TY - THES A1 - Winter, Thorsten Ralf T1 - Induced indirect defense in soybean and maize: Effects of ultraviolet radiation, nitrogen availability and heavy metal stress T1 - Induzierte indirekte Verteidigung bei Soja und Mais: Effekte von ultravioletter Strahlung, Stickstoffverfügbarkeit und Schwermetallstress N2 - Plants exposed to herbivory may defend themselves by attracting the “enemies of their enemies”, a phenomenon called induced indirect defense (IID). In this process, the de novo production and emission of volatile organic compounds (VOC) by the affected plant is activated via a jasmonic acid (JA) dependent signaling cascade. VOC can be very specific for the inducing herbivore as well as for the emitting plant. Carnivores as predatory mites and parasitoid wasps use these substances as prey- or host-finding cues. If the herbivore is parasitized successfully, its development is slowed and thus the damage of the plant is decreased. Additional abiotic stress may modulate the plant’s ability to produce and/or emit herbivore induced VOC. Ultraviolet (UV) radiation can have multiple physiological effects on plants, amongst others the activation of the expression of genes that are also activated during anti-herbivore defense. To investigate UV effects, foils with different UV transmittance were used to manipulate ambient solar radiation. One foil was permeable for the whole solar spectrum including UV radiation whereas the other excluded radiation below a wavelength of 400 nm. Soybean exposed to UV increased concentrations of isorhamnetin- and quercetin-based flavonoids as effective photo-protective compounds in the leaves and showed a reduced growth compared to plants exposed to ambient radiation lacking UV. The altered chemical composition of the leaves had no effect on food choice and performance of herbivorous Spodoptera frugiperda larvae. Photo-protection by flavonoids seems to be efficient to prevent further UV effects on IID as plants of both treatments emitted the same blend of induced VOC and hence females of the parasitoid Cotesia marginiventris did not prefer plants from on of the treatments in the olfactometer. Nitrogen is one important macronutrient for all trophic levels and thus deficiency of this nutrient was expected to affect IID of soybean profoundly. To manipulate N availability for soybean plants hydroponic culture was used. One treatment was cultured in a standard hydroponic solution whereas in the N deficiency treatment in the solution all salts containing N were replaced with N-free salts. In N deficient plants root biomass was increased to allow the plant to forage more efficiently for the nutrient. Despite this morphological adaptation, photosynthetic efficiency as well as leaf N and soluble protein content were reduced significantly in N deficient soybean. The N deficiency was passed on to the third trophic level as herbivores fed with the affected leaves had a reduced body N content on her part and showed a decreased growth but no feeding preference for the superior food. Parasitoids reared in such N deficient herbivores had significant lower pupal weight compared to parasitoids reared in hosts fed with fully fertilized soybean. N deficient plants emitted a quantitatively altered herbivore induced blend. The two terpenes β-Bergamotene and (E,E)-α-Farnesene were emitted in higher amounts whereas (Z)-3-Hexenyl-α-methylbutyrate was emitted in significantly lower amount. Despite this quantitatively modified VOC blend the parasitoids host-searching behavior was not affected. Heavy metals (HM) are proposed to affect various biochemical pathways in plants including defense pathways by production of reactive oxygen species (ROS) in the tissue. The ROS on its part may affect production and release of endogenous JA, an important messenger in defense signaling. In this study maize plants were grown hydroponically and exposed to different increased concentrations of copper and cadmium. Maize seems to be able to exclude the excess HM from the leaves because the HM were found mainly in the roots and only to a minor degree in the shoots of the plants. Despite this exclusion the HM significantly affected uptake of other metal ions into the plant. The excess of the HM in combination with the attenuated uptake of other ions led to a reduced growth of roots and shoots as well as to reduced photosynthetic efficiency. Thus the nutritional value of the plants for the herbivore was lowered either by direct toxic effects of the HM or indirectly by altering plant chemical composition. S. frugiperda larvae fed with leaves exposed to high HM concentrations showed a significantly reduced growth but they did prefer neither control nor HM treated plants in a food-choice assay. Cu had a transient priming effect on JA as pre-exposure to a high excess of Cu led to higher amounts of herbivore induced JA compared to control plants exposed only to standard concentration of Cu. As anticipated the increased JA was followed by an increase in herbivore induced VOC in high-Cu treated plants caused by a increase of the green leaf volatiles (E)-3-Hexenal, (Z)-3-Hexenol and (Z)-3-Hexenylacetat and the terpenes Linalool, (E)-α-Bergamotene, (E)-β-Farnesene, and β-Sesquiphellandrene. Despite these profound changes in herbivore induced VOC the parasitoids host searching behavior was not affected. As described, the abiotic stresses UV, N deficiency and excess HM affected the morphology and physiology of soybean and maize, the performance of the herbivore S. frugiperda and even the performance of the parasitoid C. marginiventris. However the host searching behavior of the parasitoid was not affected even if the herbivore induced VOC blend was altered. Thus parasitoids seem to be a very reliable defender for plants and IID a very robust way of herbivore defense. N2 - Pflanzen, die Herbivorendruck ausgesetzt sind, können sich verteidigen, indem sie die „Feinde ihrer Feinde“ anlocken. Dieses Phänomen wird induzierte indirekte Verteidigung (englisch: induced indirect defense IID) genannt. Dabei wird die de novo Produktion und Abgabe von flüchtigen organischen Verbindungen (englisch: volatile organic compounds VOC) durch die betroffenen Pflanze über eine jasmonsäure (JA) -abhängige Signalkaskade aktiviert. Die VOC können sehr spezifisch sowohl für den auslösenden Herbivor als auch für die abgebende Pflanze sein. Karnivoren wie Raubmilben oder parasitoide Wespen nutzen diese Substanzen zur Beute- oder Wirtsfindung. Wurde der Herbivor erfolgreich parasitiert wird seine Entwicklung verlangsamt und damit der Schaden an der Pflanze verringert. Ist die Pflanze außer Herbivorie noch zusätzlichem abiotischen Stress ausgesetzt, kann dieser die Fähigkeit der Pflanze zur Produktion und/oder Abgabe der herbivor-induzierten Duftstoffe beeinflussen. Ultraviolette Strahlung (UV) kann verschiedenste physiologische Auswirkungen auf Pflanzen haben, darunter auch die Aktivierung der Expression von Genen, welche auch bei der Herbivorenabwehr aktiviert werden. Um solche möglichen UV-Effekte zu untersuchen, wurden Folien mit unterschiedlicher Durchlässigkeit für UV genutzt, um die natürliche Sonnenstrahlung zu manipulieren. Eine der Folien war durchlässig für das gesamt Spektrum des Sonnelichtes inklusive der UV-Strahlung, während die andere Folie Strahlung unterhalb einer Wellenlänge von 400 nm ausschloss. Sojapflanzen, die UV ausgesetzt waren, erhöhten die Konzentration von isorhamnetin- und quercetin-basierten Flavonoiden mit besonders effektiven Lichtschutzeigenschaften in ihren Blätter und zeigten außerdem ein reduziertes Längewachstum im Vergleich zu Pflanzen, die natürlicher Strahlung ohne UV-Anteil ausgesetzt waren. Die veränderte Blattchemie hatte jedoch keinen Einfluss auf Futterwahl und Entwicklung von herbivoren Spodoptera frugiperda Larven. Die Lichtschutzeigenschaften der Flavonoide verhinderten auch weitergehende UV-Effekte auf die IID, da Pflanzen beider Behandlungen das gleiche Gemisch induzierter VOC abgaben und daher Weibchen des Parasitoiden Cotesia marginiventris im Olfaktometer keine Bevorzugung für Pflanzen einer der beiden Behandlungen zeigten. Stickstoff (N) ist ein wichtiges Makronährelement für alle trophischen Ebenen, daher wurde vermutet, dass ein Mangel dieses Elementes die induzierte indirekte Verteidigung von Soja tiefgreifend beeinflussen könnte. Um die Verfügbarkeit von N für Sojapflanzen gezielt zu manipulieren wurde ein Hydrokultursystem verwendet. Eine der Behandlungen wurde in einer Standard-Hydrokulturlösung kultiviert während bei der Stickstoffmangelbehandlung die stickstoffhaltigen Salze in der Lösung durch stickstofffreie Salze ersetzt wurden. In N-Mangel-Pflanzen war die Wurzelbiomasse vergrößert, um eine effizientere Aufnahme des Nährstoffes zu ermöglichen. Trotz dieser morphologischen Anpassung waren Photosyntheseleistung, Blattstickstoffgehalt und Menge an löslichem Protein in N-mangel Soja signifikant verringert. Dieser Stickstoffmangel wurde bis zur dritten trophischen Ebene weitergegeben, da mit Stickstoffmangel-Blättern gefütterte Herbivore ihrerseits einen reduzierten Körperstickstoffgehalt und verringertes Wachstum zeigten, in Wahlexperimenten jedoch nicht höherwertiges Futter bevorzugten. Parasitoiden, welche in solchen N-magel Wirten gezüchtet wurden, erreichten ein geringeres Puppengwicht als Parasitoide, welche in Wirten gezüchtet wurden, die mit normal gedüngtem Soja gefüttert wurden. Pflanzen unter Sticktoffmangel emittierten einen qualitativ veränderten herbivor-induzierten Duft. Die beiden Terpene β-Bergamoten und (E,E)-α-Farnesen wurde in höheren Mengen abgegeben, während (Z)-3-Hexenyl-α-Methylbutyrat in geringerer Menge emittiert wurde. Trotz dieser quantitativen Änderung des Duftes war das Wirtsfindeverhalten der Parasitoiden nicht verändert. Schwermetalle können verschiedenste biochemische Signal-u. Stoffwechselwege in Pflanzen beeinflussen, durch das Entstehen reaktiver Sauerstoffspezies (englisch: reactive oxygen species ROS) in Geweben auch Signalwege der pflanzlichen Verteidigung. Die ROS ihrerseits können die Produktion und Freisetzung endogener JA, ein wichtiger Signalstoff in der pflanzlichen Verteidigung, verändern. In dieser Studie wurden hydroponisch kultivierte Maispflanzen verschiedenen erhöhten Kupfer-u. Cadmiumkonzentrationen ausgesetzt. Mais scheint erhöhte Schwermetallmengen vom Spross ausschließen zu können, da die Metalle vor allem in den Wurzeln und nur in geringem Anteil im Spross wiedergefunden wurden. Trotz dieses Ausschlussmechanismuses beeinflussten die Schwermetalle die Aufnahme anderer Metallionen in die Pflanzen. Der Schwermetallüberschuss zusammen mit der eingeschränkten Aufnahme andere Ionen führte zu einem verringerten Wachstum von Wurzeln und Spross sowie verringerter Photosyntheseleistung. Der Futterwert der Pflanzen für die Herbivoren war daher entweder durch direkte toxische Eigenschaften der aufgenommenen Schwermetalle oder indirekt durch Änderung der chemischen Zusammensetzung der Pflanzen verringert. Wurden S. frugiperda Larven mit Maisblättern gefüttert, die hohen Schwermetallkonzentrationen ausgesetzt waren, zeigten sie ein signifikant verringertes Wachstum, bevorzugten in Futterwahltests jedoch weder Blätter von Kontrollpflanzen noch von schwermetallbehandelten Pflanzen. Da Pflanzen, die hohen Kupferkonzentrationen ausgesetzt waren höhere Mengen von herbivor-induzierter JA aufwiesen als Kontrollpflanzen, hatte Kupfer offenbar einen transienten Primingeffekt auf JA. Wie erwartet folgte auf die erhöhte JA-Freisetzung eine erhöhte Emission herbivor-induzierter VOC in mit hohen Kupferkonzentrationen behandelten Pflanzen. Diese Steigerung der Emission war durch eine erhöhte Emission der Grünblattdüfte (E)-3-Hexenal, (Z)-3-Hexenol and (Z)-3-Hexenylacetat und der Terpene Linalool, (E)-α-Bergamoten, (E)-β-Farnesen, und β-Sesquiphellandren bedingt. Das Wirtsfindeverhalten der Parasitoiden blieb jedoch trotz der starken Veränderungen des herbivor-induzierten Pflanzenduftes unbeeinflusst. Wie beschrieben haben die abiotischen Stressfaktoren UV-Strahlung, Stickstoffmangel und Schwermetallbelastung weitreichende Auswirkungen auf die Morphologie und Physiologie von Soja und Maispflanzen, die Larvalentwicklung des Herbivoren S. frugiperda und ebenso auf die Larvalentwicklung des Parasitoiden C. marginiventris. Das Wirtsfindeverhalten des Parasitoiden blieb jedoch trotz Änderungen in den herbivor-induzierten Duftstoffgemischen unbeeinflusst. Daher scheinen Parasitoide eine zuverlässige Verteidigung für Pflanzen und die induzierte indirekte Verteidigung eine gegen abiotischen Stress sehr robuste Art der Herbivorenabwehr darzustellen. KW - Mais KW - Chemische Ökologie KW - Abwehrreaktion KW - Sojabohne KW - Chemische Ökologie KW - Abwehrreaktion KW - Chemische Ökologie KW - indirekte Verteidigung KW - chemical ecology KW - indirect defense KW - parasitoid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54145 ER - TY - THES A1 - Demir, Fatih T1 - Lipid rafts in Arabidopsis thaliana leaves T1 - Lipid Rafts in Arabidopsis thaliana Blättern N2 - Arabidopsis thaliana (A.th.) mesophyll cells play a pivotal role in the regulation of the drought stress response. The signaling & transport components involved in drought stress regulation within lipid rafts of the plasma membrane were investigated by DRM isolation from highly purified plasma membranes. Detergent treatment with Brij-98 and Triton X-100 resulted in a total of 246 DRM proteins which were identified by nano HPLC-MS/MS. The majority of these proteins could be isolated by Triton X-100 treatment (78.5 %) which remains the ”golden” standard for the isolation of DRMs. Comparing in-gel and in-solution digestion approaches disclosed additional protein identifications for each method but the in-gel approach clearly delivered the majority of the identified proteins (81.8 %). Functionally, a clear bias on signaling proteins was visible – almost 1/3 of the detected DRM proteins belonged to the group of kinases, phosphatases and other signaling proteins. Especially leucine-rich repeat receptor-like protein kinases and calcium-dependent protein kinases were present in Brij-98 & Triton X-100 DRMs, for instance the calcium-dependent protein kinase CPK21. Another prominent member of DRMs was the protein phosphatase 2C 56, ABI1, which is a key regulator of the ABA-mediated drought stress response in A.th. The lipid raft localization of the identified DRM proteins was confirmed by sterol-depletion with the chemical drug MCD. Proteins which depend upon a sterol-rich environment are depleted from DRMs by MCD application. Especially signaling proteins exhibited a strong sterol-dependency. They represented the vast majority (41.5 %) among the Triton X-100 DRM proteins which were no longer detected following MCD treatment. AtRem 1.2 & 1.3 could be shown to be sterol-dependent in mesophyll cells as well as two CPKs (CPK10 & CPK21) and the protein phosphatase ABI1. AtRem 1.2 & 1.3 could be proven to represent ideal plant lipid raft marker proteins due to their strong presence in Triton X-100 DRMs and dependency upon a sterol-rich environment. When fluorescence labeled AtRem 1.2 & 1.3 were transiently expressed in A.th. leaves, they localized to small, patchy structures at the plasma membrane. CPK21 was an intrinsic member of Triton X-100 DRMs and displayed extreme susceptibility to sterol-depletion by MCD in immunological and proteomic assays. Calcium-dependent protein kinases (CPKs) have already been studied to be involved in drought stress regulation, for instance at the regulation of S-type anion channels in guard cells. Hence, further transient expression studies with the anion channel SLAH3, protein kinase CPK21 and its counterpart, protein phosphatase ABI1 were performed in Nicotiana benthamiana. Transient co-expression of CPK21 and the anion channel SLAH3, a highly mesophyll- specific homologue of the guard cell anion channel SLAC1, resulted in a combined, sterol-dependent localization of both proteins in DRMs. Supplementary co-expression of the counterpart protein phosphatase ABI1 induced dislocation of SLAH3 from DRMs, probably by inactivation of the protein kinase CPK21. CPK21 is known to regulate the anion channel SLAH3 by phosphorylation. ABI1 dephosphorylates CPK21 thus leading to deactivation and dislocation of SLAH3 from DRMs. All this regulative events are taking place in DRMs of A.th. mesophyll cells. This study presents the first evidence for a lipid raft-resident protein complex combining signaling and transport functions in A.th. Future perspectives for lipid raft research might target investigations on the lipid raft localization of candidate DRM proteins under presence of abiotic and biotic stress factors. For instance, which alterations in the DRM protein composition are detectable upon exogenous application of the plant hormone ABA? Quantitative proteomics approaches will surely increase our knowledge of the post-transcriptional regulation of gene activity under drought stress conditions. N2 - Mesophyllzellen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung der Trockenstress-Antwort in der Pflanze Arabidopsis thaliana (A.th.). Um die an der Trockenstress-Antwort beteiligten Signaltransduktions- und Transportproteine zu identifizieren, die sich in Lipid Rafts der pflanzlichen Plasmamembran befinden, wurden Detergent-Resistant Membranes (DRMs) aus hochreinen Arabidopsis Plasmamembran-Präparationen isoliert. Behandlung dieser hochreinen Plasmamembran mit den Detergentien Brij-98 und Triton X-100 führte zur Identifikation von 246 DRM Proteinen, die mittels der nano HPLC-MS/MS Technologie detektiert wurden. Hierbei war festzustellen, dass das Detergens Triton X-100 eindeutig den Standard für die Isolierung von DRMs darstellt. Die große Mehrheit (78,5 %) der identifizierten DRM Proteine konnte nämlich mit Triton X-100 aufgereinigt werden. Vergleichende Anwendung verschiedener Verdaumethoden (In-Gel & In-Lösung Verdau) zeigte auf, dass jede Methode einen unterschiedlichen Pool an Proteinen identifiziert. Das Gros der analysierten Proteine (81,8 %) konnte jedoch auch alleine durch In-Gel Verdau ermittelt werden. Unter den identifizierten DRM Proteinen stellten Proteine, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, fast 1/3 dar. Diese Proteingruppe wurde hauptsächlich durch Kinasen und Phosphatasen vertreten. Insbesondere Leucin-reiche rezeptor-artige and Calcium-abhängige Proteinkinasen waren in Brij-98 & Triton X-100 DRMs zu beobachten, z.B. die Calcium-abhängige Proteinkinase CPK21. Ebenso in Triton X-100 DRMs wurde die Proteinphosphatase 2C 56 (ABI1) lokalisiert, die eine zentrale Rolle bei der ABA-vermittelten Antwort auf Trockenstress in A.th. inne hat. Zur Bestätigung der Lipid Raft Lokalisation der identifizierten DRM Proteine wurden Sterole aus der Plasmamembran mittels der Chemikalie Methyl-ß-D-cyclodextrin entfernt. Besonders Proteine, die an der Signalweiterleitung beteiligt sind, zeigten eine starke Abhängigkeit von der Präsenz der Sterole. Sie waren besonders betroffen: 41,5 % der Proteine, die nach MCD Behandlung nicht mehr in DRMs identifiziert wurden, gehörten zur Gruppe der Signaltransduktionsproteine. Beispiele waren sowohl die Calcium-abhängigen Proteinkinasen CPK10 & CPK21, als auch die Proteinphosphatase ABI1. Die A.th. Remorine AtRem 1.2 & 1.3 stellen ideale Kandidaten für pflanzliche Lipid Raft Markerproteine dar, da beide sowohl ziemlich stark in Triton X-100 DRMs vertreten, als auch im besonderen Maße auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen sind. Fluoreszenzmarkierte AtRem 1.2 & 1.3 Fusionskonstrukte lokalisierten bei transienter Expression in A.th. Blättern in kleinen, punktförmigen Strukturen an der Plasmamembran. Diese Strukturen zeigten frappierende Ähnlichkeit zu bereits bekannten Mustern von Lipid Raft Proteinen in Hefen und Säugetieren. CPK21 stellte ein besonderes Mitglied der Triton X-100 DRMs dar, welches ebenfalls stark auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen war. Dies konnte durch immunologische and massenspektrometrische Experimente nachgewiesen werden. Calcium-abhängige Proteinkinasen (CPKs) sind an der Regulierung der Trockenstress-Antwort in Pflanzen beteiligt, z.B. bei der Aktivierung von S-typ Anionenkanälen in Schließzellen von A.th. Aufgrund dieser Beteiligung an der Trockenstress-Antwort, wurden transiente Co-Expressionsstudien des Anionenkanals SLAH3, der Proteinkinase CPK21 und ihrem Gegenspieler, der Proteinphosphatase ABI1 in Nicotiana benthamiana Blättern durchgeführt. Transiente Co-Expression von CPK21 und SLAH3, einem zum schließzell-spezifischen Anionenkanal SLAC1 homologen Protein in Mesophyllzellen, resultierte in einer sterol-abhängigen Co-Lokalisation beider Proteine in DRMs. Zusätzliche Gabe vom Gegenspieler ABI1 führte zum Verschwinden von SLAH3 aus DRMs, was möglicherweise auf die Inaktivierung der Proteinkinase CPK21 durch ABI1 zurückzuführen ist. Für CPK21 konnte schon aufgezeigt werden, dass es den Anionenkanal SLAH3 durch Phosphorylierung aktiviert. ABI1 hingegen dephosphoryliert die Proteinkinase CPK21 und führt zur Deaktivierung vom Anionenkanal SLAH3, welcher dann auch nicht mehr in DRMs lokalisierbar ist. Diese streng regulierten Prozesse im Rahmen der Trockenstress-Antwort spielen sich in DRMs von A.th. Mesophyllzellen ab. Die vorliegende Arbeit ist der erste Bericht eines Lipid Raft-lokalisierten Proteinkomplexes, der Signalweiterleitung und Transportprozesse in Arabidopsis Lipid Rafts vereint. Zukünftige Lipid Raft Studien könnten sich mit der Lokalisation von putativen DRM Proteinen nach Anwendung von abiotischen und biotischen Stressfaktoren befassen. So könnte man sich die Frage stellen, inwiefern sich die Proteinzusammensetzung in DRMs von der Zugabe des pflanzlichen Hormons Abscisinsäure (ABA) beeinflussen läßt. Insbesondere quantitative Proteomstudien werden in Zukunft mit Sicherheit unser Wissen über die posttranskriptionelle Regulation der Genaktivität bei Trockenstress erweitern. KW - Ackerschmalwand KW - Abscisinsäure KW - Plasmamembran KW - Stressreaktion KW - Mesophyll KW - ABA KW - DRMs KW - Membrandomänen KW - Trockenstress KW - Anionenkanal KW - Biomembran KW - Blatt KW - Membran KW - ABA KW - DRMs KW - Membrane domains KW - Drought stress KW - Anion channel Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53223 ER - TY - THES A1 - Stange, Annette T1 - Beziehung zwischen Ca2+-Homöostase und Aktivität der S-Typ Anionenkanäle in Schließzellen T1 - Relation of Ca2+-homeostasis and activity of S-type anion channels in guard cells N2 - Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosphäre, indem sie die Öffnungsweite von Poren in der Epidermis von Blättern, sog. Stomata, verändern. Bei Wassermangel werden die stomatären Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgelöst, welches eine Aktivierung von Anionenkanälen in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkanäle ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkanäle führt, nur lückenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkanäle untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration für eine Aktivierung der Anionenkanäle ausreicht. Für diese Studien wurde hauptsächlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die Möglichkeit Anionenkanäle durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgelöst wurden und gleichzeitig die Ströme, die über die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei führte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erhöhung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration während des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zunächst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration auslöste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden Fällen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kanäle beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgelöst wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivität der Schließzellen während einer langen Depolarisation findet möglicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kanäle und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkanälen. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkanäle durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorgänge über die Plasmamembran wurde auch in Drüsenzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale nötig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszulösen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Drüsen nicht direkt mit Ca2+-Flüssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abhängigen Aktivierung scheinen Anionenkanäle in Drüsen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabhängigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabhängige Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abhängigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivität zeigten. Die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkanäle vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden könnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenströme waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivität gegenüber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollständige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatidsäure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollständigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatidsäure im ABA-Signalweg hinweisen könnte. N2 - Plants regulate gas exchange with the atmosphere by changing the aperture of pores in the epidermis of leaves, which are called stomata. Upon water deficiency, stomatal pores close to minimize water loss. This process is initiated by the phytohormone ABA, which induces activation of anion channels in the plasma membrane of guard cells. Even though activation of anion channels is a central element in the response to ABA, the signalling pathway, leading to the activation of anion channels, is still not understood. This work focuses on the role of signalling intermediates like protein kinases, protein phosphatases, lipid-based messengers and Ca2+ in the activation of anion channels. With regard to Ca2+, the generation of Ca2+-signals and the extent to which a rise in the cytosolic free Ca2+-concentration is sufficient for the activation of anion channels was studied. For this purpose, especially the double electrode voltage clamp (DEVC) technique was used in combination with FURA-2 based Ca2+-imaging. The ability of Ca2+ to activate anion channels was tested by evoking Ca2+-signals in guard cells of intact Nicotiana tabacum plants by either clamping the plasma membrane to hyperpolarized or depolarized voltages and simultaneously measuring plasma membrane currents. Thereby a transient elevation of the cytosolic free Ca2+-concentration directly followed the hyperpolarization, whereas depolarization initially induced lowering of the cytosolic free Ca2+-concentration, followed by a transient Ca2+-increase after returning to the holding potential. This suggests that hyperpolarization-activated Ca2+-channels are involved in both Ca2+-responses and that the threshold potential of the guard cell at which a Ca2+-signal is generated shifts to more positive values after a prolonged depolarization. Modulation of the voltage sensitivity of the guard cell during a prolonged depolarization might be due to activation of Ca2+-channels and/or inhibition of Ca2+-transport proteins by a low cytosolic free Ca2+-concentration. The transient elevation of the cytosolic free Ca2+-concentration, induced by hyperpolarization or prolonged depolarization, correlated with a transient activation of S-type anion channels. Analysis of the Ca2+-concentration and time dependence showed that S-type anion channels are activated by Ca2+ in a fast signalling pathway with a half maximal cytosolic free Ca2+-concentration of 515 nM (SE=235, n=33). The mean saturated S-type anion current was -349 pA (SE=107, n=33) at -100 mV. The effect of Ca2+ on plasma membrane transport processes was also studied in gland cells of Dionaea muscipula. In this cell type, a mechanical stimulation of trigger hairs induced a Ca2+-signal, whereby more than two action potentials were needed for a transient increase in the cytosolic free Ca2+-concentration. This data indicates that that the depolarization-phase of the action potential is not directly coupled to Ca2+-fluxes. Instead of a Ca2+-dependent activation, anion channels in glands of Dionaea muscipula thus seem to be activated by a Ca2+-independent signalling pathway. This type of activation mechanism can also be found in ABA-signalling in guard cells. There, a Ca2+-independent activation of S-type anion channels involves protein kinases like OST1 and CPK23, a process that is negatively regulated by the protein phosphatase ABI1. In this work, the redundancy between OST1 and CPK23 as well as components of the Ca2+-dependent signalling pathway could be shown in DEVC experiments with ost1-2 and cpk23-mutants of Arabidopsis thaliana, which still showed S-type anion channel activity. Furthermore, the activity of S-type anion channels in Arabidopsis thaliana mutants lacking the S-type anion channel SLAC1 indicates that redundant S-type anion channels exist, which might be activated by other protein kinases as well. ABA-induced S-type anion currents could also be measured in abi1-transformed Nicotiana tabacum plants, although these plants showed a reduced sensitivity to ABA compared to wildtype plants, suggesting an incomplete inhibition of the ABA-signalling pathway. The redundancy of intermediates in the ABA-signalling pathway could also be seen in studies with the lipid-based messenger phosphatidic acid, which only induced a slow and incomplete stomatal closure. However, this could point at a minor role for phosphatidic acid in the ABA-signalling pathway, as well. KW - Schließzelle KW - Plasmamembran KW - Schmalwand KW - Abscisinsäure KW - Venusfliegenfalle KW - Aktionspotenzial KW - S-Typ Anionenkanal KW - Ca2+-Signal KW - FURA KW - Tabak KW - S-typ anionchannel KW - Ca2+-signal KW - FURA Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52131 ER - TY - THES A1 - Abdelmohsen, Usama Ramadan T1 - Antimicrobial Activities from Plant Cell Cultures and Marine Sponge-Associated Actinomycetes T1 - Antimikrobielle Aktivitäten aus Pflanzenzellkulturen und marinen Schwamm-assoziierten Actinomyceten N2 - This thesis is divided into three parts with the main goal allocating novel antimicrobial compounds that could be used as future antibiotics. The first part aimed to evaluate the potential of plant suspension cultures for the production of antimicrobial proteins. The extracellular, intracellular and cell wall bound fractions of seven heterotrophic and photomixotrophic plant cell suspension cultures treated with nine different elicitors were tested for the elicitor dependent production of antimicrobial proteins. Bioactivities were tested against a selected panel of human isolates including Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as fungi using the disc diffusion assay. The intracellular fractions of elicited cell cultures were more active than extracellular fractions while the cell wall bound fractions showed lowest activities. Among the 21 fractions tested, the intracellular fraction of Lavendula angustifolia elicited with DC3000 was most active against Candida maltosa. The second most active fraction was the intracellular fraction of Arabidopsis thaliana elicited with salicylic acid which was moreover active against all test strains. The antimicrobial activity of elicited Arabidopsis thaliana cell cultures was tested by bioautography to locate the antimicrobial proteins in the crude extract. The intracellular fraction of photomixotrophic Arabidopsis thaliana cells elicited with salicylic acid was selected for further gel filtration chromatography on S-200 column leading to the purification of one 19 kDa antimicrobially active protein, designated, AtAMP. Our findings suggest that elicited plant cell cultures may present a new promising alternative source of antimicrobial proteins. The second part comprises the isolation of actinomycetes associated with marine sponges and testing the bioactivities of new species for further investigations. Actinobacterial communities of eleven taxonomically different sponges that had been collected from offshore Ras Mohamed (Egypt) and from Rovinj (Croatia) were investigated by a culture-based approach using different standard media for isolation of actinomycetes and media enriched with aqueous sponge extract to target rare and new actinomycete species. Phylogenetic characterization of 52 representative isolates out of 90 based on almost complete sequences of genes encoding 16S rRNA supported their assignment to 18 different actinomycete genera. Altogether 14 putatively new species were identified based on sequence similarity values below 98.2% to other strains in the NCBI database. The use of M1 agar amended with aqueous sponge extract yielded a putative new genus related to Rubrobacter which highlighting the need for innovative cultivation protocols. Biological activity testing showed that five isolates were active against Gram-positives only, one isolate was active against Candida albicans only and one isolate showed activity against both groups of pathogens. Moreover, the antiparasistic activity was documented for four isolates. These results showed a high diversity of actinomycetes associated with marine sponges as well as highlighted their potential to produce anti-infective agents. The third part of the thesis focused on the isolation and structure elucidation of new bioactive compounds. Streptomyces strain RV15 recovered from sponge Dysidea tupha, was selected for further chemical analysis by virtue of the fact that it exhibited the greatest antimicrobial potential against Staphylococcus aureus as well as Candida albicans among the all tested strains. Moreover, members of the genus Streptomyces are well known as prolific producers of interesting pharmacologically active metabolites. Chemical analysis of the methanolic crude extract using different chromatographic tools yielded four new compounds. The structures of the new compounds were spectroscopically elucidated to be four new cyclic peptides, namely, cyclodysidins A-D. Their bioactivity was tested against different proteases, bacteria and Candida as well as tumor cell lines. The compounds did not show any significant activities at this point. N2 - Die hier vorliegende Dissertation ist in drei Kapitel gegliedert und hatte die Bereitstellung neuer antimikrobieller Substanzen, die zukünftig als Antibiotika genutzt werden könnten, zum Hauptziel. Das erste Kapitel befasst sich mit dem Potenzial von Pflanzen zur Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung. Pflanzenzellkulturen wurden mit neun verschiedenen Induktoren stimuliert und anschließend auf die Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung hin untersucht. Dafür wurden die extra-, intrazellulären sowie die membrangebundenen Proteinfraktionen von sieben heterotrophen und photomixotrophen Pflanzenzellkulturen extrahiert. Mittels Diffusionstests wurden die Wirkung der Proteine gegen eine Sammlung menschlicher Pathogene inklusive Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, sowie Pilze getestet. Die intrazellulären Fraktionen zeigten dabei höhere Aktivitäten als die extrazellulären, wohingegen die membrangebundenen Proteine die geringsten Aktivitäten aufwiesen. Von den insgesamt 21 getesteten Proteinfraktionen wies die mit DC3000 induzierte intrazelluläre Fraktion von Lavendula angustifolia die größte Wirkung gegen Candida maltosa auf. Die mit Salicylsäure induzierte intrazelluläre Proteinfraktion von Arabidopsis thaliana zeigte eine Hemmung aller getesteten pathogenen Stämme. Die antimikrobielle Aktivität der induzierten Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde mittels Bioautography weiter untersucht, um das wirksame Protein im Gesamt-(Roh-) extrakt einzugrenzen. Die intrazelluläre Fraktion der photomixotrophen Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde ausgewählt, um ein 19 kDa Protein mit antimikrobieller Wirkung, genannt AtAMP, mittels Gelfitrationschromatography über eine S-200 Säule aufzureinigen. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass induzierte Pflanzenzellkulturen zukünftig als aussichtsreiche alternative Quelle für antimikrobiell wirksame Proteine herangezogen werden können. Der zweite Teil dieser Dissertation beinhaltet die Isolation von mit marinen Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Testung auf Bioaktivität. Aus 11 taxonomisch verschiedenen, an den Küsten von Ras Mohamed (Ägypten) und Rovinj (Kroatien) gesammelten Schwammspezies, wurden Actinobakterien auf verschiedenen Standardmedien kultiviert. Um seltene, neue Stämme zu isolieren, wurden diese Medien mit wässrigen Schwammextrakten angereichert. Die auf der 16S rRNA-Gensequenz basierenden phylogenetischen Charakterisierung von 52 der insgesamt 90 Isolate, zeigte die Zugehörigkeit zu 18 verschiedenen Actinomyceten-Gattungen. Die 16S rRNA-Gene von 14 Isolaten zeigten Homologien von weniger als 98,2% zu denen anderer in Datenbanken abgelegten Bakterien und stellen somit vermutlich neue Arten dar. Die Verwendung von mit Schwammextrakt angereichertem M1-Agar resultierte in der Kultivierung einer mutmaßlich neuen, mit Rubrobacter verwandten Gattung und bestätigt die Notwendigkeit der Entwicklung neuer innovativer Kultivierungsprotokolle. Aktivitätstests von fünf Isolaten zeigten deren hemmende Wirkung nur gegen Gram-positive Bakterien, ein Isolat zeigte Aktivität nur gegen Candida albicans und ein Isolat war wirksam gegen beide genannten Pathogengruppen. Desweiteren konnten antiparasitäre Wirkungen von vier Isolaten dokumentiert werden. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen die große Diversität von mit Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Potential Antiinfektiva zu produzieren. Der dritte Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die Isolation und Strukturaufklärung neuer bioaktiver Substanzen. Streptomyceten sind bekannt für die Produktion von interessanten, pharmakologisch aktiven Metaboliten. Der aus dem Schwamm Dysidea tupha isolierte Stamm Streptomyces RV 15 zeigte eine hohe Aktivität gegen Staphylococcus aureus und C. albicans und wurde deshalb für nähere Untersuchungen ausgewählt. Die chemische Analyse des Methanol-Rohextrakts unter der Verwendung verschiedener Chromatographie-Verfahren resultierte in der Isolation von vier Substanzen. Die spektroskopische Analyse zeigte, dass diese neuen Substanzen zyklische Peptidstrukturen aufweisen und wurden daraufhin als Cyclodysidin A-D benannt. Die Bioaktivitäten dieser Substanzen wurden gegen verschiedene Proteasen, Bakterien und Candida sowie gegen verschiedene Tumorzelllinien getestet. Bis zum jetzigen Zeitpunkt zeigte keine der getesteten Peptide eine aussagekräftige Wirkung. KW - Antimikrobieller Wirkstoff KW - Pflanzenzelle KW - Zellkultur KW - Antimikrobielle Aktivitäten KW - Pflanzenzellkulturen KW - Proteinen mit antimikrobieller Wirkung KW - Actinomyceten KW - zyklische Peptide KW - Antimicrobial activities KW - Plant cell cultures KW - Antimicrobial proteins KW - Actinomycetes KW - Cyclic peptides Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51483 ER - TY - THES A1 - Seltmann, Martin Alexander T1 - Bildung und Funktion von Jasmonaten während Seneszenz-Prozessen in Arabidopsis thaliana T1 - Formation an Function of Jasmonates during Senescence-Processes in Arabidopsis thaliana N2 - Jasmonsäure und verwandte Oxylipine wurden bisher als Substanzen, die an der Regulation von Initialisierung und Progression der Blattseneszenz beteiligt sein sollen, kontrovers diskutiert. Bisherige Studien haben sich dabei auf die exogene Applikation von Jasmonaten oder die Messung endogener Spiegel beschränkt. Um die Funktion von Jasmonaten in der Seneszenz-Regulation zu klären, wurden in dieser Arbeit die Profile freier und membranveresterter Oxylipine sowie die Auswirkungen verminderter Oxylipinbildung während der natürlichen Seneszenz und Seneszenz-ähnlicher Prozesse induziert durch Dunkel- und Sorbitol-Inkubation in Blättern von Arabidopsis thaliana untersucht. Jasmonsäure sowie freie 12-Oxo-Phytodiensäure steigen während dieser drei Prozesse an, mit dem stärksten Anstieg von Jasmonsäure nach Dunkelinkubation. Eine deutliche Akkumulation membranveresterter Oxylipine (Arabidopside) konnte lediglich nach Flottierung auf Sorbitol festgestellt werden. Die Mengen an plastidären Mono- und Digalaktosyl-Diacylglycerolen verringerten sich jedoch während der Behandlungen bzw. im Verlauf der Alterung. Zur Untersuchung möglicher Funktionen ansteigender Jasmonat-Konzentrationen wurden Lipoxygenase 2 RNAi-Pflanzen konstruiert, welche basal Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure produzieren können, jedoch keinen Anstieg während Seneszenz- bzw. Stress-Prozessen zeigen. Die Gehalte an Chlorophyll und Membranlipiden sowie die Genexpression entwicklungsspezifischer Seneszenzmarker waren während der natürlichen und der dunkelinduzierten Seneszenz in diesen Pflanzen nicht verändert. Dies legt nahe, dass diese Oxylipine im Verhältnis zu anderen endogenen Faktoren keine bzw. nur geringe Wirkungen auf die Seneszenz-Progression haben. Aus den gemachten Beobachtungen kann vielmehr geschlossen werden, dass bei diesen Prozessen die Akkumulation von Jasmonaten eher die Folge eines veränderten Lipid-Metabolismus als ein Auslöser der Seneszenz ist. Im Gegensatz dazu zeigen die Lipoxygenase 2 RNAi-Linien eine verlangsamte Seneszenz nach Sorbitol-Behandlung. Ähnlich verhält sich die Allenoxid-Synthase Mutante dde2-2, die zwar 13-Lipoxygenase-Produkte aber keine Jasmonate bilden kann. Dies bedeutet, dass die Jasmonate und nicht andere 13-Lipoxygenase-Produkte für die Seneszenz-ähnlichen Symptome unter diesen Bedingungen verantwortlich sind. Dabei stellt die Sorbitol-induzierte Seneszenz einen Stress-Prozess dar, der sich in vielen Punkten von der natürlichen Seneszenz unterscheidet aber große Ähnlichkeiten zur Seneszenz-Induktion nach exogener Jasmonat-Applikation aufweist. Lipoxygenase 2 ist also durch die Bereitstellung von Oxylipinen weniger in Entwicklungs- als vielmehr in Stress-Prozesse involviert. N2 - Jasmonic acid and related oxylipins have been controversely discussed to be involved in regulating the initiation and progression of leaf senescence. Present studies mostly focus on exogenous application of jasmonates or measurements of endogenous levels. To this end we analysed profiles of free and esterified oxylipins during natural senescence and upon induction of senescence-like phenotypes by dark treatment and flotation on sorbitol in Arabidopsis thaliana. Jasmonic acid and free 12-oxo-phytodienoic acid increased during all three processes with the strongest increase of jasmonic acid after dark treatment. Arabidopside content did only increase considerably in response to sorbitol treatment. Mono- and digalactosyldiacylglycerols decreased during these treatments and aging. Lipoxygenase 2 RNAi plants were generated which produce basal levels of jasmonic acid and 12-oxo-phytodienoic acid but do not exhibit accumulation during natural senescence or upon stress treatment. Chlorophyll loss, degradation of membrane lipids as well as expression of senescence markergenes during aging and upon dark incubation was not altered suggesting that these oxylipins are less or not involved in regulating these processes in comparison to other endogenous factors. From these observations it could be further concluded, that jasmonate accumulation in those processes is rather a result of altered lipid metabolism than a promoter of senescence. In contrast, lipoxygenase 2 RNAi lines and the allene oxid synthase deficient mutant dde2-2 were less sensitive to sorbitol treatment than the wild type. This indicates that jasmonates but not other 13-lipoxygenase products are responsible for senescence-like symptoms. Furthermore sorbitol-induced senescence represents a stress-related process, which is similar to senescence processes induced by exogenous jasmonate application but rather than to natural developmental processes. To this end lipoxygenase 2 is rather involved in stress-related processes by providing oxylipins than in developmental functions. KW - Ackerschmalwand KW - Jasmonate KW - Altern KW - Schmalwand KW - Lipide KW - Lipidstoffwechsel KW - Oxylipine KW - Lipoxyg KW - Senescence KW - Jasmonates KW - Lipids KW - Oxylipins KW - Lipoxygenase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51563 ER - TY - THES A1 - Kuhlmann, Franziska T1 - The influence of ultraviolet radiation on plant-insect interactions T1 - Der Einfluss von ultravioletter Strahlung auf Pflanzen-Insekten Interaktionen N2 - Plants must respond to multiple stimuli in a natural environment. Therefore they need the ability to rapidly reorganise and specifically build up appropriate metabolites to adapt to their environment. Abiotic cues, such as ambient solar radiation, influence the next trophic level directly, but also an altered plant composition triggered by these environmental cues can have an effect on the behaviour of herbivores. The aim of this study was to test effects of the important ultraviolet (UV) radiation on plants and on plant-insect interactions using multi-level investigations. The focus was on the conduction of controlled experiments with broccoli plants in highly engineered greenhouses covered with innovative materials, which only differed in their UV-B transmission. For the first time in this controlled environment the plant-mediated UV-B effects on phloem-feeding aphids were studied. Broccoli plants (Brassica oleracea L. convar. botrytis, Brassicaceae) were under filter tents either exposed to (inclusion, +UV) or not exposed to (exclusion, -UV) UV-A / UV-B radiation. In greenhouses covered with new, innovative materials transmitting high (80%), medium (23%) or low (4%) levels of ambient solar UV-B radiation, in particular the influence of UV-B radiation on broccoli was examined. Plants respond highly specific to environmental stimuli such as UV-B radiation and herbivory. UV-B radiation has a strong impact on the plants’ architecture and flavonoid contents, which can in turn influence plant-insect interactions. Phloem-feeding aphids can be negatively affected by UV-B mediated plant changes. However, a direct effect of UV radiation on the behaviour of herbivores is also evident. Mainly the number, composition and quality of herbivorous species as well as an exceeding of a certain infestation threshold determine the mode of plant changes. In conclusion, UV-B radiation has the potential to harden plants against herbivores and simultaneously increases the concentrations of valuable secondary metabolites for human nutrition in important crop species such as broccoli. N2 - In ihrer natürlichen Umgebung sind Pflanzen verschiedensten und vor allem wechselnden Umwelteinflüssen ausgesetzt, auf die sie schnell und angemessen reagieren müssen. Das Insektenverhalten der nächsten trophischen Ebene wird direkt durch abiotische Umweltfaktoren, wie zum Beispiel Sonnenstrahlung, sowie durch daraus resultierende Veränderungen in Pflanzen gesteuert. Das Ziel dieser Untersuchung war es, herauszufinden, wie sich ultraviolette (UV) Strahlung auf Pflanzen und Pflanzen-Insekten Interaktionen auswirken kann. Dies wurde auf verschiedensten Ebenen untersucht. Mit Hilfe von speziell angefertigten Gewächshäusern konnten Brokkolipflanzen unter kontrollierten UV-B Bedingungen angezogen werden. Der Einfluss von UV-B Strahlung auf Brokkoli und von UV-B induzierten Effekten in Brokkoli auf phloem-fressende Blattläuse wurde erstmals untersucht. Die Experimente wurden mit Brokkolipflanzen (Brassica oleracea L. convar. botrytis, Brassicaceae) durchgeführt, die in Folienzelten mit unterschiedlicher UV-Strahlungsdurchlässigkeit exponiert wurden. Die Eindeckungen der Folienzelte waren entweder UV-A / UV-B durchlässig (+UV) oder undurchlässig (-UV). Gewächshäuser mit innovativen Eindeckungsmaterialien, die speziell UV-B in hohen (80%), mittleren (23%) oder geringen (4%) Mengen transmittierten, wurden genutzt, um den alleinigen Effekt von UV-B Strahlung auf Pflanzen hervorzuheben. Pflanzen reagieren auf verschiedene Umweltreize wie zum Beispiel UV-B Strahlung und Herbivorie sehr zielgerichtet. UV-B Strahlung hat einen starken Einfluss auf das Pflanzenwachstum und die Flavonoidgehalte, was wiederum Pflanzen-Insekten Interaktionen artspezifisch steuern kann. Phloem-fressende Herbivoren können durch UV-B-induzierte Pflanzenveränderungen negativ beeinflusst werden. Ein direkter UV-Effekt auf das Verhalten von Herbivoren ist jedoch ebenfalls erwiesen. Sowohl die Anzahl, Zusammensetzung und Qualität von Herbivorenarten also auch das Überschreiten einer definierten Befallsschwelle bestimmen das Ausmaß der Pflanzenveränderungen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass UV-B Strahlung Pflanzen gegenüber Fraßfeinden abhärten und gleichzeitig die Konzentration wertvoller pflanzlicher Inhaltsstoffe für die menschliche Ernährung in Feldfrüchten erhöhen kann. KW - ultraviolette Strahlung KW - Pflanzen KW - Insekten KW - chemische Ökologie KW - ultraviolette Strahlung KW - Pflanzen KW - Insekten KW - chemische Ökologie KW - ultraviolet radiation KW - plant KW - insect KW - chemical ecology Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39608 ER - TY - THES A1 - Arand, Katja T1 - Charakterisierung hydrophiler Permeationswege in der pflanzlichen Kutikula anhand der Permeationseigenschaften ionischer Aminosäuren T1 - Characterisation of the hydrophilic pathway in plant cuticles by means of permeation properties of hydrophilic, ionic amino acids. N2 - Um sich vor dem Austrocknen zu schützen, haben Pflanzen eine Transpirationsbarriere entwickelt, die als Membran alle primären, oberirdischen Pflanzenteile überzieht. Diese so genannte Kutikula besteht hauptsächlich aus den lipophilen Komponenten Kutin und Wachs und reduziert so effektiv den Verlust von Wasser und wasserlöslichen Nährstoffen aus dem Blattinneren. Trotzdem ist sie nicht vollständig undurchlässig, und so können Wasser und gelöste Substanzen wie organische und anorganische Nährstoffe, Pestizide oder Umweltchemikalien die Kutikula in beiden Richtungen permeieren. Dabei ist offensichtlich, dass die zu Grunde liegenden Transportmechanismen den Ernährungszustand der Pflanzen, die Effizienz von Pestiziden und die Wirkung von Umweltchemikalien beeinflussen. Ein genaues Verständnis der Transportprozesse auf denen die kutikuläre Permeation basiert, kann helfen die Wirkweise von blattapplizierten Dünge- und Pflanzenschutzmitteln zu optimieren, indem gezielt Wirk- oder Zusatzstoffe modelliert werden können, welche die Aufnahme steigern. