber den resistenten Stämme beobachtet werden. Vielmehr gelingt es den MRSA-Stämmen, ein Wachstumsgemisch zu ihrem Vorteil zu beeinflussen, indem sie die getesteten anderen Mikroorganismen (S. epidermidis, S. cerivisiae) im Wachstum hemmen, mit Ausnahme von E. faecium. Die Arbeit beleuchtet die Schwierigkeiten der Identifizierung von probiotischen Arten zur Verdrängung eines MRSA. In Zukunft sollte vielleicht an der Optimierung von in vitro Systemen gearbeitet werden (in vitro Organkulturen) oder Tiermodelle verwendet werden. Den Transmissionsunterschieden und der Tenazität sind weiterhin Aufmerksamkeit zu widmen. Wie in der Literatur beschrieben ist es zum Verständnis des Wachstumsverhal-tens der resistenten Stämme wichtig zu wissen, auf welchen molekularbiologischen Grundlagen die Resistenz beruht, da eine einzelne Site-Mutation zusätzliche Resistenzen bedeuten und einen eventuellen Wachstumsnachteil wieder ausgleichen kann. Im Klinikalltag scheinen sich die MRSA-Stämme auszubreiten, die den Wachstumsnachteil bereits ausgeglichen haben, beziehungsweise deren Methicillinresistenz keinen Wachstumsnachteil bedeutet. N2 - The competitive in vitro growth of selected MRSA-Clones in comparison to bacteria from the human skin and probiotic bacteria respectively are evaluated in this study. There was no proof of in vitro growth advantage for the common MRSA-Clones in comparison to the uncommonly found MRSA-Clones in clinical samples. This concludes that there must be a different reason for the spreading of the commonly found MRSA-Clones other than the growth rate. The competitive growth analysis with bacteria of the human skin (S. epidermidis, Methicillin susceptible S. aureus), E. faecium and probiotic bacteria (S. cerivisiae) showed, that none of the tested bacteria could decrease the growth rate of the MRSA-Clones in clinical relevant concentrations. Methicillin resistence shows a growth rate decrease for some MRSA-clones as described in the literature. By contrast, the results of this study reveal, that the clinical acquired MRSA-clones must have somehow compensated for the growth disadvantage. KW - MRSA KW - Staphylococcus KW - Fitness KW - MSSA KW - Wachstumsverhalten KW - MRSA KW - MSSA KW - Competitive Growth KW - Bacterial Fitness Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55570 ER - TY - THES A1 - Geis, Tanja T1 - Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen zu klinisch relevanten immunodominanten Antigenen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Bakterien (MRSA) für eine Antikörpertherapie T1 - Molecular and immunological characterization of immunodominant antigens of MRSA N2 - Zusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberflächlichen Hautinfektionen auch gefürchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. In den beiden immundominanten Antigenen IsaA und IsaB scheinen solche geeigneten Angriffsstrukturen gefunden zu sein. In dieser Arbeit wurde eine IsaB-Mutante hergestellt und nachfolgend phänotypisch charakterisiert. Diese Arbeiten bilden die Grundlage für die Aufklärung der Funktion von IsaB. Weiterhin sollte ein humaner monoklonaler Antikörper gegen IsaA generiert werden. Zur Testung der Antigenspezifität war es notwendig einen anti-IsaA-spezifischen ELISA zu entwickeln. Durch die Fusion der Hybridomzelllinie HAB mit B-Lymphozyten aus lymphatischem Gewebe septikämischer Patienten sollten Fusionszellen gewonnen werden, die spezifische anti-IsaA-Antikörper produzieren. Durch den Einsatz einer humanen Hybridomzelllinie sollten Kreuzspezies-Reaktionen, wie sie bei murinen therapeutischen Antikörpern beobachtet wurden, ausgeschaltet werden. Es wurden mehrere Fusionen mit lymphatischem Material (Lymphknoten, Blut-B-Lymphozyten) durchgeführt. Eine spezifische Antikörperproduktion blieb hierbei jedoch aus. Ein anti-IsaA-spezifischer ELISA konnte auf der Grundlage polyklonaler anti-IsaA-Antikörper aus immunisierten Kaninchen erfolgreich etabliert werden. Der ELISA zeigte die höchste Spezifität bei einer Antigenbeschichtung von 2 µg/ml IsaA und einer optimalen Primärantikörperkonzentration von 1 : 25600. