TY  - THES
A1  - Schmithausen, Patrick Alexander Gerhard
T1  - Three-dimensional fluorescence image analysis of megakaryocytes and vascular structures in intact bone
T1  - Dreidimensionale Fluoreszenzbildanalyse von Megakaryozyten und Gefäßstrukturen in intaktem Knochen
N2  - The thesis provides insights in reconstruction and analysis pipelines for processing of
three-dimensional cell and vessel images of megakaryopoiesis in intact murine bone.
The images were captured in a Light Sheet Fluorescence Microscope. The work
presented here is part of Collaborative Research Centre (CRC) 688 (project B07) of
the University of Würzburg, performed at the Rudolf-Virchow Center. Despite ongoing
research within the field of megakaryopoiesis, its spatio-temporal pattern of
megakaryopoiesis is largely unknown. Deeper insight to this field is highly desirable to
promote development of new therapeutic strategies for conditions related to
thrombocytopathy as well as thrombocytopenia. The current concept of
megakaryopoiesis is largely based on data from cryosectioning or in vitro studies
indicating the existence of spatial niches within the bone marrow where specific stages
of megakaryopoiesis take place. Since classic imaging of bone sections is typically
limited to selective two-dimensional views and prone to cutting artefacts, imaging of
intact murine bone is highly desired. However, this has its own challenges to meet,
particularly in image reconstruction. Here, I worked on processing pipelines to account
for irregular specimen staining or attenuation as well as the extreme heterogeneity of
megakaryocyte morphology. Specific challenges for imaging and image reconstruction
are tackled and solution strategies as well as remaining limitations are presented and
discussed. Fortunately, modern image processing and segmentation strongly benefits
from continuous advances in hardware as well as software-development. This thesis
exemplifies how a combined effort in biomedicine, computer vision, data processing
and image technology leads to deeper understanding of megakaryopoiesis. Tailored
imaging pipelines significantly helped elucidating that the large megakaryocytes are
broadly distributed throughout the bone marrow facing a surprisingly dense vessel
network. No evidence was found for spatial niches in the bone marrow, eventually
resulting in a revised model of megakaryopoiesis.
N2  - Im Rahmen dieses Dissertationsvorhabens wurden Segmentierungs- und
Auswertepipelines dreidimensionaler Bilder von Zellen und Gefäßen im intakten
Mausknochen erarbeitet. Die Bilder entstanden durch Fluoreszenzaufnahmen eines
Lichtblattmikroskops. Das Dissertationsvorhaben war Teil des
Sonderforschungsbereichs 688 (Teilprojekts B07) der Universität Würzburg und es
wurde am Rudolf-Virchow-Zentrum durchgeführt. Trotz einer Vielzahl aktueller
Forschungsprojekte auf dem Gebiet der Megakaryopoese sind Erkenntnisse über
deren räumlich-zeitliche Zusammenhänge größtenteils unbekannt. Neuere
wissenschaftliche Erkenntnisse auf diesem Gebiet wären insbesondere hilfreich für die
Weiterentwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten, die an
Thrombozytopenien oder Thrombozytopathien leiden. Das aktuell vorherrschende
Modell zur Erklärung der Megakaryopoese geht von der Existenz räumlicher Nischen
im Knochenmark aus, in denen sich die einzelnen Schritte der Megakaryopoese
vollziehen. Dieses Modell basiert hauptsächlich auf Auswertungen von
Gefrierschnitten sowie in-vitro Experimenten. Da die klassische Bildgebung von
Knochenschnitten nur auf eine bestimmte Anzahl zweidimensionaler Schnitte begrenzt
ist und deren Qualität unter Schnittartefakten leidet, ist die Bildgebung des intakten
Knochens von besonderem Interesse. Dennoch führt dies zu neuen
Herausforderungen im Bereich der Bilddatenauswertung. Im vorliegenden
Dissertationsvorhaben beschäftige ich mich in diesem Bereich mit der Erarbeitung von
Auswerteprotokollen, welche beispielsweise den Einfluss unregelmäßiger Färbungen
oder Signalabschwächungen sowie die extreme Heterogenität der
Megakaryozytenmorphologie berücksichtigen. Spezifische Herausforderungen für die
Bildgebung und Bildrekonstruktion werden in Angriff genommen und
Lösungsstrategien sowie verbleibende Einschränkungen werden vorgestellt und
diskutiert. Erfreulicherweise profitieren insbesondere die moderne Bildbearbeitung
sowie die Objekterkennung in großem Ausmaß von fortlaufenden Entwicklungen aus
dem Hard- sowie Softwarebereich. Dieses Dissertationsvorhaben zeigt auf
exemplarische Art und Weise auf, wie gemeinsame Forschungsanstrengungen im
Bereich der Biomedizin, des Maschinellen Sehens, der Datenverarbeitung sowie der
Bildtechnologie zu einem tieferen Verständnis der Megakaryopoese führen. Die
maßgeschneiderten Pipelines zur Bilddatenauswertung stützten letztlich die These,
dass größere Megakaryozyten im Knochenmark breit verteilt sind und von einem überraschend dichten Gefäßnetz umgeben sind. Beweise für die Existenz räumlicher
Nischen im Knochenmark konnten nicht gefunden warden. Dieses führte schließlich
zur Vorstellung eines überarbeiteten Modells der Megakaryopoese.