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb der Einfluss physiko-chemischer Eigenschaften von hydrophilen Verbindungen auf die kutikuläre Permeation untersucht werden. Nicht zuletzt wegen ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit den blattapplizierten Herbiziden Glufosinat und Glyphosat wurden Aminosäuren als Modellsubstenzen ausgewählt. Die verwendeten Aminosäuren sind gut wasserlöslich, wobei alle Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten kleiner als 1 sind. Zusätzlich liegen alle Aminosäuren in gelöster Form als Ionen vor, was zu einer Hydratisierung der Moleküle führt. Es wird spekuliert, dass hydratisierte Moleküle keinen Zugang zur lipophilen Phase der Kutikula haben. Welche Rolle die Hydrathülle bei der Permeation tatsächlich spielt, ist allerdings noch unklar. Viele Aktivwirkstoffe liegen nur unter ganz bestimmten Bedingungen in geladener Form vor, während die Richtung der kontinuierlichen Nettoladung der Aminosäuren durch den pH Wert modifiziert wird. Damit kann der Einfluss verschiedener Ladungszustände auf die kutikuläre Permeation unter Verwendung eines einheitlichen Sets von Modellsubstanzen untersucht werden. Unter natürlichen Bedingungen sind Aminosäuren unter anderem auf Blattoberflächen zu finden, wo sie blattassoziierten Mikroorganismen eine profitable Nahrungsquelle bieten. Ob äußere Faktoren für die Deposition dieser Recourcen verantwortlich sind, oder ob der Ursprung innerhalb des Blattgewebes liegt, wird kontrovers diskutiert. Die Sorption von Aminosäuren in isolierte Kutikularmembranen ist sehr gering, und korreliert - anders als bei lipophilen Substanzen - nicht mit dem Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten. Das zeigt, dass der Verteilung von lipophilen und hydrophilen Substanzen innerhalb der Kutikula verschiedene Mechanismen zu Grunde liegen. Unter einer gegebenen Bedingung werden die kutikulären Leitwerte der Aminosäuren negativ vom Molvolumen beeinflusst. Zudem übersteigt die Länge des Permeationswegs die eigentliche Dicke der Membran um ein Vielfaches. Diese Zusammenhänge kennzeichnen eine gehinderte Diffusion innerhalb einer engporigen und weit verzweigten Umgebung. Eine Änderung des pH Wertes wirkt sich in unterschiedlicher Form auf die Leitwerte von Wasser und Aminosäuren aus. Mit steigendem pH Wert erhöht sich die Wasserpermeabilität isolierter Kutikularmembranen, was durch eine zunehmende, messbare Wassersorption in die Kutikula erklärt werden kann. Eine pH abhängige Dissoziation funktioneller Gruppen bewirkt eine Schwellung des polaren Weges, weshalb auch für die anionischen Aminosäuren bei pH 11 die höchsten Leitwerte gemessen wurden. Die zwitterionischen Aminosäuren bei pH 6 wiesen hingegen die geringsten Leitwerte auf, was im Widerspruch zu der Beobachtung steht, dass bei pH 1 die geringste Wassersorption in die Kutikula stattfindet. Eine Erklärung hierfür liefern die Hydrathüllen, die bei den zwitterionischen Aminosäuren am stärksten und bei den anionischen Species am geringsten ausgeprägt sind. Eine negative Korrelation aller gemessenen Aminosäureleitwerte mit den entsprechenden hydratisierten Molvolumen zeigt eindeutig, dass die Hydrathülle eine wichtige Größe für die Permeation durch die Kutikula darstellt. Dabei nimmt der Leitwert einer hydrophilen Substanz mit definiertem Molvolumen mit kleiner werdender Hydrathülle zu. Intakte Blätter wurden in flüssiges Wasser als Rezeptorlösung getaucht, um steady-state Bedingungen aufrecht zu erhalten. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Permeabilitäten von intakten Kutikularmembranen, die anhand der natürlichen Aminosäurekonzentration innerhalb der Blätter bestimmt wurden, in derselben Größenordnung liegen, wie die für isolierte Membranen gemessenen. Außerdem konnte ein Vergleich der Flussraten auf der Ober- und Unterseite der Blätter zeigen, dass die stomatären Poren nicht direkt in den Leachingprozess involviert sind. N2 - In order to overcome the risk of withering, all primary, aerial plant parts are bordered against the atmosphere with a transpiration barrier membrane, the so called cuticle. It is mainly composed of the lipophilic compounds cutin and waxes and therefore ensure an essentially reduction of uncontrolled loss of water and water soluble metabolites from plant tissues. Nevertheless, the cuticle is partially permeable for water and solutes like organic and inorganic nutrients, pesticides or environmental chemicals, and the flow can occur in both directions. It is obvious, that the basic transport processes are important for the survival of plants, agricultural success or environmental pollution. Therefore, the knowledge of the meachanisms, underlying cuticular permeation, can improve the effectiveness of foliar applied nutrients and pesticides, in the way of modelling ideal active ingredients or additives to enhance cuticular uptake. In the present study aminio acids were used as model compounds to understand the influence of the physico-chemical properties of hydrophilic solutes on cuticular permeability. This is not only because of their structural similarity to foliar applied herbicides like glyphosate and glufosinate. Amino acids are water soluble with octanol/water partition coefficients always smaller than 1 and they carry charges. The resulting hydration of the molecules renders them insoluble in the waxy layer of the cuticle and therefore the actual role of the associated hydration shell for cuticular permeation is still questionable. In contrast to many active ingredients, which are ionised only under certain conditions, the continuous net charge of amino acids is modified by pH. This provides an insight into the effect of anionic, zwitterionic and cationic properties on cuticular permeability by using the same set of solutes. Furthermore, amino acids are frequently found on leaf surfaces where leaf associated microorganisms benefit from their nutritional significance. It is still controversial, if amino acids originate from airborne particles or from the underlying leaf tissue. The sorption of amino acids into isolated cuticular membranes was very low and cuticle/water partition coefficients were not correlated to octanol/water partition coefficients, as is true for lipophilic solutes. This proves the existence of two different mechanisms for cuticular penetration of lipophilic and hydrophilic solutes. Under a given condition, permeances were determined by the molar volume of the amino acids and the pathway was much longer than the membrane thickness, which indicates a hindered diffusion in a porous and tortuous environment. Permeances for water and amino acids were affected by pH but in different ways. The water permeance increased with increasing pH which can be explained by a higher water sorption caused by dissociation of weak acidic groups within the cuticle above pH 6. Due to the maximum swelling of the pathway at pH 11 amino acid permeances were highest for the anionic form. Surprisingly, permeances were lowest for the zwitterionic species at intermediate pH and not for the cationic amino acids at pH 1 where the least water sorption occurs. The reason becomes obvious, when - next to the molar volume of the amino acids - the hydration shell is taken into account. Since the zwitterionic species at pH 6 possess the biggest and the anionic amino acids the smallest hydration shells, overall permeances are well correlated with the hydrated molar volume. Thus, it was shown that the hydration shell plays an important role in cuticular permeability in the way that smaller hydration shells favour an increase in permeances, given that the molar volume of the “naked” molecule remain constant. One exception was found for the amino acid permeability of isolated rose cuticles at pH 1. The fact, that under this condition, permeances are partially controlled by octanol/water partition coefficient shows clearly, that the lipophilic and the hydrophilic pathway are not strictly separated from each other. Amino acids with large lipophilic side chains can also benefit from partitioning within the lipophilic phase of the cuticle. It is still a matter of debate, if permeation experiments with isolated cuticular membranes reflect the real situation in intact plants, because isolation processes could alter cuticular properties. To proof the authority of this set up, additional leaching experiments were performed with intact leafs. It was shown that permeances of intact cuticles, which were driven by the natural amino acid content in the leaf tissue, are in deed in the same order of magnitude as for isolated cuticular membranes, when liquid water was used as receiver. Furthermore, a comparison between fluxes from the upper and the lower leaf side showed that stomatal pores are not directly involved into the leaching process. KW - Permeation KW - Aminosäuren KW - Kutikula KW - Efeu KW - pH-Wert KW - Rose KW - Hydrathülle KW - Amino acids KW - aqueous pathways KW - hydration KW - permeability KW - plant cuticle Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49954 ER - TY - THES A1 - Griebel, Thomas T1 - Local and systemic resistance in Arabidopsis thaliana in response to Pseudomonas syringae: impact of light and phytosterols T1 - Lokale und systemische Resistenzausbildung in Arabidopsis thaliana gegen Pseudomonas syringae: Der Einfluss von Licht und pflanzlichen Sterolen N2 - Inoculation with plant pathogens induces a diverse range of plant responses which potentially contribute to disease resistance or susceptibility. Plant responses occuring in consequence of pathogen infection include activation of classical defence pathways and changes in metabolic activity. The main defence route against hemibiotrophic bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae is based on the phytohormone salicylic acid (SA). SA-mediated responses are strictly regulated and have also been shown to depend on external factors, e.g. the presence of light. A major goal of this work was to provide a better understanding of the light dependency of plant defence responses mediated through SA. The second part of the project focussed on the influence of plant sterols on plant resistance. I analyzed leaf lipid composition and found that accumulation of the phytosterol stigmasterol in leaves and in isolated (plasma) membranes is a significant plant metabolic process occurring upon pathogen infection. N2 - Eine Infektion mit Pathogenen veranlasst Pflanzen zur Aktivierung zahlreicher Abwehrreaktionen, welche entscheidend dazu beitragen können, ob die Pflanze anfällig ist und erkrankt oder eine erfolgreiche Resistenz ausbilden kann. Die Abwehr gegen hemibiotrophe bakterielle Pathogene basiert vor allem auf der verstärkten Bildung des Pflanzenhormons Salicylsäure (SA) und der Aktivierung SA-vermittelter Abwehrreaktionen. Beides ist nicht nur intern genau reguliert, sondern auch von externen Faktoren beeinflusst. So trägt zum Beispiel die Verfügbarkeit von Licht wesentlich zum Ausmaß und zum Erfolg dieser Abwehrreaktionen bei. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, zu einem besseren Verständnis des Einflusses von Licht auf die Pathogenabwehr beizutragen. Das zweite Projekt dieser Arbeit stellt die Lipidzusammensetzung pathogen-infizierter Blätter in den Mittelpunkt. Bei der Analyse pflanzlicher Sterole zeigte sich unter anderem, dass das C22-ungesättigte Sterol Stigmasterol in Blättern und in daraus isolierten Plasmamembranen nach Pathogenbehandlungen akkumuliert. KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Resistenz KW - Licht KW - Phytosterine KW - Phytopathologie KW - Schmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - pflanzliche Sterole Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48370 ER - TY - THES A1 - Jeworutzki, Elena T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen zur frühen Erkennungsphase zwischen Pflanzen und Mikroorganismen T1 - Electrophysiological analyses of the early recognition phase between plants and microorganism N2 - An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molekülen, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten frühe Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der über die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunität in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der kürzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminosäuren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenflüssen in der Initiationsphase der basalen Immunität. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in höchstem Masse reproduzierbar und öffnen eine neue Sicht, über die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verzögerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abhängige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen können. Das um 2 Aminsäuren kürzere Peptid flg22 Δ2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) führten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungsänderungen in dem Arabidopsis Ökotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung für flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgeführt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abhängigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. Möglicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitfähigkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation benötigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 – eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist – fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zusätzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. Ähnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenströme von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgeführt, während in der externen Lösung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine Änderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkanäle blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkanäle die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von auswärtsgerichteten Kaliumkanälen folgt. Zukünftige Studien mit Doppelläufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen über die Natur der Ionenkanäle in der basalen Immunität oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. Über die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenströme in der basalen Immunität hinaus, ist natürlich der nächste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die für die Ionenkanäle oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden. N2 - The plant plasma membrane represents the first site for recognition of microbial patterns called MAMPs. MAMP receptors mediate early defense responses including production of reactive oxygen species (ROS), external alkalinisation or ethylene. The Arabidopsis FLS2 receptor-like kinase (RLK) represents a plasma-membrane localized MAMP receptor that provides for innate immunity in Arabidopsis thaliana plants by specifically recognizing the flagellum (flg) of Pseudomonas species. Flg22, the shortest active part of flagellin, composed by 22 aminoacids is the best established bacterial elicitor that. About the role of ion channels in innate immunity nothing was known yet. In the current work we show a strong involvement of ion fluxes in the initiating phase of innate immunity. Our measurements on intact Arabidopsis plants and plant tissues are highly reproducible and open a new view of ion channel functions in plant microbe interactions. In response to the application of flg22, after a delay of about 2 minutes, we recorded a transient, dose-dependent depolarization (EC50=0.2 nM) in mesophyll and root hair cells of A. thaliana. Following wash-out of the peptide elicitor and recovery of the membrane potential to resting potential values within 70 ± 9 min, depolarizations could be elicited several times. No membrane depolarization was evoked upon application of flg22Δ2, a truncated flg22 peptide, or by application of flagellin from other bacteria (Agrobacterium or Azospirillum). Likewise, depolarization was not observed in the natural knockout mutant of the Arabidopsis ecotype Ws-0 lacking the functional FLS2 receptor. Complementation of transgenic Ws-0 plants with the functional FLS2 receptor restored flg22 sensitivity, indicating that FLS2 is essential for flg22 evoked membrane potential changes. Similar results were obtained using the E. coli EF-Tu elicitor peptide elf18, which is recognized by the Arabidopsis MAMP receptor EFR. Aequorin based calcium measurements allowed us to record a transient increase in cytosolic calcium concentration in response to applied flg22. Dose-response studies revealed two distinct EC50 values for the calcium response of 43 ± 2 pM and 67 ± 42 nM respectively. This indicates that two different calcium pools or two different calcium permeabilities in the plasma membrane were activated by flg22. In line with a requirement of receptor-kinase activity for ion channel activation and subsequent depolarization, the latter was completely blocked by the kinase inhibitor K-252a. In bak1-4 Arabidopsis plants, lacking the FLS2 subunit BAK1 – a promiscuous RLK also associated with the brassinosteroid receptor - no depolarisation was measured in response to flg22. This indicated that both RLKs – FLS2 and BAK1 – are required for flagellin induced ion channel activation. Arabidopsis mesophyll cells showed the typical alkalinization of the apoplast in response to flg22. Noninvasive experiments with vibrating ion-selective electrodes revealed that this pH rise was due to an influx of protons. In addition an efflux of chloride and potassium was recorded. All fluxes were transient in nature, as was the observed calcium signal. Simultaneous measurements using two ion-selective electrodes showed a delay of the potassium efflux in comparison to the other ions that participate in the flg22 response. In the second approach, membrane potential measurements were performed while changing extracellular concentrations of protons, calcium, potassium or anions. Changing the anion gradient had the greatest impact on flg22 induced depolarization, suggestive of anion channel activation. Exudates analyses of flg22 treated leaves revealed that nitrate was the favored anion transported. Among many putative channel blocking agents tested, only lanthanum was identified to be potent in blocking the flg22 induced the cytosolic calcium rise, proton influx, and membrane potential depolarization. Since lanthanum represents a non-specific cation channel blocker, we favor to conclude that a calcium dependent activation of anion channels mediated membrane potential depolarization and consequently outward rectifying potassium channels. Future studies with double-barreled microelectrode voltage-clamp or external ion selective electrodes on intact guard cells may help to gain further information about the nature of ion channels in innate immunity or plant microbe interaction in general. Of course, all over the electrophysiological characterization of the multiple ion fluxes in innate immunity the next important step would be to discover the gene(s) coding for ion channels or transporters activated by non necrotic elicitors as flg22 in the innate immune response of plants. KW - Calcium KW - Induzierte Resistenz KW - Ackerschmalwand KW - Ionenkanal KW - Elektrophysiologie KW - Pseudomonas syringae KW - Membranpotenzial KW - Flagelline KW - Ionenkanäle KW - Anionen KW - Rezeptorkinasen KW - basale Immunität KW - Einstichmessungen KW - innate immunity KW - Calcium KW - Anion KW - ion channels KW - receptor kinases KW - flagellin KW - membrane potential KW - Pseudomonas syringae KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47489 ER - TY - THES A1 - Escalante Perez, Maria T1 - Poplar responses to biotic and abiotic stress T1 - Pappeln antworten auf biotischen und abiotischen Stress N2 - In this study poplar trees have been examined under different stress conditions. Apart from the detailed descriptions above two main conclusions might be drawn: i) A small plant like Arabidopsis thaliana is highly susceptible to stress situations that might become life-threatening compared to a tree that has extremely more biomass at its disposal. Such an organism might be able to compensate severe stress much longer than a smaller one. It seems therefore reasonable that a crop like Arabidopsis reacts earlier and faster to a massive threat. ii) In poplar both tested stress responses seemed to be regulated by hormones. The reactions to abiotic salt stress are mainly controlled by ABA, which also has a strong impact upon cold and drought stress situations. The term commonly used for ABA is “stress hormone” and is at least applicable to all abiotic stresses. In case of herbivory (biotic stress), jasmonic acid appears to be the key-player that coordinates the defence mechanism underlying extrafloral nectary and nectar production. Thus the presented work has gained a few more insights into the complex network of general stress induced processes of poplar trees. Future studies will help to understand the particular role of the intriguing indirect defence system of the extrafloral nectaries in more detail. N2 - In dieser Arbeit wurden Pappelbäume unter verschiedenen Stressbedingungen untersucht. Zusammenfassend und zusätzlich zu den obigen Beschreibungen lassen sich zwei Schlussfolgerungen ziehen: i.) Eine kleine Pflanze wie Arabidopsis ist viel empfindlicher für Stresssituationen, die möglicherweise lebensbedrohlich werden könnten, im Gegensatz zu einem Baum mit wesentlich grösserer Biomasse . Solch ein Organismus kann schwerwiegendem Stress viel länger kompensieren als ein kleinerer Organismus. Es erscheint daher sinnvoll, dass eine Pflanze wie Arabidopsis viel früher und schneller auf eine massive Bedrohung reagiert. ii.) In Pappeln scheinen beide untersuchten Arten von Stressreaktion durch Hormone reguliert zu werden. Die Reaktionen auf abiotischen Salzstress werden hauptsächlich durch ABA kontrolliert, welches auch einen starken Einfluss auf Kälte- und Trockenstressszenarien hat. Üblicherweise wird für ABA der Ausdruck "Stress-Hormon" verwendet, was zumindest für abiotischen Stress zutreffend ist. Im Fall von Herbivorie (biotischer Stress) scheint Jasmonsäure die Schlüsselrolle zu spielen, die die Abwehrmechanismen koordiniert, die den extrafloralen Nektarien und der Nektarproduktion zu Grunde liegt. Demzufolge hat die vorliegende Arbeit ein paar neue Einsichten in das komplexe Netzwerk der Stress-induzierten Prozesse der Pappel ermöglicht. Zukünftige Studien werden dazu beitragen die besondere Rolle des faszinierendem indirektem Abwehrmechanismus der extrafloralen Nektarien en detail zu verstehen. KW - abiotic stress KW - biotic stress KW - ABA KW - nectaries KW - defence KW - plant KW - volatiles KW - nectar KW - abiotische stress KW - biotische stress KW - ABA KW - nektarien KW - pflanze KW - volatiles KW - nektar KW - schutz KW - abiotic stress KW - biotic stress KW - ABA KW - nectaries KW - defence KW - plant KW - volatiles KW - nectar Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46893 ER - TY - THES A1 - Attaran, Elham T1 - Regulation of pathogen-inducible volatile compounds in Arabidopsis and their role in plant defense N2 - Plants are constantly attacked by pathogenic microbes. As a result, they have evolved a plethora of constitutive and inducible defense responses to defend against attempted pathogen infection. Although volatile organic compounds have been implicated in plant defense, direct evidence of their function in plant resistance is still lacking. I have examined the role of VOCs in Arabidopsis defense against the hemibiotrophic bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. maculicola. The obtained results show that the vegetative parts of Arabidopsis produces and emits the volatile phenylpropanoid MeSA and three kinds of terpenoids, (E,E)-4,8,12-trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraene (TMTT), alpha-ionon and beta-farnesen, upon avirulent and virulent P. syringae inoculation. Whereas the most abundant volatiles, MeSA and TMTT, are already produced at early stages of infection in the compatible and incompatible interaction, enhanced emission of alpha-ionon and beta-farnesen can only be detected in later stages of the compatible interaction. It was revealed that pathogen-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis requires the JA signaling pathway but occurs independently of SA defense signaling. Similarly, the production of MeSA is dependent on JA signaling but not on the SA defense signaling pathway. Furthermore, production of MeSA is dependent on the function of ISOCHORISMATE SYNTHASE1, which produces its precursor SA. Upon inoculation with avirulent P. syringae, endogenously produced JA activates the JA signalling pathway to mediate MeSA and TMTT synthesis. By contrast, in the compatible Arabidopsis-Psm interaction, production of MeSA predominantly depends on the P. syringea the virulence factor coronatine, which activates JA downstream signaling. To learn more about the role of inducible VOCs in plant defense responses, I have identified an Arabidopsis T-DNA insertions line with a defect in the TERPENE SYNTHASE4 (TPS4) gene. Emission profiles from this mutant revealed that the induced production of TMTT but not of alpha-ionone, beta-farnesene or MeSA are abolished, demonstrating that TPS4 specifically regulates the P. syringae-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis. The lack of TMTT in tps4 mutants, however, does not affect plant defense responses and resistance induction against P. syringae. This excludes a role of the terpenoid as an effective phytoalexin in Arabidopsis leaves against the bacterial pathogen. Moreover, tps4 mutant plants are still able to mount a SAR response, excluding a signaling function of TMTT during SAR. An important aim of our studies was to address the defensive role of MeSA, the major VOC emitted from P. syringae-inoculated Arabidopsis leaves. MeSA has been recently proposed as a critical long distance signal in the development of SAR. I found that two independent T-DNA insertions lines with defects in expression of the pathogen-inducible SA methyl transferase gene BSMT1 are completely devoid of pathogen-induced production of MeSA. However, bsmt1 mutant plants are capable to increase the level of SA in systemic, non-infected leaves of Arabodopsis and develop SAR like wild-type plants upon local P. syringae-inoculation. Thus, MeSA does not function as a critical SAR signal in Arabidopsis. Further experiments showed that SA accumulation in distant leaves occurs due to de novo synthesis through isochorismate synthase. In addition, we also ruled out a critical defensive role of MeSA at inoculation sites, because bsmt1 mutants are able to build up SA-dependent defense responses and local resistance in a wild-type-like manner. The conversion of SA to MeSA and subsequently emission of MeSA from the plant might help the plant to detoxify an excess of SA. This process is regulated by the JA pathway and might be one means to mediate negative crosstalk between JA and SA signaling. Moreover, the COR-triggered conversion of SA to MeSA and emission of the volatile methyl ester could be a way by which virulent P. syringae is able to attenuate the SA-defense pathway. N2 - Pflanzen sind einer ständigen Bedrohung durch phytopathogene Mikroorganismen ausgesetzt und haben deshalb eine Vielzahl von konstitutiven und induzierbaren Abwehrstrategien entwickelt. Die Phytohormone Salicylsäure (SA), Jasmonsäure (JA) und Ethylen sind zum Beispiel entscheidende Regulatoren von induzierten Abwehrmechanismen. Eine Antwort der Pflanze auf mikrobielle Angriffe beinhaltet auch die Emission volatiler organischer Verbindungen (volatile organic compounds - VOCs). Antimikrobielle Wirkungen von VOCs wurden bisher jedoch nur in in-vitro-Assay beobachtet. Ein direkter Beweis für eine mögliche Rolle der VOCs in der Pflanzenabwehr wurde bisher nicht erbracht. Die Rolle pflanzlicher VOCs und deren Bedeutung für die Pathogenabwehr im Modellsystems Arabidopsis thaliana – Pseudomonas syringae ist das zentrale Element dieser Arbeit. Zunächst wurden Terpenoide, die die größte Gruppe der VOCs bilden, untersucht. Vegetative Teile von Arabidopsis emittieren nach Inokulation mit virulenten und avirulenten Stämmen von P. syringae pv. maculicola (Psm) vor allem drei Terpene: das Homoterpen (E,E)-4,8,12-Trimethyl-1,3,7,11-tridecatetraen (TMTT), alpha-Ionon und beta-Farnesen, welches zur Gruppe der Sesquiterpene gehört. Als Hauptkomponente des pathogen-induzierten VOC-Profils wurde das Phenylpropansäurederivat Methylsalicylsäure (MeSA) identifiziert. Um einen besseren Einblick in die Rolle der VOCs in der Pflanzenabwehr zu erhalten, wurden Arabidopsis T-DNA-Insertionslinien des Terpensynthase-gens TPS4 isoliert. Die Emissionsmuster zeigten, dass die induzierbare Freisetzung von TMTT, aber nicht von alpha-Ionon und beta-Farnesen oder MeSA reduziert war. Dies zeigt, dass TPS4 spezifisch die Psm-induzierte TMTT-Synthese in A. thaliana reguliert. Die verringerte Menge TMTT in den tps4-Mutanten hat jedoch keinen Einfluss auf die pflanzlichen Abwehrreaktionen und die Resistenzinduktion gegen P. syringae, was eine Rolle von TMTT als effektives Phytoalexin in A. thaliana gegen bakterielle Pathogene ausschließt. Ebenso hat TMTT keine Signalfunktion bei der Ausbildung der Systemisch erworbenen Resistenz (SAR), da tps4-Mutanten weiterhin in der Lage sind eine SAR-Antwort zu induzieren (Attaran et al. 2008). Als weiteres Teilprojekt wurde die Regulation von pathogen-induzierten VOCs in A. thaliana untersucht. Viele induzierte Abwehrmechanismen beinhalten Signaltransduktionsnetzwerke an denen Salicyl- oder Jasmonsäure beteiligt sind. Mit A. thaliana-Mutanten, die in der SA- oder JA- Synthese oder den jeweiligen Signalwegen beeinträchtigt sind, konnte gezeigt werden, dass die pathogen-induzierte TMTT-Produktion in A. thaliana über den JA-Signalweg, aber unabhängig von Salicylsäure verläuft. Auch die MeSA-Produktion ist JA-abhängig. Für die Biosynthese von SA, genauso wie für deren Derivat MeSA, wird ISOCHORISMAT SYNTHASE1 benötigt, die den MeSA-Vorläufer SA bildet. Im Rahmen einer inkompatiblen Interaktion wird die Bildung von MeSA in Abhängigkeit von der JA-Biosynthese gesteuert. Im Gegensatz dazu ist in der kompatiblen Interaktion die MeSA-Produktion vom bakteriellen Virulenzfaktor Coronatin abhängig. Coronatin-defiziente Stämme von P. syringae sind nicht fähig, eine MeSA-Emission zu induzieren (Attaran et al., 2009). Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit die Rolle von MeSA in der Pflanzenabwehr untersucht. MeSA ist das VOC, welches von P. syringae-inokulierten A. thaliana-Blättern vorwiegend abgegeben wird. Kürzlich wurde für MeSA eine Signaleigenschaft als Langstreckensignal in der Etablierung der SAR postuliert (Park et al., 2007). Wir konnten zeigen, dass T-DNA Insertionslinien, bei denen keine Expression der pathogeninduzierten SA-Methyltransferase BSMT1 nachgewiesen werden konnte und die somit keine pathogen-induzierte MeSA-Produktion aufwiesen, auch in systemischen, nicht infizierten Blättern nach P. syringae-Inokulation einen erhöhten SA-Spiegel, eine verstärte Expression von Abwehrgenen und eine erhöhte Pathogenresistenz aufwiesen. Diese Mutantenlinien können also die SAR genauso und in demselben Maß wie Wildtyp-Pflanzen entwickeln. Damit konnte gezeigt werden, dass MeSA nicht als zentrales Signal für die Ausbildung der SAR in Arabidopsis wirken kann. Weitere Experimente machten deutlich, dass die SA-Akkumulation in distalen Blättern auf eine de-novo-Synthese durch die Isochorismat-Synthase zurückzuführen ist. Schließlich konnte auch eine wichtige Rolle von MeSA in der Pflanzenabwehr an den Infektionsstellen ausgeschlossen werden, da bsmt1-Mutanten SA-abhängige Abwehrreaktionen und lokale Resistenzantworten in gleicher Weise wie Wildtyp-Pflanzen zeigen (Attaran et al., 2009). Produktion und anschließende Emission von MeSA könnte daher in der Pflanze dazu beitragen, einen toxischen Überschuss an SA abzubauen. Reguliert wird dieser Prozess durch den JA-Signalweg, der dadurch einen negativen Einfluss auf den SAHaushalt der Pflanze innehat. Die Auslösung der MeSA-Produktion von dem bakteriellen Virulenzfaktor COR in der kompatiblen Wechselwirkung könnte eine Strategie von P. syringae sein, die Effizienz der SA-basierenden Abwehr zu verzögern. KW - Ackerschmalwand KW - Pathogener Mikroorganismus KW - Abwehrreaktion KW - VOC <Ökologische Chemie> KW - Volatiler oraganischer Verbindungen KW - Abwehrmechanismen KW - Systemisch erworbenen Resistenz KW - Volatiole Compounds KW - disease resistance KW - Systemic acquired resistance Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46715 ER - TY - THES A1 - Weidauer, Stella Elisabeth T1 - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Knochenwachstums-Modulators Sclerostin T1 - Structural and functional characterization of the bone-modulator protein sclerostin N2 - Die Knochenhomöostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. Während die Osteoblasten für den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorgänge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine Störung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose führen. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen über zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein“-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signalübertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Deren Aktivierung führt zu einem intrazellulären Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellulär, membranständig und intrazellulär reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellulären Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugehörigkeit zur DAN-Familie zunächst fälschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors“ gehören. Über den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufklärung mittels NMR-Spektroskopie ergab für Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop“-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und ähneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verläuft („Loop“), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente ermöglichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann für die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivität neutralisierende Antikörper AbD09097, hochinteressante Ansätze für neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen. N2 - Different cell types like osteoblasts, osteoclasts and osteocytes maintain bone homeostasis. While osteoblasts build up bone, osteoclasts resorb bone tissue and both actions are tightly regulated by the osteocytes. Imbalance between bone formation and resorption will lead to various bone diseases, e.g. osteoporosis. On a molecular level communication between these cell types occurs through two major signalling pathways, i.e. the bone morphogenetic proteins (BMPs) and the Wnt-factors. In both pathways signal transduction is induced by secreted factors, which bind to cell surface receptors. This activation leads to an intracellular signal that finally regulates expression of target genes. Both pathways are tightly regulated at various cellular levels, extracellular, at the membrane as well as intracellular. Sclerostin, which was identified in 2003, is a member of the extracellular modulator proteins. Initially it was wrongly classified as a direct inhibitor of the BMP-signalling pathway due to its classification as a member of the DAN-family. Meanwhile it became apparent that sclerostin targets the Wnt-pathway by binding to the Wnt co-receptors LRP5 and LRP6, which belong to the family of low-density lipoprotein receptors. At the beginning of this work very little was known about the molecular mechanism how sclerostin inhibits the Wnt-pathway. The structure analysis of sclerostin employing NMR-spectroscopy revealed in a modular architecture, which can be divided into three regions: the central, characteristic cystine knot, the loop-region and the two fingers. From the cystine knot three loops emanate in two opposite directions. Loop one and loop three form defined ß-sheet structures resembling two fingers of a hand. Loop two, which runs into the opposite direction, is unstructured and highly flexible like the long N- and C-termini. Antibody fab-fragments, which were generated in collaboration with AbD-Serotec, facilitated the mapping of the binding-epitop of sclerostin to LRP5/6, highlighting an extended area of the unstructured loop region of sclerostin as the LRP5/6 binding site. The high-resolution structure of sclerostin and the identification of the LRP5-binding-epitop yield first insights into the molecular mechanism of sclerostin-LRP5 interaction. This knowledge can now be used to develop small-molecule inhibitors by rational drug design, which are, like the sclerostin activity neutralising fab-fragment AbD09097, highly interesting targets for new bone-anabolic therapies of diseases characterised by bone loss. KW - Cytokine KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Wnt-Proteine KW - Transforming Growth Factor beta KW - Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie KW - Struktur-Aktivitäts-B KW - LRP5/6 KW - DAN-Modulatorproteine KW - Cystinknotenprotein KW - Knochenhomöostase KW - LRP5/6 KW - DAN modulator proteins KW - cystin knot protein KW - bone homeostasis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46224 ER - TY - THES A1 - Levchenko, Victor T1 - Studies of CA 2+ -signaling and CL-conductance changes in response to abscisic acid, voltage changes and cold, in the plasma membrane of guard cells N2 - Land plants must control the transpiration water stream and balance it with carbon dioxide uptake for optimal photosynthesis. A highly specialized type of plant cell called guard cells have evolutionary appeared which are suited for this complicated purpose. Guard cells are located by pairs on aerated plant surface and form stomata – structural units, which represent highly regulated “watergate” (Roelfsema and Hedrich, 2005). Guard cells sense many environmental and internal plant-derived stimuli and by changing degree of their swelling tightly regulate diffusion of water vapor and other gases. Cell processes taking place in stomata during their movements had been a subject of intensive investigation for more than three decades (Schroeder et al., 2001; Assmann and Shimazaki, 1999). With use of electrophysiological technique the basic processes underlying stomatal movements were described (Thiel et al., 1992; Dietrich et. al., 2001; Roelfsema and Hedrich, 2005). Another set of questions arised between plant biologists is how the signals affecting stomatal aperture are transduced in guard cells starting from perception by receptor structures and ending on the osmodynamic motor components. Introduction of fluorescent microspectroscopy technique allowed to characterize some Ca2+ and H+-based signaling events, taking place in the cytoplasm during stomata function. Most of the processes, taking place in stomata were characterized in guard cell preparations, such as strips of isolated leaf epidermis or guard cell protoplasts, - cells with enzymaticaly digested cell walls. Some experimental observations although point that reactions of guard cells located in their natural environment, leaves of intact plants can differ from those could be registered in preparations. These deviations might be explained by the modulation of guard cell function by apoplastic factors originating from surrounding tissues like mesophyll or leaf epidermis (Roelfsema and Hedrich, 2002). On the other hand registration of physiological responses in prepared tissues may also contain possible artifacts, related to the preparation procedures. The aim of the experimental work presented here was to investigate the cell signaling events, taking place in guard cells upon plant stress hormone abscisic acid (ABA) and some other stimuli action. Abscisic acid is a compound that synthesized in plant roots upon drought and closes stomata in the leaf to prevent the plant organism from excessive water loss. Previous studies on guard cell of isolated epidermis and guard cell protoplasts showed, that ABA induces stomatal closure via activation of plasma membrane anion channels (Grabov et al., 1997; Pei et al, 1997). Anion channels are known to be activated by elevated 2 concentrations of cytoplasmic Ca2+ [Ca2+]cyt (Schroeder and Hagiwara, 1989; Hedrich et al., 1990). Application of Ca2+-sensitive fluorescent probes revealed [Ca2+]cyt increases in guard cells upon ABA action (McAinsh et al., 1990). This observation led to suggestion that [Ca2+]cyt directly participate in the transduction of ABA signal in guard cells. Although no direct evidences for co-occurrence of [Ca2+]cyt rises and following activation of anion channels upon ABA action was not presented until yet. Results of experimental work performed on intact Vicia faba, Commelina communis and Nicotiana plumbagnifolia plants showed that guard cells of intact plant leaves respond with transient activation of plasma membrane anion channels upon perception of ABA. Kinetics of the response is highly reproducible and seemed to be conserved between species. Although despite clear generation of anion current transients, no [Ca2+]cyt increases could be recorded with using fluorescent probe Fura-2 microinjected into the cytoplasm. Together with results of later study on intact Nicotiana tabacum guard cells, reported obligatory [Ca2+]cyt increases which were desynchronized with anion current transients (Marten et al., 2007b) this, may indicate that [Ca2+]cyt increases are not necessary component of ABA signal transduction pathway. Together with absence of the effect of cytoplasm-delivered Ca2+- mobilizing agents IP3, IP6 and NAADP on anion currents these data may suppose that role of [Ca2+]cyt in ABA signaling must be reassessed. Further interest represented characterization of [Ca2+]cyt signaling and homeostasis in intact guard cells comparing with those in prepared cells. Experiments revealed strong deviations in [Ca2+]cyt behavior between different measuring systems. While guard cells of intact plants were able to strictly maintain [Ca2+]cyt level upon experimental shifting of [Ca2+]cyt level in either direction of elevation or decrease, cells of isolated epidermis showed complete absence of such ability. Guard cell protoplasts showed even weaker [Ca2+]cyt regulation ability and were capable of low physiological [Ca2+]cyt levels maintaining only at depolarized membrane potentials. Apart to these differences, prepared guard cells showed also for-time less activation of anion currents by experimentally imposed [Ca2+]cyt increases. These data strongly suggest that registered in guard cell preparations [Ca2+]cyt signals may contain significant part of artifacts and must be carefully used for the building of models of guard cells signaling. Further experimental investigations are strongly required for understanding guard cell functioning, especially with relation of vacuoles participation. The experimental work was done by the author in the period from october 2001 until november 2004 under supervision of Professor Dr. Rainer Hedrich in laboratory of molecular plant physiology and biophysics at Julius-Maximillians University of Würzburg, Würz3 burg, Federal Republic of Germany. Scientific coordinator of the Ph. D. project is Dr. Max Robert Gustaaf Roelfsema, University of Würzburg. Most of experimental results, presented here (chapter III) are also published elsewhere (Roelfsema et al., 2004; Langer et al., 2004; Levchenko et al., 2005, 2008). Chapter I intend to shortly introduce the reader into the field of guard cell research and point out the current level of understanding regarding this branch of plant research. Special attention is given to description of guard cell ion channels, their function and regulation, including the mechanisms of Ca2+-, H+- and phosphorylation-based signaling. This section is preceded by a short history of guard cell research and explains the actuality of presented work. In chapter II experimental techniques, methods and data processing approaches, used in the presented work are described. Technique used for electrophysiological registrations on intact plant leaves were used before and described in more details by Roelfsema et al. (2001). Fluorescent microspectroscopy technique was for the first time applied to intact plant leaves in this work and described in more details including calibration of Fura-2 based measurements. Chapter III presents the major results of the experimental work. In chapter IV the experimental results are discussed and put into context with current knowledge of guard cell function knowledge. Finally, remarks on perspectives of guard cell signaling research are drawn. N2 - Landpflanzen sind in der Lage ihren Transpirationsfluss durch das Xylem zu regulieren und so den Wasserverlust mit dem Kohlendioxidbedarf der Photosynthese abzugleichen. Zu diesem Zweck haben sich im Laufe der Evolution Schließzellen entwickelt, welche in der Lage sind, diese komplizierte Aufgabe zu erfüllen. Schließzellen befinden sich auf Oberflächen oberirdischer Pflanzenorgane, wo sie als Paar eine Pore, dem sogenannten Stoma bilden. Schließzellen sind in der Lage mehrere Signale aus der Umwelt und von benachbarten Pflanzen wahrzunehmen. Anhand dieser Signale wird die Porenöffnung durch Änderungen des Schwellungsgrads der beiden Schließzellen genau reguliert. Die intrazellulären Prozesse die während der Stomabewegungen in den Schließzellen stattfinden sind bereits seit Jahrhunderten ein intensiv bearbeitetes Forschungsgebiet. Mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken konnten bereits einige für die Stomabewegung grundlegende Prozesse beschrieben worden. Trotzdem sind immer noch viele Fragen offen. Dazu zählen vor allem die Mechanismen, die zur Wahrnehmung verschiedener Signale der Regulierung des osmotischen Motors in Schließzellen führt. Die meisten Studien zur Signalweiterleitung wurden mit isolierten Schließzellpräparationen durchgeführt, wie z.B. Epidermisstreifen oder Schließzellprotoplasten. Obwohl einige Schließzell-spezifische Eigenschaften in diesen Präparationen erhalten bleiben, deuteten kürzlich experimentelle Ergebnisse auf Unterschiede zwischen Antworten isolierter Schließzellen und denen intakter Pflanzen hin. Diese Unterschiede könnten durch die von Mesophyll- oder Epidermiszellen freigesetzte apoplastische Faktoren bedingt sein. Das Ziel der experimentellen Arbeiten dieser Dissertation war die Charakterisierung des Schließzellsignalweges ausgehend vom pflanzlichen Stresshormon Abscisinsäure (ABA). ABA wird in der Wurzel bei Trockenstress synthetisiert und bewirkt den Stomaschluss, um übermäßigen Wasserverlust zu unterbinden. Bisherige Studien mit isolierten Schließzellen ergaben, dass ABA die Aktivität der Plasmamembran-ständigen Anionenkanäle erhöht. In diesem Zusammenhang wurde postuliert, dass eine Aktivierung des ABAabhängigen Anionenkanals durch eine Erhöhung der zytosolischen Ca2+ Konzentration ([Ca2+]zyt) ausgelöst wird. Anionkanäle werden durch Ca2+ stimuliert und ABA bewirkt eine Erhöhung der [Ca2+]zyt. Die Resultate dieser Arbeit mit Vicia faba, Commelina communis und Nicotiana plumbagnifolia haben gezeigt, dass Schließzellen in intakten Blättern mit einer transienten Aktivierung der Plasmamembran-ständigen Anionenkanäle auf ABA reagieren. Die sehr typische 5 Aktivierungskinetik dieser ABA-Antwort scheint evolutionär gut konserviert zu sein. Obwohl ABA große Anionenströme in Vicia faba Schließzellen auslösen konnte, wurden keine Änderungen der [Ca2+]zyt mit dem Ca2+-Fluoreszenzindikator Fura-2 aufgezeichnet. Diese Resultate zeigen, dass zumindest in Vicia faba Schließzellen, eine Erhöhung der [Ca2+]zyt keine essentielle Komponente des ABA-Signalweges ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass vor allem die Rolle der [Ca2+]zyt im ABA-Signalwege neu bewertet werden muss. Vor allem mit dem Unfähigkeit in Kombination mit den drei tierischen Ca2+-mobilisierenden Signalstoffen, IP3, IP6 and NAADP, die Anionenkanalaktivität zu beeinflussen. In einem weiteren Experiment, wurden Ca2+-abhängige Signalmechanismen und die Ca2+–Homöostase in Schließzellen zwischen isolierten Zellen mit denen in intakten Pflanzen verglichen. Schließzellen in intakten Pflanzen waren in der Lage, die [Ca2+]zyt unabhängig von Änderungen des Plasmamembranpotentials auf ein konstantes Niveau zu halten, während Schließzellen in isolierten Epidermisstreifen diese Fähigkeit verloren hatten. In Präparationen mit Epidermisstreifen löste eine Hyperpolarisierung des Membranpotentials einen dauerhaften Anstieg der [Ca2+]zyt aus. In Schließzellprotoplasten war das Vermögen, die [Ca2+]zyt zu regulieren, noch stärker eingeschränkt. Diese Zellen konnten nur bei depolarisierenden Membranpotentialen eine stabile [Ca2+]zyt halten. Darüber hinaus war auch das Vermögen von ABA, die Anionenkanalaktivität zu erhöhen bei Schließzellen in Epidermisstreifen stark begrenzt. Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse legen nahe, dass die bisher gemessenen [Ca2+]zyt-Signale an isolierten Schließzellen mit Fehlern behaftet sind. Die Isolierungsprozedur beeinflusst die Eigenschaften der Schließzellen und Daten aus solchen Präparationen sollten deswegen sorgfältiger bei der Entwicklung von Modellen zu Schließzellsignalwegen betrachtet werden. Einer Neubewertung der Rolle des [Ca2+]cyt wird voraussichtlich auf die Beteiligung neuartiger Komponenten des ABA Signalwegs hinweisen. Eine dieser Komponenten könnte die Vakuole der Schließzellen sein. „Tracer-Flux“ Experimente mit radioaktiven Isotopen und Patch-Clamp Studien an isolierten Vakuolen deuteten bereits auf eine wichtige Rolle der Vakuole bei der Regulierung der Schließzellbewegungen hin. Zukünftige Studien an intakten Schließzellen sind notwendig um diese Funktion in weiteren Details aufzuklären KW - Schließzelle KW - Abscisinsäure KW - Cytoplasma KW - Abscisic Acid KW - Guard Cell KW - Cytoplasmic Ca"+ KW - Vicia Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45309 ER - TY - THES A1 - Bonfig, Katharina Barbara T1 - Untersuchungen zur Rolle des Kohlenhydratmetabolismus während Pflanze-Pathogen-Interaktionen und der Keimlingsentwicklung T1 - Studies on the role of carbohydrate metabolism during plant-pathogen-interactions and seedling development N2 - Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung. N2 - Invertases are key metabolic enzymes in carbohydrate partitioning which may also play an important role during pathogen infection. In this study, the regulation of different metabolic pathways in Arabidopsis thaliana plants after infection by a virulent and an avirulent strain of Pseudomonas syringae was investigated. With help of chlorophyll fluorescence imaging spatio-temporal changes in photosynthesis were monitored. The monitored chlorophyll fluorescence parameters were showing differential regulation. The effects were restricted to the vicinity of the infection site and did not spread to uninfected areas of the leaf. Qualitatively similar changes in photosynthetic parameters were observed in both interactions. Major differences between the responses to both strains were evident in the onset and time course of changes. Changes could be detected by chlorophyll fluorescence imaging before symptoms were visible by eye. In contrast to photosynthesis, the regulation of marker genes for source/sink relations and the activities of invertase isoenzymes showed qualitative differences between both interactions. Inoculation of the virulent but not the avirulent strain resulted in downregulation of photosynthetic genes and upregulation of vacuolar invertases. The activity of vacuolar invertases transiently increased upon infection with the virulent strain but decreased with the avirulent strain while extracellular invertase activity was downregulated in both interactions. As an advanced tool for the characterization of the interaction between A. thaliana and P. syringae bacteria expressing the green fluorescing protein were generated. Invertases are regulated on transcriptional and posttranscriptional level. To understand the function of invertases in plant-pathogen-interactions, the regulation of endogenous proteinaceous invertase inhibitors was investigated. According to expression profiling the analysis of reporter gene lines and Northern Blot analyses revealed a strong expression of invertase inhibitors in source leaves of A. thaliana. After application of biotic and abiotic stress factors this expression was completely repressed. Indirect determination of invertase inhibitor activity by measurement of invertase activity in mixed extracts revealed a complete repression of inhibitor activity after pathogen infection. In functional approaches transgenic plants were generated, expressing invertase inhibitor proteins under control of inducible promoters. However, no effect of the induction of inhibitor expression on the sensitivity to different pathogens could be observed so far. In a pharmacological approach acarbose war used as an invertase inhibitor. Simultaneous treatment of plants with acarbose and bacteria revealed an increased sensitivity of the plant towards the bacterial infection and a stronger repression of chlorophyll fluorescence parameters compared to plants treated with bacteria alone. No effects on photosynthesis, carbohydrate metabolism and defence could be observed on transcriptional level. A tendency of lowered invertase activity could be observed after treatment with acarbose and bacteria compared to bacterial treatment alone. Acarbose treatment enhanced the levels of salicylic acid independent of bacterial infection. The acarbose-mediated increase in sensitivity was also detectable in sid2 and cpr6 mutants indicating that the effect of acarbose is independent of the salicylic acid mediated defence pathway. Invertases are important enzymes in higher plants, which are involved in regulating developmental processes and responses to external factors. In a functional approach the role of invertases was investigated using transgenic plants ectopically expressing inhibitor proteins to decrease invertase activity. For generating specific effects, these inhibitor proteins were expressed in A. thaliana under the control of synthetic promoters consisting of tetramers of pathogeninducible elements, which were reported to yield low constitutive expression. Unexpectedly, seedling growth of putative transgenic plants was arrested at the four-leaf stage. Analysis of ß-glucuronidase activity of corresponding reporter gene lines showed a correlation of the growth arrest with high activity of these promoters in seedlings grown under tissue culture conditions. The negative effect of invertase inhibition on seedling growth was substantiated by transgenic tobacco plants expressing an invertase inhibitor under control of a tetracycline inducible promoter. Ectopic induction of the invertase inhibitor during early seedling development resulted in a reduced fresh weight of seedlings. Expression profiling and Northern Blot analyses further supported the importance of invertase in Arabidopsis thaliana seedling development. Different invertases were specifically and strongly expressed. These complementing results show that invertase activity is required for normal seedling development. KW - Invertase KW - Invertaseinhibitor KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - invertase KW - invertase inhibitor KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32488 ER - TY - THES A1 - Pimentel Elardo, Sheila Marie T1 - Novel anti-infective secondary metabolites and biosynthetic gene clusters from actinomycetes associated with marine sponges T1 - Neue anti-infektive Sekundärmetabolite und biosynthetische Gencluster aus mit marinen Schwämmen assoziierten Actinomyceten N2 - Marine sponges (Porifera) harbor diverse microbial communities within their mesohyl, among them representatives of the phylum Actinobacteria, commonly known as actinomycetes. Actinomycetes are prolific producers of pharmacologically important compounds and are responsible for producing the majority of antibiotics. The main aim of this Ph.D. study was to investigate the metabolic potential of the sponge-associated actinomycetes to produce novel anti-infective agents. The first aim was to cultivate actinomycetes derived from different marine sponges. 16S rDNA sequencing revealed that the strains belonged to diverse actinomycete genera such as Gordonia, Isoptericola, Micromonospora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora and Streptomyces. Phylogenetic analyses and polyphasic characterization further revealed that two of these strains represent new species, namely Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T (Pimentel-Elardo et al. 2008a) and Streptomyces axinellae strain Pol001T (Pimentel-Elardo et al. 2008b). Furthermore, secondary metabolite production of the actinomycete strains was investigated. The metabolites were isolated using a bioassay-guided purification scheme followed by structure elucidation using spectroscopic methods and subjected to an elaborate anti-infective screening panel. Several interesting compounds were isolated namely, the novel polyketides cebulactam A1 and A2 (Pimentel-Elardo et al. 2008c), a family of tetromycin compounds including novel derivatives, cyclodepsipeptide valinomycin, indolocarbazole staurosporine, diketopiperazine cycloisoleucylprolyl and butenolide. These compounds exhibited significant anti-parasitic as well as protease inhibitory activities. The third aim of this Ph.D. study was to identify biosynthetic gene clusters encoding for nonribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS) present in the actinomycete strains. Genomic library construction and sequencing revealed insights into the metabolic potential and biosynthetic pathways of selected strains. An interesting NRPS system detected in Streptomyces sp. strain Aer003 was found to be widely distributed in several sponge species, in an ascidian and in seawater and is postulated to encode for a large peptide molecule. Sequencing of the PKS gene cluster of Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T allowed the prediction of the cebulactam biosynthetic pathway which utilizes 3-amino-5-hydroxybenzoic acid as the starter unit followed by successive condensation steps involving methylmalonyl extender units and auxiliary domains responsible for the polyketide assembly. In conclusion, this Ph.D. study has shown that diverse actinomycete genera are associated with marine sponges. The strains, two of them novel species, produced diverse chemical structures with interesting anti-infective properties. Lastly, the presence of biosynthetic gene clusters identified in this study substantiates the biosynthetic potential of actinomycetes to produce exploitable natural products and hopefully provides a sustainable supply of anti-infective compounds. N2 - Zahlreiche marine Schwämme (Phylum: Porifera) beherbergen eine phylogenetisch diverse mikrobielle Gemeinschaft in der Mesohyl-Matrix, darunter auch viele Vertreter des bakteriellen Phylums Actinobacteria, die umgangssprachlich als Actinomyceten bekannt sind. Actinomyceten sind wichtige Produzenten vieler Antibiotika und von weiteren pharmazeutisch relevanten Substanzen. Das Hauptziel dieser Promotionsarbeit war die Untersuchung des Potentials Schwamm-assoziierter Actinomyceten zur Produktion neuer Infektions-hemmender Substanzen. Ein erstes Ziel dieser Doktorarbeit war die Kultivierung von Actinomyceten aus verschiedenen marinen Schwammarten. Die Sequenzierung der respektiven 16S rRNA Gene zeigte eine phylogenetische Zugehörigkeit der Isolate zu verschiedenen Actinomyceten-Familien, wie Gordonia, Isoptericola, Micromonospora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora und Streptomyces. Durch phylogenetische Analysen und umfangreiche taxonomische Charakterisierungen konnten zwei neue Actinomyceten-Arten, Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T (Pimentel-Elardo et al. 2008a) und Streptomyces axinellae strain Pol001T (Pimentel-Elardo et al. 2008b) beschrieben werden. Des Weiteren sollten die Actinomyceten-Isolate auf die Produktion von Sekundär-Metaboliten hin untersucht werden. Die Substanzen wurden „bioassay-guided“ aufgereinigt und isoliert sowie deren Struktur mittels spektroskopischer Methoden aufgeklärt. Anschließend wurden die Substanzen ausführlichen Screening-Methoden unterzogen, um sie auf anti-infektive Wirkungen hin zu untersuchen. Zahlreiche interessante Verbindungen konnten so isoliert werden, u. a. die neuen Polyketide Cebulactam A1 und A2 (Pimentel-Elardo et al. 2008c); eine Familie von Tetromycin-Substanzen inklusive neuartiger Derivative; das Cyclodepsipeptid Valinomycin, Indolocarbazole Staurosporine, Diketopiperazine Cycloisoleucylprolyl und Butenolide. Die Verbindungen zeigten signifikante anti-parasitische und Protease-hemmende Aktivitäten. Das dritte Ziel dieser Arbeit war es, die für nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) und Polyketidsynthasen (PKS) kodierenden, biosynthetischen Gen-Cluster in den Actinomyceten-Isolaten zu identifizieren. Die Konstruktion von Genbanken sowie die Sequenzierung ausgewählter Cosmidklone lieferte erste Einblicke in das Stoffwechsel- und Biosynthesepotential ausgewählter Isolate. Beispielsweise konnte ein interessantes NRPS-System in Streptomyces sp. Stamm Aer003 identifiziert werden, welches in verschiedenen Schwammarten, einer Ascidienart sowie im Meerwasser gefunden wurde. Die Sequenzierung eines PKS-Genclusters aus Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T ermöglicht die Voraussage des Cebulactam-Biosynthesewegs in dem 3-Amino-5-Hydroxybenzoesäure als Ausgangsprodukt dient, welches durch sukzessive Kondensationsschritte sowie Verlängerungen durch Methylmalonyl- und Zusatzdomänen zum endgültigen Polyketid führen. Zusammenfassend konnte in dieser Promotionsarbeit gezeigt werden, dass marine Schwämme mit diversen Vertretern aus verschiedenen Familien der Actinomyceten assoziiert sind. Die Bakterienisolate, von denen zwei neue Arten repräsentieren, produzierten mehrere chemische Substanzen mit interessanten anti-infektiven Eigenschaften. Des Weiteren konnte mit dieser Arbeit durch die Identifizierung von Biosynthese-Genclustern das Potential von Actinomyceten zur Produktion verwertbarer bioaktiver Substanzen bekräftigt und somit ein Beitrag zur Entdeckung neuer anti-infektiver Substanzen erbracht werden. KW - Meeresschwämme KW - Strahlenpilze KW - Sekundärmetabolit KW - Actinomyceten KW - Biosynthese-Genclustern KW - neuer anti-infektiver Substanzen KW - actinomycetes KW - marine sponges KW - anti-infective KW - biosynthetic gene clusters KW - secondary metabolites Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40463 ER - TY - THES A1 - Müller, Stefan T1 - Wirkspektrum und Signaltransduktionsmechanismus von oxidierten Lipiden in Arabidopsis thaliana N2 - Die endogen in Pflanzen radikalisch gebildeten Phytoprostane regulieren in Arabidopsis thaliana eine Reihe von Genen, die an den Prozessen der Detoxifizierung und Zellproliferation beteiligt sind, während die externe Applikation dieser Oxylipine in vitro eine Akkumulation von sekundären Metaboliten, sogenannten Phytoalexinen, nach sich zieht. Ferner war aus vorherigen Arbeiten des Lehrstuhls für Pharmazeutische Biologie bekannt, dass die Vorbehandlung mit Phytoprostanen in Arabidopsis thaliana eine Schutzwirkung gegen nachfolgenden oxidativen Stress vermittelt. Neben nicht-enzymatisch gebildeten Oxylipinen akkumulieren in höheren Pflanzen als Antwort auf einen oxidativen Stress auch enzymatisch gebildete Oxylipine wie 12-Oxophytodiensäure (OPDA) und Jasmonsäure (JA). Als Ausgangspunkt zur systematischen Analyse der von einzelnen Phytoprostanen vermittelten Wirkspektren diente in der vorliegenden Arbeit eine Transkriptionsanalyse unter Verwendung einer mixotrophen Arabidopsis thaliana Zellkultur nach Phytoprostan-A1 (PPA1)-Behandlung. In weiterführenden Experimenten wurde das durch PPA1-vermittelte Genexpressionsprofil mit dem Profil von weiteren, nicht-enzymatischen sowie dem durch die enzymatisch gebildeten Oxylipine OPDA bzw. JA hervorgerufenen Genexpressionsprofil verglichen. Die Vergleiche zeigten signifikante Übereinstimmungen, aber auch deutliche Unterschiede im Wirkprofil einzelner enzymatischer bzw. nicht-enzymatischer Oxylipine. Das Wirkungsspektrum der radikalisch gebildeten PPA1 überschneidet sich zu 40 Prozent mit dem der enzymatisch gebildeten OPDA, jedoch nur zu sieben Prozent mit dem Wirkspektrum der ebenfalls enzymatisch gebildeten JA. Diese Beobachtung ließ einen über strukturelle Merkmale vermittelten Signalmechanismus vermuten, da die chemischen Strukturen von PPA1 und OPDA, nicht jedoch PPA1 und JA, verwandt sind. Zur Überprüfung der vorstehenden Hypothese wurden die Promotorbereiche der durch PPA1 mehr als dreifach induzierten Gene bioinformatisch auf häufig vorhandene Sequenzmotive untersucht. Es zeigte sich, dass etwa die Hälfte der Promotorbereiche der durch PPA1 induzierten Gene ein Bindungsmotiv für TGA-Transkriptionsfaktoren enthält. Nachfolgende Transkriptomanalysen in der TGA-Dreifach knockout Arabidopsis thaliana Mutante tga2tga5tga6 zeigten, dass 60 Prozent der PPA1- bzw. 30 Prozent der ODPA-vermittelten Genexpression durch die TGA-Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6 vermittelt werden. Neben übereinstimmenden Wirkungen von PPA1 und OPDA in der Genexpression sind in der Literatur überschneidende Wirkungen von OPDA und JA bezüglich einer Wurzelwachstumshemmung in Arabidopsis thaliana beschrieben. In Experimenten zur Untersuchung des Wurzelwachstums resultierte die exogene Applikation von JA bzw. OPDA auf Arabidopsis thaliana Samen in einer Hemmung des Wurzelwachstums um 63 bzw. 72 Prozent. Dagegen vermittelte PPA1 nur eine Hemmung um 50 Prozent. Die vorstehend beschriebenen Wirkungen verschiedener Phytoprostane belegen ein umfassendes Wirkspektrum dieser heterogenen Substanzklasse. Neben den in vorliegender Arbeit im Vordergrund stehenden Phytoprostan-vermittelten Stressreaktionen sind eine Reihe physiologischer Prozesse, darunter das Wurzelwachstum, zumindest teilweise durch Phytoprostane reguliert. Ferner konnte in der der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass mindestens zwei der durch Phytoprostane induzierten Gene Proteine kodieren, die effizient die Metabolisierung von Phytoprostanen fordern, um oxidativen Schäden vorzubeugen. Vermittelt werden die Phytoprostan- Wirkungen unter anderem durch die TGA-Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6, welche zur Expression von Detoxifizierungs- und Stressgenen führen. N2 - Phytoprostanes that are endogenously and radically formed in higher plants regulate in Arabidopsis thaliana a number of genes that are involved in the processes of detoxification and cell proliferation. In contrast, the external application of these oxylipins results in vitro in the accumulation of secondary metabolites, so-called phytoalexines. Moreover, it was known from previous studies performed by the Chair for Pharmaceutical Biology that the pre-treatment with phytoprostanes in Arabidopsis thaliana leads to the protection against subsequent oxidative stress. In addition to nonenzymatically formed oxylipines, enzymatically formed oxylipines, such as 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) and jasmonic acid (JA) accumulate in higher plants as a consequence of oxidative stress. The present dissertation uses a transcription analysis of an Arabidopsis thaliana mixotroph cell culture after treatment with phytoprostane A1 (PPA1) as basis for the systematic analysis of the gene expression profile mediated by enzymatically and non-enzymatically formed oxylipines. Thus, in further experiments, the gene expression profile resulting from PPA1 was compared with the gene expression profile of other non-enzymatically, i.e., PPB1 and dPPJ1 as well as the one of the enzymatically formed oxylipins, i.e., OPDA and JA, respectively. These comparisons showed significant consistencies but also considerable differences in the gene expression profile of certain enzymatic and non-enzymatic oxylipines. In 40 percent of all cases, the gene expression profile of radically catalyzed PPA1 equals the one of enzymatically formed OPDA, but only in 7 percent of all cases, this gene expression profile is identical to the enzymatically catalyzed JA. This observation leads to the assumption of a signal mechanism resulting from structural characteristics, since the chemical structures of PPA1 and OPDA are related to each other while PPA1 and JA are not. In order to verify the above-mentioned hypothesis, the promoter regions of those genes which were more than three times induced were bioinformatically analysed for an abundance of specific binding sites. As a result, it turned out that approximately half of the promoter regions of the PPA1-induced genes contained a binding site for TGA transcription factors. Subsequent transcription analyses in the TGA-triple knockout Arabidopsis thaliana mutant tga2tga5tga6 showed that 60 percent of the PPA1- induced and 30 percent of the ODPA-induced gene expression was mediated by the TGA-transcription factors TGA2, TGA5 and TGA6. In addition to the overlapping effect on gene expression described above, the literature describes an equal effect of OPDA and JA concerning the root growth inhibition in Arabidopsis thaliana. In experiments performed to evaluate the overall growth of the seedlings by JA or OPDA resulted in a 63 or 72 percent reduction of the root length in comparison to control plants. Rather to the contrary the use of PPA1 only resulted in a 50 percent reduction in comparison to Arabidopsis thaliana control plants. Thus, the above mentioned effects of phytoprostanes demonstrate an extensive biological spectrum of these heterogenous types of substances. Apart from the phytoprostane-induced analysis of gene ecpression which is the crucial topic of this dissertation, a number of physiological processes, such as the root growth inhibition are at least in parts regulated by phytoprostanes. Furthermore, the present dissertation shows for the first time that at least two of the phytoprostane-induced genes encode a protein that efficiently enhance the metabolisation of phytoprostanes in order to prevent oxidative damages. The effects of phytoprostanes are inter alia mediated by the TGA transcription factors TGA2, TGA5 and TGA6 which result in the expression of detoxification and stress genes. KW - Oxylipine KW - Jasmonsäure KW - Oxophytodiensäure <12-> KW - Microarray KW - Phytoprostane KW - TGA-Transkriptionsfaktoren Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40013 ER - TY - THES A1 - Kandert, Sebastian T1 - Der Einfluss von Mutationen im LMNA-Gen auf die Struktur und Funktion des Zellkerns T1 - The impact of mutations in the LMNA-gen on structure and function of the nucleus N2 - Die Lamina ist ein Netzwerk aus Lamin-Proteinen und befindet sich unterhalb der inneren Kernmembran. Die Lamine A/C, die zu den Typ V Intermediärfilamenten gehören, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des Zellkernes sowie der Chromatinorganisation, der Transkription, der DNA-Replikation, der Differenzierung und der Genomstabilität. In den letzten Jahren wurden über 200 verschiedene Mutationen im Lamin A/C kodierenden LMNA Gen gefunden, die mehr als 10 unterschiedliche Krankheiten, die so genannten Laminopathien, auslösen können. Zu diesen Laminopathien zählen unter anderem die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD) und das Progerie-Syndrom. Die Mutation LMNA S143F In dieser Arbeit wurde zunächst die Punktmutation LMNA S143F, die in der N-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert ist, näher untersucht. Diese Mutation ist der Auslöser von einzigartigen phänotypischen Merkmalen einer frühen Myopathie sowie einer Progerie. Strukturelle Analysen mit dem Elektronenmikroskop ergaben, dass die primären dermalen Fibroblasten der Laminopathie-Patientin morphologisch veränderte Zellkerne hatten. In Abhängigkeit von S143F Lamin A/C konnte in den Patientenfibroblasten eine abnormale Lokalisation der Kernproteine Nesprin2 Giant und den kürzeren Nesprin2-Isoformen nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass eine reduzierte Expression von Nesprin2 Giant eine Rolle bei der Ausprägung der morphologischen Kerndeformationen spielte. Patientenzellen, die Nesprin2 Giant in hohem Maße exprimierten, zeigten keine Deformationen des Zellkerns und eine normale Verteilung verschiedener Kernproteine. FRAP-Analysen in vivo und biochemische Proteinextraktionsstudien des S143F-Lamin A/Cs in vitro zeigten eine verringerte Mobilität und Dynamik, sowie eine reduzierte Löslichkeit von S143F Lamin A/C gegenüber wildtypischem Lamin A/C. Die Mutation LMNA S143F liegt im Außenbereich der coiled-coil-Struktur des Lamins. Dadurch führt der Austausch der neutralen AS Serin durch die große hydrophobe AS Phenylalanin nicht zu einer Störung in der Dimer-bildung, sondern zu einer Beeinflussung der Formierung zu Protofilamenten bzw. höheren Strukturen. Dies konnte durch in vitro Untersuchungen von rekonstituierten Parakristallen aus S143F Lamin A/C dargestellt werden, die eine Veränderung des transversalen Bänderungs-musters aufwiesen. Zusammengenommen zeigen die Resultate, dass die Mutation LMNA S143F die Lamin-A-Polymerisation beeinflusst und dadurch die Dynamik und Mobilität der Typ A-Lamine beeinträchtigt. Außerdem konnte erstmals nachgewiesen werden, dass das Nesprin2 Giant Protein eine essentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt, indem es die Struktur des Zellkerns verstärkt und als struktureller „Gegenspieler“ zu Lamin A/C fungiert. Die Mutation LMNA R545C Die Punktmutation LMNA R545C, die in der C-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert, ist Auslöser eines sehr gravierenden Phänotyps der autosomal dominanten Form der Emery- Dreifuss-Muskeldystrophie (AD-EDMD). Strukturelle Analysen ergaben, dass die primären Myoblasten des EDMD-Patienten morphologisch veränderte Zellkerne haben. Ein Vergleich von deformierten Kernen aus Zellen mit verschiedenen Laminopathie-auslösenden Mutationen wie LMNA R545C, LMNA S143F und LMNA R377H zeigten allerdings, dass die untersuchten Mutationen nicht immer zu gleichen abnormalen Phänotypen der Kernmorphologie, sondern zu divergenten Ausprägungen der morphologischen Kernveränderungen in Patientenzellen führten. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass auch die Proteine Lamin A/C und Emerin in den Patientenzellen eine fehlerhafte Verteilung aufwiesen und „Honigwabenmuster“ ausbildeten. Interessanterweise konnte auch eine vom Alter der Zellen abhängige Akkumulation der 20S-Untereinheit des Proteasoms in kleine nukleäre Foci beobachtet werden. Diese Foci kolokalisierten weitgehend mit den promyelotischen Leukämie-Körperchen (PML). In den Patientenmyoblasten war der CDK-Inhibitor p21 stark angereichert, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der proteasomalen Funktion ist. Nach Kultivierung der Patientenmyoblasten in Minimalmedium zeigten diese eine eingeschränkte Fähigkeit zur ex-vivo Differenzierung zu Myotuben. Dementsprechend war die Expression des Myogenese-spezifischen Transkriptionsfaktors Myogenin, sowie des Proliferationmarkers hypophosphoryliertes Retinoblastoma-Protein in Patientenmyoblasten nicht korrekt induziert. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass auch die Mutation LMNA R545C Einfluss auf die Kernarchitektur und -Proteinverteilung, die Chromatinorganisation, Gen-expression und Funktion des Proteasoms einnimmt. Darüber hinaus beeinträchtigte die Mutation LMNA R545C die Fähigkeit zur korrekten Proliferation und Differenzierung der Myoblasten, welches eine potentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt. N2 - The nuclear lamina is a network of lamin polymers underlying the inner nuclear membrane. The lamins A/C, which are type V intermediatefilaments, are involved in the organisation of chromatin, gene regulation, DNA-replication, differentiation and the integrity of the genome. In recent years more than 200 mutations in the lamin A/C coding LMNA gene were discovered, which cause more than 10 genetic diseases, collectively termed as laminopathies. These laminopathies include the Emery-Dreifuss-muscular dystrophy (EDMD) and the progeria syndrome. The mutation LMNA S143F First we observed the S143F lamin A/C point mutation, located in the N-terminal domain of the lamin A/C. This mutation causes a phenotype combining features of myopathy and progeria. Structural analyses revealed that patient dermal fibroblast cells had dysmorphic nuclei containing numerous blebs and lobulations. The lamin S143F organization was altered, showing intranuclear and nuclear envelope aggregates and often presenting a honeycomb appearance. Subject to the S143F lamin A/C, there is a reduced expression and an altered distribution of nesprin2 giant and the shorter nesprin2 isoforms in patient fibroblasts. A subpopulation of mutant cells, however, expressing the nesprin2 giant isoform, did not show an overt nuclear phenotype. By contrast, nesprin2 giant deficient cells reveal an aberrant nuclear phenotype and a mislocalization of LAP2α and the transcriptional active form of the RNA-Polymerase II. More detailed analyses of the S143F lamin A/C structure by FRAP-analysis in vivo and biochemical extraction studies in vitro revealed that S143F lamin is less dynamic and dissoluble compared to wildtype lamin A/C. The LMNA S143F mutation occupies the surface of the coiled-coil-structure of the lamin A/C. Thus, the structural topology and particularly the substitution by a bulky, hydrophobic amino acid do not affect the lamin A/C dimer structure but rather perturb intermolecular interactions. This was confirmed by in vitro analysis of reconstituted paracrystals of lamin A/C, which exhibited an altered transversal stratification-pattern. Beyond that, another question was, whether there is a formation of heteropolymers of wildtype and S143F lamin A/C and a formation of homopolymers in vivo. BIFC-analysis confirmed that wildtype and mutated lamins had the capacity to form heteropolymers and homopolymers in vivo. Moreover, the wildtype homopolymers and the lamin A/C-heteropolymers localized correctly in the nuclear envelope. In contrast, the formation of the S143F lamin A/C homopolymers influenced their correct localization in the nuclear envelope and lead to an aberrant nuclear morphology. The mutation LMNA R545C Myoblasts of patients developing a serious form of the autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (AD-EDMD) in response to the R545C lamin A/C point mutation, located in the C-terminal domain, have been analyzed. Structural analyses revealed that subpopulations of these patient myoblast precursor cells had nuclear structural defects as lobulations, whose frequency increased with cell passages in culture. This overt phenotype was compared to other dysmorphic nuclei from laminopathy-causing mutations like LMNA S143F or LMNA R377H. These analyses pointed out, that each mutation leads to a specific nuclear phenotype. Immunofluorescence microscopy showed that the organisation of both lamin A/C and its inner nuclear membrane partner emerin were altered, showing a honeycomb appearance too. Furthermore, our data showed for the first time that in an EDMD context, a progressive accumulation of the 20S proteasomal core subunits into foci that largely colocalized with promyeolocytic leukemia bodies (PML) was obvious, as cells age in culture. Moreover, the impairment of proteasome function, as pointed out by p21 nuclear accumulation, may contribute to the high index of premature cellular senescence we observed in patient cells. Another signal concerning the premature senescence was the accumulation of heterochromatin in late passages and the one- to twofold increase of the nuclear volume of the patient myoblasts. When transferred into low serum medium, patient myoblasts expressing R545C mutated lamin A/C were deficient for ex-vivo differentiation into myotubes. Accordingly, the myogenesis transcription factor myogenin and the hypophosphorylated retinoblastoma-protein were not induced properly in patient myoblasts. These data suggest that the LMNA R545C mutation also affected the nuclear envelope architecture and the distribution of nuclear proteins, chromatin organization, gene expression and the proper function of the proteasome. Furthermore, the LMNA R545C mutation impaired both proliferation and differentiation capacities of myoblasts precursors as part of the pathogenesis of the AD-EDMD. KW - Krankheit KW - Genmutation KW - Kernproteine KW - Laminopathie KW - Lamin KW - LMNA S143F KW - laminopathy KW - lamin KW - LMNA S143F KW - nucleus Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36145 ER - TY - THES A1 - Thein, Marcus T1 - Porins of Lyme Disease and Relapsing Fever Spirochetes T1 - Porine aus Lyme-Borreliose- und Rückfallfieber- Spirochäten N2 - Die Gattung Borrelia gehört zur Abteilung der Spirochäten, einem alten Zweig der Bakteriendomäne, der nur entfernt mit Gram-negativen Bakterien verwandt ist. Sämtliche Arten dieser Gattung sind obligate Parasiten. Borrelien können in die Erreger zweier humaner Krankheiten eingeteilt werden: die Lyme-Borreliose und das Rückfallfieber. Borrelien besitzen mit 0.91 Mb ein sehr kleines Chromosom und sind daher in ihren metabolischen Fähigkeiten eingeschränkt. Folglich ist das Überleben sämtlicher Borrelienarten absolut abhängig von Nährstoffen, die von ihren Wirten bereitgestellt werden. Der Transport dieser Nährstoffe und anderer Moleküle über die äußere Membran wird durch porenformende Proteine, so genannte Porine ermöglicht. Porine sind wassergefüllte Kanäle, die in zwei Klassen unterteilt werden können: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Aus dem Lyme-Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi wurden bisher drei mutmaßliche Porine charakterisiert und beschrieben: P13, Oms28 und P66. Demgegenüber sind die Kenntnisse über Porine in Rückfallfieberarten rudimentär und es wurde bisher noch kein einziges Porin für Vertreter dieser Krankheit identifiziert. Unter Berücksichtigung dieses Hintergrunds war die allgemeine Zielsetzung dieser Arbeit, einen Einblick in die Porinzusammensetzung von sowohl Lyme Borreliose- als auch Rückfallfieber-Spirochäten zu erlangen. Dieses Ziel konnte erreicht werden, indem Porine aus den Außenmembranen von Borrelien isoliert und identifiziert wurden und anschließend biophysikalisch in künstlichen Lipidmembranen charakterisiert wurden. Ein Kapitel dieser Arbeit beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung des ersten Porins aus Rückfallfiebererregern. Das porenformende Protein wurde aus den Außenmembranen von Borrelia duttonii, Borrelia hermsii und Borrelia recurrentis isoliert und Oms38 genannt, für „outer membrane-spanning protein of 38 kDa“. Die biophysikalische Charakterisierung mit der „black lipid bilayer“ Methode zeigte, dass Oms38 kleine, wassergefüllte Kanäle mit einer Einzelkanalleitfähigkeit von 80 pS in 1 M KCl bildet. Diese Kanäle sind nicht spannungsabhängig und leicht selektiv für Anionen mit einem Permeabilitätsverhältnis von Kationen zu Anionen von 0,41 in KCl. Ein homologes Protein zu Oms38 wurde in den Lyme Borreliose Erregern Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii und Borrelia afzelii identifiziert. Das porenformende Protein dieser Arten weist eine hohe Sequenzhomologie zu Oms38 auf und zeigt ähnliche biophysikalische Eigenschaften, das heißt es formt Poren von 50 pS in 1 M KCl. Durch Titrationsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Pore teilweise durch Dicarboxylate blockiert werden kann. Eine Auswertung dieser Versuche legte nahe, dass dieses Protein keine allgemeine Diffusionspore darstellt, sondern einen Kanal mit einer spezifischen Bindestelle für diese Komponenten. Daher wurde dieses Porin DipA genannt, was für „dicarboxylate-specific porin A“ steht. In einer anderen Versuchsreihe wurde gezeigt, dass das Porin P66 sowohl in Lyme Borreliose Erregern als auch in Rückfallfieberarten vorhanden ist. Hierfür wurden die Außenmembranen der Lyme Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii und Borrelia garinii und der Rückfallfieberarten Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis und Borrelia hermsii genauer untersucht. Mit Ausnahme des P66 Homologs von Borrelia hermsii rekonstituierten P66 Proteine aus allen Arten sehr aktiv in künstliche Membranen und formten Poren zwischen 9 und 11 nS in 1 M KCl. Die biophysikalischen Eigenschaften der Homologe wurden in Experimenten mit „black lipid bilayer“ Membranen ausführlich verglichen. Des Weiteren wurden Porendurchmesser und Konstitution des Borrelia burgdorferi Porins P66 genau untersucht. Hierfür wurde die P66 Einzelkanalleitfähigkeit in Anwesenheit von verschiedenen Nichtelektrolyten in künstlichen Lipidmembranen analysiert. Der effektive Durchmesser des P66 Wasserlumens wurde auf ~1.9 nm bestimmt. Darüber hinaus konnte P66 mit bestimmten Nichtelektrolyten wie PEG 400, PEG 600 und Maltohexaose blockiert werden. Weitere Blockierungsexperimente auf Einzelkanalebene deckten sieben Unterzustände von P66 auf, die auf ein P66 Heptamer schließen ließen. Dieser heptamere Charakter konnte durch Blue native PAGE Analysen bestätigt werden. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von Porinen aus sowohl Lyme Borreliose- als auch Rückfallfieber-Borrelien. Erkenntnisse aus dieser Arbeit bringen das Verstehen der Nährstoffaufnahme über Außenmembranen dieser streng wirtsabhängigen, pathogenen Spirochäten einen großen Schritt vorwärts. Ein fundiertes Wissen über oberflächenexponierte Proteine wie Porine ist Vorraussetzung für die Herstellung erfolgreicher Impfstoffe und Therapeutika gegen die von Borrelien verursachten Krankheiten. N2 - The genus Borrelia belongs to the spirochete phylum, an ancient evolutionary branch of the domain bacteria that is only afar related to Gram-negative bacteria. Borreliae can be subdivided into the agents of the two borrelian-caused human diseases, Lyme disease and relapsing fever. Both disease patterns are closely related to the peculiar biology of Borrelia species and exhibit a wide spectrum of diverse clinical manifestations. Due to the small 0.91 Mb chromosome, borreliae have a lack of biosynthetic capacity. Thus, all Borrelia species are highly dependent on nutrients provided by their hosts. The transport of nutrients and other molecules across the outer membrane is enabled by pore-forming proteins, so-called porins. Porins are water-filled channels and can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. In terms of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi, three putative porins were characterized in previous studies: P13, Oms28 and P66. In contrast to Lyme disease species, the porin knowledge of relapsing fever Borrelia is low, which means that not any porin has actually been described for representatives of these agents. Thus, the general aim of this thesis was to provide insight into the porin content of both, Lyme disease and relapsing fever spirochetes. This aim could be achieved by isolating and identifying porins from Borrelia outer membranes and by biophysically characterizing them in artificial lipid membranes. In one chapter of this study, the first identification and characterization of a relapsing fever porin is presented. The pore-forming protein was isolated from outer membranes of Borrelia duttonii, Borrelia hermsii and Borrelia recurrentis and designated Oms38, for “outer membrane-spanning protein of 38 kDa”. Biophysical characterization of Oms38 was achieved by using the black lipid bilayer method and demonstrated that Oms38 forms small, water-filled channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. The Oms38 channel did not exhibit voltage-dependent closure and is slightly selective for anions with a permeability ratio of cations over anions of 0.41 in KCl. Subsequently, a protein homologous to Oms38 was identified in the Lyme disease agents Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii and Borrelia afzelii. The pore-forming protein of these species exhibits high sequence homology to Oms38 and similar biophysical properties, i.e. it forms pores of 50 pS in 1 M KCl. Interestingly, titration experiments revealed that this pore could be partly blocked by dicarboxylic anions, which means that this protein does not form a general diffusion pore but a channel with a binding-site specific for those compounds. Consequently, this porin was termed DipA, for “dicarboxylate-specific porin A”. In another set of experiments, it was shown that the porin P66 is present in both Lyme disease and relapsing fever species. Therefor, the outer membranes of the Lyme disease species Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii and the relapsing fever species Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis and Borrelia hermsii were closer investigated. Except of the P66 homologue of Borrelia hermsii P66 of all species was highly active in artificial lipid membranes, forming pores with huge single-channel conductances between 9 and 11 nS in 1 M KCl. Moreover, the channel diameter and the constitution of Borrelia burgdorferi P66 were investigated in detail. Therefor, the P66 single-channel conductance in the presence of different nonelectrolytes with known hydrodynamic radii was analyzed in black lipid bilayers. The effective diameter of the P66 channel lumen was determined to be ~1.9 nm. Furthermore, as derived from multi-channel experiments the P66-induced membrane conductance could be blocked by certain nonelectrolytes, such as PEG 400, PEG 600 and maltohexaose. Additional blocking experiments on the single-channel level revealed seven subconducting states and indicated a heptameric constitution of the P66 channel. This indication could be confirmed by Blue native PAGE analysis which demonstrated that P66 units form a complex with a corresponding mass of approximately 440 kDa. Taking together, this thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of both Lyme disease and relapsing fever Borrelia porins and represents an important step forward in understanding the outer membrane pathways for nutrient uptake of these strictly host-dependent, pathogenic spirochetes. Furthermore, it provides some knowledge of the outer-membrane protein composition of Borrelia spirochetes. A profound knowledge of surface-exposed proteins, such as porins, is one precondition for the production of a successful vaccine and the drug design against the two borrelian-caused diseases. KW - Porin KW - Membranproteine KW - Borrelia KW - Lyme-Borreliose KW - Rückfallfieber KW - Spirochäten KW - porin KW - membrane protein KW - Borrelia KW - Lyme disease KW - relapsing fever Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35158 ER - TY - THES A1 - Hyun, Tae Kyung T1 - Function and regulation of plant Mitogen-Activated Protein Kinases in metabolic and stress signaling pathways T1 - Funktion und Regulation von pflanzlichen Mitogen-aktivierten Proteinkinasen in metabolischen und Stress Signalwegen N2 - In Pflanzenzellen ist die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Protein (MAP) Kinasen eine allgemeine Reaktion zur abwehrvermittelten Signaltransduktion. Da die nachgeschalteten Prozesse der Aktivierung der MAP Kinasen in Pflanzen weitestgehend unbekannt sind,wurde die Rolle der MAP Kinasen in Abhängigkeit von stressvermittelnden Stimuli auf die Abwehrmechanismen und den primären Kohlenhydratmetabolismus in Tomate untersucht. Dabei wurde die Beziehung zwischen MAP Kinasen (LpMPK2 und LPMPK3) und der extrazellulären Invertase Lin6, welche ein Schlüsselenzym der apoplastischen Phloementladung darstellt, analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die mRNAs von LpMPK3 und Lin6 sequenziell durch dieselben stressvermittelnden Stimuli (E-Fol, PGA,Verwundung, KCl) induziert werden. Die Induktion des Lin6 Promotors, erkennbar durch eine erhöhte β-Glucuronidase Aktivität 2 Stunden nach Behandlung der Reporterlinien mit Stimuli, war abhängig von der Expression und Aktivierung der LpMPK3. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Induktion von der extrazellulären Invertase Lin6 durch stressvermittelnde Stimuli LpMPK3 bedarf. Die Behandlung mit Glukose zeigte eine gleichzeitige Induktion der AtMPK4 und AtMPK6 Aktivität, welche durch Anionen-Austausch-Chromatographie separiert und mit Hilfe von spezifischen MAP Kinase Antikörpern nachgewiesen werden konnten. Zusammengefasst lassen diese Daten vermuten, dass die Aktivierung der MAP Kinasen eine zentrale Rolle in der Zucker vermittelten Signalübertragung spielt. Die Bewegung der Stomata wird durch umweltbedingte Einflüsse wie ichtintensität, Luftfeuchtigkeit und CO2-Konzentration kontrolliert. In Arabidopsis wird die Entwicklung und Strukturierung durch eine komplette MAP Kinasen Signalkaskade reguliert. Hingegen ist in höheren Pflanzen wenig über die CO2 induzierte Signalübertragung bei der Bewegung der Stomata bekannt. Experimente zeigten, dass hohe CO2 Konzentrationen eine schnelle und kurzzeitige Aktivierung von SIPK und NtMPK4 bewirken. Die Aktivierung der beiden MAP Kinasen könnte bei hoher CO2 Konzentration die Aktivierung eines Anionenkanals zur Stomata Bewegunng regulieren. Während in einer Vielzahl von Studien die antioxidativen Eigenschaften von Tocopherolen im Hinblick auf die Regulierung der Stresstoleranz beschrieben ist, sind die nicht-antioxidativen Eigenschaften von Tocopherolen in höheren Pflanzen bis heute nur wenig aufgeklärt. Daher wurde in Tabak die Funktion von α-Tocopherol auf die Stimuli-induzierte und MAP Kinasevermittelte Signalübertragung analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung der MAP Kinase durch die Behandlung mit einem pilzlichen Elizitor und dem Derivat α-Tocopherol- Phosphat induziert wird. Bei der Behandlung mit α-Tocopherol trat dieser Effekt nicht auf. Interessanterweise wurde bei α-Tocopherol im Gegensatz zu Ascorbinsäure ein kurzzeitiger inhibitorischer Effekt auf die Aktivierung der Stimuli-induzierten MAP Kinasen in BY2 Zellen und Tabakpflanzen beobachtet. Der Inhibitor-Aktivitäts-Test ließ vermuten, dass die Applikation indirekt die Aktivität von MAP Kinasen beeinflussen könnte. Diese Ergebnisse deuten auf eine negative Regulierung von α-Tocopherol auf die Stimuli-induzierte Signalübertragung durch Inaktivierung der MAP kinasen hin. Purin-Analoga sind aufgrund ihrer strukturellen Selektivität als spezifische Proteinkinase- Inhibitoren in Mammalia beschrieben. In dieser Arbeit wurden C2, N6, N9 –trisubstituierte Purine getestet, um grundlegende Beziehungen zwischen chemischer Struktur und inhibitorischen Effekten auf pflanzliche MAP Kinasen zu untersuchen. Die Modifikation der Substitution in der Position C2 und N9 bedingte eine erhöhte inhibitorische Aktivität von 6- (Benzylamino)-Purin Analoga. Daneben lassen die 6-(iso-Pentenylamino)-Purin Analoga vermuten, dass die Addition einer Methylgruppe an der N9 Position verglichen mit der Addition einer Isopropyl-Gruppe eine um das zweifache erhöhte inhibitorische Aktivität bewirkt. Zusammengefasst zeigen die Studien, dass die Selektivität und Wirksamkeit der Inhibitioren durch die Modifikation der chemischen Struktur verbessert wird. Desweiteren wurde die physiologische Funktion von AtPDP1 (Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1) auf die Regulation der Abwehrsignalübertragung, hervorgerufen durch biotsche und abiotische Faktoren, charakterisiert. Interessanterweise bewirkte die Überexpression von AtPDP1 eine erhöhte Empfindlichkeit gegen virulente Pathogene und nekrotrophe Pilze. Zudem begünstigte es die Bildung von Nekrosen aufgrund von unbekannten biotischen Faktoren. Dagegen zeigten diese überexprimierenden Linien während erhöhtem Salzstress eine signifikante Verzögerung der Seneszenz und eine höhere Quantenausbeute des PS II im Vergleich zu den Kontrollpflanzen. Die Ergebnisse weisen sehr deutlich auf eine positive Regulation von AtPDP1 auf die Salztoleranz und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber biotischem Stress hin. Daher wird angenommen, dass AtPDP1 durch komplexe Signalwege und Wechselwirkungen während der Stressadaptation reguliert wird. N2 - Activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases is a common reaction of plant cells in defense-related signal transduction pathways. Since the downstream events after the activation of MAP kinases are largely unknown in plants, the role of MAP kinases in the co-ordinate regulation of defense reactions and primary carbon metabolism by stress related stimuli has been analyzed in tomato. Thus, the relationship between mitogen activated protein kinases (LpMPK2 and LpMPK3) and extracellular invertases Lin6, as the key enzyme of an apoplasmic phloem unloading pathway, has been analyzed. The results showed that the mRNAs of LpMPK3 and Lin6 are sequentially induced by the same set of stress related stimuli (E-Fol, PGA,wounding, and KCl). The induction of the Lin6 promotor, as revealed by an increase in β-glucuronidase activity after 2 hours, was dependent both on the expression and activation of LpMPK3. These data suggest that the induction of extracellular invertase Lin6 by stress related stimuli requires LpMPK3. Glucose, metabolic molecule, was shown to result in the simultaneous induction of AtMPK4 and AtMPK6 activities that could be separated by anion-exchange chromatography, and characterized by differential cross-reaction with MAP kinase antibodies. Taken together, these data suggest that the activation of MAP inases play central roles in the regulation of sugar signaling. Stomatal movement is controlled by environmental signals including light intensity,humidity and atmospheric CO2 level. In Arabidopsis, a complete MAP kinase signaling cascade regulates stomatal development and patterning. However, the movement of stomata mediated by CO2 induced signaling pathways is not fully studied in higher plants. Here, we show that elevated levels of CO2 induce rapid and transient activation of SIPK and NtMPK4. The activation of both MAP kinases may regulate the anion channel activation for stomatal movement by the elevated level CO2. Up to now, the non-antioxidant function of tocopherol is not clear in higher plant,whereas the ability of tocopherol to modulate the stress tolerance mediated by function of antioxidant has been described in numerous studies. Thus, the function of α-tocopherol in stimuli-induced signal transduction pathways mediated by MAP kinase has been analyzed in tobacco. It has been shown that the activation of MAP kinase was induced by treatment of fungal elicitor and α-tocopherol phosphate but not α-tocopherol. Interestingly, α-tocopherol showed the transient inhibitory effect on the activation of stimuli-induced MAP Kinases in BY2 cells and tobacco plants, whereas ascorbate did not inhibit the activation of MAP kinases. The inhibitory activity test indicated that current application may indirectly affect the activity of MAP kinases. These results suggest that α-tocopherol can negatively regulate stimuliinduced signal transduction pathways via inactivation of MAP kinases. The purine-analogues have been tested and reported to be specific inhibitors of protein kinases mediated by structural-based selectivity in mammalian. Here, we tested C2, N6, N9-trisubstituted purines to determine basic relationship between their chemical structure and inhibitory activity using a particular plant MAP kinase. The modification of substitution in position C2 and N9 caused the increased inhibitory activity of 6-(benzylamino) purine analogue. In addition, 6-(isopentenylamino) purine analogues suggested that addition of a methyl group to position N9 caused at least 2-fold increased inhibitory activity compared with the addition of isopropyl group.Taken together, our study suggests that the selectivity and potency of inhibitors can be improved by structure modification. In addition, we have characterized the physiological function of Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1 (AtPDP1) in modulating the interaction of defense pathways mediated by biotic and abiotic factors. Interestingly, overexpression of AtPDP1 resulted in increasing susceptibility of virulent pathogens and necrotrophic fungus, and developing necrosis induced by unknown biotic factors. However, these overexperssion lines showed the significantly delayed senescence and higher level of phosystem II quantum yield compared with control plants against high salt stress. Our results strongly indicate that AtPDP1 positively regulate with salt tolerance, and enhances the sensitivity to biotic stresses. We propose that the AtPDP1 might be regulated with the complex pathways of interplay among various signaling during stress adaptation. KW - Signaltransduktion KW - (Signal transduction pathways) Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34978 ER - TY - THES A1 - Dunkel, Marcel T1 - Untersuchungen zur Translokation und Funktion von Tandem-Poren Kaliumkanälen der TPK-Familie aus Arabidopsis thaliana T1 - Targeting and function of Arabidopsis thaliana tandem pore potassium channels belonging to the TPK family N2 - • Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor. N2 - • The model plant Arabidopsis harbours 15 genes encoding potassium selective channels. Five of them belong to the structural class of tandem-pore K+ channels and are therefore called TPK channels. • Blast searches revealed the occurrence of TPK channels in many eucaryots, but not in procaryots. Plant TPK channels cluster in a phylogenetic analysis and branch into a TPK1- and a TPK2-subfamily. The evolution Arabidopsis TPK2-subfamily members (TPK2, TPK3, TPK4, and TPK5) can be attributed to distinct large-scale duplication events in ancestral genomes. Further more phylogenetic analysis showed the relatedness of the one-pore potassium channel KCO3 to TPK2. • The trafficking of the four vacuolar membrane intrinsic TPK channels (TPK1, TPK2, TPK3, and TPK5) utilizes the secretory path, from the endoplasmic reticulum (ER), via Golgi apparatus and maybe intermediate compartments to the lytic vacuole. The carboxy terminus (CT) of TPK1 was critically involved in both ER and Golgi sorting steps. The minimal requirement for vacuolar localisation was the proximal CT up to the Ca2+-binding EF-hand I. Due to mutational analyses one of several di-acidic motifs consisting of aspartate, leucin, and glutamate (aa 296-298) could be identified as the essential ER-export motif. By this TPK1 likely interacts with the coat of COPII vesicles, which adopt the ER to Golgi transport. Like TPK1 the orthologs of the TPK1-subfamily, but not the Arabidopsis homologs, exhibit the same di-acidic motif. In agreement vacuolar trafficking of TPK3 was independent of its CT. • TPK4 is the solely plasma membrane integral AtTPK channel and thus its currents can be recorded at the plasma membrane of Xenopus leavis oocytes. Mutation of in plant TPK channels perfectly conserved pore aspartates (D86N; D200N) knock-out TPK4 channel function and suggest a dimeric assembly similar to that of animal tandem-pore channels. Employing TPK4 as matrix for the expression of the pore domains of the vacuolar TPKs in Xenopus oocytes, I could show the capability of TPK2, TPK3 and TPK5 to complement TPK4. Therefore these channels probably form instantaneous, voltage-independent and potassium selective channels in the vacuolar membrane. Existence of one 14-3-3 binding motif each and one EF-hand (except TPK5) implicates Ca2+ and 14-3-3 dependent activation of those channels like seen for TPK1. • Further combination of structural, mutational and electrophysiological analyses led to the identification of another pore aspartat (Asp 110) essential for the potassium permeation and responsible for the inward rectification. The charged side chain of this Asp 110 faces the water cavity and thus could concentrate and coordinate potassium in the pore as well as interact with cationic blockers like e.g. Mg2+ or polyamine. Again, conservation among the Arabidopsis TPK2-subfamily members suggests that the vacuolar TPKs (except TPK1) are regulated by cytoplasmic blockers and exhibit weak inward rectifiying properties, too. • In contrast to inward rectification current reduction due to cytoplasmic acidification is voltage-independent and thus likely protonation dependent. Due to chimera and deletion mutants of TPK4 the possible sites of the pH-Sensor as well as the gate could be narrowed down to a few residues in the transition zone of transmembrane and cytoplasmic domains, but the essential residues remain elusive. KW - Vakuole KW - Translokation KW - Endoplasmatisches Retikulum KW - Kaliumkanal KW - TPK KW - KCO KW - ER-Export KW - diazidisches Motiv KW - DEVC KW - particle bombardment KW - double electrode voltage clamp KW - targeting Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34743 ER - TY - THES A1 - Leide, Jana T1 - Cuticular Wax Biosynthesis of Lycopersicon esculentum and Its Impact on Transpiration Barrier Properties during Fruit Development T1 - Untersuchungen zur kutikulären Wachsbiosynthese und deren Bedeutung als Transpirationsbarriere während der Fruchtentwicklung von Lycopersicon esculentum N2 - Cuticular waxes cover all above-ground growing parts of plants. They provide the outermost contact zone between plants and their environment and play a pivotal role in limiting transpirational water loss across the plant surface. The complex mechanisms in cuticular wax biosynthesis conferring proper barrier function still remain to be elucidated. The present study focuses on biosynthetic pathways in wax formation, cuticular wax accumulation and composition and its impact on the epidermal barrier property of the intact system of the astomatous tomato fruit (Lycopersicon esculentum Mill.). Fruits of all developmental stages of the wild type cultivar MicroTom and its lecer6 mutant defective in a β-ketoacyl-CoA synthase involved in very-long-chain fatty acid elongation were analyzed. This 'reverse genetic' approach clarified the importance of the β-ketoacyl-CoA synthase LeCER6 for epidermal barrier property in vivo on the biochemical-analytical level, on the transcriptional level and, furthermore, on the physiological level comparatively between MicroTom wild type and MicroTom lecer6. Surfaces of MicroTom wild type and MicroTom lecer6 fruits showed similar patterns of quantitative wax accumulation, but differed considerably in the permeance for water. Qualitative analyses of the chemical composition of fruit cuticular waxes in the course of fruit development revealed the meaning of the β-ketoacyl-CoA synthase deficiency in the lecer6 mutant. Fruits of this mutant exhibited a distinct decrease in the proportion of n-alkanes of chain lengths > C28. Moreover, a concomitant increase in pentacyclic triterpenoids became discernible in the mature green fruit stage of the mutant. Since quantitative changes of the cutin matrix were not sufficient to affect transpiration barrier properties of the lecer6 mutant presumably the shift in cuticular wax biosynthesis of the lecer6 mutant is responsible for the observed increase of water permeance. In order to investigate the molecular basis of wax formation, a microarray experiment was established that allows the simultaneous and comprehensive analysis of the timing and abundance of transcriptional changes in MicroTom wild type and MicroTom lecer6. This microarray consists of 167 oligonucleotides corresponding to EST and gene sequences of tomato potentially participating in wax biosynthesis, wax modification, transport processes and stress responsiveness. These parameters were correlated with the course of fruit development. This comparison of gene expression patterns showed a variety of differential expressed transcripts encoding for example lipid transfer proteins and the dehydrin TAS14. On the basis of these findings, it can be proposed that diverse regulatory mechanisms like lipid transfer processes or osmotic stress response are affected by the LeCER6 deficiency, which is primarily accompanied by an impaired water barrier property of the fruit cuticle. This present study correlates the continuous increase of LeCer6 gene expression and the accumulation of very-long-chain n-alkanes within the cuticular waxes during the transition from the immature green to the early breaker fruit phase displaying a developmental regulation of the cuticular wax biosynthesis. Organ-specific wax biosynthesis resulted in different cuticular wax pattern in tomato fruits and leaves. Moreover, in contrast to the fruits, LeCER6-deficient leaves showed a significantly reduced wax accumulation, mainly due to a decrease of n-alkanes with chain lengths > C30, while the proportion of pentacyclic triterpenoids were not affected. Deduced from these biochemical-analytical data on tomato fruits and leaves LeCER6 was characterized as a key enzyme in VLCFA biosynthetic pathway responsible for cuticular wax accumulation. In silico analysis of the LeCER6 sequence revealed the presence of two putative transmembrane domains in the N-terminal position. In addition, highly conserved configurations of catalytic residues in the active site of the enzyme were observed, which are probably essential to its overall structure and function in the fatty acid elongation process. High sequence homology of LeCER6 to the very-long-chain condensing enzymes GhCER6 of Gossypium hirsutum L. and AtCER6 of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. was found, which might be a good evidence for similar biochemical functions. Apart from developmental regulation of the cuticular wax biosynthesis, environmental factors influenced the cuticular wax coverage of tomato fruits. Mechanical removal of epicuticular fruit wax evoked large-scale modifications of the quantitative and qualitative wax composition, such as a reduction of aliphatic wax components, and therewith affected the cuticular water permeability. A subsequent regeneration event was included in the regular wax biosynthesis process and led to the compensation of the detached wax amounts and increased the water barrier properties of the cuticular membrane again. In contrast, water-limited conditions had only minor impact on alterations in cuticular wax biosynthesis and, consequently, on the permeance for water of tomato fruits. Floral organ fusion and conditional sterility, as observed in this study, are caused as pleiotropic effects in cell-cell signaling by the loss-of-function mutation in LeCER6. These findings corroborated the functional impact of LeCER6 on the epidermal integrity and are consistent with the current knowledge on eceriferum mutants of Arabidopsis. Investigations of phenotypic and biochemical characteristics of tomato fruits allowed a broader system-orientated perspective of the fruit development of MicroTom wild type and its lecer6 mutant. These analyses highlight more precisely alterations in the fruit surface area, fresh and dry weight, epidermal cell density, photosynthetic activity or glucose content in the course of fruit development. The differences between MicroTom wild type and MicroTom lecer6 characterize very well the large-scale consequences of the LeCER6 deficiency on the physiological status of tomato fruits. Moreover, the results clearly show a part of the genetic controlled network that governs tomato fruit metabolism and mediates extensive changes of the tomato fruit life cycle. The analyses of the stem scar tissue of the tomato fruit revealed a complex set of responses caused by the harvesting process in detail. Throughout storage of the tomato fruits barrier properties were attributed to the suberized stem scar tissue in regard to water loss limitation and reduction of the fungal infection rate. Thereby the endogenous level of abscisic acid was found to be involved in the molecular signaling pathway that regulates the de novo formation of this tissue. For the first time, the chemical composition and physiological importance could be correlated with molecular changes at the transcriptional level during suberization of the stem scar of tomato fruits. In conclusion, this work indicates a novel intact model system for an integrative functional approach for plant barrier properties that was successfully established and carefully studied. The results highlight correlations between wax biosynthesis, distribution of cuticular waxes, and its relevance on the transpirational water loss across the plant surface and, thus, promote the global understanding of plant cuticle biology. N2 - Kutikuläre Wachse bedecken alle oberirdischen Pflanzenteile und stellen somit die Kontaktzone zwischen Pflanzen und ihrer Umwelt dar. Zudem spielen sie eine entscheidende Rolle für den Schutz der Pflanzen vor unkontrolliertem Wasserverlust. Die komplexen Mechanismen der Wachsbiosynthese, die zur dieser Barrierefunktion beitragen, sind jedoch noch weitgehend unaufgeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht Biosynthesewege von kutikulären Wachsen, ihre chemische Beschaffenheit sowie deren funktionelle Bedeutung als Transpirationsbarriere an dem intakten System der astomatären Tomatenfrucht (Lycopersicon esculentum Mill.). Untersuchungen wurden dabei an Früchten unterschiedlicher Entwicklungsstadien des Tomatenkultivars MicroTom Wildtyp und dessen lecer6 Mutante durchgeführt. Die lecer6 Mutante ist durch einen genetisch determinierten Defekt in der β-Ketoacyl-CoA Synthase LeCER6 unfähig zur Verlängerung von sehr langkettigen Fettsäuren. Durch diesen 'reverse genetic' Ansatz wurde der Einfluss der β-Ketoacyl-CoA Synthase LeCER6 auf die Barrierefunktion der Epidermis zunächst in vivo auf der biochemisch-analytischen und physiologischen Ebene vergleichend zwischen MicroTom Wildtyp und MicroTom lecer6 analysiert. Daran schlossen sich Untersuchungen auf transkriptioneller Ebene an. Die den Früchten von MicroTom Wildtyp und der lecer6 Mutante aufgelagerten Wachse unterscheiden sich quantitativ nur wenig, weisen hingegen deutliche Unterschiede in der qualitativen Zusammensetzung und den Wasserleitwerten auf. Die Analyse der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse zeigte im Verlauf der Fruchtentwicklung, dass die Defizienz in der β-Ketoacyl-CoA Synthase LeCER6 eine Abnahme des n-Alkananteils in den Wachsen ab einer Kettenlängen > C28 bewirkt, was bereits im Stadium der reifen grünen Früchte zu erkennen ist. Die in der lecer6 Mutante vermehrt eingelagerten pentazyklischen Triterpenoide können die Transpirationsbarriereeigenschaft der aliphatischen n-Alkane nicht adäquat ersetzen. Ein möglicher Einfluss der ebenso untersuchten Kutinmatrix der Tomatenfrucht konnte ausgeschlossen werden. Für eine umfangreiche Genexpressionsanalyse von MicroTom Wildtyp und MicroTom lecer6 wurde ein microarray Experiment konzipiert, welches 167 Oligonukleotide umfasst entsprechend zu bekannten EST- und Gensequenzen der Tomate, die möglicherweise an der Wachsbiosynthese, Wachsmodifikation, relevanten Transportprozessen oder Stressreaktionen beteiligt sind. Der Vergleich der Genexpression zwischen Wildtyp und der lecer6 Mutante zeigte eine Vielzahl von differentiell expremierten Transkripten unter anderem Lipidtransferproteine und das Dehydrin TAS14. Anhand derer kann davon ausgegangen werden, dass der Verlust der LeCER6 Funktion unterschiedliche regulative Mechanismen beeinflusst, wie zum Beispiel Lipidtransportprozesse und Reaktionen des osmotischen Stresses, die mit einer Schwächung der kutikulären Transpirationsbarriere der Fruchtepidermis einhergehen. Die vorliegende Studie belegt zudem erstmals einen Zusammenhang zwischen der Steigerung der LeCer6 Genexpression, der nur geringfügig zeitverzögerten Anreicherung sehr langkettiger n-Alkane in den kutikulären Wachsen und der daraus resultierenden Barriereleistungsfähigkeit. Ebenso wird eine Regulation der kutikulären Wachsbiosynthese in Abhängigkeit von den jeweiligen Stadien der Fruchtentwicklung veranschaulicht. Der organspezifische Vergleich der kutikulären Wachsbiosynthese zeigte, dass sich die Wachsmuster von Früchten und Blättern der Tomatenpflanzen deutlich voneinander unterscheiden. Die Wachsakkumulation auf der Blätterepidermis ist durch die LeCER6-Defizienz hauptsächlich im Anteil sehr langkettiger n-Alkane > C30 signifikant herabgesenkt, während der Gehalt an pentazyklischen Triterpenoiden jedoch nicht, so wie in den Früchten der lecer6 Mutante beobachtet, ansteigt. Aufgrund dieser Untersuchungen der Tomatenfrüchte und -blätter konnte LeCER6 als ein Schlüsselenzym für die Verlängerung sehr langkettiger Fettsäurederivate innerhalb der kutikulären Wachsbiosynthese funktionell charakterisiert werden. Anhand von vergleichenden in silico Sequenzanalysen mit den Fettsäurenelongasen GhCER6 aus Gossypium hirsutum L. und AtCER6 aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. konnten sowohl zwei mögliche transmembrane Proteindomänen im N-terminalen Bereich als auch hochkonservierte Bereiche im katalytischen Zentrum des LeCER6-Enzyms lokalisiert werden, die vermutlich zur funktionellen Struktur des Enzyms beitragen. Neben der bereits angeführten entwicklungsabhängigen Regulation der Wachsbiosynthese beeinflussen auch Umweltstressoren die kutikuläre Wachsauflage der Tomatenfrüchte. Ein mechanisches Entfernen der epikutikulären Wachse führt zu einer beträchtlichen Reduktion der aliphatischen Wachsbestandteile, welche maßgeblich die Barriereeigenschaft der Kutikulamembran bestimmen. Die einsetzende Regeneration der manipulierten Wachsoberfläche führt zu einer vollständigen Kompensation der entfernten Wachskomponenten, so dass die Tomatenfrüchte in nur kurzer Zeit wieder eine dem Reifestadium entsprechende normale Verteilung der kutikulären Wachse aufweisen. Im Gegensatz dazu führt Wassermangel nur zu sehr geringfügigen qualitativen und quantitativen Veränderungen der kutikulären Wachsschicht und folglich des Wasserleitwertes der Tomatenfrüchte. Die hier dokumentierte Organfusion der Blüte und die eingeschränkte Sterilität der Tomatenpflanzen wurden als pleiotrope Effekte der lecer6 Mutation auf die Zell-Zell-Kommunikation charakterisiert, was der funktionellen Bedeutung von LeCER6 für die Epidermisintegrität entspricht und mit Beobachtungen an eceriferum Mutanten in Arabidopsis übereinstimmt. Die kombinierte Untersuchung phänotypischer und biochemischer Merkmale der Tomatenfrucht erlaubt eine breitere, systemorientierte Gegenüberstellung der Fruchtentwicklung von MicroTom Wildtyp und MicroTom lecer6. Dabei werden durch die Analysen von Größe, Frisch- und Trockengewicht, Dichte der Epidermiszellen, Photosyntheseaktivität und Glukosegehalt der Früchte die Unterschiede zwischen MicroTom Wildtyp und der lecer6 Mutante deutlich aufgezeigt. Die LeCER6-Defizienz der Mutante führt dabei zu weitreichenden Veränderungen im physiologischen Status der Frucht. Diese Ergebnisse spiegeln somit einen Teil des physiologischen Netzwerkes wider, welches weitreichende sekundäre Veränderungen im Lebenszyklus der Tomatenfrucht vermittelt. Das Stielnarbengewebe der Tomatenfrucht wird infolge der Verletzung durch den Ernteprozess gebildet. Basierend auf der de novo Suberinbiosynthese kann diesem Gewebe eine wichtige Barrierefunktion sowohl zur Einschränkung des unkontrollierten Wasserverlustes als auch zur Verringerung der Infektionsrate durch einen pilzlichen Erreger während der Lagerung von Tomatenfrüchten beigemessen werden. Eine Beteiligung der endogenen Abscisinsäure an dem der Bildung des suberinisierten Gewebes der Fruchtstielnarbe zugrunde liegendem, molekularen Signalweg konnte nachgewiesen werden. Zusammenfassend dokumentiert diese Arbeit erstmalig detaillierte Studien im Hinblick auf pflanzliche Barriereeigenschaften an einem intakten Modellsystem. Die präsentierten Ergebnisse zu molekularen Untersuchungen der Wachsbiosynthese und qualitative and quantitative Analysen der Wachsakkumulation werden im Zusammenhang des Schutzes der Pflanzenoberfläche gegen Wasserverlust durch Transpiration diskutiert und bieten somit neue Erkenntnisse über die pflanzliche Kutikula. KW - Wachs KW - Kutikula KW - Tomate KW - Fruchtbildung KW - Transpiration KW - wax KW - cuticle KW - tomato KW - fruit KW - transpiration Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34526 ER - TY - THES A1 - Förstner, Konrad Ulrich T1 - Computational analysis of metagenomic data: delineation of compositional features and screens for desirable enzymes T1 - Computergestützte Analyse von Metagenomedate: Beschreibung von kompositionellen Eigenschaften und Suchen nach gewünschten Enzymen N2 - The topic of my doctorial research was the computational analysis of metagenomic data. A metagenome comprises the genomic information from all the microorganisms within a certain environment. The currently available metagenomic data sets cover only parts of these usually huge metagenomes due to the high technical and financial effort of such sequencing endeavors. During my thesis I developed bioinformatic tools and applied them to analyse genomic features of different metagenomic data sets and to search for enzymes of importance for biotechnology or pharmaceutical applications in those sequence collections. In these studies nine metagenomic projects (with up to 41 subsamples) were analysed. These samples originated from diverse environments like farm soil, acid mine drainage, microbial mats on whale bones, marine water, fresh water, water treatment sludges and the human gut flora. Additionally, data sets of conventionally retrieved sequence data were taken into account and compared with each other N2 - Das Thema meiner Doktorarbeit war die bioinformatische Analyse von metagenomischen Sequenzdaten. Ein Metagenom umfasst die genomische Information aller Mikroorganismen eines Biotops. Die bisher durchgeführten metagenomische Projekte sequenzierten auf Grund des technischen und finanziellen Aufwands einer solchen Unternehmung nur kleine Teile dieser im allgemeinen sehr großen Metagenome. Im Zuge meiner Doktorarbeit, die auf solchen Sequenzierungprojekten aufbaut, wurden bioinformatische Werkzeuge entwickelt und angewandt um genomische Eigenschaften verschiedener metagenomische Datensätze zu analysieren und um biotechnologisch und pharmakologisch relevante Enzyme exemplarisch in diesen Datensätzen zu suchen. In den Analysen wurden neun publizierte, metagenomische Projektedatensammlungen (teilweise mit bis zu 41 Subproben) untersucht. Die Probem stammen von zahlreichen unterschiedlichen Habitaten wie Farmerde, sauerer Minendrainage, dem mikrobiellen Belag auf Walknochen, Meerwasser, Süßwasser, Abwasseraufbereitungssschlamm und der menschlichen Darmu flora. Zusätzlich wurden in den meisten Analysen konventionell gewonnene Sequenzdaten vergleichend hinzugezogen und analysiert. KW - Bioinformatik KW - Metagenomomanalyse KW - GC-Wert KW - Enyzme KW - PKS KW - NHase KW - Nitrilase KW - Metagenomics KW - GC-value KW - enzymes KW - PKS KW - NHase KW - Nitrilase Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33577 ER - TY - THES A1 - Hirsche, Jörg T1 - Metabole Regulation von Pollenentwicklung und Pollenkeimung durch Zucker T1 - Metabolic regulation of pollen development and pollen germination by sugars N2 - Invertasen spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden über eine Vielzahl von Faktoren in ihrer Regulation beeinflusst. Invertasen mit pH-Optimum im sauren Bereich liegen dabei als vakuoläre und zellwandgebundene Isoformen einer Genfamilie in den Pflanzen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal 9 putative Invertasen aus der Nutzpflanze Brassica napus, sowie 4 weitere putative Mitglieder der bereits bekannten Tabakinvertasenfamilie isoliert und Expressionsprofile für die neu klonierten Invertasen erstellt. Symplastisch isolierte Zellen, wie z. B. Pollen und Pollenschläuche, sind auf die Expression zellwandgebundener Invertasen besonders angewiesen, da sie Kohlen-hydrate primär in Form von Fructose und Glucose aufnehmen, die über die Invertasen-vermittelte Spaltung aus Saccharose gebildet werden. An Tabak hatten Goetz et al. (2001) gezeigt, dass eine Inhibierung dieser pollen¬spezi¬fischen Invertaseaktivität zu männlich sterilen Pflanzen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass durch Inhibierung der Zellwandinvertase¬aktivität mittels Antisense-Technik oder Expression des proteinogenen Invertase-Inhbitors AtC/VIF2 auch männlich sterile Arabidopsis-Pflanzen generiert werden können. Ein Aktivitätsvergleich der Invertase-promotoren von Nin88 aus Tabak und AtcwINV2 aus Arabidopsis im jeweiligen homo- und heterologen System zeigte jedoch, dass der Einsatz dieser pollenspezifischen Promotoren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen über Familiengrenzen hinweg nicht möglich ist. Neben ihrer Funktion als Energieträger stellen Kohlenhydrate auch Signalmoleküle dar, die in die Regulation zentraler Prozesse der Pflanzen eingreifen. Anhand von Keimungsanalysen mit Arabidopsis-Pollen wurde festgestellt, dass Hexokinase-unabhängige Signalingwege involviert sein müssen, um ein Auskeimen der Pollen zu ermöglichen. Dabei kann die Hexokinase-vermittelte Inhibition der Pollenkeimung vermutlich durch die Beteiligung anderer Signaling-Wege aufgehoben werden. Es wurde außerdem die zuckerabhängige Ausbildung blasenartiger Strukturen an Arabidopsis-Pollen nachgewiesen, die vermutlich durch einen Zucker-spezifischen Abbruch des Pollenschlauchwachstums gebildet werden. N2 - Invertases with acid pH-optimum play a central role in plant metabolism and are regulated by numerous biotic and abiotic factors. They consist of vacuolar and extracellular isoforms of a gene family in plants. For the first time 9 putative members of the invertase family of Brassica napus, as well as 4 additional putative tobacco acid invertases were cloned in this work and expression profiles were analysed. Symplastically isolated cells, like pollen and pollen tubes, in particular depend on the expression of extracellular invertases, since they prefer the uptake of glucose and fructose. These hexoses are generated by the invertase-mediated cleavage of sucrose. Goetz et al. (2001) have shown on tobacco that inhibition of the pollen specific invertase activity lead to male sterile plants. In this work it was shown that inhibition of cell wall invertase activity via antisense technology or expression of the proteinaceous invertase inhbitor AtC/VIF2 also causes male sterility in Arabidopsis thaliana. Comparison of the promoter activities of the invertases Nin88 (tobacco) and AtcwINV2 (Arabidopsis) in the corresponding homo- and heterologous systems revealed that the use of these pollen specific promoters for generating male sterile plants is not possible in diverse plant families. Besides their function as energy source, carbohydrates are signaling molecules that influcence regulation of central processes in the plants. On the basis of germination assays with Arabidopsis pollen, it was shown that hexokinase-independent signaling pathways must be involved to permit normal pollen germination. In this context, hexokinase-mediated inhibition of pollen germination might be overrode by the involvement of other signaling pathways. In addition, the sugar-dependent generation of bubble-like structures at Arabidopsis pollen was demonstrated, which might be caused by the sugar-specific interruption of pollen tube growth. KW - Pollen KW - Ackerschmalwand KW - Invertase KW - Tabak KW - Raps KW - Sink-Source-Relation KW - Pollenschlauch KW - Signaling KW - Hexokinase KW - Pollenkeimung KW - Invertase-Inhibitor KW - männliche Sterilität KW - Zucker-Signaling KW - Promotoraktivität KW - pollen germination KW - pollen tube KW - sugar signaling KW - male sterility KW - promoter activity Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29654 ER - TY - THES A1 - Anschütz, Uta T1 - Physiologie und Biophysik der pflanzlichen Glutamatrezeptoren T1 - Physiology and biophysics of plant glutamate receptors N2 - In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Applikation von Glutamat zur transienten Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration sowie zu einer Depolarisation der Plasmamembran von Mesophyllzellen führt. Pharmakologische Studien weisen auf mögliche Orthologe tierischer ionotroper Glutamatrezeptoren (iGLuRs) hin. Ziel dieser Arbeit war eine vertiefte molekulare und funktionelle Analyse der Glutamatrezeptoren (GLRs) aus Arabidopsis thaliana. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: i. Zugabe von extrazellulärem Glutamat in Kombination mit Glycin führt in Abhängigkeit der extrazellulären ATP-Konzentration (eATP) zu einer transienten Erhöhung der Calciumkonzentration in Mesophyllzellen. ii. Die Reaktion von Mesophyllprotoplasten auf die Applikation von Glutamat und Glycin ist im Vergleich zum intakten Blatt stark reduziert, kann jedoch in Gegenwart von eATP oder Glucose signifikant gesteigert werden. iii. Diese Responsibilität von Mesophyllprotoplasten ist zum Zeitpunkt des Einsetzens der Zellwandsynthese (48h) am höchsten. iv. In Patch-Clamp Experimenten führt die photolytische Freisetzung von extrazellulärem caged-Glutamat bei 34 % der gemessenen A. thaliana Mesophyllprotoplasten zu einem verstärkten Kationentransport über die Plasmamembran. Dieser Kationenstrom kann durch gleichzeitige Anwesenheit von extrazellulärem ATP noch verstärkt werden und ist durch einen Desensitivierungsprozess gekennzeichnet. Die Empfindlichkeit dieser Ströme gegenüber Antagonisten tierischer iGluRs stellt eine Verbindung zu der Genfamilie der AtGLRs dar. v. Coexpressionexperimente ausgewählter AtGLRs geben erste Hinweise auf eine Homo- bzw. eine Heteromerbildung von AtGLR1.1 und AtGLR1.4. Aufgrund fehlender Kanalaktivität konnten einzelne, in Oozyten exprimierte AtGLRs bislang nicht funktionell charakterisiert werden. vi. Studien zur transienten und stabilen Überexpression im homologen Expressionssystem zeigen einen cytotoxischen Effekt bei funktioneller Überexpression ausgewählter AtGLRs. vii. Die Analyse der Stellung des Glutamatrezeptors 3.4 in kälteregulierten Signalnetzwerken via Microarrays weist auf ein überlappendes Aufgabenspektrum der Familie der AtGLRs hin. viii. Im Rahmen von Microarray Transkriptionsanalysen an der glr3.4-1 Mutante konnte ein bisher nicht charakterisiertes, co-reguliertes Protein identifiziert werden. Dieses Protein ist durch den Besitz einer transmembranen Region sowie einer ATP-Bindedomäne charakterisiert und könnte einen möglichen Regulator des AtGLR3.4-Kanals darstellen. ix. Die Überprüfung einer möglichen Beteiligung der pflanzlichen Glutamatrezeptoren an der Generierung der glutamatabhängigen Ca2+-Signale sowie die Suche nach Regulatoren bzw. fehlenden Untereinheiten erfolgte mithilfe Mutanten-„Sreenings“. Die Analyse der bis dato identifizierten, Glutamat-insensitiven Mutanten konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden. N2 - Preliminary work has shown that glutamate application results in a transient increase of cytosolic calcium and leads to a depolarisation of the plasma membrane potential in Arabidopsis mesophyll cells. Pharmacological studies indicate that orthologs of mammalian ionotropic glutamate receptors (iGLuRs), members of the AtGLR family, participate in this process. Aim of this work was to analyse the molecular and functional properties of Arabidopsis thaliana glutamate receptors (GLRs). During the course of this work the following results were obtained: i. The extracellular application of glutamate in combination with glycine leads to a transient rise in cytosolic calcium concentration in Arabidopsis mesophyll cells which was strongly enhanced in the presence of extracellular ATP (eATP). ii. The response of mesophyll protoplasts upon an application of glutamate and glycine was strongly reduced in comparison to intact leaves, but was increased significantly in the presence of eATP or glucose. iii. This response peaked out at the inset of cell wall synthesis i.e. after 48 hours. iv. After a photolytic release of caged-glutamate the probability of observing glutamate-activated cation currents across the plasmamembrane was about 34 % of all measured A. thaliana. mesophyll protoplasts. The observed cationic currents could be further stimulated in the presence of eATP and were characterized by desensitization. The responsiveness of these currents to antagonists of mammalian iGluRs constitutes a connection to the gene family of the AtGLRs. v. Coexpression-experiments of selected AtGLRs provide a first indication to a homo- and heteromerization of AtGLR1.1 and AtGLR1.4. Due to channel inactivity of individual AtGLRs expressed in oocytes, a functional characterization, however, was not possible so far. vi. Transient and stable overexpression in homologous expression systems indicated a cytotoxic effect, when individual AtGLR were functionally overexpressed. vii. Analysis of AtGLR3.4 function in cold-induced signal transduction networks via microarrays point to overlapping tasks among members of the glutamate-receptor-family. viii. The microarray-transcript-analysis of the glr3.4-1 mutant resulted in the identification of a not yet characterized, co-regulated gene. The deduced protein contains a putative signal peptide, a single transmembrane region, as well as an ATP-binding domain and could represent a putative regulator of the AtGLR3.4-channel. ix. Participation of plant glutamate receptors in generating glutamate-dependent calcium signals as well as the search for novel regulators was carried out by using an EMS-based mutant-screening procedure. The analysis of the so far identified, glutamate-insensitive mutants could not be completed within this thesis. KW - Glutamate KW - Glutamatrezeptor KW - GLR KW - Arabidopsis KW - eATP KW - caged glutamate KW - GLR KW - Arabidopsis KW - eATP KW - caged glutamate Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29438 ER - TY - THES A1 - Qiu, Liyan T1 - Structural and functional analysis of crossveinless 2 / BMP-2 /Chordin interaction N2 - No abstract available KW - structure KW - protein KW - BMP Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29249 ER - TY - THES A1 - Marten, Holger T1 - Rolle und Regulation von Anionenkanälen während der Stomabewegung als Reaktion auf Licht, CO2 und Wasserstress T1 - Role and regulation of anion channels during stomatal movements in response to light, CO2 and water stress N2 - Die Stomata in der Epidermis von Pflanzen sind Poren, die den Gasaustausch mit der Atmosphäre regulieren. Die Öffnungsweite der Stomata kann verändert werden, was eine Optimierung der CO2 Aufnahme für die Photosynthese ermöglicht und gleichzeitig den Wasserverlust durch Transpiration minimiert. Um diese Funktion zu erfüllen, können Stomata verschiedene Stimuli wie Wasserstress (durch Abscisinsäure), Licht und CO2 wahrnehmen. Die oben genannten Reize führen dann zu einer Aufnahme oder Abgabe von osmotisch aktiven Substanzen in zwei Schließzellen, welche die Stomaöffnung kontrollieren. Die Rezeptoren zur Wahrnehmung dieser Stimuli, die intrazellulären Signalwege und die beteiligten Ionentransportproteine in den Schließzellen sind nur lückenhaft bekannt. In dieser Arbeit lag ein Hauptaugenmerk auf der Rolle von Anionenkanälen der Plasmamembran bei Stomabewegungen, sowie auf den Signalwegen welche diese Kanäle steuern. Die Aktivität der Anionenkanäle wurde mit der DEVC (Double Electrode Voltage Clamp) Einstich-Methode in Schließzellen in der intakten Pflanze gemessen, kombiniert mit Calcium Imaging durch den Ca2+ Indikator Farbstoff FURA2. Stomaschlussreaktionen werden durch Abscisinsäure (ABA), CO2 und Dunkelheit induziert und bei allen drei Stimuli konnten wir in Nicotiana tabacum eine Aktivierung von Anionenkanälen beobachten. Das führt zu Anionenefflux aus den Schließzellen und einer Depolarisation der Plasmamembran, was wiederum Kalium-Efflux-Kanäle spannungsabhängig aktiviert. Der resultierende Verlust osmotisch aktiver Teilchen führt dann zu Turgorabnahme der Schließzellen und Stomaschluss. Das zeitliche Muster der Anionenkanalaktivität bei dem Stomaschluss, ausgelöst durch CO2, Dunkelheit und ABA war bei allen Reizen ähnlich. Es zeigte sich eine charakteristische transiente starke und darauf folgende schwächere Anionenkanalaktivität. Dieses konservierte Muster lässt Überschneidungen bei der Signaltransduktion der verschiedenen Stimuli vermuten. Die gesteigerte Aktivität der Anionenkanäle während der Reaktion auf ABA und Dunkelheit wurde in ungefähr der Hälfte der Antworten von einem Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration begleitet. Bei beiden Stimuli scheinen somit Ca2+ abhängig und unabhängig Signale intrazellulär weitergeleitet zu werden. Allerdings war der Effekt der Ca2+ Signale auf die Aktivität der Anionenkanäle bei den beiden Stimuli unterschiedlich. Eine zytosolisch erhöhte Ca2+ Konzentration konnte bei Antworten auf ABA nicht mit einer erhöhten Anionenkanalaktivität in Verbindung gebracht werden, bei Dunkelheit hingegen wurde die Aktivität der Anionenkanäle in Anwesenheit von Ca2+ gesteigert. Die wichtige Rolle von Anionenkanälen beim Stomaschluss lässt vermuten, dass ihre Deaktivierung eine Vorraussetzung für eine Stomaöffnung ist. Blaulicht führt bei niedrigen Photonen-Fluss Raten zu Stomaöffnung und sollte daher Anionenkanäle inhibieren. Übereinstimmend damit konnten wir tatsächlich zeigen, dass Blaulicht in Schließzellen von Vicia faba und Arabidopsis thaliana Anionenkanäle deaktiviert. Diese Deaktivierung ist von den Phototropin-Blaulichtrezeptoren abhängig, da die Deaktivierung der Anionenkanäle in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 Doppelmutanten nicht beobachtet werden konnte. Neben einer Blaulicht spezifischen Antwort öffnen Stomata auch in Antwort auf photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die PAR Wahrnehmung scheint zu einem wesentlichen Teil über Veränderungen der interzellulären CO2 Konzentration, ausgelöst durch die Photosyntheseaktivität des Mesophylls, stattzufinden (Roelfsema et al., 2002). In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir in Schließzellen in Albino Blattarealen von Chlorophytum comosum und gebleichten Vicia faba keine Reaktion auf PAR beobachten, obwohl Schließzellen von Chlorophytum comosum in Albino Bereichen funktionierende Chloroplasten besitzen. Die Rolle von CO2 bei der PAR Antwort haben wir des Weiteren in NtMPK4 antisense Pflanzen untersucht. Stomata von NtMPK4 antisense Pflanzen haben nicht auf Änderungen in der atmosphärischen CO2 Konzentration reagiert und zeigten eine stark reduzierte Antwort auf PAR. Diese Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der intrazellulären CO2 Konzentration bei der PAR Antwort, sie zeigen aber auch, dass es anscheinend zusätzlich zu CO2 noch ein weiteres PAR abhängiges Signal für Stomaöffnung gibt. N2 - Stomata in the epidermis of plants are pores, which regulate the gas exchange with the atmosphere. The aperture of these stomata can be altered and thus enable the plant to optimize the uptake of CO2 for photosynthesis, while minimizing loss of water via transpiration. To fulfil this function, stomata are able to sense several stimuli like water stress (through abscisic acid), light and CO2. The mentioned stimuli can induce accumulation in or release of osmotically active substances from two guard cells that control the stomatal aperture. The receptors for perception of these stimuli, the intracellular signal transduction pathways and the involved ion transporters of the guard cells are only partially resolved. This work focuses on the role of plasma membrane anion channels during stomatal movements and the signal transduction pathways that controls these channels. The activity of the anion channels was studied with the DEVC (double electrode voltage clamp) impalement method, in combination with FURA2 based calcium imaging in guard cells located in intact plants. Closure of stomata is induced by abscisic acid (ABA), CO2 and darkness and all these stimuli were found to activate anion channels in Nicotiana tabacum. This response not only leads to an anion efflux from the guard cells, but also causes depolarization of the plasma membrane, which in turn activates voltage dependent potassium efflux channels. As a result, osmotically active particles are lost, causing a decrease of the guard cell turgor and stomatal closure. The timing of anion channel activation in response to CO2, darkness and ABA displayed a similar pattern for all three stimuli. It was characterized by a transient strong-, followed by a steady low activity of anion channels. This conserved pattern suggests conserved steps in the signal transduction pathways of these stimuli. The activation of anion channels in response to ABA and darkness was in approximately half of the responses accompanied by an increase in the cytosolic Ca2+ concentration. This suggests that ABA and darkness are transmitted through Ca2+-dependent as well as Ca2+-independent signalling pathways. However, the effect of Ca2+ signals on the degree on anion channel activity differed for both stimuli. During ABA responses, an increase in the cytosolic Ca2+ concentration could not be linked to enhanced anion channel activity, but Ca2+ signals were related to large anion currents in responses to darkness. The important role of anion channels for inducing stomatal closure suggests that their deactivation is a prerequisite for stomatal opening. Blue light provokes stomatal opening, at low photon flux densities, and thus should inhibit anion channels in guard cells. We were able to show that blue light indeed deactivates anion channels in Vicia faba and Arabidopsis thaliana. This response depends on phototropin blue light receptors, because it was not observed in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 double mutants. In addition to a blue light-specific response, stomata open in response to photosynthetically active radiation (PAR). The perception of PAR seems to depend mainly on a decrease of the intercellular CO2 concentration, which is caused by photosynthetic activity of the mesophyll (Roelfsema et al., 2002). In agree with this proposed mechanism, we observed no response to PAR in guard cells located in albino leaf areas of Chlorophytum comosum and bleached Vicia faba, even though guard cells of Chlorophytum comosum in albino areas contain functional chloroplasts. We further studied the role of CO2 in the PAR response with NtMPK4 antisense plants. Stomata of NtMPK4 silenced plants did not respond to changes in the atmospheric CO2 concentration and showed a strongly reduced response to PAR. These data thus confirms the important role of intracellular CO2 in the PAR response, but also point to an additional PAR dependent signal for stomatal opening. KW - Elektrophysiologie KW - Ionenkanal KW - Abscisinsäure KW - Phototropine KW - Schließzellen KW - CO2 Reaktion KW - Phototropins KW - Guard Cells KW - CO2 Response KW - Abscisic Acid Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29349 ER - TY - THES A1 - Efetova, Marina T1 - Molekulare Mechanismen einer wechselseitigen Kontrolle der Arabidopsis-Agrobacterium-Interaktion T1 - Bidirectional control of Arabidopsis-Agrobacteria interactions; an analysis of underlying molecular mechansisms. N2 - Phytohormone sind wichtige Signalmoleküle bei der durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Tumorgenese. Zum einen sind sie direkt am onkogenen Prozess beteiligt, indem sie die Proliferation von transformierten Zellen fördern und physiologische Anpassungen im entstehenden Tumor steuern. Auf der anderen Seite vermitteln Phytohormone aber auch Abwehrreaktionen der Pflanze als Folge eines Befalls mit onkogenen Pathogenen. Um diese verschiedenen Wirkungen der Phytohormone während der Tumorgenese besser zu verstehen, wurde die Genexpression durch Microarrays zu unterschiedlichen Zeitpunken dieses Prozesses an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert und die Rolle ausgewählter Phytohormone, wie Abscisinsäure, Salizylsäure, Jasmonsäure, Ethylen und H2O2 durch Mutanten in entsprechenden Signalwegen funktionell untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die bekannten Pathogenabwehrwege bei Befall durch onkogene Agrobacterien mit einer zeitlichen Verzögerung aktiviert werden. Diese Verzögerung wird wahrscheinlich durch das vom Bakterium abgegebene Auxin reguliert, und somit könnte dieses Auxin die Integration der T-DNA indirekt fördern. Sind die pflanzlichen Abwehrmechanismen jedoch vor dem Transformationsprozess aktiviert, wie z.B. in cpr5–Mutanten, kann die T-DNA nicht integrieren und es entsteht kein Tumor. Beim Wildtyp akkumulieren in Folge der T-DNA Integration mit Pathogenabwehr assoziierte Signalmoleküle, wie H2O2, Ethylen und Salizylsäure, nicht aber Jasmonsäure. Die Analyse des Tumorwachstums an Mutanten mit unterschiedlichen Defekten in diesen Signalwegen zeigte jedoch, daß Ethylen und Salizylsäure keinen Einfluß auf das Tumorwachstum haben. Vielmehr regulieren Ethylen und H2O2 morphologische Anpassungen und Adaptationen an Trockenstress in Tumoren. Die von Agrobacterium tumefaciens induzierten Tumore beziehen außer Nährstoffe, vor allem Wasser von der Wirtspflanze. Das Fehlen einer intakten Epidermis oder Kutikula führt allerdings zu unkontrolliertem Wasserverlust. Da aber weder der Tumor noch die Pflanze welken, muss eine Trockenstressadaptation stattzufinden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phytohormone Abscisinsäure (ABA) und Ethylen an diesem Prozess beteiligt sind. Zum einen regulieren sie die Akkumulation von Osmoregulatoren, sowie Suberineinlagerungen in den äußeren Zellschichten des Tumors, wodurch eine dem Periderm ähnliche Schutzschicht entsteht. Diese Suberinisierung wird im Tumor wahrschein-lich von ABA induziert, wie Experimente an Arabidopsis Wurzeln belegten. Die Microarray-Analysen ergaben, dass im Tumor ein spezielles Muster an ABA- und Trockenstress-induzierten Markergene exprimiert wird, sowie einigen Aquaporinen, die den erhöhten Wasserbedarf des Tumors regulieren könnten. Das verminderte Tumorwachstum an abi- and aba-Mutanten belegt die Bedeutung von ABA-Signalen für die Homeostase des Wasser-haushalts im Tumor. N2 - Phytohormones are important signaling molecules involved in Agrobacterium tumefaciens mediated tumor development. On the one hand, they are directly involved in the infection process by supporting proliferation of transformed plant cells and mediating physiological adaptations of the developing tumor. On the other hand, phytohormones also mediate defense responses of the host plant upon bacterial infection. In order to get further insight into these supplementary roles of phytohormones during tumor development, microarray techniques have been used to analyze changes in gene expression of Arabidosis thaliana upon infection with Agrobacterium tumefaciens at distinct time points during tumor development. The functional relevance of selected phytohormones, e.g. abscisic acid, salicylic acid, jasmonic acid, ethylene and H2O2 was analyzed by the use of Arabidopsis mutants with defects in the respective signaling pathways. This work suggests a delayed activation of the well known defence response pathways to take place upon infection by agrobacteria. This delay is most likely mediated by auxin, which is synthesized and secreted by the bacteria. Hence, auxin indirectly promotes T-DNA integration by causing delay of the plant´s defence responses. However, if pathogen defence is active before agrobacterial infection, e.g. in cpr5 mutant plants, T-DNA integration is prevented and tumor growth cannot be observed. Signaling molecules associated with defence responses, e.g. H2O2, ethylene and salicylic acid, but not jasmonic acid accumulate due to T-DNA integration in wild type plants. However, Arabidopsis mutants with defects along the ethylene or salicylic acid signalling pathways revealed wild type like tumor development neglecting their involvement in tumor associated defence responses. Rather, this work supports the hypothesis that ethylene and H2O2 are involved in regulating tumor morphology and drought stress adaptations. Crown gall tumours induced by Agrobacterium tumefaciens represent a sink that is provided with nutrients and water by the host plant. The lack of an intact epidermis or cuticle results in uncontrolled loss of water. However, neither the tumor nor the host plant display wilting. This phenomenon points to drought stress adaptations in both, tumours and the host plant. In order to understand the protecting molecular mechanisms against desiccation, the gene expression pattern of Arabidopsis thaliana tumors was compared with the profile of stress metabolites: Arabidopsis tumors accumulated high amounts of ABA, the ethylene precursor ACC, osmoprotectants and form a suberized periderm-like layer. Suberization of the outer tumor cell layers most likely is mediated by ABA since external application of ABA induced suberization of Arabidopsis roots. However, the expression level of the classical marker genes, known to respond to drought stress and/or ABA, was lower in tumors. Instead another set of drought and/or ABA-inducible genes, was higher transcribed. Elevated transcription of several ABA-dependent aquaporin genes might indicate that ABA controls the water balance of the tumor. The retarded tumor growth on abi and aba mutant plants underlined the importance of a tumor-specific ABA signaling pathway. Taken together, we propose that ABA is an important signal for protection of tumors against desiccation and thus supports tumor development. KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Arabidopsis KW - Phytohormone KW - Pathogenabwehr KW - Trockenstress KW - Agrobacterium KW - crown gall KW - defence response KW - innate immunity KW - dehydration Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28475 ER - TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Konrad, Kai Robert T1 - Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba T1 - Investigation of the early ABA-induced electric responses of Vicia faba guard cells N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren. N2 - Within the framework of this dissertation the perception and early signal transduction chain of the phytohormon ABA was investigated with the Patch-Clamp-technique in Vicia faba guard cell protoplasts. It was discovered that the ABA-signalling chain to activate plasma-membrane anion channels likely implied a protein kinase and was triggered through a cytosolic ABA-perception. The ABA-induced anion channel activation leads to plasma membrane depolarization. Based on the ABA-evoked depolarization response a method was developed to monitor and quantify membrane potential changes in populations of Vicia faba guard cell protoplasts with the voltage-sensitive dye DiBAC4(3). KW - Schließzelle KW - Membranpotenzial KW - Anionentranslokator KW - Ackerbohne KW - Abscisinsäure KW - DiBAC4(3) KW - guard cell KW - anion channel KW - membrane potential KW - abscisic acid KW - DiBAC4(3) Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27216 ER - TY - THES A1 - Zabka, Vanessa T1 - The Plasticity of Barley (Hordeum vulgare) Leaf Wax Characteristics and their Effects on Early Events in the Powdery Mildew Fungus (Blumeria graminis f.sp. hordei): Interactive Adaptations at the Physiological and the Molecular Level T1 - Die Plastizität von Blattwachsen der Gerste (Hordeum vulgare) und deren Effekte auf initiale Ereignisse der Mehltaukrankheit (Blumeria graminis f.sp. hordei): wechselseitige Anpassungen auf physiologischer und molekularer Ebene N2 - In order to test the effects of environmental factors on different characteristics of plant leaf waxes, barley plants (Hordeum vulgare) were abiotically stress treated (exposure to darkness, heavy metal, high salt concentrations and drought), and biotically stressed by the infection with powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei; Bgh). Different wax parameters like amount, chemical composition, and micromorphology of epicuticular wax crystals, were investigated. Etiolated leaves of barley showed distinctly reduced wax amounts and modifications in their relative composition. The alterations of these wax parameters might be a result of a developmental delay, which could have been caused by a decreased availability of energy for cellular processes, due to lack of light. Cadmium exposure led to a 1.5-fold increase of wax amount, while chemical composition was unaffected. In drought- and salt-stressed plants, all investigated leaf wax parameters remained unaltered. In each of the abiotic treatments, the microstructure of epicuticular wax crystals, formed as typical platelets, was not modified. Even after 6d infection with powdery mildew (Bgh), neither locally nor systemically enforced modifications of wax features were revealed. The analyzed leave surfaces, resulting from these four abiotic and the biotic treatment (phenotypic approach), were compared to altered leaf surfaces’ characteristics of 18 analyzed eceriferum (cer-) wax mutants (genotypic approach). Within the screening, 5 mutants were selected which distinctly differed from the wild-type in wax amount, portions of epi- and intracuticular wax fraction, relative chemical composition, crystal morphology, and surface wettability (hydrophobicity). Apart from quantitative and qualitative effects on the leaf waxes, environmentally enforced modifications in cuticular waxes might be reflected in molecular processes of wax biogenesis. Therefore, a barley wax-microarray was established. 