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Spezifität des polyklonalen Antikörpers und das Vorkommen von IsaA bei verschiedenen Staphylococcus aureus-Stämmen und anderen Bakterienspezies getestet werden. Dazu wurde mittels Western-Blot die Expression von IsaA untersucht. Ergebnis dieser Untersuchung war, dass IsaA unabhängig von der Herkunft, vom Infektionstyp oder Resistenzeigenschaften von allen S. aureus-Isolaten exprimiert wird. Von den anderen untersuchten Bakteriespezies zeigte der IsaA-spezifische polyklonale Antikörper auch eine Reaktion gegen S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. warnerii und S. cohnii. Ob diese Staphylokokkenarten ein IsaA-homologes Protein mit konservierten Domänen exprimieren, das mit dem Antiserum kreuzreagiert, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Die Herstellung der IsaB-Mutante erfolgte durch Konstruktion eines Inaktivierungsplasmides (pTG1), in dem eine Erythromycinkassette zwischen ein „upstream“- und „downstream“-Fragment kloniert wurde. Als Grundlage diente der temperatursensitive „shuttle“-Vektor pBT2, der bei erhöhter Temperatur in S. aureus nicht weiter replizieren kann und dadurch homologe Fragmente auf dem Vektor mit genomischen Abschnitten rekombinieren. Die erfolgreicher Herstellung der isaB-Mutante wurde im Southern-Blot überprüft. Die Mutante wurde verschiedenen vergleichenden Experimenten mit dem Wildtyp unterzogen, um Informationen über die mögliche Funktion des Targetproteins IsaB im Hinblick auf Wachstum und Virulenz für S. aureus zu gewinnen. Die Wachstumsexperimente ergaben einen deutlichen Unterschied im Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Da die Mutante deutlich schneller wuchs als der Wildtyp scheint IsaB wichtig für das Wachstum von S. aureus zu sein. In vitro-Experimente zur Testung von möglichen in vivo-Umwelteinflüssen bzw. Stressfaktoren auf das Wachsum der Stämme erfolgten mittels Zusetzung von Glucose und NaCl. Hier zeigte sich ein deutlicher Wachstumsvorteil des Wildtyps gegenüber der isaB-Mutante, so dass unter extremen Umweltbedingungen IsaB S. aureus ein besseres Wachsen ermöglicht. In weiteren Experimenten wurden das Hämolyse- und Proteolyseverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht. IsaB scheint Einfluss auf die Expression von Hämolysinen und Proteasen zu haben, die wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Wildtyp und Mutante ergaben ebenfalls Unterschiede für verschiedene Antibiotika, so dass IsaB Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu nehmen scheint. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Eignung von IsaB als Targetprotein für eine Antikörpertherapie bei lebensbedrohlichen S. aureus-Infektionen. N2 - Summary: Staphylococcus aureus is one of the most frequent causes of nosocomial infections. The spectrum of diseases ranges from self limiting local infections of the skin to feared life-threatening systemic infections. The increasing rate of multi-resistant S. aureus strains represents a serious problem in the therapy of infections due to S. aureus. In addition to the development of new antibiotics, it is very important to develop alternative forms of therapy in the fight against multi-resistant bacteria, such as S. aureus. As an alternative, immuno-therapeutical methods can be developed, for example the use of monoclonal antibodies against target elements of S. aureus. A prerequisite for the development of therapeutical antibodies is the identification of immuno-dominant antigens which should preferentially be located on the cell surface of the pathogen or being secreted proteins. Recently, two immunodominant antigens named IsaA and IsaB have been identified which seem to be suitable structures for an antibody-based immuno-therapeutical approach. To learn more about the function of the immunodominant antigens and to evaluate the role in diseases caused by S. aureus in this work an isaB-mutant was constructed and phenotypically characterized. Moreover, a human monoclonal antibody against IsaA should be generated. For testing the specificity of monoclonal antibodies, it was necessary to develop an anti-IsaA-specific ELISA. By fusion of the human heteromyeloma cell line HAB-1 with B-lymphocytes from lymphatic material of patients with sepsis anti-IsaA producing hybridoma clones should be generated and later on tested in different models. By application of the human heteromyeloma cell line cross-reactions of species, as they were observed with murine antibodies, can be circumvented. In this work, several fusions of different lymphatic material were accomplished. However, specific anti-IsaA producing antibodies could not be generated. Furthermore, an anti-IsaA-specific ELISA could successfully be established on the basis of polyclonal anti-IsaA-antibodies from immunized rabbits. The ELISA showed the highest specificity at an antigen-coating of 2 µg/ml of IsaA and an optimal primary antibody concentration of 1:25600. To evaluate the expression of IsaA protein within the species S. aureus and to test the specificity of the antibody Western blot experiments were performed using different S. aureus strains, strains from other staphylococcal species and also