KW  - Megakaryozytopoese
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Megakaryozyt
KW  - Lichtscheibenmikroskopie
KW  - Bildverarbeitung
KW  - lightsheet microscopy
KW  - megakaryopoiesis
KW  - fluorescence microscopy
KW  - intact bone imaging
KW  - object segmentation
KW  - Lichtblattmikroskopie
KW  - Bildbearbeitung
KW  - Megakaryopoese
KW  - Bildgebung intakten Knochens
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178541
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gorelashvili, Maximilian Georg
T1  - Investigation of megakaryopoiesis and the acute phase of ischemic stroke by advanced fluorescence microscopy
T1  - Untersuchungen der Megakaryopoese und der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls mit Hilfe von hochentwickelter Fluoreszenzmikroskopie
N2  - In mammals, anucleate platelets circulate in the blood flow and are primarily responsible for maintaining functional hemostasis. Platelets are generated in the bone marrow (BM) by megakaryocytes (MKs), which mainly reside directly next to the BM sinusoids to release proplatelets into the blood. MKs originate from hematopoietic stem cells and are thought to migrate from the endosteal to the vascular niche during their maturation, a process, which is, despite being intensively investigated, still not fully understood. 
Long-term intravital two photon microscopy (2PM) of MKs and vasculature in murine bone marrow was performed and mean squared displacement analysis of cell migration was performed. The MKs exhibited no migration, but wobbling-like movement on time scales of 3 h. Directed cell migration always results in non-random spatial distribution. Thus, a computational modelling algorithm simulating random MK distribution using real 3D light-sheet fluorescence microscopy data sets was developed. Direct comparison of real and simulated random MK distributions showed, that MKs exhibit a strong bias to vessel-contact. However, this bias is not caused by cell migration, as non-vessel-associated MKs were randomly distributed in the intervascular space. Furthermore, simulation studies revealed that MKs strongly impair migration of other cells in the bone marrow by acting as large-sized obstacles. MKs are thought to migrate from the regions close to the endosteum towards the vasculature during their maturation process. MK distribution as a function of their localization relative to the endosteal regions of the bones was investigated by light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The results show no bone-region dependent distribution of MKs. Taken together, the newly established methods and obtained results refute the model of MK migration during their maturation.
Ischemia reperfusion (I/R) injury is a frequent complication of cerebral ischemic stroke, where brain tissue damage occurs despite successful recanalization. Platelets, endothelial cells and immune cells have been demonstrated to affect the progression of I/R injury in experimental mouse models 24 h after recanalization. However, the underlying Pathomechanisms, especially in the first hours after recanalization, are poorly understood.
Here, LSFM, 2PM and complemental advanced image analysis workflows were established for investigation of platelets, the vasculature and neutrophils in ischemic brains. Quantitative analysis of thrombus formation in the ipsilateral and contralateral hemispheres at different time points revealed that platelet aggregate formation is minimal during the first 8 h after recanalization and occurs in both hemispheres. Considering that maximal tissue damage already is present at this time point, it can be concluded that infarct progression and neurological damage do not result from platelet aggregated formation. Furthermore, LSFM allowed to confirm neutrophil infiltration into the infarcted hemisphere and, here, the levels of endothelial cell marker PECAM1 were strongly reduced. However, further investigations must be carried out to clearly identify the role of neutrophils and the endothelial cells in I/R injury.