254 genes were selected, which are putatively involved in processes of de novo fatty acid biosynthesis, fatty acid elongation, and modification, and which are supposed to take part in lipid-trafficking between cell compartments, and transport of wax components to the outer cell surface. The regulations within the expression pattern evoked by the respective treatments were correlated with the corresponding analytical wax data, and the observed molecular effects of a 3d powdery mildew infection were compared with succeeding fungal morphogenesis. Etiolation and cadmium exposition pointed to transcriptional modifications in the de novo fatty acid synthesis, and in the screened, transport-related mechanisms, which correlate with respective alterations in surface wax characteristics. Moderate changes in the gene expression pattern, evoked by drought- and salinity-stress, might give hints for evolved adaptations in barley to such common habitat stresses. Theinvasion of powdery mildew into the epidermal host cells was reflected in the regulation of several genes. Beside other functions, these genes take part in pathogen defense, and intracellular component transport, or they encode transcription factors. The different modifications within the molecular responses evoked by the investigated abiotic treatments, and the effects of powdery mildew infection representing a biotic stressor, were compared between the different treatments. In order to test the potential impact of different wax parameters on Bgh, conidia germination and differentiation was comparably investigated on leaf surfaces of abiotically stressed wild-type and cer-mutants, isolated cuticles, and further artificial surfaces. The rates of conidial development were similar on each of the leaf surfaces resulting from the abiotic treatments, while a significant reduction of the germination and differentiation success was revealed for the wax mutant cer-yp.949. Compared to the wild-type, developmental rates on isolated cuticles and extracted leaf waxes of the mutant cer-yp.949 indicated a modified embedding of cuticular waxes, and a possibly changed three-dimensional structure of the cer-yp.949 cuticle, which might explain the reduced conidial developmental rates on leaf surfaces of this particular mutant. Experiments with Bgh conidia on mechanically de-waxed leaf surfaces (selective mechanical removal of the epicuticular leaf waxes with glue-like gum arabic, followed by an extraction of the intracuticular wax portion with chloroform) demonstrated the importance of the wax coverage for the germination and differentiation of the fungal conidia. On all dewaxed leaf surfaces, except those of cer-yp.949, the differentiation success of the germlings was significantly reduced, by about 20% (“wax-effect”). This result was verified through an artificial system with increased conidia developmental rates on glass slides covered with extracted leaf waxes. Further comparative tests with the major components of barley leaf wax, hexacosanol and hexacosanal, showed that the germination and differentiation of powdery mildew conidia not only depends on the different chemistry, but is also influenced by the respective surface hydrophobicity. Compared to hexacosanol, on hexacosanal coated glass surfaces, higher germination and differentiation rates were achieved, which correlated with increased levels of surface hydrophobicity. Developmental rates of conidia on hydrophobic foils demonstrated that hydrophobicity, as a sole surface factor, may stimulate the conidial germination and differentiation processes. Moreover, the survival of conidia on artificial surfaces is determined by additional surface derived factors, e.g. the availability of water, and a pervadable matrix. N2 - Abiotische und biotische Umweltfaktoren können sowohl die Struktur als auch die chemischen Eigenschaften pflanzlicher Oberflächenwachse beeinflussen. In der vorliegenden Studie wurde vergleichend untersucht, inwiefern sich verschiedene Parameter von Gersten (Hordeum vulgare) Blattwachsen, wie deren Menge, chemische Zusammensetzung und die Morphologie epikutikulärer Wachskristalle unter dem Einfluss unterschiedlicher abiotischer Stressoren (Wachstum in Dunkelheit, Schwermetallbelastung, erhöhte Salzkonzentrationen, Trockenheit) und eines biotischen Stressors, dem Befall von Gerstenmehltau (Blumeria graminis fsp. hordei; Bgh), verändern können. Die Aufzucht ohne natürliches Licht führte zu etiolierten Blättern, die deutlich reduzierte Wachsmengen und quantitative Veränderungen in der Zusammensetzung einzelner Wachskomponenten zeigten. Die Veränderung dieser Wachscharakteristika könnte das Resultat einer pflanzlichen Entwicklungsverzögerung darstellen, die auf den Mangel an Licht, und damit einem Mangel an Energie für die zelluläre Triebkraft zurückzuführen ist. Cadmium-Belastung führte zu einer 1.5-fach erhöhten Wachsauflage der Versuchspflanzen bei unveränderter Chemie. Unter Trocken- und Salzstress zeigten sich keine Veränderungen der untersuchten Wachsparameter. Die plättchenförmige Kristallstruktur der epikutikulären Wachse blieb in jeder der untersuchten abiotischen Behandlungen unverändert. Um Auswirkungen von biotischem Stress auf die Wachsauflage zu testen, wurde eine Infektion mit Gerstenmehltau (Bgh) vorgenommen. Nach sechstägiger Pilzinfektion konnten hierbei weder lokale, noch systemische Veränderungen der unterschiedlichen Wachsparameter der Gerstenblätter detektiert werden. Zusätzlich zu solchen Blattoberflächen, die aus den vier abiotischen und der biotischen Behandlung resultierten (phänotypischer Ansatz), wurden die Oberflächenwachse von 18 cer-Wachsmutanten untersucht (genotypischer Ansatz). Hieraus wurden diejenigen fünf Mutanten ausgewählt, die die stärksten Abweichungen an Wachsmengen, Mengenverteilung zwischen epi- und intrakutikulärer Wachsfraktion und/ oder Anteilen der Einzelkomponenten, der Morphologie der epikutikulären Wachskristalle, und somit auch in der davon abhängenden Oberflächenbenetzbarkeit (Hydrophobizität) gegenüber dem Wildtyp aufwiesen. Um zu überprüfen, inwiefern sich die Modifizierung der Oberflächenwachse durch Umweltfaktoren in den zugrunde liegenden molekularen Prozessen der Wachsbiosynthese widerspiegelt, wurde ein Gerstenwachs-Microarray etabliert. Eine Auswahl von 254 Genen wurde zusammengestellt, denen potentiell Funktionen in der Fettsäurebiosynthese, Kettenverlängerung von Fettsäuren und deren Modifikation zu Wachskomponenten, sowie im Transport von Lipid- und Wachskomponenten zwischen den Zellkompartimenten zukommen. Die Veränderung der Expression einzelner Gene während der abiotischen Stress-Behandlungen wurde mit den Daten der Wachsanalyse dieser Behandlungen korreliert, sowie der Einfluss einer dreitägigen Mehltauinfektion auf molekulare Prozesse der Wirtspflanze mit der Pilzmorphogenese kombiniert. Hinweise auf transkriptionelle Veränderungen in der de novo Fettsäuresynthese und den untersuchten Transportmechanismen, die mit den Veränderungen der Oberflächenwachse korrelieren, waren insbesondere unter Cadmiumstress und durch Etiolierung zu verzeichnen. Die durch Trocken- und Salzstress verursachten, moderaten Veränderungen im Expressionsmuster untersuchter Gene könnten auf eine erworbene Toleranz von Gerste gegenüber solcher Art von Umweltstress hinweisen. Das Eindringen des Pilzes in die Epidermis spiegelte sich in zahlreichen Genregulierungen wider, die besonders der Pathogenabwehr und dem intrazellulären Komponententransport dienen, oder Transkriptionsfaktoren codieren. Der Einfluss der untersuchten abiotischen Faktoren und der Pilzbefall als biotischer Stressor lösten unterschiedliche Modifikationen der molekularen Antworten aus, die miteinander verglichen wurden. Um zu klären welche Wachsparameter die Auskeimung und Differenzierung der Konidien von B. graminis beeinflussen, wurden alle analysierten Blattoberflächen (abiotisch gestresster Wildtyp und cer-Mutanten) und weitere artifizielle Oberflächen in Biotests eingesetzt. Auf allen Blattoberflächen des abiotisch behandelten Wildtyps war die Konidienentwicklung gleichermaßen erfolgreich, während sich innerhalb des genotypischen Ansatzes eine signifikante Reduktion des Keimungs- und Differenzierungserfolgs auf Blättern der Mutante cer-yp.949 zeigte. Durch vergleichende Untersuchungen mit isolierten Kutikeln und extrahierten Blattwachsen von Wildtyp und der Mutante cer-yp.949 konnte gezeigt werden, dass der herabgesetzte Entwicklungserfolg der Konidien auf Blättern der Mutante cer-yp.949 auf eine modifizierte Einbettung der Wachse und eine veränderte dreidimensionale Struktur der cer-yp.949 Kutikula zurückzuführen sein könnte. Untersuchungen zur Entwicklung von Konidien auf sukzessiv entwachsten Blattoberflächen von Wildtyp und Mutanten (zunächst mechanisches Abheben der epikutikulären Wachskristalle durch Gummi arabicum, gefolgt von einer Extraktion der intrakutikulären Wachse mit Chloroform) zeigte die Bedeutung des Vorhandenseins von Wachs für die Auskeimung und Differenzierung der Konidien. Mit Ausnahme der Mutante cer-yp.949 wurde der Differenzierungserfolg der Konidien auf allen Blattflächen durch Wachsextraktion signifikant um ca. 20% reduziert („Wachseffekt“). Durch die Beschichtung von Glasobjektträgern mit extrahierten Blattwachsen konnte dieses Ergebnis auf ein artifizielles System übertragen und bestätigt werden. Zusätzliche Tests mit den Hauptkomponenten der Gerstenwachse Hexacosanol und Hexacosanal zeigten, dass Auskeimung und Differenzierung von Mehltau-Konidien von der unterschiedlichen Chemie, und auch von der Hydrophobizität der Oberfläche beeinflusst werden. Im Vergleich mit Hexacosanol zeigten Hexacosanal beschichtete Glasoberflächen sowohl den größten Keimungs- und Differenzierungserfolg, als auch die höchste Hydrophobizität. Entwicklungsraten auf hydrophoben Folien bestätigten, dass allein die Hydrophobizität der Oberfläche die Auskeimung und die Differenzierung der Konidien stimulieren kann. Das Überleben der Konidien auf artifiziellen Oberflächen wird darüber hinaus durch weitere Faktoren wie Wasserverfügbarkeit und eine durchdringbare Matrix bestimmt. KW - Mehltau KW - Gerstenkrankheit KW - Konidie KW - Keimung KW - Morphogenese KW - Wachs KW - Microarray KW - Differentielle Genexpression KW - powdery mildew desease KW - conidial differentiation KW - leaf wax analysis KW - microarray KW - wax biosynthesis KW - gene expression Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26402 ER - TY - THES A1 - Gupta, Kapuganti Jagadis T1 - Nitric oxide in plants: Investigation of synthesispathways and role in defense against avirulent Pseudomonas N2 - Die Zahl der physiologischen Prozesse in Pflanzen, die scheinbar durch NO reguliert werden, hat in den letzten Jahren stark zugenommen. NO übernimmt wichtige Rollen für die Steuerung von Wachstum und Entwicklung, für die Pathogenresistenz und bei abiotischem Stress, sowohl in unterirdischen als auch in oberirdischen Organen. In Pflanzen wurden bisher eine Reihe verschiedener enzymatischer und einige wenige nichtenzymatische Synthesewege für NO vorgeschlagen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand nun darin, die NO Produktion von Pflanzen und speziell von Wurzeln möglichst quantitativ zu erfassen und die beteiligten Enzyme zu identifizieren. Dieses Ziel sollte vor allem durch Chemilumineszenz-Messung von NO in der Gasphase (= direkte Chemilumineszenz) erreicht werden, aber auch durch die indirekte Chemilumineszenz, bei welcher Spuren von NO-Oxidationsprodukten wie Nitrat und Nitrit erfasst werden. Als Versuchspflanzen wurden verwendet: Wildtypen von Nicotiana tabacum cv. Xanthi oder cv. Gatersleben; Nitratreduktase-freie, auf Ammonium-N angezogene Mutanten, die keine Nitratreduktase (NR) induzieren; WT Pflanzen, die auf Wolframat angezogen wurden um die Synthese funktionaler MoCo-Enzyme zu unterbinden; eine NO-überproduzierende, Nitritreduktase (NiR)-freie Transformante, sowie gelegentlich Gerste, Reis und Erbsen. Eine hypersensitive Reaktion (HR) von Tabak wurde erzeugt durch Druckinfiltration von avirulenten Bakterien des Stammes Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Bei Sauerstoffkonzentrationen ≤1% wurde exogenes Nitrit auch von völlig NR-freien Wurzeln zu NO reduziert. Folglich war NR nicht die einzige NO-Quelle von Wurzeln. Im Gegensatz dazu waren NR-freie Blattstreifen nicht in der Lage, Nitrit zu NO umzusetzen. Die NO-Bildung von Wurzeln wurde außerdem durch Hemmstoffe des mitochondrialen Elektronentransportes, Myxothiazol und Salicylhydroxamsäure (SHAM) gehemmt, während die NO-Produktion von NR-exprimierenden Blattstreifen gegen diese Inhibitoren unempfindlich war. Damit stimmte auch überein, dass gereinigte Mitochondrien aus Wurzeln, aber nicht die aus Blättern Nitrit mit Hilfe von NADH zu NO reduzieren konnten. Die Inhibitor-Wirkung lässt darauf schließen, dass in Wurzelmitochondrien beide terminalen Oxidasen and der NO-Bildung beteiligt sind, und dass selbst in NR-haltigen Wurzeln ein großer Teil der Reduktion von Nitrit zu NO durch die Mitochondrien bewerkstelligt wird, und weniger durch NR selbst. Die Unterschiedliche Fähigkeit von Blatt-und Wurzelmitochondrien zur anaeroben Nitrit:NO-Reduktion wurde nicht nur bei Tabak, sondern auch bei Arabidopsis, Gerste und Erbse gefunden. Sie scheint also eine generelle Eigenschaft höherer Pflanzen zu sein. Die Nitrit:NO Reduktion wurden auch direkt als Nitrit- bzw. NADH-Verbrauch gemessen. Die Reaktion war außerdem exklusiv mit der Membranfraktion der Mitochondrien assoziert, ohne jede Beteiligung von Matrixkomponenten. Es wurde auch geprüft, ob Wurzelmitochondrien und- gereinigte Membranen NO ausschließlich aus Nitrit produzierten, oder eventuell auch über eine NO-Synthase (NOS). Außerdem wurde untersucht, ob und in welchem Umfang die NO-Messungen durch eine NO-Oxidation verfälscht werden konnten. Zusätzlich zur Chemilumineszenz wurden Fluoreszenzmessungen mit Diaminofluoreszeinen (DAF) zum Vergleich herangezogen. In Luft produzierten Mitochondrien ja kein Nitrit-abhängiges NO, und eine NOS-Aktivität konnte weder durch direkte noch durch indirekte Chemilumineszenz nachgewiesen werden. Mit DAF-2 oder DAR-4M wurde jedoch eine L-Arginin-abhängige Fluoreszenzerhöhung beobachtet. Diese scheinbare NOS-Aktivität wurde mit kommerzieller iNOS verglichen und zeigte dabei sehr untypische Antworten auf NOS-Inhibitoren, Substrate und Kofaktoren. Sie wird deshalb als Artefakt beurteilt. Bei Verwendung von iNOS wurden ca. 2/3 des insgesamt produzierten NO zu (Nitrit+Nitrat) oxidiert. Mitochondrien scheinen NO zu verbrauchen, ohne jedoch die Oxidation von NO zu (Nitrit+Nitrat) zu erhöhen. Vermutlich wird dabei ein flüchtiges Intermediat gebildet (eventuell N2O3). In unserer Gruppe wurde kürzlich gezeigt, dass der pilzliche Elicitor Cryptogein eine hypersensitive Reaktion (HR) bei Tabak hervorrief, die völlig unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von NR war. Eine Schlussfolgerung daraus war, dass die NR-abhängige NO-Bildung für die HR keine Rolle spielte. Hier präsentieren wir Hinweise darauf, dass dieses Szenario Cryptogein-spezifisch sein könnte. Pseudomonas syringae pv phaseolicola wurde in Tabakblätter des Wildtyps und derNiR-defizienten, NO-überproduzierenden Mutante (clone 271) infiltriert, die entweder auf Ammonium oder auf Nitrat angezogen waren. Es wurde die Entwicklung der Läsionen, das Bakterienwachstum und die Zuckerkonzentrationen in den Blättern und im Blattapoplasten verfolgt. Die Läsionen-Entwicklung war positiv, und das Bakterienwachstum negativ korreliert mit der Nitrat-Ernährung und einer eventuellen NO-Produktion. Das Bakterienwachstum war positiv korreliert mit einer Ammonium-Ernährung und mit apoplastischen Zuckerkonzentrationen. Der Gesamtgehalt an freier + konjugierter Salicylsäure (SA) war durch bakterielle Infektion immer drastisch gesteigert, aber ohne klare Korrelation mit einer NO-Produktion. In Gegenwart von Cryptogein war das Wachstum von Pseudomonas fast völlig gehemmt. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die vermutete gegenseitige Abhängigkeit von Bakterienwachstum, NO-Produktion und der HR sehr komplex ist und nicht auf einfache unifaktorielle Beziehungen reduziert werden kann. N2 - During the last few years an increasing number of physiological processes in plants have been shown to be regulated by NO. NO plays important roles in growth and development, plant disease resistance, abiotic stress, and in above and underground plant organs. In recent years several enzymatic pathways and few non-enzymatic pathways were proposed for nitric oxide production in plants. The major goal of this work was to quantify NO production by plants and especially by roots, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by roots was followed through on-line measurement of NO emission into the gas phase by chemiluminescence (= direct chemiluminescence), and also by indirect chemiluminescence where trace amounts of oxidized products like NO2- and NO3- can be easily measured. Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCo-enzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant as well as barley, rice and pea. Induction of a hypersensitive response (HR) in tobacco leaves was achieved by using avirulent Pseudomonas syringae pv phaseolicola. At oxygen concentrations of <1%, even completely nitrate reductase (NR)-free root tissues reduced added nitrite to NO, indicating that in roots, NR was not the only source for nitrite-dependent NO formation. By contrast, NR-free leaf slices were not able to reduce nitrite to NO. Root NO formation was blocked by inhibitors of mitochondrial electron transport (Myxothiazol and SHAM), whereas NO formation by NR containing leaf slices was insensitive to the inhibitors. Consistent with that, mitochondria purified from roots, but not those from leaves, reduced nitrite to NO at the expense of NADH. The inhibitor studies suggest that, in root mitochondria, both terminal oxidases participate in NO formation, and they also suggest that even in NR-containing roots, a large part of the reduction of nitrite to NO was catalysed by mitochondria, and less by NR. The differential capacity of root and leaf mitochondria to reduce nitrite to NO appears to be common among higher plants, since it was observed with Arabidopsis, barley, pea, and tobacco. Nitrite and NADH consumption by mitochondria were also measured. Anaerobic, nitrite-dependent NO emission was exclusively associated with the membrane fraction, without participation of matrix components. It was also examined whether root mitochondria and mitochondrial membranes produce nitric oxide (NO) exclusively by reduction of nitrite or also via a nitric oxide synthase (NOS),- and to what extent direct NO measurements could be falsified by NO oxidation. In addition to chemiluminescence, Diaminofluoresceins (DAF) were used as an NO indicators for comparison. In air, mitochondria apparently produced no nitrite-dependent NO, and no NOS activity was detected by direct or indirect chemiluminescence. In contrast, with DAF-2 and DAR-4M an L-arginine-dependent fluorescence increase took place. However, the response of this apparent NOS activity to inhibitors, substrates and cofactors was untypical when compared with commercial iNOS and is considered an artefact. With iNOS, about 2/3 of the NO were oxidized to (nitrite + nitrate). Mitochondria also appear to consume NO without increasing oxidation to (nitrite+ nitrate). We therefore assume formation of NO to a volatile intermediate (eventually N2O3). It was recently shown that the hypersensitive response (HR) of tobacco triggered by the fungal elicitor cryptogein occurred independent of the presence or absence of nitrate reductase (NR). One conclusion was that NR-dependent NO formation played no role in the HR. Here we present evidence that the described scenario may be specific for cryptogein. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was infiltrated into tobacco leaves from WT plant and from the NiR-deficient NO-overproducing clone 271, grown either on nitrate or ammonium. Lesion development as well as bacterial growth and sugar concentrations in leaves and in the leaf apoplast was monitored. Lesion development was positively and bacterial growth was negatively correlated with nitrate nutrition and eventually with NO formation. Bacterial growth was positively correlated with ammonium nutrition and apoplastic sugar concentrations. Total (free and conjugated) SA content were always drastically increased by bacterial infection, but there was no clear correlation with NO production. In the presence of cryptogein, Pseudomonas growth was drastically reduced. This shows that the assumed interdependence of bacterial growth, NO production and the HR is complex and not unifactorial. KW - Pflanzen KW - Nitric Oxide KW - Mitochondria KW - Nitrate Reductase KW - Nitric Oxide Synthase KW - Nitrite KW - Stickstoffoxide KW - Stickstoffoxidsynthase KW - Mitochondrium KW - Nitratreduktase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25545 ER - TY - THES A1 - Travers-Martin, Nora Verena T1 - The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of Brassicaceae with the turnip sawfly Athalia rosae(L.) T1 - Die Rolle des Glucosinolat-Myrosinase Systems bei der Interaktion von Brassicaceae mit der Rübsenblattwespe Athalia rosae (L.) N2 - Brassicaceae and a few related plant families are characterized by possession of the glucosinolate-myrosinase system. Glucosinolates are amino-acid derived allelochemicals which are hydrolysed upon tissue damage by myrosinase enzymes to produce various degradation products which can be toxic for generalist insects. The larvae of the crucifer-specialist Athalia rosae, the turnip sawfly, sequester glucosinolates into their haemolymph. The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of the turnip sawfly with Brassicaceae was examined in this study from two different perspectives: variation within individual plants and between plant species. The plant responses to the feeding by herbivores and the short-term effects this induction had on insect behaviour were investigated in white mustard. Furthermore, plants can use multiple defences. Hence correlations of glucosinolates and myrosinase activities with other defences and nutritional quality and their long-term effects on the development of the insects were investigated in seven different plant species. N2 - Die Brassicaceen und einige nah verwandte Pflanzenfamilien zeichnen sich durch den Besitz des Glucosinolat-Myrosinase Systems aus. Glucosinolate sind von Aminosäuren abgeleitete Allelochemikalien, die nach Gewebezerstörung von Myrosinaseenzymen hydrolysiert werden. Die entstehenden Abbauprodukte wirken auf generalistische Insekten toxisch. Larven der auf Brassicaceen spezialisierten Rübsenblattwespe, Athalia rosae, sequestrieren Glucosinolate in ihre Hämolymphe. In der vorliegenden Studie wird die Rolle des Glucosinolat-Myrosinase Systems für die Interaktion von Brassicaceen mit der Rübsenblattwespe aus zwei unterschiedlichen Perspektiven untersucht: Variationen innerhalb einzelner Pflanzen und zwischen verschiedenen Pflanzenarten. Die pflanzliche Antwort innnerhalb einzelner Individuen auf Herbivorenfraß und deren kurzzeitige Auswirkungen auf das Insektenverhalten wurden am Weißen Senf untersucht. Des Weiteren nutzen Pflanzen multiple Abwehrmethoden. Daher wurden Korrelationen des Glucosinolat-Myrosinase Systems mit anderen Abwehrmethoden und mit dem Nährstoffgehalt der Pflanzen sowie deren langfristige Effekte auf die Entwicklung der Insekten an sieben verschiedenen Pflanzenarten untersucht. KW - Glucosinolate KW - Chemische Ökologie KW - Myrosinase KW - Insekten KW - Pflanzen-Insekten Interaktionen KW - Glucosinolates KW - Myrosinase KW - Insects KW - Chemical Ecology KW - Plant-Insect Interactions Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25335 ER - TY - THES A1 - Latz, Andreas T1 - Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana T1 - Localization, function and regulation of plant tandem-pore potassium-channels in Arabidopsis thaliana N2 - Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden. N2 - Localization - All TPK´s with the exception of TPK4 are located in the tonoplast. TPK4 however is localized in the plasmamembrane. - The 14-3-3 binding motif and the whole N-terminus does not play a role in the targeting process because swapping the N-termini has no effect on the targeting - The C-terminus might harbour a targeting motif as well as an assembly domain TPK4 - TPK4 is expressed in Nicotiana benthamiana after agro-infiltration and is localized in the plasmamembrane. - The electrophysiological properties of TPK4 expressed in tobacco are similar to TPK4 expressed in oocytes of Xenopus laevis. TPK1 - TPK1 interacts with the 14-3-3 protein GRF6 in a phosphospecific and isotypspecific manner. - Interaction of TPK1 with GRF6 leads to channel activation. - The kinases CPK3 and CPK29 are able to phosphorylate the 14-3-3 binding motif of TPK1 in vitro. - These kinases are activated by elevated levels of free cytosolic calcium. - The phosphatase responsible for the dephosphorylation of the 14-3-3 binding domain of TPK1 belongs to the family of the PP2A proteinphosphatases. - It is possible that the kinases are activated under salt stress conditions and thereby phosphorylate the 14-3-3 binding domain of TPK1 leading to the interaction with GRF1 and activation of TPK1. - Germination is reduced under salt stress conditions and limited K+ supply in tpk1.3 and cpk3.1 knockout plants. KW - Ackerschmalwand KW - Signaltransduktion KW - Vakuole KW - Kaliumkanal KW - Salzstress KW - 14-3-3 KW - Calcium KW - Proteinkinase KW - 14-3-3 . calcium KW - protein kinase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24915 ER - TY - THES A1 - Ali, Walid Wahid T1 - Screening of plant suspension cultures for antimicrobial activities and characterization of antimicrobial proteins from Arabidopsis thaliana T1 - - N2 - Die zunehmende Resistenz humanpathogener Mikroorganismen gegen bekannte Antibiotika bedingt die Notwendigkeit, nach neuen Quellen für die Produktion antimikrobieller Stoffe zu suchen. Als eine solche Quelle gelten besonders Pflanzen, da viele antimikrobielle Stoffe bei der Abwehr gegen invasierende Mikroorganismen bilden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit besteht in der Charakterisierung von pflanzlichen Zellkulturen im Hinblick auf ihre Fähigkeit, anitimkrobielle Aktivität gegen humanpathogene Mikroorganismen zu entwickeln. Dabei sollen aktive Proteine aufgereinigt und die kodierenden Gene isoliert werden. Dazu wurden zehn verschiede pflanzliche Suspensionskulturen in Anwesenheit von neun Elicitoren auf ihre antimikrobielle Aktivität gegen fünf humanpathogene Mikroorganismen getestet. Dabei erwiesen sich die heterotrophen Kulturen im Vergleich zu den autotrophen als aktiver. Die höchste antimikrobielle Aktivität wurde bei der intrazellulären Fraktion der mixotrophen Kultur von Arabidopsis thaliana nach Elicitierung mit Salicylsäure nachgewiesen. Da in einem Präzipitat mit Ammoniumsulfat Aktivität gegen Candida maltosa nachgewiesen wurde, konnte angenommen werden, dass es sich bei der aktiven Komponente um ein Protein handelt. Durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation wurde eine partielle Aufreinigung dieser aktiven Komponente erreicht. Die proteinoide Natur wurde durch Bioautographie bestätigt und das Molekulargewicht auf ca. 26kDa geschätzt. Mittels Gelfiltration und Massenspektrometrie wurde das Protein aufgereinigt. Die Mikrosequenzierung ergab ein Protein mit bisher unbekannter Funktion, das eine pflanzliche Stressdomäne (PLAT) enthält. Das Protein wurde daraufhin als AtPDP1 (Arabidopsis thaliana Plat-Domain Protein 1) bezeichnet. Das Gen und ein zweites mit hochgradiger Homologie (AtPDP2) wurden in E. coli kloniert. Der Digital Northern zeigt an, das beide Gene durch verschiedene Pathogene induziert werden, sowie von Chemikalien, die pflanzliche Abwehr hervorrufen und weiterhin von Phytohormonen. Der Versuch, AtPDP1 unter die Kontrolle eines Promors einer Proteinase zu stellen, der Induzierbarkeit durch Elicitoren vermittelt, blieb erfolglos. Weiterhin wurden 13 Thaumatingene aus Arabidopsis thaliana in E. coli kloniert, da ihre antimikrobielle Aktivität bekannt ist, und ihre Expression durch verschiedene Stimuli induziert wird. Von diesen Genen zeigt der Digital Northern bei allen Stimuli eine maximale Expression für At1g75800, während At1g75050 minimal induziert ist. Diese Gene stehen für zukünftige Studien zur Verfügung. N2 - The continuously increase in resistance of human pathogenic microorganisms to the known antibiotics leads to the necessity for searching new sources for production of new active antimicrobial compounds from different natural sources especially plants, since many plants have been found to be able to produce antimicrobial compounds as a defense phenomenon against invading microorganisms. The aim of this work is to screen cultures for production of antimicrobial activity against representative of human pathogenic microorganisms and selection the most active cell culture producing antimicrobial protein(s) which are active against these pathogenic microorganisms and also isolation ,purification of the active protein(s) and cloning of its/their genes. Ten different plant suspension cultures have been screened in presence of nine elicitors for their antimicrobial activity against five selected human pathogenic microorganisms, and it has been found that the heterotrophic cultures are more active against the tester isolates than the autotrophic ones. The intracellular fraction of the mixotrophic Arabidopsis thaliana culture elicited with salicylic acid showed the highest antimicrobial activity against the tester isolates. The presence of proteinous antimicrobial activity has been elucidated by testing the activity of ammonium sulphate precipitate against Candida maltosa. High speed centrifugation technique has been used for partial purification of the active protein. The proteinous nature of the isolated compound has been confirmed by using bioautography technique and its molecular weight could be estimated to be around 26KDa. The active protein has been purified using gel filtration, and using mass spectrometry technique, for microsequencing of the active protein, it has been found that the function of the protein is unknown and we have termed it as AtPDP1 according to Arabidopsis thaliana Plat-Domain Protein1, since it contains a plant stress domain termed PLAT domain. It has been found that a second protein from the same plant with high homology level to AtPDP1 with the same domain, we termed it as AtPDP2. Genes for AtPDP1 and AtPDP2 have been cloned in E. coli using PGEM-T easy vector. The expression of both genes have been tested using Digital Northern program, and it has been observed that both genes are induced by different pathogens, chemicals known to induce defense in plant cells and also different hormones. We tried to clone the gene for AtPDP1 in PBI121 binary vector under the control of an elicitor inducible promoter of a proteinase inhibitor gene, to test its function in plant by overexpression, but we did not succeeded. Also the work aims to cloning the different known thaumatin genes from Arabidopsis thaliana for future work which represented by testing their expression under different stimuli, since most thaumatins have antimicrobial activity and some of them are active against Candida spp..Thirteen genes of known thaumatins from Arabidopsis thaliana have been cloned in PGEM-Teasy vector in DH5-alpha cells. coli cells. The expression of the thirteen genes has been done using Digital Northern program and it has been found that different genes show different expressions under different stimuli and the expression of At1g75800 gene was the maximum under all stimuli. The minimum expression of genes was for At1g75050. The rest of thaumatin genes showed moderate expressions under different stimuli. KW - - KW - Plant antimicrobial proteins KW - Arabidopsis thaliana KW - PLAT-Domain KW - Thaumatins Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24358 ER - TY - THES A1 - Nhan, Pham Phuoc T1 - Accumulation and biological activity of oxidized lipids in Anabaena PCC 7120 T1 - Akkumulation und biologische Aktivität von oxidierten Fettsäuren in Anabaena PCC 7120 N2 - Oxylipine sind wichtige biologisch aktive Verbindungen, die entscheidende Rollen in der Abwehr, dem Wachstum, der Entwicklung und der Reproduktion von Pflanzen und Tieren spielen. Oxylipine können entweder über enzymatische Wege oder eine Radikal-katalysierte Reaktion gebildet werden. Enzymatische und nicht-enzymatische Oxidationsprodukte der Arachidonsäure (C20:4) in Tieren sind Prostaglandine und Isoprostane. In Pflanzen werden ausgehend von der -Linolensäure (C18:3) über einen enzymatischen Weg OPDA und Jasmonsäure und durch Radikal-katalysierte Reaktion Phytoprostane gebildet. Die Membranen von Cyanobakterien enthalten, ähnlich denen von Pflanzen, einen großen Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, ca. 25% der gesamten Fettsäuren. Biosynthese und Funktionen der Oxylipine wurden an zwei Modell-Cyanobakterien, Anabaena PCC 7120 und Synechocystis PCC 6803 untersucht: 1. Das fadenförmige Cyanobakterium Anabaena PCC 7120 kann Phytoprostane Typ I und II sowie Hydroxyfettsäuren ähnlich wie Pflanzen produzieren aber die enzymatische Ausstattung zur Bildung von Jasmonaten (12-oxo-Phytodiensäure und Jasmonsäure) und Prostaglandinen ist nicht vorhanden. Die erhaltenen Daten stellen den ersten Nachweis für das Vorkommen von Phytoprostanen in Cyanobakterien bzw. bei Prokaryonten dar. 2. Durch GC-MS Analyse wurden E1- and F1-Phytoprostane in Anabaena PCC 7120 in freier und veresterter Form detektiert. Die Spiegel sind vergleichbar mit denen in Pflanzen und lagen im Bereich von ng/g TG. PPF1 ließen sich nicht in einwöchigen Kulturen nachweisen, die Spiegel in sechswöchigen Kulturen lagen bei 142 ng/l. Die Spiegel von PPE1 waren hingegen in ein- und sechswöchigen Kulturen ähnlich und lagen bei ca. 20 ng/g TG. Die Mengen an freien PPE1 in den Zellen waren mit 80.5  23.6 etwa viermal höher als die von PPF1 mit 24.1  10.9 ng/g TG. Allerdings gab es keine signifikanten Unterschiede in den Spiegeln an gesamten PPF1 und PPE1 in den Zellen, sie lagen im Bereich von 150 bis zu ca. 200 ng/g TG. 3. Die Akkumulation von Phytoprostanen in Anabaena ist induzierbar. Nach der Kombination von oxidativem Stress (200 µM H2O2 oder 10 µM CuSO4) und hoher Lichtintensität (330 µE.m-2.s-1) für 8 h stiegen die Spiegel an gesamten PPE1 und PPF1 um den Faktor 2 bis 4 an. Interessanterweise führte im Gegensatz zu höheren Pflanzen die Applikation von oxidativem Stress oder hoher Lichtintensität alleine nicht zur Induktion der Phytoprostanakkumulation in diesen Cyanobakterien. 4. Eine Vorbehandlung von Anabaena Zellen mit exogenen Phytoprostanen führte zu einer erhöhten Toleranz gegenüber oxidativem Stress. Alle Phytoprostane außer PPE1 zeigten einen Schutzeffekt. Eine Mischung von PPA1 Typ I und II ergab den höchsten Schutzeffekt. Eine Vorinkubation von Anabena Zellen mit 100 µM PPA1–type I/II für 16 h schützte 84.2% beziehungsweise 77.5% der Zellen vor einer anschießenden lethalen Applikation von 1 mM H2O2 beziehungsweise 50 µM CuSO4 für 5 h. Ohne eine Oxylipin-Vorinkubation starben etwa 98% der Zellen. Überraschenderweise ergab auch die Vorbehandlung mit anderen, enzymatisch gebildeten Oxylipinen aus Tieren und Pflanzen einen Schutzeffekt, der allerdings nur 10 bis 30% betrug. Dagegen schützte eine Phytoprostan-Vorbehandlung nicht Pseudomonas syringae und Escherichia coli gegen toxische Mengen von Wasserstoffperoxid. Allerdings fehlen in den Membranen dieser Bakterien mehrfach ungesättigte Fettsäuren und deshalb endogen oxydierte Lipide. 5. Eine exogene Applikation von 100 µM PPF1 oder 1,5 mM H2O2 führte in Anabaena nicht zu einer Induktion der Expression des isiA Gens. Oxylipin-Behandlungen zeigten auch keine Wirkung auf Shinorin- und Tocopherol-Spiegel in Anabaena. Die Applikation von 100 µM PPF1 für 6 h führte aber zu Änderungen im Proteinmuster in Anabaena. Der größte Teil der differentiellen Proteine wurde durch PPF1 herunterreguliert. Bei vielen dieser Proteine handelt es sich um photosynthetische Proteine. Da ein oxidativer Stress nur in der Kombination mit hoher Lichtintensität die Lipidperoxidation erhöht, könnte die negative Regulation der Photosynthese nach Erkennung von oxydierten Lipiden (Phytoprostanen) eine Überlebens-Strategie sein um Schäden durch peroxidierte Lipide zu vermeiden. 6. Tote Pflanzen könnten eine hauptsächliche Quelle der exogenen Phytoprostane in der natürlichen Umgebung von Anabaena sein. Trockenes Heu gibt PPE1 und PPF1 (11 µg/g TG) an die wässerige Umgebung ab. Anabaena ist ein typisches Cyanobakterium in Reisfeldern. Nach der Ernte bleiben meist die nicht genutzten Teile der Reispflanzen auf dem Feld. Diese könnten Phytoprostane abgeben, die wiederum einen Einfluß auf die Cyanobakterien im Reis-Ökosystem haben könnten. 7. Eine neue Kategorie von Oxylipinen, die Phytoprostane Typ III und IV, wurden in vitro identifiziert und quantifiziert. Die beiden Haupt-Phytoprostane, PPE1 und PPF1 (Typ III und IV), können durch die Autoxidation der -Linolensäure oder des Borretschsamenöls (enthält 25% der -Linolensäure) gewonnen werden. Nach 12 Tagen Autoxidation und anschließender Hydrolyse wurden aus 1 g Borretschsamenöl 112,71 ± 1,93 µg PPF1 und 3,80 ± 0,14 mg PPE1 isoliert. PPB1 und PPA1 (Typ III und IV) wurden durch Isomerisierung und Dehydratisierung von PPE1 hergestellt. Die Ausbeute von PPB1 lag bei 1,71 ± 0,04 mg/g Öl (Typ III) und 2,09 ± 0,12 mg/g Öl (Typ IV), die von PPA1 lag bei 8,38 ± 0,35 µg/g und 10,18 ± 0,30 µg/g Öl. 8. Es wurde eine schnelle HPLC-MS/MS Methode für die Analytik der Phytoprostane und Phytohormone entwickelt. Diese Methode wurde für die Quantifizierung von freien und veresterten E1- and F1-Phytoprostane Typ III und IV in Synechocystis PCC 6803 angewendet. Die Phytoprostane Typ III und IV sind in vivo in freier und veresterter Form vorhanden. Die Spiegel der gesamten PPE1 Typ III und IV in Synechocystis sind mindestens doppelt so hoch wie die von PPF1. Im Gegensatz zu Anabaena, waren PPE1 und PPF1 in ein- und sechswöchigen Kulturen von Synechocystis detektierbar. Die Spiegel an freien PPF1 im Medium (231,8 ± 36,2 ng/l) und in den Zellen (164,9 ± 15,2 ng/g TG) waren niedriger als die von PPE1 (1003,3 ± 365,2 ng/l und 2331,0 ± 87,7 ng/g TG). N2 - Oxylipins are important biological active compounds that play essential roles in defense, growth, development, and reproduction of plants and animals. Oxylipins are formed either by enzymatic pathways or radical catalyzed reaction from polyunsaturated fatty acids. Products of oxidation of arachidonic acid (C20:4) in animals by enzymatic and non-enzymatic pathways are prostaglandins and isoprostanes, respectively. In plants, radical catalyzed reaction of -linolenic acid (C18:3) forms phytoprostanes and enzymatic oxidation of this fatty acid produces OPDA and jasmonic acid. Like plants, cyanobacterial membranes contain a high ratio of polyunsaturated fatty acid, about 25% of total fatty acids. Oxylipin biosynthesis and function was studied in two model cyanobacteria, Anabaena PCC 7120 and Synechocystis PCC 6803, for the first time: 1. The filamentous cyanobaterium Anabaena PCC 7120 can naturally produce phytoprostanes type I and II as well as hydroxy fatty acids like in plants but lacks the enzymatic capacity to form jasmonates (12-oxo-phytodienoic acid and jasmonic acid) and prostaglandins. Data obtained provide the first evidence for the occurence of phytoprostanes in cyanobacteria as well as in the baterial kingdom. 2. By GC-MS analysis, the E1- and F1-phytoprostanes in Anabaena PCC 7120 were detected both in free and esterified form. Their levels are comparable with those in plants, in the range of ng/g DW. In one week old cultures, there was no evidence of PPF1 in the medium but its level accumulated up to 142 ng/l in six weeks old cultures. In contrast, PPE1 was stable over time, about 20 ng/g DW. Free cellular PPE1 was found about 4 times higher than that of PPF1, 80.5  23.6 and 24.1  10.9 ng/g DW, respectively. However, there was no significant difference in the total cellular levels of PPF1 and PPE1, ranging from 150 to about 200 ng/g DW. 3. Phytoprostanes are inducible in Anabaena. In the combination of oxidative stress (200 µM H2O2 or 10 µM CuSO4) with high light intensity (330 µE.m-2.s-1) for 8 h, levels of total cellular PPE1 and PPF1 were increased about 2 to 4 times. Interestingly, unlike in higher plants, application of oxidative stress or high light intensity alone showed no phytoprostaneous induction in this cyanobacterium. 4. When Anabaena cells were treated with phytoprostanes, Anabaena cells became remarkably resistant against subsequently applied – otherwise lethal – oxidative stress. All phytoprostanes displayed a high protective effect except for PPE1. The highest protection level was contributed by a mixture of PPA1 type I and II. After preincubation of Anabena cells with 100 µM PPA1–type I/II for 16 h followed by application of 1 mM H2O2 or 50 µM CuSO4 for 5 h, A1-phytoprostane pre-treatment protected 84.2% and 77.5% of the cells from cell death, respectively. Without oxylipins pre-treatment, about 98% of the cells were dead. Surprisingly, preincubation of Anabaena with other oxylipins derived from enzymatic pathway in plants and animals showed also an effect, however, the protection effect was low and ranged from 10 to 30%. In contrast, phytoprostanes did not protect Pseudomonas syringae and Escherichia coli from the toxicity of hydrogen peroxide. However, these bacteria do not synthesize polyunsaturated fatty acids and are therefore devoid of and not exposed to endogenously formed oxidized lipids. 5. Exogenous application of 100 µM PPF1 or 1.5 mM H2O2 for 90 min did not activate the expression of isiA in Anabaena. Oxylipins also displayed no effect on shinorine and tocopherol levels in Anabaena. However, application of 100 µM PPF1 for 6 h altered the protein expression in Anabaena. Most PPF1-modulated proteins are down-regulated and related to photosynthesis. Since oxidative stress only in combination with high light intensity increased lipid peroxidation, down-regulation of photosynthesis after recognition of oxidised lipids (phytoprostanes) may be a survival strategy of Anabaena to avoid damage by peroxidized lipids. 6. Dead plants may be the main source of (exogenous) phytoprostanes in the natural environment of Anabaena. Dry hay releases PPE1 and PPF1 (11 µg/g DW) into an aqueous environment. Anabaena is the typical cyanobacterium in paddy rice fields. After harvesting, most of uneconomical parts of rice plants are abundant on the field, which may release phytoprostanes that in turn might have an impact on cyanobacteria in the rice ecosystems. However, field research is needed to clarify this suspection. 7. A new class of oxylipins, phytoprostanes type III and IV, was identified and quantified in vitro. The two main phytoprostanes, PPE1 and PPF1 (type III and IV), can be obtained by autoxidation of -linolenic acid or Borage oil (containing 25% esterified -linolenic acid). After 12 days of autoxidation and subsequent hydrolysis, 1 g of Borage oil yielded 112.71 ± 1.93 µg of PPF1 and 3.80 ± 0.14 mg of PPE1. PPB1 and PPA1 (type III and IV) were prepared by isomerization and dehydration of PPE1 (type III and IV). The overall yield of PPB1 was 1.71 ± 0.04 mg/g oil (type III) and 2.09 ± 0.12 mg/g oil (type IV). Those of PPA1 were 8.38 ± 0.35 µg/g and 10.18 ± 0.30 µg/oil, respectively. 