non-staphylococcal isolates. These experiments reveal that IsaA is specifically expressed by all S. aureus strains tested, independently of the origin of the strains and regardless the type of infection the strains have caused or the type of resistance they do express. The isaB-mutant was created via constructing an inactivating plasmid (pTG1), in which the erythromycin resistance cassette ermB was cloned between an upstream and downstream fragment of isaB in the temperature-sensitive shuttle-vector pBT2, which cannot replicate in S. aureus at higher temperatures (42°C) facilitating homologous recombination with homologous sequences in the genome. The successful construction of the isaB-mutant was proven by Southern blot hybridization. Moreover, the mutant was submitted to different comparative experiments with the wildtype, in order to get information about the possible function of the target protein IsaB. Growth experiments have clearly demonstrated a faster growth behaviour of the isaB-mutant cells compared to the wildtype. However, in the presence of high salt and glucose concentrations the wildtype grew much faster suggesting a role of IsaB in growth under extreme environmental conditions. The results of this work clearly support the idea of using IsaB as a target protein for immuno-therapy against life-threatening infections due to S. aureus. KW - MRSA KW - monoklonale Antikörper KW - immunodominante Antigene KW - ELISA KW - Immuntherapie KW - MRSA KW - monoclonal antibodies KW - immunodominant antigens KW - ELISA KW - immuntherapy Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18108 ER - TY - THES A1 - Langenhan, Ronny T1 - Identifizierung immunodominanter antigener Strukturen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) mit Hilfe einer Expressionsgenbank T1 - Identification immunodominant and antigenic structures of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with an expression library N2 - Infektionen durch MRSA können aufgrund der zunehmenden Therapieresistenz der Erreger ernsthafte Verläufe zeigen. Daher ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien ein Ziel der aktuellen Infektionsforschung. Ein vielversprechender Ansatz liegt in der Verwendung pathogenspezifischer, monoklonaler Antikörper gegen immunodominante Antigene der Erreger. Durch die Fortschritte in der Genomforschung der vergangenen Jahre ist nun die Analyse der Gesamtheit der Pathogenitätsfaktoren eines bakteriellen Erregers möglich. Durch eine funktionelle Genomanalyse mit Hilfe immunologischer Detektionssysteme können antigene Bakterienzellstrukturen identifiziert werden. Daraus abgeleitete Targetstrukturen sollen die Grundlage bilden für die Entwicklung spezifischer humaner Antikörper, die in alternativen Therapieansätzen zusätzlich zur antimikrobiellen Chemotherapie zukünftig an Bedeutung gewinnen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Expressionsgenbank eines MRSA-Stammes hergestellt und mittels Patientenseren nach immunodominanten Antigenen gesucht. Die aus einem Partialverdau der genomischen DNA gewonnenen Fragmente wurden in einen Expressionsvektor kloniert. Die so hergestellte Genbank des ausgewählten MRSA-Stammes A 134 umfasst ca. 10000 Klone. Ein vergleichendes Screening der Genbank erfolgte mit dem Serum eines Patienten mit einer MRSA-Sepsis und mit dem Serum einer negativen Kontrollperson. Die DNA-Inserts der immunoreaktiven Klone wurden sequenziert und durch Datenbankvergleiche identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass der gewählte Ansatz geeignet ist, um immunodominante Antigene, die während einer Sepsis exprimiert werden, zu identifizieren. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen putativen immunodominanten Antigenstrukturen umfassen ein Holin, die Amidase LytA, Faktoren des isd-Genclusters, der für die Cadmiumresistenz wichtige Transporter CadA, unbekannte Proteine der Staphylokokken-Pathogenitätsinsel SaPI3 und Protein A. Interessanterweise wurden durch den methodischen Ansatz vorwiegend Proteine auf mobilen genetischen Elementen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während einer S. aureus-Infektion nicht nur Gene für das Wachstum der Zellen und Virulenzfaktoren wie Toxine und Adhäsine, sondern auch mobile Elemente exprimiert werden. Die Bedeutung dieser Prozesse für das Infektionsgeschehen ist allerdings bislang unbekannt und zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit diese Elemente für die Pathogenese von Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene müssen auch in zukünftigen Arbeiten durch Subklonierung weiter charakterisiert werden. Eine weitere interessante Beobachtung ist die