N2  - In Säugetieren zirkulieren kernlose Thrombozyten im Blutstrom und sind primär für die Aufrechterhaltung der funktionellen Hämostase verantwortlich. Thrombozyten werden im Knochenmark durch Megakaryozyten gebildet, die sich hauptsächlich in direkter Nähe zu Knochenmarkssinusoiden befinden, um Proplättchen in das Blut freizusetzen. Megakaryo-zyten stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab und man glaubt, dass sie während ihres Reifungspro¬zesses von der endostalen in die vaskuläre Nische wandern – ein Prozess, der trotz intensiver Forschung noch nicht vollständig verstanden ist. 
Langzeit-Zwei-Photonen-Mikroskopie von Megakaryozyten und des Gefäßbaums wurde in murinem Knochenmark von lebenden Tieren in Kombination mit der Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung der Zellmigration durchgeführt. Die Megakaryozyten zeigten keine Migration, sondern eine wackelartige Bewegung auf Zeitskalen von 3 Stunden. Die gerichtete Zellmigration führt stets zu einer nicht zufälligen räumlichen Verteilung der Zellen. Daher wurde ein Computermodellierungsalgorithmus entwickelt, der eine zufällige Megakaryo¬zytenverteilung unter Verwendung von realen 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Datensätzen simuliert. Der direkte Vergleich realer und simuliert zufälliger Megakaryozyten¬verteilungen zeigte, dass MKs stark mit Knochenmarksgefäßen assoziiert sind. Dieses wird jedoch nicht durch Zellmigration verursacht, da nicht-Gefäß-assoziierte MKs zufällig im intervaskulären Raum verteilt waren. Darüber hinaus zeigten Simulationsstudien, dass Megakaryozyten die Migration anderer Zellen im Knochenmark stark beeinträchtigen, da sie als sterische Hindernisse wirken. Es wird angenommen, dass MKs während ihres Reife¬prozesses von den Regionen in der Nähe des Endosteums in Richtung des Gefäßsystems wandern. Die Megakaryozytenverteilung als Funktion ihrer Lokalisierung relativ zu den endo¬stalen Regionen des Knochens wurde durch Lichtblattmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse zeigen keine knochenregionabhängige Verteilung von Megakaryozyten. Zusammenge¬nommen widerlegen die neu etablierten Methoden und erzielten Ergebnisse das Modell der Megakaryozyten¬migration während ihrer Reifung.
Ischämie-Reperfusionsschaden (I/R) ist eine häufige Komplikation des zerebralen ischämischen Schlaganfalls, bei dem trotz erfolgreicher Rekanalisierung eine Schädigung des Hirngewebes auftritt. Es wurde gezeigt, dass Thrombozyten, Endothelzellen und Immunzellen das Fortschreiten der I/R-Verletzung in experimentellen Mausmodellen 24 Stunden nach der Rekanalisierung beeinflussen. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen, insbesondere in den ersten Stunden nach der Rekanalisierung, sind jedoch kaum verstanden.
Hier wurden Lichtblattmikroskopie, Zwei-Photonen-Mikroskopie und ergänzende hochkom-plexe Bildanalyse-Workflows zur Untersuchung von Thrombozyten, der Gefäße und Neutro-philen in ischämischen Gehirnen etabliert. Die quantitative Analyse der Thrombusbildung in der ipsilateralen und kontralateralen Hemisphäre zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte, dass die Thrombozytenaggregationsbildung während der ersten 8 Stunden nach der Rekanalisierung minimal ist und in beiden Hemisphären auftritt. In Anbetracht dessen, dass zu diesem Zeitpunkt bereits eine maximale Gewebeschädigung vorliegt, kann geschlossen werden, dass die Infarkt¬progression und der neurologische Schaden nicht aus der Bildung von Thrombozytenaggre¬gaten resultieren. Darüber hinaus erlaubte Lichtblattmikroskopie die Neutrophileninfiltration in die infarzierte Hemisphäre zu bestätigen und hier waren die Spiegel des Endothelzellmarkers PECAM1 stark reduziert. Es müssen jedoch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Rolle von Neutrophilen und Endothelzellen bei I/R-Verletzungen klar zu identifizieren.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Schlaganfall
KW  - Megakaryozyt
KW  - Computersimulation
KW  - Light sheet microscopy
KW  - ischemic stroke
KW  - megakaryopoiesis
KW  - multi-photon microscopy
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186002
ER  -