8. A rapid HPLC-MS/MS method for phytoprostane and phytohormone analysis has been developed. This method was applied to quantify free and esterified E1- and F1-phytoprostanes type III and IV in Synechocystis PCC 6803. The in vivo phytoprostanes type III and IV are present both in free and esterified form. The total cellular level of PPE1 type III and IV in Synechocystis is at least 2 times higher than that of PPF1. Unlike Anabaena, PPE1 and PPF1 were detectable in the medium of one week old Synechocystis cultures. Free levels of PPF1 in the medium (231.8 ± 36.2 ng/l) and in the cells (164.9 ± 15.2 ng/g DW) are lower than those of PPE1 (1003.3 ± 365.2 ng/l and 2331.0 ± 87.7 ng/g DW). KW - Oxidativer Stress KW - oxidative stress KW - phytoprostane KW - oxidized lipids Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24347 ER - TY - THES A1 - Reifenrath, Kerstin T1 - Effects of variable host plant quality on the oligophagous leaf beetle Phaedon cochleariae: Performance, host plant recognition and feeding stimulation T1 - Auswirkung variabler Wirtspflanzenqualität auf den oligophagen Blattkäfer Phaedon cochleariae: Entwicklung, Wirtspflanzenfindung und Fraßstimulation N2 - Abiotic environmental stress, as evoked by short-term exposure of greenhousegrown plants to ambient ultraviolet radiation (UV), induces chemical and morphological adaptations of plants. Responses depend on the strength of stress and differ between species and tissues of variable age. In two Brassicaceae, Sinapis alba and Nasturtium officinale, stress responses towards short-term exposure to ambient radiation including or excluding UV reveal a high phenotypic plasticity, with strong differences their chemical composition compared to plants that remained in the greenhouse. The most pronounced defensive response against UV, the accumulation of flavonoid pigments, was strongest in young UV-exposed leaves, with an increase of the more effectice flavonol quercetin on the expense of less effectice kaempferol. Glucosinolates and myrosinase enzymes showed highly species-specific responses to UV-stress. Feeding behaviour and larval performance of the oligophagous Brassicaceae specialist, Phaedon cochleariae (Chrysomelidae; Coleoptera) were poorly affected by these differently UV-exposed host plants. Effects of plant stress on larval development were restricted to a minor variation in body mass due to variable food conversion of certain larval instars, which were compensated until pupation. Moreover, larval developmental times were unaffected by UV-exposure, but varied between species and leaves of different age. For P. cochleariae, this lack of variation in larval and pupal development towards UV-altered phytochemistry may suggest a strong genetic fixation of life history traits. In combination, the high plasticity towards variable food quality may correspond to the beetles’s specialisation on a narrow range of chemically highly variable host plants. Apart from being involved in plant defence against generalist herbivores, glucosinolates may also act as recognition cues and feeding stimulants for specialist insects. In earlier studies, glucosinolates were assumed to stimulate feeding by P. cochleariae, and they were suggested to be present on outermost leaf surfaces. However, since these findings were based on crude extraction methods, the presence of feeding stimulants in epicuticular waxes of Brassicaceae was re-investigated. In our study, glucosinolates were not detectable in mechanically removed waxes in Brassica napus and N. officinale, whereas substrate concentrations in solvent leaf extracts corresponded to densities and closure of leaf surface stomata. Therefore, glucosinolates that originate from the mesophyll may have been washed out through open stomata. Neither leaf waxes, nor leaf waxes combined with sinigrin or pure sinigrin evoked feeding. Moreover, in choice tests, these leaf beetles clearly preferred to feed on de-waxed surfaces. Finally, the presence of feeding stimulants in epicuticular waxes is highly unlikely considering the physico-chemical properties of the plant cuticle. The lack of stimulants on the outermost surface corresponds to the plant’s perspective, which should avoid easily accessible feeding stimulants. Nevertheless, the role of glucosinolates for feeding stimulation of P. cochleariae remained unclear. Therefore, S. alba leaf extracts of different polarities were tested in bioassays in order to identify which chemical leaf compounds act as stimulants. In bioassay-guided fractionations of methanol extracts by semi-preparative HPLC, two distinct fractions with stimulating activity were detected, whereas other fractions were not effective. Flavonoids were identified as main component in one stimulating fractions, the second fraction mainly contained glucosinolates, including sinalbin. The combination of both fractions was significantly more stimulating than each individual fraction, indicating additive effects of at least one compound of each fraction. However, since the combined fractions were less effective compared to the original extracts, other compounds may additionally be involved in the complex composition of leaf compounds acting as feeding stimulants for P. cochleariae. Finally, fractionated extracts of UV altered plants were used to test whether the strength of feeding responses depend on different ratios of glucosinolates and flavonoids. However, since the feeding behavior of this leaf beetle was not affected, such quantitative variations were concluded to be less important. The initiation of feeding behaviour may solely depend on the presence of stimulating compounds. N2 - Abiotische Umwelteinflüsse induzieren chemische und morphologische Adaptionen in Pflanzen. Nachdem Pflanzen im Gewächshaus in Lichtverhältnissen ohne ultraviolette Strahlung (UV) aufgezogen wurden, zeigten diese bei Einwirkung von UV zeigen artspezifische Veränderungen, die sich außerdem zwischen Blättern unterschiedlichen Alters unterschieden. Sinapis alba und Nasturtium officinale, zwei Vertreter der Brassicaceae zeigten dabei eine ausgeprägte phänotypische Plastizität. Die Akkumulation von Flavonoiden in der Epidermis stellt die wirksamste pflanzliche Schutzreaktion gegen UV dar. Die höchste Flavonoidkonzentration lag in jungen UV-exponierten Blättern vor, verbunden mit einem Anstieg hochwirksamer Quercetine auf Kosten der weniger wirksamen Kämpferole. Weiterhin wurden artspezifische Veränderungen der Konzentration von Glukosinolaten und Myrosinase-Enzymen festgestellt. Die Larvalentwicklung von Phaedon cochleariae (Chrysomelidae; Coleoptera), einem oligophagen Spezialisten auf Brassicaceae, wurde kaum von der veränderten Qualität der unterschiedlich exponierten Pflanzen beeinflusst. Auswirkungen von Pflanzenstress auf die Larvalentwicklung des Blattkäfers beschränkten sich auf geringe Gewichtsveränderungen durch unterschiedliche Futterverwertung bei bestimmten Larvenstadien, die aber noch vor der Verpuppung kompensiert wurden. Die Dauer der Larvalentwicklung unterschied sich zwischen Pflanzenarten und bei unterschiedlichem Blattalter, nicht aber in Folge der UV-Behandlung des Pflanzenmaterials. Dass die Entwicklung von Larven und Puppen trotz der durch UV hervorgerufenen Unterschiede der Wirtpflanzenchemie nicht beeinflusst wurde, könnte in der strengen genetischen Festlegung der Wachstumsparameter des Käfers begründet sein. Die hohe phänotypische Plastizität des Blattkäfers in Bezug auf unterschiedliche Futterqualität, könnte mit seiner starken Spezialisierung auf wenige Wirtspflanzen zusammenhängen. Neben ihrer Funktion im Abwehrsystem gegen generalistische Herbivore nehmen Glukosinolate außerdem eine wichtige Rolle bei der Wirtspflanzenerkennung und Fraßstimulanz von Spezialisten ein. In früheren Studien wurde angenommen, dass Glukosinolate auf P. cochleariae fraßstimulierend wirken und auf Blattoberflächen vorhanden sind. Die in diesen Studien angewandte Methode zur Extraktion von Blattoberflächen scheint jedoch ungeeignet und wurde in unserer Studie modifiziert. In mechanisch abgelösten Blattwachsen von Brassica napus und N. officinale (Brassicaceae) konnten keine Glukosinolate nachgewiesen werden. In Lösungsmittelextrakten hingegen stieg die Glukosinolatkonzentration mit dem Öffnungszustand und der Anzahl der Stomata deutlich an. Offenbar werden demnach Glukosinolate aus dem Mesophyll durch geöffnete Stomata extrahiert. In Biotests konnte P. cochleariae weder durch Blattwachse, noch durch ein Gemisch aus Wachsen und Sinigrin oder reines Sinigrin stimuliert werden. Darüber hinaus präferierten sie entwachste Blätter gegenüber bewachsten Blättern. Schließlich sprechen auch physikochemische Eigenschaften von Glukosinolaten und pflanzlicher Kutikula gegen das Vorkommen von Glukosinolaten in epikutikulären Wachsen. Somit blieb die Rolle von Glukosinolaten für die Fraßstimulation von P. cochleariae unklar. Um fraßstimulierende Komponenten zu identifizieren, wurde die Wirkung von S. alba Blattextrakten unterschiedlicher Polarität auf das Verhalten der Käfer untersucht. Durch Fraktionierungen mittels HPLC, begleitet durch Biotests, wurden zwei stimulierende Fraktionen aus stimulierenden Methanol-Extrakten isoliert, während die übrigen Fraktionen unwirksam waren. Eine der aktiven Fraktionen enthielt hauptsächlich Flavonoide, die zweite Glukosinolate, darunter Sinalbin. Die Kombination dieser beiden Fraktionen wirkte signifikant stimulierender als die Einzelfraktionen, sodass auf eine additive Wirkung mindestens zweier Komponenten jeder Fraktion geschlossen werden kann. Da die Aktivität dieser kombinierten Fraktionen jedoch geringer war als die der Ausgangsextrakte, könnten weitere Komponenten in das komplexe Zusammenwirken von Blattinhaltsstoffen zur Fraßstimulantion von P. cochleariae involviert sein. Extrakte unterschiedlich UV exponierter Pflanzen wurden getestet, um festzustellen, ob die Stärke der Fraßreaktion durch das Verhältnis von Glukosinolaten und Flavonoiden bestimmt wird. Das Verhalten von P. cochleariae wurde jedoch nicht beeinflusst, sodass die Quantität der involvierten Komponenten von geringer Bedeutung sein könnte. Zur Initiierung des Fraßverhaltens könnte allein die Anwesenheit von Stimulantien genügen. KW - Meerrettichkäfer KW - Pflanzenfressende Insekten KW - Phytochemie KW - Herbivorie KW - Phytochemie KW - Blattkäfer KW - Insekten-Pflanzen-Interaktionen KW - herbivory KW - phytochemistry KW - leaf beetle KW - insect-plant-interaction Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23459 ER - TY - THES A1 - Mishina, Tatiana E. T1 - Mechanisms of local and systemic defences in Arabidopsis thaliana in response to host and non-host strains of Pseudomonas syringae N2 - Stickstoffmonooxid (NO) wird als wichtige Signalkomponente bei der Entwicklung der Hypersensitiven Reaktion beschrieben. Außerdem wird NO eine Rolle als Signalmolekül bei der Expression von Abwehrgenen wie PR-1, PAL1 oder Chalkonsynthase (CHS) und bei der Akkumulation von Salicylsäure zugeordnet (Durner et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden transgene Pflanzen mit veränderten endogenen NO-Spiegeln verwendet, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Arabidopsis-Pflanzen, die aufgrund der Expression einer NO Dioxygenase erniedrigte NO-Gehalte aufweisen, zeigen nach einem Angriff avirulenter Pathogene einen abgeschwächten oxidative burst und eine reduzierte Expression von Genen des Phenylpropanbiosyntheseweges. Weitere Experimente mit transgenen Pflanzen, die eine bakterielle NO-Synthase exprimieren, legen nahe, dass eine konstitutive Erhöhung der NO-Spiegel nicht zu einer konstitutiv verstärkten Pathogenabwehr führt. Möglicherweise ist eine graduelle Steigerung der NO-Gehalte nach Pathogenkontakt für die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen erforderlich. Im Gegenteil, die NOS-exprimierenden Pflanzen waren anfälliger gegen bakterielle Pathogene als Wildtyp-Pflanzen und zeigten eine abgeschwächte SAR-Reaktion. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass NO eine wichtige Rolle bei der Regulation des Redoxstatus in der Pflanzenzelle spielt. Diese Funktion von NO ist wichtig beim Seneszenzvorgang. Entsprechend der Ergebnisse dieser Arbeit kann NO als negativer Regulator der Blattseneszenz angesehen werden. Die Wirkungsweise von NO auf molekularer Ebene und die Signalkaskaden, in die NO involviert ist, sind immer noch nicht ausreichend verstanden. In zukünftigen Experimenten wird es notwendig sein, die selektive Quantifizierung von NO in intaktem Pflanzengewebe zu gewährleisten, die Proteintargets von NO zu identifizieren und die Struktur und Funktion NO-modifizierter Biomoleküle zu entschlüsseln, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Wechselwirkungen besser verstehen zu lernen. Die Nichtwirtsresistenz beruht auf mehreren Verteidigungsebenen, welche konstitutive und induzierte Komponenten beinhalten. Die Bedeutung induzierter Abwehrreaktionen für die Nichtwirtsresistenz gegen bakterielle Pathogene ist nicht vollständig klar. Die Daten der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass das Wachstum von Nichtwirtsbakterien in Arabidopsis-Blättern durch vorgebildete toxische Substanzen und durch induzierte Zellwandverstärkungen gehemmt wird. Nichtwirtsbakterien verursachen eine schnelle Induktion der Expression der Ligninbiosynthesegene PAL1 und BCB, die unabhängig vom Typ III-Sekretionssystem ist und möglicherweise zur Papillenbildung beiträgt. Darüber hinaus ist die Überlebensrate der Nichtwirtsbakterien in den extrazellulären Räumen der Arabidopsis pal1-Mutante höher als in Wildtyp-Pflanzen, was die funktionelle Bedeutung der PAL1-Expression bei der Nichtwirtsresistenz verdeutlicht. Außerdem zeigen die Experimente, dass Nichtwirtsbakterien in ähnlicher Weise wie Wirtsbakterien die Akkumulation von Salicylsäure und die Expression von PR-Genen induzieren. Die Induktion dieser Abwehrkomponenten ist abhängig von einem intakten Typ III-Sekretionssystem. Die Signalwege, auf denen nach Kontakt mit Nichtwirtsbakterien und Wirtsbakterien Abwehrreaktionen induziert werden, sind ähnlich. Es wurden jedoch zwischen zwei verschiedenen Nichtwirtsstämmen auch unterschiedliche Signalwege aktiviert, was möglicherweise auf ein unterschiedliches Repertoire von TypIII-Effektoren der beiden Stämme zurückgeführt werden kann. Trotz der Aktivierung dieser induzierten Abwehr zeigen Experimente mit klassischen Abwehrmutanten, dass SA- und JA-abhängige Abwehrreaktionen nicht direkt zur Nichtwirtsresistenz gegen P. syringae beitragen. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass die Nichtwirtsresistenz des Arabidopsis-Ökotyps Col-0 effektiver ist als die des Ler-0-Ökotyps, obwohl bei letzterem die Resistenz gegen virulente Bakterien höher ist. Diese Unterschiede scheinen nicht mit der unterschiedlichen Glucosinolatzusammensetzung der beiden Ökotypen im Zusammenhang zu stehen. Um das Verständnis der Nichtwirtsresistenz von Arabidopsis gegenüber P. syringae zu verbessern, können in zukünftigen Experimenten Doppel- und Triplemutanten hergestellt werden, die gleichzeitig Defekte in der zellwandabhängigen Abwehr (Lignin- und Callosebiosynthese) und in klassischen, SA-abhängigen Abwehrreaktionen aufweisen. Auch können Analysen des Genom-Polymorphismus und der Zusammensetzung von Sekundärmetaboliten in den Ökotypen Ler-0 und Col-0 zu einem besseren Verständnis der Nichtwirtsresistenz führen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass ein lokaler, symptomfreier Kontakt von Arabidopsis-Blättern mit Nichtwirtsbakterien, TTSS-defiziente Bakterien und allgemeine bakterielle Elicitoren (PAMPs) wie Flagellin und Lipopolysaccharide die systemisch erworbene Resistenz innerhalb der Gesamtpflanze hervorrufen. Die symptomlose systemische Resistenzreaktion findet in SAR-defizienten Mutanten nicht statt, wird jedoch in der Jasmonat-insensitiven jar1-Mutante, die keine ISR-Reaktion ausbilden kann, beobachtet. Durch Behandlung von Arabidopsis-Blättern mit unterschiedlichen Inokuli von virulenten oder avirulenten P. syringae-Stämmen wurde auch eine deutliche Korrelation des Ausmaßes der SAR-Induktion mit der Höhe der SA-Akkumulation oder der PR-Genexpression, aber nicht mit der Nekrosenbildung oder der JA-Produktion, am Infektionsort festgestellt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass nicht die Hypersensitive Reaktion oder Gewebenekrosen, sondern möglicherweise die Stärke bestimmter Abwehrreaktionen am Ort der Inokulation zur Auslösung der SAR beitragen. Die Befunde, dass die systemische Resistenz auch durch PAMPs und durch TTSS-defekte P. syringae-Stämme erhöht wird, verdeutlicht die wichtige Rolle von allgemeinen Elicitoren bei der SAR-Induktion. In künftige Experimenten kann untersucht werden, ob verschiedene PAMPs die SAR in synergistischer Weise induzieren und ob allgemeine Elicitoren pilzlicher Herkunft SAR auslösen können. Weiterhin können die molekulare Prozesse spezifiziert werden, die stromabwärts von PAMP-Erkennungsprozessen für die SAR-Ausbildung notwendig sind. In weiteren Experimenten könnte die Hypothese überprüft werden, ob einzelner PAMPs als mobile SAR-Langstreckensignale fungieren können. Durch phytopathologische Charakterisierung von T-DNA-Knockout-Linien, die Defekte in Genen aufweisen, welche in Arabidopsis nach einer P. syringae-Infektion aufreguliert werden, konnte das FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1)-Gen als notwendige Komponente der SAR in Arabidopsis identifiziert werden. So bleiben die im Wildtyp induzierten systemischen Abwehrreaktionen und die Erhöhung der systemischen Resistenz nach lokaler Inokulation mit P. syringae in fmo1-Knockout-Pflanzen vollständig aus. Weiterhin korreliert die systemische Expression des FMO1-Gens eng mit der SAR-Induktion. So gibt es bei allen Abwehrmutanten, die keine SAR nach Kontakt mit P. syringae ausbilden können, keine FMO1-Expression in distalen Blättern inokulierter Pflanzen. Umgekehrt verhält es sich mit Arabidopsis-Linien, die die SAR ausbilden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass FMO1 eine wichtige Komponente eines Signalverstärkungszyklus darstellt, der in nichtinfizierten, systemischen Teilen der Pflanze wirkt, um die SAR zu ermöglichen. In künftigen Experimenten soll der postulierte Amplifizierungsmechanismus experimentell verifiziert werden. Die Konstruktion von transgenen Linien, die ein FMO1:GFP-Fusionsprodukt exprimieren, kann Informationen über die zelluäre Lokalisation des FMO1-Proteins liefern. Weiterhin können vergleichende Analysen der chemischen Zusammensetzung von Blattextrakten der fmo1 Knockout-Linien, von FMO1-Überexprimierern und von Wildtyp-Pflanzen zur Aufklärung der biochemischen Reaktion beitragen, die die FMO1-Monooxygenase katalysiert. In Anlehnung an die Funktion von yFMO, die die einzige Flavin-abhängige Monooxygenase der Hefe darstellt, kann überprüft werden, ob FMO1 die korrekte Faltung von Proteinen am endoplasmatischen Retikulum vermittelt. Schließlich kann durch die Identifizierung weitere SAR-Gene nach der beschriebenen Strategie und durch funktionelle Charakterisierung der zugehörigen Proteine das Verständnis der SAR-Reaktion auf molekularer Ebene weiter verbessert werden. N2 - NO has been described as an important component involved in the development of the hypersensitive reaction (Delledonne et.al., 1998). Furthermore, NO induces expression of a set of defence gene, such as PR-1, PAL1 and chalcone synthase (CHS), and accumulation of SA (Durner et al., 1998). In this study, transgenic plants with altered NO levels were used to study the role of NO in plant defence. Arabidopsis plants which, due to expression of a bacterial NO dioxygenase, exhibit lower levels of NO than wild-type plants, show several weakened defence response, including the oxidative burst and expression of phenylpropanoid pathway genes. By contrast, constitutive expression of a bacterial NO synthase in Arabisopsis results in increased levels of endogenous NO. However, these plants do not show constitutively activated defence responses, but suffer from increased susceptibility to various strains of P. syringae. This might indicate that a gradient in NO production rather than constitutive elevation of NO is necessary to trigger plant defence responses. Nevertheless, NO seems to be important for regulation of the oxidative state in plant cells. This function of NO is important during leaf senescence. The data of the present work indicate that NO acts as senescence-delaying factor during plant development. The molecular action of NO in plants and signalling cascades in which NO is involved as second messenger are still poorly understood. Experiments addressing the selective quantification of NO in intact plant tissue, the identification of NO-target proteins as well as the function of NO-modified biomolecules might help to understand the role of NO in plants. Non-host resistance consists of several layers of defence that include preformed compounds existing in plants before pathogen infection and induced defences which the plant activates after recognition of a pathogen. The role of inducible defences in preventing multiplication of non-adapted bacteria is not clear. Our experiments suggest that to restrict non-adapted bacterial growth, pre-formed antimicrobial compounds and an early inducible cell wall-based defence might play an important role in Arabidopsis leaves. Upon inoculation with non-adapted bacteria, we have observed early, TTSS-independent up-regulation of PAL1 and BCB, two lignin biosynthesis genes which might be involved in papilla formation or other kinds of cell wall fortification. Moreover, Arabidopsis pal1 knockout lines permit significantly higher survival of non-adapted bacteria in leaves than wild-type plants, suggesting a functional importance of PAL1 up-regulation. Although non-host bacteria, like host bacteria, induce accumulation of SA and PR gene expression in a TTSS-dependent manner, SA-dependent or JA/ET-dependent defences do not directly contribute to non-host resistance. Moreover, non-adapted bacteria activate similar defence signalling pathways as do host bacteria. However, because of varieties in effector protein composition between different non-adapted bacterial strains, the activated signalling pathways might also include different compounds. The Arabidopsis ecotype Ler 0 is more susceptible to a non-adapted strain of P. syringae than ecotype Col-0. Although differences in glucosinolate content and composition between those ecotypes exist, they are probably not a major reason for the observed difference in non-host resistance. To further understand the mechanisms underlying non-host resistance, the generation of double or triple mutants with deficits in both cell wall-based defences and SA-dependent signal cascades is necessary. Moreover, the study of genome polymorphism and composition of secondary metabolites between Ler-0 and Col-0 can shed new light into the mechanisms of non-host resistance against bacterial pathogens. Additionally, experiments addressing papilla formation and callose biosynthesis in Ler-0 and Col-0 could help to further elucidate bacterial non-host resistance. Our data indicate that localized contact of Arabidopsis leaves with non-adapted bacteria, type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) induce systemic acquired resistance (SAR) at the whole plant level. This finding contrasts the general belief that an HR or other leaf necroses are required for SAR induction. The observed symptomless systemic response was abolished in all SAR-deficient mutants tested in this study, but was intact in the jar1 mutant, which is compromised in induction of ISR, indicating that non-host bacteria and PAMPs induce SAR in a mechanistically similar way than host bacteria. In addition, our data show that the extent of SA accumulation or PR gene expression induced at sites of virulent or avirulent P. syringae inoculation rather than the amount of tissue necroses or jasmonate accumulation determine the magnitude of SAR. The fact that systemic responses were also triggered after local treatment with type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial PAMPs indicate that induction of SAR is TTSS-independent. Instead, recognition of general elicitors like flagellin and LPS play an important role in activation of the SAR process. To broaden the concept of PAMP-based SAR initiation, further general elicitors from bacteria and fungal pathogens should be tested for their capability to induce SAR. Screens for mutants with deficiency in SAR activation by individual PAMPs can help to identify new components involved in the SAR signalling cascade. Possible functions of PAMPs as mobile systemic signals should be tested in future experiments. By selection of candidate genes whose expression is up-regulated in Arabidopsis leaves infected with avirulent and virulent P. syringae and pathophysiological analyses of corresponding T-DNA knockout lines, FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1) was identified as a key SAR regulator. SAR triggered by P. syringae is completely abolished in fmo1 mutant plants, and pathogen-induced expression of FMO1 in systemic leaves is closely correlated with the capability of different Arabidopsis lines to develop SAR. According to our findings, we have proposed that the FMO1 acts in signal amplification in non-inoculated, systemic leaves to trigger SAR. Experimental verification of the postulated potential amplification cycle underlying SAR should be tested in future experiments. The generation of transgenic lines expressing FMO1::GFP will provide useful information about the cellular localization of the FMO1 protein. Moreover, a comparative metabolomic analysis using SAR-induced wild-type, fmo1 knockout and FMO1 overexpressing lines can be used to identify substrates and reaction products of the FMO1 monooxygenase. As the single yeast FMO (yFMO) provides oxidizing equivalents at the ER for correct protein folding, expression of FMO1 in yfmo mutant yeast combined with protein activity assays might indicate whether FMO1 exhibits functional similarities with yeast FMO, e.g. in assuring proper folding of ER-targeted proteins essential for SAR establishment. Identification of further genes involved in activation of systemic resistance and biochemical characterization of the corresponding proteins can help to understand the SAR process in more detail. KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Induzierte Resistenz KW - Stickstoffmonoxid KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - systemisch erworbene Resistenz KW - Stickstoffmonoxid KW - Nichtwirtsresistenz KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - systemic acquired resistance KW - nitric oxide KW - non-host resistance Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23160 ER - TY - THES A1 - Raacke, Ines Christine T1 - Wirkmechanismen von Hefe-Elicitoren sowie die Rolle von Jasmonaten in Pflanze-Pathogen-Interaktionen T1 - Mechanisms of defense activation by yeast elicitors and function of jasmonates in plant-pathologen-interactions N2 - Die Anwendung von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) als Elicitor wurde bisher in Zellkulturen, ebenso in Sojabohne und Gerste beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Elicitorwirkung von Hefe auf A. thaliana untersucht. Das Sprühen mit autoklavierter Bäckerhefe führte zu einem Anstieg des Phytoalexins Camalexin mit einem Maximum (54 nmol/g FG) am 5. Tag nach der Behandlung mit dem Elicitor. Bei nachfolgenden Infektionen am 5. Tag nach Hefebehandlung mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 wurde eine Schutzwirkung detektiert, die beim Wildtyp Col-0 zu einer 3 bis 4fachen Verringerung des Bakterienwachstums im Vergleich zur Wasserbehandlung führte. Die Schutzwirkung setzte mit dem 5. Tag nach Hefebehandlung ein und hielt bis einschließlich dem 11. Tag an. Ein Schutz gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 war auch systemisch in nicht mit Hefe behandelten Blättern zu detektieren. Infektionen mit Botrytis cinerea 5 Tage nach Hefebehandlung führten beim Wildtyp Col-0 zu Nekrosengröße, die nur 17 % der Nekrosengröße der mit Wasser behandelten Kontrolle betrugen. Veränderungen in der Genexpression 48 Stunden nach Hefebehandlung wurden in einer Microarray-Analyse (in Kooperation mit der GSF Neuherberg) ermittelt. Von rund 1400 Stress-responsiven Genen konnte eine Induktion von 6 Genen nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich um Salicylsäure-abhängige Gene (Pr1, Pr2 und Pr5), Gluthation-S-Transferasen (Gst2 und Gst11) und eine UDP Glucosyltransferase. Die Erhöhung der Gene Pr1 und Pr2 deutet auf eine Aktivierung des Salicylsäure-Weges hin. Die Induktion der anderen Gene deutet auf eine Aktivierung der Detoxifizierung hin. Gene aus dem Jasmonsäure (JA)- und Ethylen-Weg wurden nicht induziert. Reprimiert wurde das Gen Asa1, das für eine JA-induzierte Antranilatsynthase kodiert. In Northernblot-Analysen wurden Gene auch zu früheren Zeitpunkten als in der Microarray-Analyse untersucht. Für die Untersuchung, welche Signalwege für die Resistenz durch Hefebehandlung verantwortlich sind, wurden verschiedene Mutanten mit den korrespondierenden Wildtypen von Arabidopsis thaliana aus dem JA-Weg (dde2, opr3 und jin1), aus dem Salicylsäure-Weg (nahG und npr1) und aus dem Camalexin-Weg (cyp79B2/B3 und pad3) mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 oder Botrytis cinerea infiziert. Nach Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 konnte nur in den Salicylsäure-Mutanten keine erhöhte Hefe-vermittelte Resistenz festgestellt werden. Das deutet darauf hin, dass Salicylsäure für den Schutzeffekt der Hefe gegenüber Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 notwendig ist. Bei den getesteten Wildtypen und den Mutanten aus dem JA- und Camalexin-Weg wurden in den mit Hefe vorbehandelten Pflanzen Schutzfaktoren gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 zwischen 2 und 5fach nachgewiesen. Bei Infektionen mit Botrytis cinerea wurde in allen getesteten Mutanten nach Hefebehandlung eine Schutzwirkung aufgezeigt (Schutzfaktoren von 3 bis 7). Das deutet darauf hin, dass weder JA, noch Salicylsäure oder Camalexin für die Schutzwirkung gegen Botrytis cinerea verantwortlich ist. Eine direkte hemmende Wirkung der Hefe auf das Wachstum des nekrotrophen Pilzes konnte durch Wachstumsversuche auf unterschiedlichen Medien ausgeschlossen werden. In Versuchen mit den Mutanten dde2 und opr3 konnte nachgewiesen werden, dass dde2, die weder 12-Oxo-Phytodiensäure noch JA bilden kann, größere Läsionen nach Botrytis cinerea Infektionen ausbildet als der Wildtyp. Größere Läsionen zeigte auch opr3, die 12-Oxo-Phytodiensäure, aber keine JA bildet, die sich aber nicht signifikant vom Wildtyp unterschieden. Daraus lässt sich schließen, dass 12-Oxo-Phytodiensäure eine wichtige Rolle für die Abwehr gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea spielt, wobei JA vermutlich zusätzlich zur Abwehr beiträgt. Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 führten bei beiden Mutanten zu einer geringeren Symptomausprägung als in den Wildtypen. Übereinstimmend mit den makroskopisch sichtbaren Symptomen zeigte die Mutante dde2 ein mehr als 20fach geringeres Bakterienwachstum als der Wildtyp. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass sich die Anwesenheit von 12-Oxo-Phytodiensäure und JA im Wildtyp negativ auf die Abwehr gegen das biotrophe Pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 auswirkt. In Fusarium graminearum konnte JA nachgewiesen werden. Ob es sich bei der JA um einen Pathogenitätsfaktor des Pilzes handelt, sollte durch Mutanten mit einem Defekt im Lipoxygenasegen untersucht werden. Infektionsversuche mit Lipoxygenase-Knockout-Mutanten und Stämmen mit komplementierter Lipoxygenase-Expression zeigten keine Unterschiede in der Symptomausprägung an Blüten und jungen Schoten von Arabidopsis thaliana im Vergleich zum Wildtyp-Pilz. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Lipoxygenase in Fusarium graminearum keine Rolle in der Pathogenität gegenüber Arabidopsis thaliana spielt. N2 - In previous studies yeast-elicitors (Saccaromyces cerevisiae) were described as defense inducers in different cell cultures as well as in plants of soybean and barley. In this work a possible elicitor effect on Arabidopsis thaliana was analysed. After spraying with autoclaved bakers yeast, the phytoalexin camalexin increased in the plants and reached maximum level of 54 nmol/g fw five days after treatment. Infection with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 five days after yeast treatment showed a protection effect which resulted in 3 to 4 fold less bacterial growth in the wild type Col-0. A protection was detectable between five and eleven days after yeast treatment. Protection was also systemic. Infection with Botrytis cinerea five days after yeast spraying showed a reduction in necrotic lesions to 17 % of water pre-treated plants. Regulation of gene expression 48 hours after yeast treatment was assessed. In a cDNA array comprising 1,400 stress responsive genes (in cooperation with GSF Neuherberg) six genes were induced. Induction was evident for salicylic acid-responsive genes (Pr1, Pr2 and Pr5), glutathion-S-transferases (Gst1 and Gst2), and an UDP-glucosyl transferase. This regulation of gene expression indicated an activation of the salicylic acid pathway and of the detoxification system by yeast. Genes of the jasmonic acid (JA)- and ethylene pathway were not induced. The gene Asa1 which encodes a JA-inducible antranilate synthase was down regulated. With Northern blot analysis the results of the array analyses were verified and in addition earlier time points were analysed. To investigate which signaling pathways are involved in the resistance after yeast treatment different Arabidopsis thaliana mutants were analysed. In the jasmonic acid pathway the mutant’s dde2, opr3 and jin1 were examined, in the salicylic acid pathway nahG and npr1 and in the camalexin biosynthesis cyp79B2/B3 and pad3. The mutants in the salicylic acid pathway showed no yeast-mediated resistance against Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. This indicates that the salicylic acid pathway is necessary for the protection by yeast against Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. In contrast, yeast pre-treatment resulted in a protection in mutants in the jasmonic acid and Camalexin pathways which was similar to the wild type. Upon infection with Botrytis cinerea after yeast pre-treatment a protection effect was detectable in all explored mutants (three to seven fold). This indicates that neither JA, nor salicylic acid nor camalexin is necessary for the protection against Botrytis cinerea. A direct inhibitory effect of yeast on the growth of the necrotrophic fungus can be excluded from growth tests on different plates. Experiments with the dde2 mutant which is not able to synthesize 12-oxo-phytodienoic acid and JA, and the opr3 mutant which is able to accumulate 12-oxo-phytodienoic acid but not JA showed that after Botrytis cinerea infection dde2 developed bigger lesions as the wild type. Lesion sizes were also bigger in opr3 but not significant. These results suggest that 12-oxo-phytodienoic acid is important for the defense against the necrotrophic fungus Botrytis cinerea while JA might additionally contribute. Both mutants showed fewer symptoms after Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 infection as the corresponding wild typs. In agreement with the symptom development, the bacterial growth of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in the mutant dde2 was more than 20-fold lower than in the wild type. This result indicates that in the wild type 12-oxo-phytodienoic acid and JA negatively affect the defense against the biotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. JA was detected in Fusarium graminearum. In order to investigate if JA is important for pathogenicity of this fungus, mutants with a defect in the lipoxygenase gene were analysed. No difference in the symptom development after infection of flowers and young siliques of Arabidopsis thaliana with lipoxygenase-knockout-mutants or strains with complemented lipoxygenase expression in comparison to the wild type were detectable. These results indicated that the lipoxygenase gene in Fusarium graminearum is not necessary for the pathogenicity in Arabidopsis thaliana. KW - Ackerschmalwand KW - Phytopathogene Pilze KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Resistenzfaktor KW - Jasmonate KW - Jasmonate KW - Hefe-Elicitor KW - Pflanze-Pathogen-Interaktion KW - OPDA KW - jasmonates KW - yeast-elicitor KW - plant-pathogen-interaction KW - OPDA Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22255 ER - TY - THES A1 - Guhling, Ortwin T1 - Biosynthese kutikulärer Triterpenoide : Klonierung und Charakterisierung von Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum T1 - Biosynthesis of cuticular triterpenoids: cloning and characterization of epoxysqualene cyclases from Ricinus communis and Lycopersicon esculentum N2 - Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekundärmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikuläre Wachsbestandteile im primären Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzflächeneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenphänotypen in Erscheinung: Der Glossy-Phänotyp ist frei von epikutikulären Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von fadenförmigen epikutikulären Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Phänotyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikulärem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikulären Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Phänotyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit höhere Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der frühen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Phänotyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgeführt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer frühen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer täglichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenförmigen Wachskristalle in der frühen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die für die Biosynthese des kutikulären Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Phänotyp beschränkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der frühen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Phänotyps überein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die für die Bildung kutikulärer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikulären Triterpenen über die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenzähnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach β-Amyrin und bestätigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans für die katalytische Funktionalität dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt für ein tieferes Verständnis der Biosynthese kutikulärer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als β-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit α-, β- und δ-Amyrin gleich drei Triterpene in größeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tatsächlichen Relevanz der klonierten OSCs für die Biosynthese dieser kutikulären Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden. N2 - Triterpenoids are a large group of secondary metabolites found in different plant species, either as glycoside conjugates or as aglycones. The latter in many cases accumulate to high amounts in the cuticular wax and hence the primary surface of above-ground plant organs, influencing their surface properties. In the present work, the cuticle-specific formation of triterpenoids was investigated in Ricinus communis stems, combining analytical and molecular genetic methods. Two phenotypes of castor bean could be distinguished based on the appearance of the surface of all stem portions including the hypocotyls: The stems of the glossy phenotype are devoid of wax crystals. In contrast, the stems of the glaucous phenotype are covered by a layer of thread-like epicuticular wax crystals. Comparative studies by GC-FID analysis revealed that the cuticles of 67-day old hypocotyls of the glossy and the glaucous phenotypes contained 12.5 and 51.9 µg/cm^2, respectively. The wax mixture of the glossy phenotype was dominated by VLC aliphatic compounds. In the cuticular wax of the glaucous phenotype, VLC aliphatics were found in similar absolute amounts as in the glossy phenotype, whereas the triterpene loads were significantly higher. Here, the wax mixture was dominated by lupeol, making it the single most abundant component (56% of the total wax). To monitor the accumulation of cuticular lupeol during ontogenesis, the chemical composition of the wax mixture was studied at different stages of hypocotyl growth. In these investigations, lupeol was found to accumulate rapidly during early development at the surface of glaucous hypocotyls: between day 6 and day 25 the lupeol load increased by a daily rate of 1.2 µg/cm^2. During the period of highest lupeol increase from day 11 to day 18, a daily rate of 0.013 ng/cell could be calculated. Within that early time period a sharp increase in the number of epicuticular wax crystals on the surface of glaucous hypocotyls was observed by SEM. Based on the cuticular wax analyses of both stem phenotypes, it was hypothesized that a triterpene synthase should exist in castor bean responsible for the biosynthesis of cuticular lupeol in the glaucous phenotype. In a homology-based cloning approach two epoxysqualene cyclases were cloned from R. communis, functionally expressed in the yeast strain GIL 77 and characterized as a cycloartenol synthase (RcCAS1) and a lupeol synthase (RcLUS1). Both the organ-specific expression of RcLUS1 (with an expression exclusively in stems of the glaucous phenotype) and the expression pattern during hypocotyl development (with a peak at day 12) exactly matched the accumulation of cuticular lupeol in the plant. From the strong correlation of the organ specific and time dependent accumulation of lupeol in the cuticle of glaucous hypocotyls on the one hand, and the expression patterns of the RcLUS1 gene on the other, it can be concluded that the lupeol synthase RcLUS1 from castor bean is the central enzyme responsible for the biosynthesis of cuticular lupeol. This is the first report on a cuticle-relevant triterpene synthase. Based on the studies on castor bean, it can be concluded that the biosynthesis of cuticular triterpenoids is accomplished by enzymatic cyclisation of the substrate 2,3-oxidosqualene and obviously controlled by a transcription regulation of the corresponding epoxysqualene cyclase. Phylogenetic analyses revealed that RcLUS1 exhibits only weak sequence similarities to the two clades of so far known lupeol synthases and was thus interpreted as a first member of a new class of lupeol synthases in higher plants. The RcLUS1 mutant F257W was created by a site-directed mutagenesis approach and the mutated enzyme was functionally characterized in yeast. The mutation resulted in an altered product pattern, switching from lupeol to β-amyrin, thus confirming the importance of the corresponding Trp in amyrin synthases for the catalytical function of these enzymes. Besides Ricinus communis, Lycopersicon esculentum was chosen as a model plant to study the biosynthesis of cuticular triterpenes. The implementation of the homology-based primer design and cloning strategy developed for castor bean led to the successful cloning of two triterpene synthases from L. esculentum. One of these enzymes, LeTTS1, was characterized as a monofunctional β-amyrin synthase. In contrast to the glaucous stems of R. communis, with α-, β- and δ-amyrin, more then one single triterpene compound accumulates to high amounts in the tomato fruit cuticle. The evidence of the cuticle-relevance of the cloned epoxysqualene cyclases LeTTS1 and LeTTS2 has to be proven in accompanying experiments by determination of the expression patterns of these genes. KW - Rizinus KW - Kutikularwachs KW - Synthasen KW - Genexpression KW - Rizinus KW - pflanzliche Kutikula KW - epikutikuläre Wachskristalle KW - Oxidosqualenzyklase KW - Lupeolsynthase KW - Castor bean KW - plant cuticle KW - epicuticular wax crystals KW - Oxidosqualene cyclase KW - Lupeol synthase Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21796 ER - TY - THES A1 - Forster, Wilhelmina Alison T1 - Mechanisms of cuticular uptake of xenobiotics into living plants T1 - Mechanismen der kutikulären Xenobiotika-Aufnahme in lebende Pflanzen N2 - The objective of this Thesis was to progress the understanding of the mechanisms of cuticular uptake into living plant foliage, thereby enabling uptake of important compounds such as pesticides and pollutants to be modelled. The uptake of three model compounds, applied in the presence and absence of surfactants, into the leaves of three plant species (Chenopodium album L., Hedera helix L. and Stephanotis floribunda Brongn) was determined. The results with 2-deoxy-D-glucose (DOG), 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) and epoxiconazole in the presence of surfactants (the polyethylene glycol monododecyl ethers C12EO3, C12EO6, C12EO10, and a trisiloxane ethoxylate with mean ethylene oxide (EO) content of 7.5, all used at one equimolar concentration) illustrated that the initial dose (nmol mm-2) of xenobiotic applied to plant foliage was a strong positive determinant of uptake. Using this new approach for whole plant uptake, uptake on a per unit area basis was found to be related to initial dose of xenobiotic applied, by an equation of the form: Uptake(nmol mm-2) = a [ID]b at time t = 24 hours, where ID is the initial dose or the mass of xenobiotic applied per unit area (M(nmol xenobiotic applied)/A(droplet spread area)). Total mass uptake can then be calculated from an equation of the form: Total Uptake(nmol) = a [ID]b.A. In order to verify this relationship, further studies determined the uptake of three pesticides, applied as commercial and model formulations in the presence of a wide range of surfactants, into the leaves of three plant species (bentazone into Chenopodium album L. and Sinapis alba L., epoxiconazole and pyraclostrobin into Triticum aestivum L.). The results confirmed that the initial dose (nmol mm-2) of xenobiotic applied to plant foliage is a strong, positive determinant of uptake. In a novel approach, further studies used this relationship (nmol mm-2 uptake versus ID; termed the uptake ratio) to establish the relative importance of species, active ingredient (AI), AI concentration (g L-1) and surfactant to uptake. Species, AI, its concentration, and surfactant all significantly affected the uptake ratio. Overall, 88% of the deviance could be explained. More useful was the analysis of the individual xenobiotics, where the models explained 83%, 85%, and 94% of the variance in uptake ratio for DOG, 2,4-D, and epoxiconazole, respectively. In all cases, species, surfactant, and AI concentration significantly affected the uptake ratio. However, there were differences in the relative importance of these factors among the xenobiotics studied. Concentration of AI increased in importance with increasing lipophilicity of AI, while species was much less important for the most lipophilic compound. Surfactant became less important with increasing AI lipophilicity, although it was always important. The preceding studies considered uptake at only one time interval (24 hours). Total uptake after 24 hours can be the same for a compound formulated with different surfactants, but rates of uptake (and therefore rain-fastness and subsequent translocation to target sites) can be quite different. Therefore, there was a requirement to be able to model uptake over time into whole plants. Hence, the objective of further studies was to determine whether a logistic-kinetic penetration model, developed using isolated plant cuticles, could be applied to whole plant uptake. Uptake over 24 hours was determined for three model compounds, applied in the presence and absence of surfactants, into the leaves of two plant species. Overall, the model fitted the whole plant uptake data well. Using the equations developed, based on initial dose, to calculate uptake at 24 hours, in conjunction with the logistic-kinetic model, has significantly progressed our understanding and ability to model uptake. The advantages of the models and equations described are that few variables are required, and they are simple to measure. N2 - Das Ziel dieser Dissertation war es, das Verständnis der Mechanismen der Aufnahme von Wirkstoffen über die Kutikula in die Blätter einer lebenden Pflanze zu verbessern und es dadurch möglich zu machen, die Aufnahme von wichtigen Verbindungen wie z.B. von Pestiziden und Schadstoffen zu modellieren. Es wurde die Aufnahme von drei Modellverbindungen ermittelt, die in Anwesenheit und Abwesenheit von oberflächenaktiven Stoffen in die Blätter von drei Pflanzenarten (Chenopodium album L., Hedera helix L. und Stephanotis floribunda Brongn.) aufgetragen wurden. Das Ergebnis mit 2-Deoxy-D-Glucose (DOG), 2,4-Dichlorphenoxy-Essigsäure (2,4-D) und Epoxiconazol in Anwesenheit der oberflächenaktiven Stoffe (die Polyethylenglycolmonododecylether C12EO3, C12EO6, C12EO10, und ein Trisiloxanethoxylat mit einem EO-Mittelwert von 7,5; wobei alle in einer äquimolaren Konzentration und daher in verschiedenen prozentualen Konzentrationen verwendet wurden) zeigte, dass die auf die Pflanzenblätter aufgetragene anfängliche Dosis (nmol mm-2) an Xenobiotikum ein starker, positiv bestimmender Faktor für die Aufnahme war. Verwendet man diese neue Beschreibung der Aufnahme von Xenobiotica in ganze Pflanzen, so kann man feststellen, dass die Aufnahme pro Einheitsfläche von der anfänglichen Dosis von aufgetragenem Xenobiotikum abhängig ist, und zwar nach folgender Gleichung: Aufnahme(nmol mm-2) = a [ID]b bei einer Zeit t = 24 Stunden, wobei ID für die anfängliche Dosis oder die Masse an pro Einheitsfläche aufgetragenem Xenobiotikum steht (M(nmol aufgetragenes Xenobiotikum)/A(Tropfenausbreitungsbereich)). Die Gesamtaufnahme der Masse kann dann aus einer Gleichung der Formel: Gesamtaufnahme(nmol) = a [ID]b.A errechnet werden. Um diese Beziehung zu bestätigen, wurde in zusätzlichen Studien die Aufnahme von drei Pestiziden ermittelt, die als gewerbliche und Modellformulierungen in Anwesenheit einer großen Auswahl von oberflächenaktiven Stoffen in die Blätter von drei Pflanzenarten (Bentazon in Chenopodium album L. und Sinapis alba L., Epoxiconazol und Pyraclostrobin in Triticum aestivum L.) aufgetragen wurden. Die Ergebnisse bestätigten die Feststellung, dass die anfängliche, auf die Pflanzenblätter aufgetragene Dosis (nmol mm-2) an Xenobiotikum ein starker, positiv bestimmender Faktor der Aufnahme ist. Bei einem neuartigen Ansatz verwendeten zusätzliche Studien dieses Verhältnis (nmol mm-2 Aufnahme pro ID; genannt Aufnahmeverhältnis), um die relative Bedeutung der Arten, der Wirksubstanz (AI), der AI-Konzentrationen (g L-1) und der oberflächenaktiven Stoffe für die Aufnahme zu ermitteln. Die Art, AI, ihre Konzentration und die oberflächenaktiven Stoffe hatten alle einen erheblichen Einfluss auf das Aufnahmeverhältnis. Insgesamt konnte 88 % der Abweichung erklärt werden. Noch nützlicher war die Analyse der einzelnen Xenobiotika, bei denen die Modelle 83 %, 85 % und 94 % der Varianz im Aufnahmeverhältnis jeweils für DOG, 2,4-D und Epoxiconazol erklärten. In allen Fällen hatten die Arten, der oberflächenaktive Stoff und die AI-Konzentration einen erheblichen Einfluss auf das Aufnahmeverhältnis. Es gab jedoch Unterschiede bei der relativen Bedeutung dieser Faktoren unter den untersuchten Xenobiotika. Die Konzentration von AI gewann größere Bedeutung mit einer erhöhten Fettlöslichkeit von AI, während die Art eine weit geringere Rolle für die meisten lipophilen Verbindungen spielte. Oberflächenaktive Stoffe verloren an Bedeutung mit zunehmender AI-Fettlöslichkeit, obwohl diese stets von Bedeutung waren. Die bisher dargestellten Studien zogen die Aufnahme bei nur einem Uhrzeitintervall (24 Stunden) in Betracht. Die Gesamtaufnahme nach 24 Stunden kann zwar bei einer Verbindung, die mit verschiedenen oberflächenaktiven Stoffen formuliert ist, die gleiche sein, die Aufnahmeraten (und daher die Regenfestigkeit und anschließende Translokation an Zielstellen) können dabei jedoch völlig verschieden sein. Es bestand daher die Notwendigkeit, die Aufnahme in vollständigen Pflanzen im Zeitablauf modellieren zu können. Infolgedessen war es das Ziel zusätzlicher Studien festzustellen, ob ein logistisch-kinetisches Penetrationsmodell, das unter Anwendung isolierter pflanzlicher Kutikeln entwickelt wurde, bei der Gesamtpflanzenaufnahme zum Einsatz kommen könnte. Die Aufnahme über 24 Stunden wurde für drei Modellverbindungen ermittelt, die in Anwesenheit und Abwesenheit von oberflächenaktiven Stoffen in die Blätter von zwei Pflanzenarten aufgetragen wurden. Insgesamt gesehen entsprach das Modell den Pflanzenaufnahmedaten sehr gut. KW - Kutikula KW - Xenobiotikum KW - Modelle KW - kutikuläre Aufnahme KW - Pestizide KW - oberflächenaktive Stoffe KW - lebende Pflanzen KW - models KW - cuticular uptake KW - pesticides KW - surfactants KW - living plants Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21240 ER - TY - THES A1 - Grun, Christoph T1 - Untersuchung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine in Arabidopsis thaliana in der kompatiblen und der inkompatiblen Interaktion mit Pseudomonas syringae T1 - Encymatically and not encymatically formed oxylipins in Arabidopsis thaliana in compatible und not compatible interaction with Pseudomonas syringae N2 - 1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein früher Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und über freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h früher als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden können und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes frühes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, während späte Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer Kälteexposition von A. thaliana bei 4°C über 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Darüberhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege über die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abhängigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtstärke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach stärkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach stärkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensität, der Pflanzen während der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung für die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker für eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden können und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabhängige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Blättern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach höhere Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Blättern. Darüberhinaus wurde eine 111-fach höhere Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Blättern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker für eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abhängigen Hauptweg auch ein Licht-unabhängiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ wäre es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Blättern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine veränderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine. N2 - 1. To obtain reference-substances for the identification of OH-FA in plant material by GC-MS, OH-FA were made in vitro. 