Identifizierung eines Bakteriophagens, der in das isd-Gencluster inserierte, das für die Aufnahme von Eisen eine Bedeutung besitzt. Inwieweit durch die Insertion des Phagens die Eisenaufnahme in dem klinischen Isolat gestört wird, müssen zukünftige Studien zeigen. Die positive Reaktion des Patientenserums mit dem Protein A ist am wahrscheinlichsten auf die Antiköperbindung am FC-Fragment zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass während der Infektion verstärkt Protein A gebildet wird, das durch die Bindung von Antikörpern am Fc-Teil eine immunsuppressive Wirkung durch die Neutralisierung opsonisierender und Toxin-inaktivierender Antikörper besitzt. Durch die Sequenzierung und Datenbankanalyse der positiven Klone konnte ein erster Überblick über immunodominante Antigene von S. aureus erhalten werden. Da auf den Insertelementen meist mehrere putative Antigene kodiert sind, müssen in zukünftigen Arbeiten die identifizierten Insertelemente subkloniert und damit weiter charakterisiert werden. Dadurch sollte es möglich sein, die immunogenen Strukturen zu erkennen und diese für die Entwicklung monoklonaler Antikörper zu nutzen. N2 - Infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are increasingly difficult to threat due to the presence of multiple antibiotic resistance traits. Therfore, the developemet of alternative strategies are urgently demanded to combat severe staphylococcal infections. Immunotherapy has become a promising approach using specific, monoclonal antibodies against defined immunodominant structures (antigens) of the bacterium. The recent progress of genome-based research of bacterial pathogens allows now the global analysis of factors involved in pathogenicity. The identification of such virulence-associated factors might result in the development of specific antibodies against bacterial pathogens which may administered supplementary to antibiotics increasing the success of of a therapy. In this study an expression library of an MRSA strain was constructed. For this purpose, genomic DNA of a MRSA strain was digested with Sau3A and DNA fragments of 3 to 10 kb were ligated into the expression vector ZAP-express. The gene library encompasses approximately 10,000 clones. To detect specific antigenic structures the expression library was screened by using human sera of MRSA septiceamic patients and sera of asymptomatically colonized individuals. Clones which specifically reacted with the patients sera were further analyzed by DNA-sequencing and BLAST analysis. Several staphylococcal antigenic and immunodominant structures were identified including a putative holin and a gene with strong homology to the amidase lytA. Both proteins may phage-derived as they show significant similarity to a range of phage proteins. In addition, genes of the isd-locus reacted with the immunsera. These genes encode proteins which are important for transport of iron into the cell. Furthermore, a cadmium resistance factor (cadA), unknown proteins localized on Staphylococcus aureus pathogenicity island 3 (SaPI3) and protein A showed a positive reaction with the immune sera. Interestingly, almost all proteins identified are associated with mobile genetic elements. The results of the study suggests that proteins encoded on mobile genetic elements are indeed expressed during infection which in turn are recognized by the immune system resulting in the production of specific antibodies. To what extend these antibodies contribute to a successful defence of staphylococcal cells is currently not known and subject of ongoing studies. Moreover, the antigenic and immunodominant structures identified in this study have to subcloned to characterize their immunoreactive potential. The positive reaction of the patient serum with protein A is probably caused by the antibody-binding capacity of the protein to the FC-fragment of antibodies. An alternative theoretical opportunity could be that an acute S. aureus infection causes a massive production of protein A that subsequently consume antibodies due to binding of the FC-Fragment. The sum of these events may cause a dramatic immunsuppressive effect. In conclusion, several putative immunodominant structures have been identified being the basis for further studies to assess whether or not these structures may serve as targets of an antibody-based therapy of infections caused by S. aureus. KW - MRSA KW - monoklonale Antikörper KW - Expressionsgenbank KW - Pathogenitätsinsel KW - Bakteriophagen KW - MRSA KW - monoclonal antibodies KW - expression library KW - pathogenicity island KW - bacteriophage Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13719 ER -