9- and 13-hydroxy-octadecadienoic acids were formed from linoleic acid, 9- and 13-hydroxy-octadecatrienoic acids from -linolenic acid by LOX-catalized reaction. 2. In order to compare the concentrations of oxylipins in A. thaliana during compatible and incompatible interaction, a virulent Pst-strain DC3000 and an avirulent strain avrRPM1 were utilized. The concentrations of oxylipins and salicylic acid were investigated within 60 h after inoculation. F1-phytoprostanes, 12- and 16-OH-FA were used as markers for non-enzymatically formed oxylipins. Concentrations of 9- and 13-OH-FA, either enzymatically or non-enzymatically formed, were measured as well as phytohormones, jasmonic acid and its precursor 12-oxo-phytodienoic acid. Within the compatible interaction an increase of the amount of all measured compounds was observed. In contrast, during incompatible interaction the increases of all measured substances was seperated into two phases. In both interactions, free and esterified OH-FA- and PPF1-concentrations exhibited maxima after 48 to 60 h, an early increase after 5 to 10 h was exclusively found in the incompatible interaction. The concurrent accumulation of 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FA und PPF1 indicates that enzymatically, Photo-oxidative, and free-radical catalyzed synthesis of oxylipins takes place simultaneously. In both interactions the accumulation of esterified OH-FA and PPF1 occurred 5 - 12 h earlier than the increase of the concentrations of free OH-FA and PPF1. These results confirm the hypothesis that oxylipins are formed non-enzymatically from lipids inside cell membranes and are subsequently released by lipases. An early increase of JA- and OPDA-concentrations after 5 h was found in the incompatible interaction, while late maxima occurred in both interactions after 24 to 36 h. Therefore, OH-FA- and PPF1-accumulation took place at the same time as the increase of jasmonates after 5 h. 3. When A. thaliana plants were chilled for 2 h at 4°C an 3,3-fold incrceased formation of both, the enzymatically formed free and esterified 13-OH-FA was detected. The amount of enzymatically formed free 9-OH-FA increased 4,6-fold. In contrast, the amount of non-enzymatically formed 12- and 16-OH-FA did not increase significantly indicating that the applied mild stress conditions triggered exclusively enzymatical OH-FA-formation. 4. In order to get information about OH-FA-formation with regard to light intensity A. thaliana was infected by Pst avrRPM1 and cultivated either in the dark or in the light. When plants were cultivated in the light after 10 h an 1,1- to 3,7- fold increased formation of free and an 2,0- to 3,4-fold increased accumulation of esterified 9-, 10-, 12-, 13-, 15- und 16-OH-FA could be detected. Therefore, the light intensity during an infection with Pst avrRPM1 is an important factor for the formation of enzymatically as well as non-enzymatically formed OH-FA in planta. The 4,9-fold increase of esterified 15-OH-FA (a marker for photooxidative formation of OH-FA) in the dark contradicted the hypothesis that its formation is impossible without the impact of light. In contrast the accumulation of 15-OH-FA in the dark points to a light-independent 1O2- and subsequent 15-OH-FA-formation by a so far unknown mechanism. 5. Determination of the concentrations of OH-FA in leaves and roots of untreated plants of A. thaliana showed 13- to 31-fold higher amounts of esterified 9-,10-, 12-, 13 und 16-OH-FA in the leaves. Moreover, the amounts of esterified 15-OH-FA exceeded in leaves by the factor 111 in comparison to roots. 15-OH-FA was used as a selective marker for Photo-oxidative formation of OH-FA by 1O2. Though, 15-OH-FA occurred to an amount of 0,57 µg/g (dry weight) in roots as well. This indicates that, apart from an primarily used light depending mechanism, a second path for the formation of 15-OH-FA respectively 1O2 exists which does not depend on light strength. An alternative explanation could be the transport of 15-OH-FA from leaves to roots. 6. Compared to the wildtype plants no significant differences in the increase of OH-FA and PPF1 could be detected in NahG-, lsd1-, atrbohD and atrbohF-mutants 48 h after infiltration of Pst avrRPM1. Under the utilized conditions the genetic defects of the analyzed mutants did not cause a modified accumulation of both, enzymatically and not enzymatically formed oxylipins. KW - Lipid-Peroxide KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Oxylipine KW - Arabidopsis KW - thaliana KW - Pseudomonas KW - syringae KW - Oxylipines KW - Arabidopsis KW - thaliana KW - Pseudomonas KW - syringae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20804 ER - TY - THES A1 - Karg, Kathrin T1 - Analyse biologisch aktiver, oxidierter Lipide in Pflanzen und Menschen T1 - Analysis of biologically acitve, oxidized lipids in plants and humans N2 - Durch freie, radikalkatalysierte Oxidation von Linolensäure können in vitro und in vivo meh-rere Klassen von Phytoprostanen gebildet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wur-den Phytoprostane in Pflanzenmaterial (Blättern, Blütenpollen), Speiseölen sowie in mensch-lichen Körperflüssigkeiten (Blut und Urinproben) untersucht. Zusätzlich wurden neue Metho-den entwickelt, um Phytohormone sowie verschiedene Metabolite des pflanzlichen Primär- und Sekundärstoffwechsels zusammen mit einer gemeinsamen Aufarbeitung erfassen und bestimmen zu können. Blütenpollen enthalten mehrere mmol/g an Phytoprostanen, darunter PPA1/PPB1, PPE1 und PPF1. Physiologisch relevant sind jedoch nur die Mengen, die sich nach Extraktion in einem wässrigen Puffer wiederfinden lassen. Deshalb wurden hier erstmals wässrige Extrakte von Birkenpollen untersucht. In diesen befanden sich durchschnittlich 60 nmol PPE1 und 10 nmol PPF1 pro g extrahiertem Pollen. Pflanzenöle enthalten a-Linolensäure bis zu einem Gewichtsanteil von 56 % (m/m). In Spei-seölen aus ausgesuchten Pflanzenarten (Leinöl, Sojaöl, Olivenöl), Walnussöl, Traubenkernöl) und parenteraler Nahrung (Intralipid) wurden die Phytoprostanklassen A1, B1, D1, E1, F1 und deoxy-J1 nachgewiesen und quantifiziert. In frischen Ölen wurden große Mengen an Phy-toprostanen (0,4 – 101 mg/g Öl) gefunden, welche teilweise frei und teilweise verestert vorla-gen. Der absolute Phytoprostangehalt der Öle nahm in folgender Reihe ab: Leinöl » Sojaöl > Olivenöl > Walnussöl > Rapsöl >> Traubenkernöl. (a-Tocopherol). In allen untersuchten Ö-len dominierten entweder PPE1 oder PPF1 als häufigste Phytoprostanklasse. PPA1 und PPB1 waren lediglich als untergeordnete Bestandteile enthalten. PPD1 und dPPJ1 konnten nur in sehr geringen Mengen gefunden werden. Wenn ein Öl bei längerer Lagerung autoxidiert, können die Gehalte an oxidierten Fettsäuren um ein Vielfaches ansteigen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der Autoxidation von Spei-seölen weitere Phytoprostane entstehen und die Konzentrationen von PPE1 und PPF1 im Öl bis auf das 10-fache ansteigen können. Weiterhin wurde dabei die Bildung von detektierbaren Mengen dPPJ1 nachgewiesen. Die Kinetik der Phytoprostanbildung folgte dem für andere Autoxidationsprodukte typischem zeitlichen Verlauf und erst nach Überschreiten einer Induk-tionsperiode traten vermehrt Phytoprostane auf. Im menschlichen Verdauungstrakt sind Phytoprostane chemisch stabil. Allerdings können im sauren Milieu des Magens (pH 0-2) Dehydratisierungen auftreten: Nach Inkubation von PPE1 in 0,1 M HCl waren nach 3 h noch 97 % intakt, wohingegen 3 % nichtenzymatisch zu PPA1 konvertiert waren. Unter den gleichen Bedingungen wurden 19 % der inkubierten PGD1 zu dPGJ1 dehydratisiert. In den Pflanzenölen veresterte PPF1 wurden mit Schweinepankreas-Lipase innerhalb 1 h zu 44 bis 100 % hydrolysiert. Raffinierte Speiseöle, welche fast ausschließlich aus Triacylglyce-riden zusammengesetzt sind, wurden die veresterten PPF1 sogar zu fast 100 % hydrolysiert. Weiterhin konnte erstmals gezeigt werden, dass Phytoprostane nach oraler Aufnahme resor-biert werden können und anschließend mit dem Urin ausgeschieden werden. Nach Verzehr von Pflanzenölen (Sojaöl, Olivenöl, Traubenkernöl) wurden die Spiegel von PPF1 in Blut und Urin bestimmt. Dabei zeigte sich eine deutliche Korrelation zwischen dem Phytoprostangehalt der Öle und dem Gehalt in den Blut- und Urinproben: Nach Konsum von Oliven- oder Sojaöl konnten innerhalb von 24 h PPF1 in Blut und Urin wiedergefunden werden, wohingegen der Konsum von Traubenkernöl in den untersuchten Zeiträumen weder im Blut noch im Urin zu detektierbaren PPF1-Mengen führte. Im Blut lag PPF1 verestert vor: Im Serum von Olivenöl-Konsumenten konnten durchschnittlich 1,22 nmol/l PPF1 gefunden werden. Das Serum eines Sojaöl-Konsumenten enthielt 0,97 nmol PPF1/l. Die Ausscheidung von unmetabolisierten PPF1 mit dem Urin erfolgte fast vollständig innerhalb der ersten 8 h nach dem Konsum der Öle, 8 bis 24 h danach konnten im Urin nur noch sehr geringe Mengen PPF1 detektiert wer-den. In den Urinproben der Konsumenten von Olivenöl oder Sojaöl konnten nach 0-4 h durch-schnittlich 2,02 bzw. 0,43 pmol PPF1/mg Kreatinin und nach 4-8 h 1,39 bzw. 0,68 pmol PPF1/mg Kreatinin gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die simultane Bestimmung von Phytohormonen, Oxylipinen und Fettsäuren ermöglicht. Weiterhin wurden Methoden zur Metabolit-Analytik entwickelt, mit welchen Konzentrationsunterschiede zwischen zwei Pro-ben direkt verglichen werden können. Zur Markierung von der Carboxylgruppe von Oxylipinen, Phytohormonen und Aminosäuren mit 18O-Sauerstoff wurden allgemein anwendbare Methoden entwickelt. Die [18O]2-markierten Verbindungen erwiesen sich als stabil und eigneten sich als interner Standard in der GC-MS und HPLC-MS Analytik. N2 - Free radical catalyzed oxidation of linolenic acid leads to the formation of several classes of phytoprostanes, which can occur in vitro and in vivo. In the present thesis, phytoprostanes have been determined in plant material (leaves, pollen), fatty oils and human body fluids (blood and urine samples). Within this work, existing methods were optimized in order to detect all phytoprostane classes in various materials. In addition, new methods for simultane-ous detection and quantification of phytohormones and other plant primary and secondary metabolites together in one sampling procedure were developed. Pollen grains contain phytoprostanes in amounts of some mmol/g, among them PPA1/PPB1, PPE1 und PPF1. However, only the concentrations that can be achieved after extraction with water are physiologically relevant. Therefore, the quantity of phytoprostanes that can be ex-tracted with aqueous buffer was examined. In aqueous birch pollen extract, considerable amounts of PPE1 and PPF1 have been found, ranging around 60 nmol PPE1 and 10 nmol PPF1 per gram extracted pollen. Vegetable oils contain a-linolenic acid in concentrations up to 50% (m/m). In edible oils from selected plant species (linseed oil, soybean oil, olive oil, walnut oil, grapeseed oil) and par-enteral nutrition (intralipid) the phytoprostane classes A1, B1, D1, E1, F1 and deoxy-J1 were identified and quantified. High levels of phytoprostanes (0,4 – 101 mg / g oil) in both free and esterified form were found even in apparently fresh oils. Linseed oil and soybean oil con-tained the highest levels of phytoprostanes (26 µg / g and 29 µg /g, respectively). The abso-lute phytoprostane content of the oil declined in the following order: Linseed oil » soybean oil > olive oil > walnut oil > rapeseed oil >> grape seed oil. Surprisingly, the total amount of phytoprostanes did not correlate well with the linolenic acid content and the content of vita-min E (a-tocopherole). In all oils, either PPE1 or PPF1 was the dominant phytoprostane class. PPA1 and PPB1 were only minor components. PPD1 was found in very small amounts whereas dPPJ1 could exclusively be detected in natural soybean oil. Moreover, levels of oxidized lipids dramatically increase when oils become autoxidized upon prolonged storage. It was shown that during autoxidation of edible oils the levels of PPE1 and PPF1 may raise 10-fold. Furthermore, the formation of detectable amounts of dPPJ1 was demonstrated. The formation of phytoprostanes showed the kinetics typical for all autoxidation products and the amount of oxylipin increased after an induction period. In the human gastrointestinal tract, phytoprostanes are chemically stable. Indeed, exposed to the acidic conditions in the stomach (pH 0-2), dehydration reactions may take place. After incubation of PPE1 in 0,1 M HCl for 3 h, 97% remained intact while 3% were non-enzymatically converted to PPA1. Under the same conditions, 19% of the incubated PGD1 were converted into dPGJ1.Pancreatic lipase released 44 to 100 % of PPF1 esterified in the plant oils within 1 h. Refined oils that consist almost completely of triacylglyceroles were hydrolyzed nearly by 100 %. Furthermore, absorption of phytoprostanes from the human intestinal tract and excretion into urine could be demonstrated for the first time. After oral consumption of 100 ml of a vegeta-ble oil (olive oil, soybean oil or grape seed oil) PPF1 levels were determined in blood and urine. A strong correlation could be found between the amount of phytoprostanes in the oil and the PPF1-content of the blood and urine samples. Within 24 hours after consuming olive or soybean oil, PPF1 were found in the examined body fluids, whereas after the intake of grape seed oil, PPF1 could be detected neither in blood nor in urine. In blood, PPF1 occurred esterified and the collected blood samples of olive oil consumers contained 1,22 nmol/l PPF1 on average while in the blood of one consumer of soybean oil 0,97 nmol PPF1/l could be de-tected. Excretion of the unmetabolized PPF1 in urine occurred nearly completely during the first 8 hours and 8 to 24 hours after the oil intake only very small amount of PPF1 were still measured. 0-4 h after the oil consumption the urine of olive or soybean oil consumers con-tained on average 2,02 and 0,43 pmol PPF1/mg creatinine and after 4-8 h 1,39 and 0,68 pmol PPF1/mg creatinine, respectively. A method that allows the simultaneous determination of phytohormones, oxylipins and fatty acids was developed. Additionally, methods were developed that enable a direct comparison of two different samples in a sum of metabolites. These methods were shown to be suitable for the determination of fatty acids and amino acids. For the labeling of oxylipins, acidic phytohormones and amino acids with 18O in the carboxyl group general methods were established. The [18O2]-labelled compounds are stable and suit-able as internal standards for GC/MS and HPLC/MS analysis. KW - Prostaglandine KW - Pflanzen KW - Mensch KW - Phytoprostane KW - Isoprostane KW - Prostaglandine KW - Jasmonate KW - Oxylipine KW - phytoprostanes KW - isoprostanes KW - prostaglandins KW - jasmonates KW - oxylipins Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20424 ER - TY - THES A1 - Hetzel, Georg T1 - Die Neophyten Oberfrankens T1 - Alien plants in Upper Franconia N2 - No abstract available KW - Oberfranken KW - Neophyten KW - Neophyten KW - Oberfranken Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18288 ER - TY - THES A1 - Schiedermair, Wolfgang T1 - Pflanzenmalereien in drei unterfränkischen Kirchen : Ikonographie, Kunstgeschichte und aktuelle Bedeutung in Bezug auf die Entwicklung von Medizin und Geschichte T1 - plant decorations in three churches in Unterfranken : Iconography, art history and actual importance referring to the development of medicine and pharmacy N2 - Zusammenfassung: Untersucht wurden die Pflanzenbemalungen in drei unterfränkischen Kirchen, die in ihrer Naturnähe und damit botanischen Korrektheit sowie in ihrer Intention differieren. Die Aufgabe der Arbeit war, soweit möglich eine botanische Bestimmung durchzuführen, nach Gründen für das Auftauchen von floralen Dekorationen in Sakralräumen allgemein und speziell für das Auftauchen einer bestimmten Species im speziellen zu suchen. Die drei betrachteten Kirchen unterscheiden sich zum einen in ihrer ursprünglichen Nutzung: "normale" Pfarrkirche, Hofkapelle eines Domherrenhofs und Betort einer Rosenkranzbruderschaft, die im Zuge der Gegenreformation unter Julius Echter gegründet wurde. Letztere diente wohl auch als repräsentative Schloßkapelle zum Schloß Büchold. Weitere Unterschiede sind in der Qualität der Ausmalung zu erkennen: Die Gotteshäuser in Rothenfels und im Seebacher Hof verfügen über Pflanzendarstellungen, die stark schematisiert sind, wobei die der Allendorfkapelle noch Ansätze von Naturbeobachtung erkennen lassen. Demgegenüber erscheinen die Fresken im Chor der Bücholder Pfarrkirche zwar auch leicht schematisiert, aber doch so nah an der Natur, daß wenigstens zum Teil eine Bestimmung bis auf die Art gelungen ist; bei einigen Exemplaren war dies jedoch nicht möglich. In letzterem Gotteshaus ist die Bemalung ein existentieller Teil des ikonographischen Konzeptes; Rothenfels läßt ein solches nicht erkennen; die Kapelle im Hof Luden entzieht sich einer Beurteilung diesbezüglich, da ihre Innenausstattung kriegsbedingt verbrannt ist. Das dortige Vorkommen von Ruta graveolens L., Rosa spec. und Tulipa spec. als bekannten Marienpflanzen macht ein früher erkennbares Konzept jedoch wahrscheinlich. Zur Kirche St. Nikolaus und Mariae Heimsuchung in Arnstein-Büchold: Der Chor ist in seiner Gesamtheit Teil des Ausstattungsprogramms der Kirche: er symbolisiert den hortus conclusus, den Garten, der Sinnbild nicht nur für die Gottesmutter ist. Innerhalb dieses Chorgartens lassen sich an den liturgisch wichtigen Stellen - Chorbogen, Chorhaupt und Schlußstein - durchweg bekannte Symbolpflanzen finden. Das Chorgewölbe ist in sich gegliedert in 50 Teile und korrespondiert direkt mit der Anzahl der Rosenkränze im Rosenkranzgebet; diese 50 Deckenteile bilden zusammen zwei vierzählige Blüten, die das Garten- oder Blumenmotiv verstärken. An Stellen, die ohne besondere Wichtigkeit sind, hat der Maler Wolfgang Ritterlein eine bunte Mischung aus einheimischen, fremdländischen und phantastischen Pflänzlein gestaltet, so daß in der Gesamtheit nicht nur ein umschlossener Garten, sondern auch eine Wunderkammer, ein Kuriositätenkabinett entsteht. - Damit erweist sich die Bemalung dieses Chors als eine schöne Symbiose aus symbolhafter Ausstattung und Repräsentation wie sie zu Beginn des Barocks nicht selten begegnet. N2 - Summary: The floral decorations of three churches in Unterfranken were investigated. These paintings differ from their similarity to nature and consequently from their botanical exactness as well as from their intention. It was my task to classify botanically the plants as far as possible, to search for reasons for the appearance of floral decorations in sacral areas in general and especially for the appearance of a particular species. The three churches have been used in different ways: as parish church, as private chapel in a canon’s Curia and meeting place of a rosarybrotherhood, which was founded, when Julius Echter von Mespelbrunn was prince-bishop of Würzburg during the Counter-Reformation. The last-named has probably been used as a representative chapel belonging to the Castle Büchold. Further differences are recognizable in the quality of the floral paintings: The places of worship in Rothenfels (parish church) and in the Seebacher Hof (private chapel) have intensively schematized plant depictions, whereas the paintings of the Allendorf Chapel (the last-named) show even first signs of nature observation. In contrast, the decorations in the choir of Büchold’s Church seem also lightly schematized, but still as similar to nature that some plants could be classified down to the species; however, a few species could not be classified at all. The floral painting is an essential part of the iconographic concept; you cannot find such a concept in Rothenfels. The interior decoration of the private chapel of the Curia Seebach was destroyed during the bomb attack of Wuerzburg at the end of the second World War, consequently an earlier iconographic concept is no longer visible. The existence there of Ruta graveolens L., Rosa spec. and Tulipa spec. makes such a former concept plausible. The church of Arnstein-Büchold is consecrated to St. Nikolaus and the Visitation of Mary; the entire choir is part of a programmatic decoration. It stands for the “hortus conclusus”, the garden that is a symbol not only for the Holy Town of Jerusalem, but also for the Mother of God. Inside this choir garden you can find well-known symbolic plants at areas that are of liturgical importance, such as choir-arch, choir-end and keystone. The vault is divided in 50 parts and this figure is corresponding to the number of prayers in the rosary. Parts of the vaulting are forming two flowers, each consisting of four petals, which are intensifying the garden and the flower motive. At areas of no special importance Wolfgang Ritterlein – the artist of the paintings – created a mixture of native, foreign and imaginative plants. The entire result is not only a surrounded garden, but even a treasury - it has become a collection of curios. Therefore, the painting of this choir is a beautiful symbiosis consisting of symbolic decoration and representation, which you could find often at the beginning of the baroque period. KW - Mariae Heimsuchung und Sankt Nikolaus KW - Büchold KW - Pflanzendarstellung KW - Deckenmalerei KW - Rothenfels KW - Mariae Himmelfahrt KW - Würzburg KW - Allendorfkapelle KW - Pflanzenmalerei KW - Büchold KW - Rothenfels KW - Allendorf-Kapelle KW - Symbolik KW - plant decorations KW - Büchold KW - Rothenfels KW - Allendorf-chapell KW - symbolism Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18069 ER - TY - THES A1 - Büchsenschütz, Kai T1 - Struktur und räumlich-zeitliches Expressionsverhalten von Kaliumkanälen bei Zea mays T1 - Structure and expressionpattern of potassium channels of Zea mays N2 - Bei Zea mays wurden neue Kaliumkanäle der Shaker-Familie isoliert, charakterisiert und zusammen mit bereits bekannten Vertretern dieser Familie hinsichtlich möglicher Aufgaben und Interaktionen untersucht. N2 - New potassium channels of Zea mays that belong to the Shaker-family were isolated and characterized. Their partial role and interaction with other channel members of the same family was focused on. KW - Mais KW - Kaliumkanal KW - Gen shaker KW - Genexpression KW - Kalium KW - Zea KW - Mais KW - Shaker KW - potassium KW - Zea KW - corn KW - Shaker Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17522 ER - TY - THES A1 - Steinmeyer, Ralf T1 - Untersuchungen und Simulationen zur Koordination der Ionenflüsse bei der Schließzellbewegung in Vicia faba und Arabidopsis thaliana T1 - Studies and Simulations about the Coordination of Ion Fluxes during the Guard Cell Movement in Vicia faba and Arabidopsis thaliana N2 - Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte. N2 - While the function of stomata as well as of the different proteins involved in ion fluxes across the plasma membrane are well understood, a guard cell specific model for the concerted function and coordination is still missing. Results - KAT1, the inward rectifying potassium channel from Arabidopsis thaliana is well characterized in terms of structure and electrophysiological function. A knock-out mutant of this channel should be restrained in stomatal opening. Nevertheless under different conditions, with light or fusicoccin as opening stimulus, no difference could be found between wild type and KAT1::En-1 mutant plants. - Glucose is found to accumulate in guard cells during the day when stomata are opened and it is thus suggested to contribute to the osmotical pressure for opening. The uptake of a fluorescent glucose derivative was found to be light dependent and impaired by addition of CCCP which eliminates the proton gradient across the plasma membrane. - A knock-out mutant of the proton/sugar cotransporter protein AtSTP1 showed a significant reduction of cells showing 2-NBDG fluorescence as compared to the wild type. This shows a prominent contribution of this transporter to the uptake of glucose. - Changes of the free running membrane potential upon light/dark transitions were measured in guard cells of intact Vicia faba plants. A majority of these cells showed repeatable hyperpolarizations in light and depolarizations in darkness. These changes in potential were mainly driven by the (in-)activation of an instantaneous positive current of about 35 mA, most probably the H+-ATPase. - In a biophysical simulation, the dependence of anion channel, inward as well as outward rectifying potassium channels and proton pump on cytosolic and apoplastic ion concentrations, pH and membrane potential were included to build a model of ion fluxes for stomatal movements. Also included were literature values for channel conductance and the kinetics of concentrations during stomatal movements. - From this model, two main predictions were made for the cooperation of transport proteins in stomatal movements: 1. At the end of the opening phase of stomata, the H+-ATPase must be deactivated, since otherwise the cytosolic potassium concentration would rise and the membrane potential would decrease both to values that were never reproduced in measurements. A desensitization of the H+-ATPase was already found after pulses of blue light, but never upon permanent white light. 2. The proton/chloride cotransporter not only needs to be active during stomal opening for chloride uptake, but also during closure. Since in guard cells of open stomata, the concentration of potassium is higher than that of chloride, a 1:1 efflux of both ions would soon end the depolarization needed for further potassium efflux. To overcome this, a chloride cycle is suggested, where the cotransporter is active and keeps the net efflux of chloride small. - Different loading techniques were tested for fluorescent calcium indicator dyes. Incubation at low pH, for the free acid form as well as low temperature for the acetoxymethyl-ester forms of the dyes were shown to be impossible in Vicia faba guard cells. During the work on this thesis, one example for a detergent-aided loading of free acid dyes was published. - For parallel recording of electrophyiological parameters and cytosolic ion concentrations, an injection technique was tested that operates by regulated air pressure on one barrel of a double-barreled pipette. The other barrel was used for measurements of the membrane potential. Experiments with a discontinuous voltage clamp amplifier failed, since the target voltage was not reached probably due to non-compensable, variable pipette capacities. KW - Ackerbohne KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Apoplast KW - Membranpotential KW - guard cell KW - ion channel KW - apoplast KW - membrane potential Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17098 ER - TY - THES A1 - Degenhardt, Birgit T1 - Wachstum und physiologisches Verhalten von Zea mays bei multiplem Streß unter besonderer Berücksichtigung des Wurzelsystems T1 - Growth and physiological behaviour of Zea mays under multiple stress with special focus on the root system N2 - In der vorgestellten Arbeit wurden das Wachstum und das physiologische Verhalten von Zea mays auf Müllheizkraftwerk (MHKW) -Schlacke im Vergleich zu Gartenerde als Kulturmedium untersucht. Dabei stand das Wurzelsystem der Maispflanzen im Mittelpunkt des Interesses. Da feste Bodensubstrate verwendet wurden, mußten diese zu Beginn der Experimente chemisch, physikalisch und bodenbiologisch charakterisiert werden. Die Analyse der Schlacke zeigte, daß Schlacke ein multifaktorielles Streßsystem darstellt: Sie enthält einen hohen Gehalt an leicht löslichen Salzen, v.a. NaCl (bis zu 220 mM in der Bodenlösung). MHKW-Schlacke ist dagegen arm an Stickstoff und pflanzenverfügbarem Phosphat. Der pH-Wert der Bodenlösung von Schlacke ist stark alkalisch (pH 8.4 - 9.0). Darüber hinaus besitzt Schlacke einen hohen Gehalt an potentiell toxischen Schwermetallen und weist im Vergleich zum Kontrollsubstrat Gartenerde eine verdichtete Bodenstruktur mit erhöhtem mechanischen Widerstand auf. Im Vergleich zu der Kontroll-Anzucht auf Gartenerde reagierten die auf Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen mit vermindertem Wachstum: Sproß und Wurzel erreichten nur die Hälfte der Länge der Kontrollpflanzen. Ein Vergleich der Biomassen von Sproß und Wurzel zeigte, daß das Sproßwachstum der Schlacke-Pflanzen stärker eingeschränkt ist als das Wurzelwachstum, woraus ein vergrößertes Wurzel / Sproß-Verhältnis resultiert. Das Wachstum von jungen Mais-Pflanzen auf Schlacke ist jedoch nicht in dem Maß eingeschränkt, wie es aufgrund der hohen Salzbelastung zu erwarten wäre. In einem Vergleichsexperiment mit Mais-Pflanzen, die in einer Nährlösung mit Zusatz von 100 mM NaCl kultiviert wurden, war das Wachstum erheblich schlechter und in den Blättern akkumulierte weitaus mehr Natrium als in Schlacke-Pflanzen. Hier wird der positive Einfluß des hohen Calciumgehaltes der Schlacke deutlich. Die Beeinträchtigung des Wachstums von Mais bei Kultur auf Schlacke wird hauptsächlich auf Phosphatmangel zurückgeführt, da durch Düngung eine beträchtliche Wachstumsverbesserung erzielt werden kann. Zudem wurden keine toxischen Konzentrationen an Schwermetallen im Blattgewebe von auf Schlacke kultivierten Pflanzen gefunden. Der Photosynthese-Apparat der Schlacke-kultivierten Pflanzen war sehr leistungsfähig: Es bestand keine Beeinträchtigung in der Energieverfügbarkeit (Quantenausbeute des Photosystems II) und die Lichtsättigung der photo-synthetischen Elektronentransportrate lag sogar höher als bei den Kontrollpflanzen. Die Bestimmung des „adenylate energy charge“ bestätigte diesen Sachverhalt. Das Wurzelsystem von Zea mays auf Schlacke wies strukturelle Veränderungen auf. Neben der verkürzten Wurzellänge und dem vergrößerten Wurzeldurchmesser der Schlacke-Pflanzen ergaben mikroskopische Untersuchungen, daß die Wurzeln durch Kultur auf Schlacke mit einer mechanischen Verstärkung reagieren: Stärker ausgeprägte tangentiale Zellwandverdickungen der Endodermis im tertiären Zustand und Zellwandmodifikationen in den radialen Zellwänden der Rhizodermis (Phi-Verdickungen). Für monokotyle Arten, insbesondere für Mais, gibt es bisher keine Beschreibung von Phi-Verdickungen in der Literatur. Gaschromatographische und massenspektrometrische Untersuchungen belegen, daß sich die Zellwände von auf Erde und Schlacke kultivierten Maiswurzeln im Hinblick auf den Gesamtgehalt an Lignin (endodermale Zellwandisolate) und in der Ligninzusammensetzung (hypodermale Zellwandisolate) unterscheiden: In Schlacke-kultivierten Maiswurzeln wurde ein höherer Anteil an dem Lignin-Monomer p Hydroxyphenyl gefunden, was zu einem höher verdichteten Lignin führt (Streßlignin). Die endodermalen Zellwände von auf Schlacke-kulivierten Pflanzen hatten dagegen einen höheren Gesamtlignin-Gehalt als die entsprechenden Kontrollen, was ebenfalls eine mechanische Verstärkung der Wurzel bewirkt. In Bezug auf Suberin konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Anzuchten gefunden werden, weder in den hypodermalen noch in den endodermalen Zellwandisolaten. Die verschiedenen Streßfaktoren führen demnach nicht zu einer verstärkten Imprägnierung der Zellwände mit lipophilem Material. Die Zellwände von Mais spielen eine wichtige Rolle bei der Immobilisierung von Schwermetallen. Die Zellwandisolate von auf Erde und Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen wiesen je nach Schwermetall-Element 43 - 100 % des Gesamtgehaltes auf. Die absoluten Gehalte in den Zellwandisolaten von auf Schlacke angezogenen Pflanzen waren dabei höher als die entsprechenden Werte der Kontrolle. Eine Anreicherung in den Zellwänden wurde hauptsächlich für die Schwermetalle Zink, Blei, Nickel und Chrom beobachtet. Als unspezifische Streßantwort reagierten Maispflanzen auf die Kultur in Schlacke mit einer erhöhten Peroxidaseaktivität in der interzellulären Waschflüssigkeit. Die Peroxidaseaktivität des Symplastens der Wurzel unterscheidet sich zwischen den beiden Anzuchten dagegen nicht. Die Konzentration des Phytohormons Abscisinsäure (ABA) war in Blättern von auf Schlacke kultivierten Pflanzen von Zea mays und Vicia faba im Vergleich zu den Kontrollpflanzen erhöht. Dieser Anstieg ist eine Folge der erhöhten Salzbelastung der Schlacke, da die ABA-Gehalte entsprechender Blätter von auf gewaschener Schlacke kultivierten Pflanzen annähernd den Kontrollwerten entsprachen. Bei der Verteilung von ABA zwischen der Wurzel und der Bodenlösung der umliegenden Rhizosphäre konnte das als Anionenfalle bekannte Prinzip bestätigt werden. Nach diesem Modell reichert sich ABA im alkalischten Kompartiment an (hier: Schlacke-Bodenlösung). In den Wurzeln konnte nur in der Maiskultur auf Schlacke ein erhöhter Gehalt gefunden werden, nicht dagegen in der Vicia faba-Kultur. Dieser Unterschied liegt daran, daß Mais im Gegensatz zu Vicia faba eine exodermale Spezies ist und die Exodermis für ABA eine Barriere darstellt, was den ABA-Efflux in die Rhizosphäre verhindert. Im Wurzelgewebe von auf Schlacke kultivierten Maispflanzen wurde ein im Vergleich zur Kontrolle 15-facher Gehalt an wasserlöslichen, nicht proteingebundenen Sulfhydrylgruppen nachgewiesen. Diese auf Schwermetallstreß zurückzuführende Reaktion impliziert, daß die in der Schlacke-Bodenlösung vorhandenen Schwermetalle nicht ausreichend im Apoplasten zurückgehalten werden und bis in den Symplasten vordringen können. N2 - In the present thesis the growth and physiological behaviour of Zea mays cultivated on municipal solid waste incinerator bottom slag and garden mould were investigated. Thereby the root system of the maize plants was of main interest. Since solid soil substrates were used, experiments started with the chemical, physical and microbiological characterisation. The analysis represents the bottom incinerator slag as a multifactorial stress system: Slag contains a considerable amount of highly soluble salts, mainly sodium chloride (up to 220 mM in the soil solution). However, slag is poor in nitrogen and plant available phosphate. The pH-value of the slag soil solution is very alkaline (pH 8.4 – 9.0). Furthermore, slag exhibits high levels of potential toxic heavy metals and presents a condensed soil matrix with strong mechanical impedance. Compared to the control culture on garden mould, maize plants cultivated on slag showed a reduced growth: shoot and root of slag cultivated plants reached only one half of the length of the control plants. On the other hand the comparison of the shoot and root biomass revealed, that the shoot growth of the slag plants was more reduced than the root growth, resulting in an increased root to shoot ratio. Observing young corn plants on slag, the growth is not decreased as such extensively as it would be expected by this high salt burden. In a comparative experiment maize plants were cultivated in hydroponic culture supplemented by 100 mM NaCl. Here the plant growth was considerable inferior and the maize leaves accumulated sodium in much higher amounts. This emphasises the positive influence of the high calcium content of the slag. The long lasting impaired growth from corn plants cultivated on slag is mainly due to phosphate deficiency, because a substantial amendment of growth can be obtained by fertilising. Furthermore, no toxic concentration of heavy metals was detected in the leaves of slag grown plants. The photosynthetic performance of slag cultivated plants is very efficient: the energy availability (quantum yield of the photosystem II) was not reduced and the light saturation of the photosynthetic electron transport rate was even higher than for the control plants. The determination of the adenylate energy charge confirms that fact. Cultivating corn on slag, structural modifications can be observed in the root system. Besides the reduced root length and the enlargement of the root diameter microscopic examinations revealed, that roots response with a mechanical strengthening. They form more intensive tangential cell wall thickenings of the endodermis in the tertiary state of development and cell wall modifications in the radial cell walls of the rhizodermis (phi thickenings). Phi thickenings in monocotyledons species especially for maize haven’t been reported in the literature to date. Gaschromatographic and mass spectrometric investigations showed, that cell walls of maize roots cultivated on garden mould and slag differ in the total amount of lignin (endodermal cell wall isolates) and in lignin composition (hypodermal cell wall isolates): In slag cultivated corn roots a larger proportion of the lignin monomer p hydroxyphenyl was detected, which results in higher condensed lignin. The higher amount of total lignin of the endodermal cell walls from slag grown plants also causes a mechanical strengthening of the root. With regard to suberin no differences were found between the cultures, neither in hypodermal nor in endodermal cell wall isolates. Therefore the various stress factors do not induce a stronger impregnation of the cell walls with lipophilic material. The cell walls of maize play an important role by immobilisation of heavy metals. Depending on the metal species, 43 - 100 % of the total amount of the metals was recovered in cell wall isolates of garden mould and slag cultivated maize plants. The absolute amounts in the cell wall isolates of slag cultivated plants were higher than the corresponding control values. An accumulation in the cell walls were found for the heavy metals zinc, lead, nickel and chrome. As a non specific answer to stress, roots of maize plants react on slag cultivation with a rise in activity of peroxidase. This increase was only manifested in the intercellular wash fluid but not in the symplast. The investigation of the phytohormone abscisic acid (ABA) revealed a higher concentration of ABA in leaves of Zea mays and Vicia faba plants cultivated on slag than for the control plants. That increase is due to the high salt burden of slag, because the ABA values of leaves of plants cultivated on washed slag correspond approximately to the control values. The distribution of ABA between roots and the soil solution of the rhizosphere match to the anion trap concept. In accordance with that model ABA is enriched in alkaline compartments (here slag-soil solution). However, in roots an increased amount of ABA was only detected for maize cultivated on slag, but not for Vicia faba. The reason for that difference between the two plant species is, that Zea mays is an exodermal species and its exodermis represents a barrier for ABA, reducing the ABA efflux into the rhizosphere. In the root tissue of slag cultivated maize plants a 15-fold amount of water soluble, non-proteinogen sulfhydrylgroups was detected. This may be an indication for heavy metal stress and implies, that heavy metal ions in slag soil solution can not be retained sufficiently by the apoplast and enter the symplast. KW - Mais KW - Wurzel KW - Stressreaktion KW - Schlacke KW - Pflanzenwachstum KW - Gartenerde KW - Zea mays KW - Wachstum KW - Physiologie KW - Stress KW - Wurzelsystem KW - Zea mays KW - growth KW - physiology KW - stress KW - rootsystem Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16964 ER - TY - THES A1 - Fuchs, Ines T1 - Die Rolle von Kaliumkanälen der AKT1-Unterfamilie für Kaliumaufnahme und gerichtetes Wachstum T1 - The role of potassium channels of the AKT1-subfamily for potassium uptake and directional growth N2 - In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Transkription des Kaliumaufnahmekanals ZMK1 durch IAA stimuliert wird und dass dieser eine wichtige Rolle für das differentielle Zellstreckungswachstum während der gravitropen Krümmung spielt. Dieser Annahme folgend wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ZMK1 auch in phototrop stimulierten Maiskeimlingen am differentiellen Wachstum der Koleoptile beteiligt ist. Im Hinblick auf diese Fragestellung wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: i. Auch in photostimulierten Keimlingen folgt die Transkription von ZMK1 dem endogenen IAA-Gradienten. Vor allem in der Koleoptilenspitze, wo die Umverteilung der freien IAA in die unbelichtete Flanke stattfindet, wurde der größte ZMK1-mRNA Gradient gemessen. ii. Der Krümmungswinkel photostimulierter Koleoptilen war erheblich kleiner als der ebenso lange gravitrop gereizter Keimlinge. Pflanzen, die auf einem Klinostaten einseitig mit Blaulicht bestrahlt worden waren, zeigten jedoch eine ähnlich starke Krümmung wie gravistimulierte Pflanzen. Der Einfluss der Schwerkraft verhinderte demzufolge eine stärkere Krümmung photostimulierter Koleoptilen. iii. Die ausgeprägtere Krümmungsreaktion von auf dem Klinostaten photostimulierten Maiskeimlingen war mit einer drastischen Auxinverschiebung in der Koleoptilenspitze und einer länger anhaltenden differentiellen Expression von ZMK1 verbunden. Die Wachstumsantwort der Keimlinge konnte daher direkt mit der Verteilung freier IAA und der daraus resultierenden Regulation von ZMK1 korreliert werden. iv. Die Wahrnehmung zweier verschiedener Reize (Schwerkraft, Blaulicht) mündet in einen gemeinsamen Signalweg, welcher zur Umverteilung endogenen Auxins innerhalb der Koleoptile und zur differentiellen Kaliumaufnahme über ZMK1 in den gegenüberliegenden Flanken führt. Die hierdurch bedingte stärker ausgeprägte Zellstreckung in der unbelichteten Koleoptilenhälfte hat schließlich die Krümmung des Keimlings zur Folge. Mit dem Ziel, auch den ZMK1-orthologen Kaliumkanal in einer der wichtigsten Nutzpflanzen, Reis, zu charakterisieren, wurden molekularbiologische und biophysikalische Analysen durchgeführt. Im Bezug auf die verfolgten Ziele dieser Arbeit lassen sich die gewonnenen Ergebnisse wie folgt zusammenfassen: v. Aus Oryza sativa-Keimlingsgewebe konnte das cDNA-Molekül OsAKT1 isoliert und anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT1-Unterfamilie des Shaker- Typs pflanzlicher Kaliumkanäle zugeordnet werden. vi. Die Transkripte von OsAKT1 wurden in Koleoptile und Wurzel 5 Tage alter Reiskeimlinge lokalisiert. Im Gegensatz zur Expression des AKT1-orthologen Kanals in Mais ZMK1 blieb die Transkription von OsAKT1 durch die Erhöhung exogenen Auxins in Koleoptilsegmenten unbeeinflusst. Demzufolge ist es unwahrscheinlich, dass OsAKT1 ähnlich wie ZMK1 eine wichtige Rolle während des auxininduzierten Streckungswachstums spielt. vii. Nach heterologer Expression in HEK293-Zellen wurde OsAKT1 als spannungsabhängiger, kaliumselektiver Einwärtsgleichrichter charakterisiert, der durch Ca2+ und Cs+ geblockt und durch extrazelluläre Protonen aktiviert wird. Ähnliche Eigenschaften konnten in Protoplasten beobachtet werden, die aus Keimlingswurzeln isoliert worden waren. Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass OsAKT1 der dominante Kaliumaufnahmekanal in Reiswurzeln ist. Keimlinge des verwendeten Reiskultivars waren in Reaktion auf Salzstress im Vergleich zu Kontrollpflanzen erheblich im Wachstum verzögert und wiesen einen geringeren Kaliumgehalt auf. Dieser Phänotyp wurde von einer Abnahme der OsAKT1-Transkripte und der Verringerung der durch OsAKT1 getragenen Kaliumströme in Wurzelprotoplasten salzbehandelter Keimlinge begleitet. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass die OsAKT1-vermittelte Aufnahme von Kalium über die Wurzel essentiell für das pflanzliche Wachstum und die Ionenhomöostase salzgestresster Pflanzen ist. N2 - Previous experiments from our lab had already demonstrated that the inward-rectifying K+ channel ZMK1 plays an important role for potassium uptake during cell elongation growth of gravistimulated maize coleoptiles. To investigate if this channel is involved in other auxin-regulated processes as well, the current work focused on the role of ZMK1 for phototropic bending. i. Alike with gravistimulated plants, ZMK1 expression also follows the IAA-redistribution in photostimulated maize seedlings. The gradient in ZMK1-mRNA was most pronounced in the coleoptile tip, where free IAA is translocated into the shaded coleoptile half. ii. The bending angle of photostimulated maize seedlings was much smaller than that reached after gravistimulation. Plants photostimulated on a clinostat, however, displayed a similar bending angle as seedlings responding to a gravistimulus, indicating that gravity restricts further bending of the coleoptile. iii. Stronger phototropic bending of plants illuminated on a clinostat was accompanied by dramatic translocation of free IAA in the coleoptile tip and prolonged differential expression of ZMK1. Thus, the growth response of maize seedlings could be directly correlated with IAA-redistribution in the coleoptile and the resulting differential regulation of ZMK1 transcription. iv. The perception of two different stimuli (gravity, blue light) thus merges into a common signaling pathway, leading to IAA-redistribution and differential K+ uptake in the two flanks of the coleoptile. As a consequence, enhanced cell elongation growth in one half of the organ gives rise to gravi- or phototropic bending. To investigate the role of the ZMK1-ortholog in one of the most important food crops, rice, the respective gene was isolated. Based on molecular and biophysical approaches the gene activity and the function of the gene product were analyzed. v. The cDNA of OsAKT1 was isolated from rice seedlings. Based on the derived amino acid-sequence, OsAKT1 could be grouped into the AKT1-family of plant Shaker-K+-channels. vi. Transcripts of OsAKT1 were localized in root and coleoptile of 5-days-old rice seedlings. In contrast to ZMK1, OsAKT1-expression was not affected by changes in IAA concentration. OsAKT1 therefore does not seem to play a major role in auxin-induced cell elongation processes. vii. Following heterologous expression in HEK293 cells, OsAKT1 was characterized as a voltage-dependent, K+-selective inward rectifier activated by extracellular protons and blocked by Ca2+ and Cs+. The K+ uptake channel measured in protoplast of root epidermal cells showed almost the same functional properties, indicating that OsAKT1 represents the dominant K+-uptake channel in rice roots. viii. Rice seedlings subjected to salt stress displayed severe growth reduction and reduced K+-concentrations both in roots and shoots. This phenotype was accompanied by decreased OsAKT1-expression and diminished K+in currents in root protoplasts. Therefore, OsAKT1-mediated K+-uptake of root cells seems to be essential for plant growth and ion homeostasis during salt stress. KW - Mais KW - Reis KW - Kaliumkanal KW - Salzstress KW - Tropismus KW - Kaliumkanäle KW - Mais KW - Reis KW - Tropismen KW - Salzstress KW - potassium channels KW - maize KW - rice KW - tropisms KW - salt stress Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15875 ER - TY - THES A1 - Glenz, Karin T1 - Entwicklung eines Lipoprotein-Impfstoffes aus Pflanzen : Produktion des rekombinanten 'outer surface protein A' (OspA) von Borrelia burgdorferi in Tabakchloroplasten T1 - Production of vaccines in transgenic plants: Expression of the recombinant outer surface protein A (OspA) of Borrelia burgdorferi in tobacco chloroplasts N2 - Transgene Pflanzen nehmen einen wachsenden Stellenwert bei der Produktion therapeutischer Proteine, besonders von Impfstoffen, ein. Einige dieser Proteine benötigen für ihre Funktionalität verschiedenste post-translationale Modifikation und es ist nicht bekannt, ob Pflanzen zu diesen Stoffwechselleistungen befähigt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte anhand eines bakteriellen Antigens geprüft werden, ob in Chloroplasten von Nicotiana tabacum an einem rekombinanten Protein eine besondere Form der post-translationalen Modifikation, die Lipidierung, durchgeführt wird und ob somit ein alternatives Produktionssystem für einen Lipoprotein-Impfstoff entwickelt werden kann. Basis für diese Untersuchungen war das bakterielle Lipoprotein OspA (outer surface protein A) aus Borrelia burgdorferi. Dieses Protein wird zur Prävention von Lyme-Borreliose eingesetzt und frühere Untersuchungen zeigten, dass OspA sowohl in B. burgdorferi als auch nach heterologer Expression in E. coli einer post-translationalen Lipidierung am N-Terminus unterliegt. Dabei wird das Protein unter Mitwirkung dreier Enzyme (Lgt, Lsp und Lnt) am N-Terminus mit einer Pam3Cys-Struktur versehen und die N-terminale Signalsequenz abgespalten. In dieser Arbeit konnten nach der Etablierung eines Expressionssystems mehrere unabhängige transplastome OspA-Tabakpflanzen generiert werden. Der Anteil an rekombinantem, plastidärem OspA (rpOspA) am löslichen Gesamtprotein wurde mit ca. 1% bestimmt. Dabei lag rpOspA sowohl in einer lipidierten, membrangebundenen als auch in einer nicht-modifizierten, löslichen Form vor. Strukturelle Untersuchungen an rpOspA ergaben, dass in Chloroplasten eine Bakterien-ähnliche Lipidierung an dem Protein durchgeführt wurde. Dabei wurde am N-Terminus ein Diacylglycerin über eine Thioetherbindung an das einzige in der Sequenz vorkommende Cystein gebunden. Anders als in Bakterien wurde die Signalsequenz in Chloroplasten jedoch nicht abgespalten und infolgedessen keine dritte Fettsäure an das Cystein gebunden. Die plastidäre Modifikation an rekombinantem OspA resultierte daher in einer Pam2Cys-Struktur mit Signalsequenz. Untersuchungen zur Immunogenität des rpOspA in Mäusen zeigten eindeutig, dass das rekombinante Protein aus Tabak die Bildung spezifischer Antikörper induziert und damit in seiner Wirkung vergleichbar dem bakteriellen Protein ist. Um die Lipidierungsrate des akkumulierten OspA in Chloroplasten zu erhöhen, wurden weitere transplastome Tabakpflanzen generiert. Diese wiesen neben dem ospA-Gen auch die Gene (lgt, lsp und lnt) der drei modifizierenden Enzyme aus E. coli auf. Durch die simultane Bildung von OspA und den drei modifizierenden Enzyme konnte eine quantitative Lipidierung von rpOspA mit einer Pam2Cys-Struktur erlangt werden. Als Grundlage für vergleichende Untersuchungen zwischen plastidärer und cytoplasmatischer Lipidmodifikation in Tabak wurden ebenfalls Transformationen des Zellkerns mit ospA durchgeführt, wobei jedoch keine heterologe ospA-Expression erreicht werden konnte. Erst durch die Anwendung eines transienten, viralen Expressionssystems war es möglich, ospA im Zellkern zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in Chloroplasten Höherer Pflanzen eine Bakterien-ähnliche Modifikation an rekombinantem OspA durchgeführt wird und das resultierende Protein eine spezifische Immunantwort in Mäusen induzieren kann. Das Potential von transgenen Pflanzen als alternatives Produktionssystem für Lipoprotein-Impfstoffe wird diskutiert. N2 - Transgenic plants play an increasing role in the production of therapeutical proteins, especially vaccines. Some of those proteins need a posttranslational modification for their activity of immunogenicity and it is still ambiguous if plants are capable of performing these modifications. In the present study it was investigated by the use of a bacterial antigen if a particular form of posttranslational modification, the lipidation of proteins, is performed in chloroplasts of Nicotiana tabacum and if the resulting plants could be further developed into an alternative production system for lipoprotein-vaccines. For this investigation, the bacterial lipoprotein OspA (outer surface protein A) of Borrelia burgdorferi was chosen, a protein used as a vaccine against Lyme disease. Previous studies have been shown that OspA is lipidated on its N-terminus both in B. burgdorferi and when expressed in Escherichia coli. This modification is performed by three different enzymes (Lgt, Lsp and Lnt) which build up a Pam3Cys-structure at the N-terminus of the protein while the N-terminal signal sequence is cleaved. In the present study several independent transgenic plant lines could be generated by the use of a suitable expression system. Analysis showed that the fraction of recombinant plastidal OspA (rpOspA) in transplastomic plants reached approx. 1% of the total soluble protein. Moreover, a lipid modification could be detected in a fraction of the rpOspA which resulted in the membrane association of a portion of the recombinant protein. The structural analysis of rpOspA revealed that in chloroplasts, rpOspA is lipidated in a bacteria-like manner, including the attachment of a diacylglycerol moiety to the sole cysteine via a thioether linkage. Other than in bacteria, the signal peptide is not cleaved in chloroplasts; thus, no additional fatty acid is attached to the cysteine. The plastidal modification on recombinant OspA therefore resulted in a Pam2Cys-structure including the signal sequence. Furthermore, the rpOspA from tobacco showed similar immunogenic properties as the recombinant protein from bacteria when tested in mice, showing the potential of plants as a production system for lipoprotein-vaccines. To further increase and modify the lipidation rate and pattern of tobacco-derived OspA, a new set of transplastomic tobacco plants were generated. These plants not only carried the ospA gene, but also the genes encoding for the three modifying enzymes (lgt, lsp and lnt). This simultaneous expression shifted the ratio between lipidated and non-lipidated rpOspA almost quantitatively to the lipidated form. For further comparisons of the OspA-lipidation either in plastids or in the cytosol transgenic tobacco plants were established. However, after stable integration of ospA into the nuclear genome, no detectable heterologeous expression could be achieved. Only by using a transient viral expression system the nuclear ospA expression was feasible. In this study it has been shown, that in chloroplasts of higher plants a bacteria-like modification on recombinant OspA was performed and that the resulting protein induced a specific immune response in mice. The potential of transgenetic plants as an alternative production system for lipoprotein-vaccines is discussed. KW - Lyme-Krankheit KW - Impfstoff KW - Tabak KW - Chloroplast KW - Lipoprotein KW - pflanzliche Vaccine KW - Lyme-Borreliose KW - lipoproteins KW - plant-derived vaccines Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15884 ER - TY - THES A1 - Popp, Christian T1 - Cuticular transport of hydrophilic molecules with special focus on primary metabolites and active ingredients T1 - Kutikulärer Transport von hydrophilen Primärmetaboliten und Aktivsubstanzen N2 - The plant cuticle as an interface between the plant interior and the adjoining atmosphere plays an important role in any interaction between the plant and its environment. Transport processes across the cuticles were the object of countless research since many decades. However, bulk of the work done was focused on transport of lipophilic molecules. It is highly plausible to examine the penetration of lipophilic compounds, since the cuticle is dominated by lipophilic compartments itself, and the most crop protection agents have lipophilic character. As a result of this research, cuticular transport of lipophilic compounds is relatively well understood. Since several years, examinations were expanded on transport of hydrophilic molecules. In the present study, a direct comparison was made between transport properties of lipophilic and hydrophilic compounds, which allows an objective assessment of the mechanism governing their penetration. The results of this present study debunked the existence of two different pathways across isolated cuticles of Hedera helix (English ivy), a lipophilic and a hydrophilic pathway. This finding was supported by examinations regarding to accelerator and temperature effects on the mobility of both pathways, because the hydrophilic path is insensitive to them - in contrary to the lipophilic one. The lipophilic pathway is rigorously restricted to lipophilic molecules and the hydrophilic pathway is only accessible for hydrophilic molecules. Uncharged hydrophilic compounds can cross the cuticle even the molecules are of relatively large dimensions. In contrast to that, dissociable compounds with a molar volume higher than 110 cm³ mol-1 are excluded from cuticular penetration. Differences in the mobility of uncharged and dissociable molecules might be a hint towards the chemical nature of the polar pathways. It is assumed, that both, cellulose and pectin fibrils, traverse the cuticle which are originated from the epidermal cell wall. While uncharged carbohydrates might be able to penetrate across a pathway made up of cellulose and pectin, dissociated amino acids might be restricted to the cellulose path. This could be a plausible explanation for the higher mobility and the higher cuticle/water partition coefficients of the carbohydrates compared with the amino acids. A hydrophilic pathway was found with isolated grapevine cuticles, too. The apparent size selectivity of the hydrophilic pathway implies transport via narrow pores. From the present data, a mean pore radius of 0.31 nm (H. helix) or rather 0.34 nm (V. vinifera) was calculated. The absolute number of pores per cm² is 1.1 x 109 for H. helix and 3.3 x 109 for V. vinifera cuticles. This finding and the enlarged pore size distribution of grapevine cuticles might be an explanation for the transport of uncharged and dissociable hydrophilic compounds of higher molar volume like paraquat dichloride - in contrast to ivy membranes Wax extraction of ivy membranes uncovers additional pores, which explains the increased mobilities of the hydrophilic compounds across dewaxed membranes. From these extensive measurements it is very conspicuous, that the bulk of cuticular water transpiration occurs via the polar pathway. Since the work was focused on cuticular penetration of primary metabolites like amino acids and carbohydrates, a mechanistic explanation of leaching processes is obtained, simultaneously. In cuticular research, an inconsistent terminology regarding the transport path of the hydrophilic compounds was used. The term ‘hydrophilic pathway’ is definitely correct, since it makes no statement with regard to the shape of this path. In contrast to that, the terms ‘polar pore’ or ‘aqueous pore’ could imply that there is a tube or rather a water-filled tube traversing the cuticle. However - at this point of time – the imagination about the shape of this path is a pathway across interfibrilar gaps within polysaccharide strains. The proposed diameter of these interfibrilar gaps fits very well to the diameter determined in this study. Therefore, the imagination of a pore is not unfounded, but it is a very narrow pore, definitely. Additionally, this pathway is a very straight pathway which corresponds to this simplified imagination. An expanded study was done with paraquat dichloride, which was applied as aqueous droplets on grapevine cuticles. It is assumed that these model membranes reflect transport properties which are very close to that of relevant crops and weeds. The predominating parameter for paraquat penetration is the moisture, either originated from a relative humidity of at least 75% or provided by added chemicals. There is a tendency for good suitability of hygroscopic additives. Increased paraquat penetration was also obtained by raised concentrations and removal of the cuticular waxes. N2 - Die pflanzliche Kutikula als Grenzfläche zwischen der Pflanze und ihrer Umgebung nimmt eine wichtige Aufgabe hinsichtlich der Interaktion Pflanze/Umwelt ein. Kutikuläre Transportprozesse sind bereits seit Jahrzehnten Gegenstand zahlreicher Forschungen. Das Hauptaugenmerk war dabei jedoch größtenteils auf lipophile Verbindungen gerichtet, was auch plausibel ist, da die Kutikula an sich eine lipophile Membran darstellt und nicht zuletzt auch viele Aktivsubstanzen aus dem Bereich des Pflanzenschutzes lipophil sind. Daraus resultiert ein sehr gutes Verständnis hinsichtlich der Transportmechanismen lipophiler Moleküle. In den letzten Jahren wurde die Forschung jedoch auf hydrophile Modellverbindungen ausgeweitet. Die vorliegende Studie beruht auf einem direkten Vergleich der Transporteigenschaften von lipophilen und hydrophilen Verbindungen, der Unterschiede in den jeweiligen Mechanismen aufzeigen soll. Die Ergebnisse dieser Messungen erbrachten den Nachweis für die Existenz zweier klar differenzierbarer Transportwege in isolierten Kutikularmembranen von Efeu (H. helix); einen lipophilen und einen hydrophilen Pfad. Diese Unterscheidung wurde durch weitere Experimente untermauert, da der lipophile Weg - im Gegensatz zum hydrophilen Weg - tensid- und temperatursensitiv ist. Lipophile Moleküle können ausschließlich über den lipophilen Weg permeieren, während der hydrophile Weg ausschließlich für hydrophile Verbindungen zur Verfügung steht. Eine Besonderheit hinsichtlich der Ladung hydrophiler Verbindungen wurde gefunden: Ungeladene hydrophile Moleküle können auch bei größerem Molvolumen noch durch die Membran transportiert werden. Im Gegensatz dazu wurde für hydrophile dissoziierbare Moleküle mit einem Molvolumen größer als 110 cm3 mol-1 ein Transportausschluss festgestellt. Unterschiede in der Mobilität geladener und dissoziierbarer hydrophiler Verbindungen könnten ein Hinweis in Richtung der Chemie des hydrophilen Weges sein. Es wird angenommen, dass sowohl Cellulose- als auch Pektinfibrillen die Kutikula durchziehen. Ursprung dieser Fibrillen ist die epidermale Zellwand. Eine höhere Mobilität der Kohlenhydrate gegenüber den Aminosäuren könnte dadurch erklärt werden. Ungeladene Kohlenhydrate können demnach sowohl über Cellulose- als auch Pektinfibrillen transportiert werden, während dissoziierte Aminosäuren möglicherweise nur über Cellulosefibrillen permeieren können. Diese Hypothese würde auch die im Vergleich zu den Aminosäuren höheren Verteilungskoeffizienten der Kohlenhydrate erklären. Auch für Blattkutikeln von Wein (V. vinifera cv. Nelly) wurde ein hydrophiler Weg gefunden. Die ausgeprägte Größenselektivität des hydrophilen Weges impliziert einen Transport durch enge Poren. Aus den gemessenen Daten ließ sich ein mittlerer Porenradius von 0.31 nm für Efeu und 0.34 nm für Wein bestimmen. Die absolute Porenanzahl pro Quadratzentimeter beträgt bei Efeu 1.1 x 109 und bei Wein 3.3 x 109. Diese Ergebnisse und die breitere Verteilung des mittleren Porenradius’ bei Wein können den Transport von Paraquat durch Weinmembranen und den Transportausschluss bei Efeumembranen erklären. Eine Extraktion der kutikulären Wachse bei Efeukutikeln legt weitere Poren frei, die ansonsten blind in der Wachsschicht enden und für Transportprozesse daher nicht zur Verfügung stehen. Aus der Auftragung aller Daten ergibt sich, daß Wasser hauptsächlich über den polaren Weg transportiert wird. Die vorliegenden Daten liefern gleichzeitig eine mechanistische Erklärung für das Auswaschen von Primärmetaboliten aus Blättern, was bereits vor vielen Jahrzehnten beobachtet wurde. Im Verlauf der Arbeit wurden verschiedene Begriffe für den Transportweg der hydrophilen Verbindungen verwendet. Der Ausdruck ‚hydrophiler Weg’ (hydrophilic pathway) ist günstig, da er keinerlei Aussagen über die Beschaffenheit dieses Weges macht. Im Gegensatz dazu beinhalten die in der Literatur präferierten Begriffe ‚polare Pore’ (polar pore) oder ‚wässrige Pore’ (aqueous pore) scheinbar Informationen hinsichtlich der Gestalt dieser Wege. Aus den bisherigen Erkenntnissen lässt sich dennoch ein Vorschlag für die Gestalt des hydrophilen Weges machen. Die Tatsache dass zu Fibrillen aggregierte einzelne Cellulosestränge einen Abstand von ca. 0.8 nm aufweisen, was dem postulierten Porenradius sehr nahe kommt, könnten interfibrilläre Zwischenräume den hydrophilen Weg darstellen. Der Begriff einer ‚Pore’ ist daher möglicherweise gar nicht abwegig. Jedenfalls ist der hydrophile Weg, im Gegensatz zum lipophilen Weg, ein ungewundener Weg, was der Vorstellung einer ‚Pore’ entgegen kommt. KW - Kutikula KW - Membrantransport KW - Metabolit KW - Kutikula KW - Transport KW - Primärmetabolite KW - Aktivsubstanzen KW - Leaching KW - cuticle KW - transport KW - primary metabolites KW - active ingredients KW - leaching Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15174 ER - TY - THES A1 - Pröls, Reinhard T1 - Regulation and function of extracellular invertases of tomato T1 - Regulation und Funktion extrazellulärer Invertasen aus Tomate N2 - Wachstum und Entwicklung pflanzlicher Gewebe bedingen eine fortwährende Veränderung von Source-Sink Beziehungen. Gewebe mit einem Nettoexport (Source) oder - import (Sink) von Kohlenhydraten müssen ihren aktuellen Bedarf an Assimilaten entsprechend dem Entwicklungsstadium anpassen. Darüber hinaus haben Pflanzen als ortsgebundene Lebewesen Regulationsmechanismen entwickelt, die eine flexible Antwort der Assimilatverteilung auf spezielle Anforderungen des Habitats, wie biotische oder abiotische Stressfaktoren und wechselnde Lichtbedingungen, ermöglichen. Die Assimilatverteilung ist vielfältig reguliert und erfordert spezifische Enzymfunktionen, wie Zuckertransporter und saccharosespaltende Enzyme. Extrazelluläre Invertasen nehmen eine essentielle Funktion in der apoplastischen Phloementladung und in der Regulation von Source-Sink Übergängen ein. Dies spiegelt sich in dem Auftreten verschiedener Invertase- Isoenzyme mit speziellen Expressions- und Regulationsmustern wider, welche eine Koordination des Kohlenhydratmetabolismus in unterschiedlichen Geweben, zu unterschiedlichen Entwicklungsstufen und unter sich ändernden Umweltbedingungen ermöglichen. Ein detailliertes Wissen über die Funktion extrazellulärer Invertasen könnte eingesetzt werden, um Wachstum, Entwicklung oder Pathogenresisitenz von Nutzpflanzen gezielt zu verändern. In der vorliegenden Studie wurden die Regulationsmuster und die Funktion dreier extrazellulärer Invertasen aus Tomate, Lin5, Lin6 und Lin7 untersucht. Durch umfangreiche Promotorstudien konnte eine gewebe- und entwicklungsspezifische Expression dieser Isoenzyme und entsprechende Regulationsmuster offengelegt werden. Lin5 zeigt eine entwicklungsabhängige Expression in Früchten. Lin6 wird in frühen Entwicklungsstadien, beginnend mit der Samenkeimung, exprimiert; in ausgewachsenen Pflanzen ist eine Lin6 Expression nur in Pollen oder nach Verwundungsinduktion nachweisbar. Lin7 wird ausschließlich in Tapetum-Gewebe und Pollen exprimiert. Die hormonelle Regulation der Isogene wurde im Detail untersucht, hierbei konnten bekannte Phänotypen, welche durch Gibberellinsäure und Jasmonate bedingt werden, mit Invertasefunktionen in Korrelation gebracht werden. Darüber hinaus konnte in einem funktionalen Ansatz gezeigt werden, dass Lin7 eine wichtige Rolle in der Pollenkeimung zukommt. Die vorliegende Arbeit stellt die umfassendste Untersuchung extrazellulärer Invertasen während der Blütenentwicklung dar, an der drei Isoenzyme aus Tomate beteiligt sind. Dadurch, dass den einzelnen Invertasen Lin5, Lin6 und Lin7 individuelle Funktionen zugewiesen werden konnten, eröffnen sich neue Erkenntnisse über die Kohlenhydratversorgung während der Blüten- und Fruchtentwicklung. Für die untersuchten gewebespezifischen Promotoren eröffnen sich zudem Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, was insbesondere für den pollenspezifischen Lin7 Promotor zutrifft. Es konnte gezeigt werden, dass der Lin6 Promotor das Ziel von hormon-, zucker- und verwundungsvermittelten Signalwegen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Elemente des circadianen Oszillators von A. thaliana mit dem Lin6 Promotor funktionell interagieren und die Lin6 Expression einem diurnalen Rhythmus unterliegt. Dieses komplexe Regulationsmuster spiegelt sich in vielen cis-aktiven Elementen wider, die im Lin6 Promotor vorgefunden wurden. Durch dieses Merkmal wird die These gestützt, dass verschiedene Stimuli über die extrazelluläre Invertase integriert werden und so eine koordinierte Zellantwort auf sich ändernde interne und externe Bedingungen ermöglicht wird. Nachdem Zuckermoleküle ihrerseits die Expression von Lin6 induzieren, wird dadurch eine Amplifikation von Signalen über eine positive Rückkopplungsschleife ermöglicht. Die Vielzahl an cis-aktiven Elementen und deren Anordnung im Lin6 Promotor stellen ein ideales Modellsystem dar, um Fragen in Bezug auf Signalinteraktion und -integration zu untersuchen. In einer umfangreichen Studie wurde der Lin6 Promotor erfolgreich als induzierbares Expressionssystem eingesetzt. Hierbei wurde ein Invertaseinhibitor unter der Kontrolle des cytokinininduzierbaren Lin6 Promotors in transgenen Tabakpflanzen exprimiert. Mit diesem Ansatz ist es gelungen einen kausalen Zusammenhang zwischen dem Hormon Cytokinin und extrazellulären Invertasen in der Seneszenzverzögerung herzustellen. Diese Studie zeigt, dass induzierbare Expressionssysteme essentiell sind, um spezifische Fragestellungen auf molekularer Ebene klären zu können. Bei der Klonierung obig genannter Promotorsequenzen haben sich zudem zwei interessante strukturelle Besonderheiten ergeben. Zum einen sind die Gene von Lin5 und Lin7 in einem Tandem auf dem Genom angeordnet, zum anderen konnte eine Transposoninsertion im Intron I des Lin5 Gens gezeigt werden. Mit einem Primerpaar, das aus der Transposaseregion dieses Transposons abgeleitet wurde, konnten entsprechende Sequenzen von mehreren Solanaceae Spezies gewonnen werden. N2 - Because of growth and development, plant tissues are characterised by a permanent change in source-sink relations. Tissues with a net carbohydrate export (source) or import (sink) have to adopt their actual demand for assimilates according to the developmental status. Furthermore, plants, as sessile life forms, have developed regulatory mechanisms that enable a flexible response of assimilate partitioning to specific requirements of the habitat, like biotic and abiotic stress factors and changing light conditions. The distribution of assimilates involves specific enzyme functions including sugar transporters and sucrose cleaving enzymes and is regulated by a variety of stimuli. Extracellular invertases cover an essential function in apoplastic phloem unloading and play an important role in regulating source-sink relations. This property is reflected by the occurrence of different invertase isoenzymes with specific expression and regulation patterns that enable a co-ordination of the carbohydrate metabolism in diverse tissues, at different developmental stages, and under varying environmental conditions. Improved knowledge of extracellular invertase function might allow altering growth, development or pathogen resistance of crop plants in a specific way. The present study is aimed at elucidating the regulation patterns and functions of three members of the extracellular invertase gene family of tomato, Lin5, Lin6, and Lin7. Detailed promoter analysis revealed a tissue- and developmental-specific expression of isoenzymes and corresponding regulation patterns. Lin5 shows a developmental regulated expression in fruits. Lin6 is expressed in early developmental stages starting in germinating seeds; in grown up plants Lin6 is solely expressed in pollen and upon wound-stimulation. Lin7 is exclusively expressed in tapetum and pollen tissue. The hormonal regulation of all three isogenes was analysed in detail, whereby known GA- and JA-mediated flower phenotypes could be correlated with invertase functions. In addition, an important role of Lin7 invertase in pollen germination was demonstrated in a functional approach. This is the most profound analysis of extracellular invertases in the delicate process of floral organ development that includes three tomato isoenzymes. In particular, dissection of the individual roles of Lin5, Lin6, and Lin7 reveals novel insights in carbohydrate supply during flower and fruit development. The analysed tissue-specific promoters are profitable tools in plant biotechnology, which in particular applies to the pollen-specific Lin7 promoter. It has been demonstrated that the Lin6 promoter serves as target for hormonal-, sugar-, and wound-mediated signalling pathways. Moreover, a functional interaction of circadian oscillator elements of A. thaliana with the Lin6 promoter and a diurnal rhythm of Lin6 expression have been substantiated. This complex regulation pattern is reflected by the identification of many well-defined cis-acting elements within the Lin6 promoter. This feature supports an integration of various stimuli mediated via extracellular invertase expression resulting in a co-ordinated cellular response to changing internal and external conditions. As sugars on their part induce Lin6 expression, this could result in signal amplification via a positive feedback loop. Furthermore, the extensive appearance and constellation of cisacting elements within the Lin6 promoter provides the basis to answer questions in signal cross-talk and signal integration in plant gene expression. In addition, the Lin6 promoter was successfully used as an inducible expression system. In transgenic tobacco lines an invertase inhibitor was expressed under control of the cytokinin-inducible Lin6 promoter. Thereby, a causal relationship between cytokinin and extracellular invertase for the delay of senescence was demonstrated. This study emphasises the importance of inducible expression systems to address specific questions on a molecular basis. The above-mentioned promoter sequences were obtained via sequential genome walks. Hereby two interesting structural features appeared. First, Lin5 and Lin7 genes are arranged in a direct tandem repeat on the genome. Second, a CACTA-like transposon insertion in intron I of the Lin5 gene was revealed. A primer pair deduced from the transposase region of this transposon allowed the amplification of similar sequences of various Solanaceae species. KW - Tomate KW - Invertase KW - Extrazellulärraum KW - Genregulation KW - extrazelluläre Invertasen KW - Genregulation KW - Tomate KW - cell-wall invertases KW - gene regulation KW - tomato Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10260 ER - TY - THES A1 - Schraut, Daniela T1 - Auswirkungen von externen Stressbedingungen auf die radialen Wasser- und ABA-Flüsse und den endogenen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes von Maiskeimlingen (Zea mays L.) T1 - Consequences of external stress conditions for the radial ABA- and water-flows and for the endogenous ABA content in root tissues of maize seedlings (Zea mays L.) N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen ABA- und Wasserfluss zu untersuchen und zu überprüfen ob diese Faktoren durch unterschiedliche Nährstoffbedingungen beeinflusst werden. Der radiale Transportweg von ABA wurde ebenfalls untersucht. • In dieser Arbeit konnte das erste Mal gezeigt werden, dass ein direkter Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen Wasser- und ABA-Transport besteht. Unter vergleichbaren Bedingungen können aus einem gegebenen ABA-Gehalt Rückschlüsse auf die radialen Wasser- und ABA-Flüsse gezogen werden. • Während Kalium- und Calciummangel und die Kultur in CaSO4 den radialen Wasserfluss von Maiskeimlingen stimulierten, war Jv unter Nitratmangel reduziert. Phosphat- und Sulfatmangel wirkten sich nicht auf den Wasserhaushalt von Maiskeimlingen aus, trotz einem deutlich reduzierten P- bzw. S-Gehalt konnten keine klaren Defizienzsymptome festgestellt werden. • Der endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe von Maiskeimlingen war nur unter Kalium- und Nitratmangel erhöht. • Der radiale ABA-Transport wurde unter Kalium-, Nitrat-, Calciummangel und in CaSO4-Kultur gesteigert. Der erhöhte ABA-Fluss in Kaliumdefizienten Keimlingen resultiert aus einer gesteigerten ABA-Biosynthese und dem erhöhten Wassertransport. Unter Nitratmangelbedingungen lässt sich der gesteigerte ABA-Fluss anhand des erhöhten ABA-Gehaltes im Wurzelgewebe erklären. Die erhöhte ABA-Konzentration im Xylemsaft von Keimlingen aus Calciummangel- und CaSO4-Kultur ist das Ergebnis des gesteigerten Wassertransportes. Phosphat- und Sulfatmangel hatten keine Auswirkungen auf den ABA-Fluss. • Salzstress (50 mM) reduzierte den radialen Wasserfluss deutlich. Der erhöhte endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe hatte keinen Einfluss auf Jv und JABA. Die Auswirkungen von Salzstress waren voll reversibel. • 100 nM externe ABA wirkte sich unter allen untersuchten Nährstoffbedingungen gleichermaßen stimulierend auf Jv und JABA aus. In NaCl-gestressten Keimlingen zeigte externe ABA keinen Effekt. • Eine Möglichkeit zur Immunolokalisation von ABA in Wurzelquerschnitten von Maiskeimlingen wurde entwickelt und optimiert. • Die Visualisierung des radialen ABA-Transportes anhand der Immunolokalisation mit monoclonalen Antikörpern zeigte, dass Endo- und Exodermis eine apoplastische Barriere für den ABA-Transport darstellen. Die Ergebnisse lassen den Rückschluss zu, dass die Exodermis die wirksamere Barriere für den ABA-Transport ist. • Wurzeln von Maiskeimlingen bildeten unter Nitratmangelbedingungen eine Exodermis aus und verstärkten die Suberinisierung der Endodermis. Unter Kaliummangel konnten keine verstärkten Barriereeigenschaften beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal aufgezeigt werden, dass eine signifikant hohe Korrelation zwischen dem endogenen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem ABA- bzw. Wassertransport besteht. Die ebenfalls positiv signifikant hohe Korrelation zwischen dem radialen Wasser- und ABA-Transport zeigt einen apoplastischen ABA-Transport an. Mit zunehmendem Wasserfluss steigt auch die ABA-Konzentration im Xylem. Ein apoplastischer radialer bypass der ABA konnte auch mit Hilfe der Immunolokalisation nachgewiesen werden. N2 - The objective of this study has been to investigate the relations between the endogenous and internal ABA content in root tissues and the radial ABA- and water-flows and how these individual factors can be affected by different conditions of nutrient deficiency. The radial transport paths also have been studied. • The experiments of this study, for the first time, show a direct correlation between endogenous and internal ABA content in root tissue and radial water- and ABA-transport. From differences of the endogenous ABA content, conclusions can be drawn about changes of the radial water- and ABA-flows under comparable transpiring conditions. • Whereas potassium and calcium deficiencies and CaSO4-culture are stimulating the radial water flow of maize seedlings, nitrate-deficiency will reduce Jv. Phosphorus and sulphur deficiencies do not have an effect on the water balance of maize seedlings because, despite clearly reduced internal P- and S-content no serious deficiency symptoms developed. • The endogenous ABA-content of maize root tissues is enhanced by potassium and nitrate deficiencies only. • Radial ABA-transport is enhanced by potassium, nitrate, calcium deficiencies and in CaSO4-culture. The increased ABA-flow in potassium deficient seedlings is a result of the enhanced ABA-biosynthesis and the increased water-transport. Under conditions of nitrate deficiency the enhanced ABA-content in root tissue results in an increased ABA-flow. In maize seedlings cultivated under calcium deficiency or in CaSO4 the enhanced ABA-concentration of xylem sap is a result of the stimulated water-flow. No effect can be seen under phosphate and sulphate deficiencies. • Salt stress (50 mM) reduces the radial water flow drastically. Although endogenous ABA is accumulated under salt stress Jv remains unaffected. The salt effect is fully reversible. • Under all nutrient deficient and hypoxic conditions, 100 nM external ABA stimulates water and ABA-flows in a comparable way. In NaCl-stressed seedlings external ABA proved to be ineffective. • A technique of immunolocalisation of ABA in cross sections of maize roots has been developed and optimised. • Visualisation of the radial ABA-transport by immunolocalisation with monoclonal antibodies demonstrated the barrier properties of endodermis and exodermis for radial ABA-transport. From the results of immunolocalisation it is concluded that the exodermis only is a significant barrier for radial ABA transport. • Roots of maize seedling build up an exodermis and enhance the suberinisation of the endodermis under nitrogen deficiency, whereas under potassium deficiency no increased barrier properties could be observed. The presented work, for the first time, shows the tight and significant correlation between the endogenous and internal ABA-content of root tissue and the radial ABA- respectively water-transport. Likewise, there is a positive highly significant correlation between the radial water- and ABA-transport, indicating an apoplastic bypass of ABA. With increasing water flow, the ABA-concentration in xylem-sap is increasing as well. A radial apoplastic ABA-flow could also be demonstrated by immunolocalisation. KW - Mais KW - Keimling KW - Abscisinsäure KW - Wasser KW - Nährstoffmangel KW - Abscisinsäure KW - Wasserfluss KW - Nährstoffmangel KW - Salz KW - Immunolokalisation KW - Suberin KW - Abscisic acid KW - water flow KW - nutrient deficiency KW - salt KW - immunolocalisation KW - suberin Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13163 ER - TY - THES A1 - Geiger, Dietmar T1 - Biophysikalische Untersuchung von Phloem-lokalisierten Carriern und Kaliumkanälen und deren Interaktion im Modellsystem der Xenopus Oozyte T1 - Biophysical studies of phloem-localized carriers and potassium channels and their interaction in the model system of Xenopus oocytes N2 - Das Phloem stellt ein Netzwerk zur Assimilat- und Nährstofftranslokation sowie zur elektrischen Kommunikation innerhalb der Pflanze dar. In apoplastisch beladenden Pflanzen werden die funktionellen Eigenschaften des Phloems im Wesentlichen vom Zusammenspiel eines Transportmoduls, bestehend aus Carriern, Kaliumkanälen und Protonen-ATPasen, bestimmt. Ausgangspunkt für die biophysikalische Charakterisierung dieses Phloem-Transportmoduls waren Arbeiten zum Saccharosetransport in der Arabidopsis akt2/3-1 Mutante. Das AKT2/3 Gen kodiert für einen Phloem-spezifischen Kaliumkanal vom Shaker-Typ. Die Tatsache, dass der Saccharosegehalt im Phloem dieser Mutante um 50% im Vergleich zum Wildtyp reduziert war, ließ eine enge Kopplung von Kalium- und Zuckerflüssen vermuten. Um diesen Phänotyp aufklären zu können und ein Modell für die Beladungsprozesse an der Phloemmembran zu entwickeln, wurde das heterologe Expressionssystem der Xenopus Oozyten gewählt. So konnte in Coexpressionsstudien die Interaktion von Phloem-lokalisierten Kaliumkanälen und Transportern sowie die Kopplung des Kalium- und Zuckertransports mit Hilfe biophysikalischer Methoden untersucht werden. N2 - In plants the phloem tissue constitutes a network providing for assimilate and nutrient translocation as well as electrical communication. A transport module, consisting of carriers, channels and pumps plays a pivotal role in apoplasmically loading plant species and determines the specific transport properties of phloem cells. The AKT2/3 channel represents a phloem-specific Shaker-like K+ channel of the model plant Arabidopsis thaliana. Based on the observation, that sucrose transport is severely impaired in the corresponding akt2/3-1 mutant, we hypothesised a tight coupling of potassium and sugar fluxes during phloem loading. In order to allow a biophysical characterisation of the transport processes at the phloem plasma membrane during sugar loading, we decided to employ Xenopus oocytes as a model system for the heterologous expression of phloem transport proteins. KW - Phloem KW - Glatter Krallenfrosch KW - Oozyte KW - Kaliumkanal KW - Zucker KW - Phloem KW - Kaliumkanal KW - Zuckertransport KW - Transporter KW - Xenopus KW - Phloem KW - Potassium channel KW - sugar transport KW - carrier KW - Xenopus Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13108 ER - TY - THES A1 - Jiang, Fan T1 - Water, mineral nutrient and hormone flows and exchanges in the hemiparasitic association between root hemiparasite Rhinanthus minor and the host Hordeum vulgare N2 - Summary Using the facultative root hemiparasite Rhinanthus minor and Hordeum vulgare as a host, several aspects of water relations, the flows and partitioning of mineral nutrients, the flows, depositions and metabolism of abscisic acid (ABA) and zeatin type cytokinins (zeatin Z, zeatin riboside ZR, zeatin nucleotide ZN) within the host, the parasite and between host and parasite and the flows and partitioning of the transport metabolites mannitol in the parasite, and of sucrose in the host, have been studied during the study period 41 to 54 days after planting, i.e about 30 to 43 days after successful attachment of the parasite to the host. Water relations Extraction of xylem sap by the parasite from the host’s roots is facilitated by considerably higher transpiration per leaf area in the parasite than in the host and by the fact that stomata of attached Rhinanthus were wide open all day and night despite extremely high ABA concentrations in the leaves. By comparison, another related root hemiparasite, Melampyrum arvense, parasitising on various grasses in the field (botanic garden), showed normal diurnal stomatal behaviour. The abnormal behaviour of Rhinanthus stomata was not due to anatomical reasons as closure could be induced by applying high external ABA concentrations. Remarkable differences have been detected between the hydraulic conductance of barley seminal roots showing relatively low values, and that of Rhinanthus the seminal root showing very high values. The latter could be related to the observed high ABA concentrations in these roots. Whole plant water uptake, transpirational losses, growth-dependent deposition and the flows of water within the plants have been measured in singly growing Rhinanthus and Hordeum plants and in the parasitic association between the two. Water uptake, deposition and transpiration in Rhinanthus were dramatically increased after attachment to the barley host; most of the water used by the parasite was extracted as xylem sap from the host, thereby scavenging 20% of the total water taken up by the host’s roots. This water uptake by the parasitised host, however, due to a parasite induced reduction in the hosts growth, was decreased by 22% as compared to non- parasitised barley. The overall changes in growth-related water deposition in host and parasite pointed to decreased shoot and relatively favoured root growth in the host and to strongly favoured shoot growth and less strongly increased root growth only in the parasite. These changes in the host became more severe, when more than one Rhinanthus was parasitising one barley plant. Mineral nutrients relations 5 mM NO3- supply In parasitising Rhinanthus shoot growth was 12-fold, but root growth only twofold increased compared to the non-parasitising (very small) plants. On the other hand, in the Hordeum host, shoot dry matter growth was clearly reduced, by 33% in leaf laminae and by 52% in leaf sheaths, whereas root growth was only slightly reduced as a consequence of parasitism. Growth-dependent increments of total N and P and of K, Ca and Mg in parasitising Rhinanthus shoot were strongly increased, particularly increments of total N and P, which were 18 and 42 times, respectively, higher than in the small solitary Rhinanthus. On the other hand, increments of the above mineral nutrients in leaf sheaths of parasitised Hordeum vulgare were more strongly decreased than in leaf laminae in response to parasitic attack. Estimation of the flows of nutrients revealed that Rhinanthus withdrew from the host xylem sap about the same percentage of each nutrients: 18% of total N, 22% of P and 20% of K. Within the host almost all net flows of nutrient ions were decreased due to parasitism, but retranslocation from shoot to root-as related to xylem flow-was somewhat increased for all nutrients. Quantitative information is provided to show that the substantially increased growth in the shoot of attached Rhinanthus and the observed decrease in Hordeum shoot growth after infection were related to strongly elevated supply of nitrogen and phosphorus in the parasite and to incipient deficiency of these nutrients in the parasitised host. The flows of nutrients between host and parasite are discussed in terms of low selectivity of nutrient abstraction from the host xylem by the hemiparasite Rhinanthus minor. 1 mM NO3- or 1 mM NH4+ supply Rhinanthus shoot growth as measured by dry matter increase, was 19-fold (1 mM NO3-) and 15-fold (1 mM NH4+), but root growth only twofold (1 mM NO3-) and 2.9-fold (1 mM NH4+) increased-relative to singly growing Rhinanthus-when parasitising on host barley. In the Hordeum host, shoot dry matter growth was clearly reduced, whereas root growth was only slightly affected. Growth-dependent increments of total N and P and of K, Ca and Mg in parasitising Rhinanthus shoot were strongly increased, particularly increments of total N or of P, which were 20 or 53 times (1 mM NO3-) and 18 or 51 times (1 mM NH4+) , respectively, higher than those in solitary Rhinanthus. Within the host almost all net flows of nutrient ions were decreased due to parasitism. Flows of mannitol in parasite and sucrose flows in host barley When the plants were supplied with 5 mM NO3-, the biosynthesis of mannitol in Rhinanthus shoots increased 16-fold by parasitism, resulting in a 15-fold higher mannitol flow in the phloem and a 10-fold higher deposition in the shoot. Also the backward transport of mannitol in the xylem were increased 10-fold after attachment. Lower level nitrogen supply increased the deposition of mannitol in both single and attached Rhinanthus shoot and root. No mannitol was found in barley roots even in the direct vicinity of the haustoria. This indicates there are no backward transport of xylem sap from parasite to host. Compared to unparasitised barley, the net biosynthesis and deposition of sucrose in the shoot and the phloem flow was decreased substantially when plants were supplied with 5 mM NO3- or 1 mM NO3-. No sucrose has been detected in barley xylem sap and consequently there was no indication of a sucrose transfer from the host to the parasite. A possible involvement of mannitol in the abscisic acid relations of the parasite is discussed. ABA relations When the plants were supplied with 5 mM NO3-, there were weak or no effects of parasitism on ABA flows, biosynthesis and ABA degradation in barley. However, ABA growth-dependent deposition was significantly increased in the leaf laminae (3 fold) and in leaf sheath (2.4 fold), but not in roots. Dramatic changes in ABA flows, metabolism and deposition on a per plant basis, however, have been observed in Rhinanthus. Biosynthesis in the roots was 12-fold higher after attachment resulting in 14-fold higher ABA flows in the xylem. A large portion of this ABA was metabolised, a small portion was deposited. Phloem flows of ABA were increased 13-fold after attachment. The concentrations of ABA in tissues and xylem sap were higher in attached Rhinanthus by an order of magnitude than in host tissues and xylem sap. Similar dramatic difference existed when comparing the high concentrations in the xylem sap of single Rhinanthus with unparasitised barley. As compared to 5 mM NO3-, lower NO3- or 1 mM NH4+ supply doubled the ABA concentrations in barley leaf laminae, while having only small or no significant effects in the other organs. The possible special functions of ABA for the parasite are discussed. Zeatin type cytokinins relations Parasitism decreased, in the case of zeatin (Z), the synthesis (by 57%) in the root, xylem flows (by 56%) and metabolism (by 71%) in leaf laminae, however, increased the phloem flows of zeatin massively (3-fold) in host barley. The deposition of zeatin in the root of Rhinanthus and the flowing in xylem and phloem were 24, 12, 29-fold, respectively, increased after successfully attaching to the host barley. However, net biosynthesis of zeatin in Rhinanthus roots decreased by 39% after attachment. This indicates that a large portion (70%) of xylem flow of zeatin in attached Rhinanthus was extracted from the host. In singly growing Rhinanthus plants, the balance of zeatin deposition in the shoot was negative, i.e. zeatin was metabolised and exported back to root in the phloem. The xylem flows of zeatin riboside (ZR) in barley decreased by 39% after infected by Rhinanthus; phloem flow, which was 117% relative to xylem flow was less decreased (by 13%) after infection. Deposition of ZR has not been significantly affected in the leaf laminae, in leaf sheaths and roots. After parasitising on the host barley depositions in root, xylem flow and phloem flow increased 12, 18, 88–fold respectively in Rhinanthus. A large portion (57%) of xylem flow of ZR in attached Rhinanthus was extracted from the host. In single Rhinanthus increament of shoot zeatin riboside was negative and a substantial portion was degraded in shoot and the rest was retranslocated back to the root in the phloem. A significant depositions of Z and ZR were detected in the haustoria of the Rhinanthus/barley association. Flows and deposition of zeatin nucleotides also have been investigated. The possible physiological functions of the large quantities of Z and ZR derived from the host barley, for the improved growth and the stomatal opening in the parasitising Rhinanthus are discussed. N2 - Zusammenfassung An dem fakultativen Hemiparasiten Rhinanthus minor, einem Wurzelparasiten, und Gerste (Hordeum vulgare) als Wirtspflanze wurden verschiedene Aspekte des Wasserhaushaltes sowie die Flüsse von mineralischen Nährstoffen in den Leitbahnen von Wirt und Parasit, die Verteilung der Nährstoffe in den ganzen Pflanzen sowie deren Transport vom Wirt zum Parasiten untersucht. Auch für die pflanzlichen Hormone Abszisinsäure (ABA) und die Cytokinine vom Zeatintyp - Zeatin (Z), Zeatinribosid (ZR) und Zeatinnukleotid (ZN) - und die hauptsächlichen Transportmetabolite Mannit (im Parasiten) und Saccharose (in der Wirtspflanze) wurden deren Flüsse in den Leitbahnen der Pflanzen, ihre Verteilung in den Pflanzen, ihre metabolischen Umwandlungen und der mögliche Austausch zwischen Wirt und Parasit untersucht. Der Unersuchungszeitraum lag zwischen 41 und 54 Tagen nach der Aussaat und das war zugleich zwischen ca. 30 und 43 Tage nach dem erfolgreichen Befall des Wirtes durch den Parasiten. Wasserhaushalt. Ein Entzug von Xylemsaft durch die Haustorien des Parasiten aus den Wurzeln des Wirtes wird dadurch bewirkt, dass der Parasit eine wesentlich höhere Transpiration pro Blattfläche aufweist als die Wirtspflanze, sowie im speziellen Fall dadurch, dass bei parasitierenden Rhinanthus-Pflanzen trotz sehr hoher ABA-Konzentration in den Blättern die Stomata Tag und Nacht weit geöffnet sind. Bei einem verwandten Wurzel-Hemiparasiten, Melampyrum arvense, der im botanischen Garten auf verschiedenen Gräsern parasitierte, wurde anders als bei Rhinanthus im Freiland ein normales diurnales Öffnen und Schließen der Stomata beobachtet. Das anomale Spaltöffnungsverhalten bei Rhinanthus beruht freilich nicht auf anatomischen Besonderheiten, denn ein Schließen der Stomata ließ sich durch Applikation extrem hoher ABA – Konzentrationen induzieren. Bemerkenswerte Unterschiede zwischen der Wirtspflanze und dem Parasiten wurden hinsichtlich der hydraulischen Leitfähigkeit der Keimwurzeln von Gerste mit vergleichsweise niedrigen Werten und derjenigen der Keimwurzel von Rhinanthus mit sehr hohen Werten gemessen. Letzteres könnte mit den beobachteten hohen ABA Konzentrationen in den Wurzeln des Parasiten zusammenhängen. Die Wasseraufnahme durch die ganze Pflanze, die Transpiration, die Deposition von Zellwasser in den Organen und die Wasserflüsse in den Leitbahnen innerhalb der Pflanze wurden in unabhängig wachsenden Rhinanthus- und in Hordeum- Pflanzen sowie innerhalb der parasitischen Assoziation zwischen beiden gemessen. Die Aufnahme von Wasser, seine Einlagerung und die Transpiration waren bei Rhinanthus nach erfolgreichem Befall einer Gersten – Wirtspflanze drastisch erhöht, wobei der Hauptanteil des vom Parasiten genutzten Wassers vom Wirt stammte und wodurch 20% der gesamten Wasseraufnahme der Gerstenwurzel entzogen wurde. In der vom Parasiten befallenen Gerste wurde dadurch jedoch die Wasseraufnahme im Vergleich zu einer unbefallenen Pflanze um 22% erniedrigt und zugleich auch das Wachstum behindert. Insgesamt kam es in der Wirtspflanze Gerste zu vermindertem Spross- und relativ gefördertem Wurzelwachstum, während im Parasiten Rhinanthus besonders das Sprosswachstum und weniger das Wurzelwachstum gesteigert wurde. Diese Veränderungen in der Wirtspflanze wurden deutlich intensiviert, wenn die Gerste von mehr als einem Rhinanthus-Parasiten befallen wurde. Mineralstoffwechsel. Düngung mit 5 mM NO3- In parasitierenden Rhinanthus-Pflanzen war das Sprosswachstum 12 – fach, das der Wurzel aber nur zweifach im Vergleich zu selbstständig wachsenden (sehr kleinen) Pflanzen erhöht. Andererseits war in der vom Parasiten befallenen Gerste das Sprosswachstum – gemessen als Trockenmassezunahme – deutlich erniedrigt, und zwar um 33% in Blattspreiten und um 52% in Blattscheiden, während das Wurzelwachstum nur geringfügig im Vergleich zur unbefallenen Kontrolle vermindert war. Die mit dem Wachstum verbundenen Inkorporationen von N, von P, von K sowie von Ca und Mg waren im Spross von parasitisch ernährtem Rhinanthus beträchtlich erhöht, besonders die von N und von P, die 18- oder sogar 42-fach im Vergleich zu den selbständig wachsenden Pflänzchen erhöht waren. Andererseits waren in der Wirtspflanze infolge des Parasitenbefalles die Inkorporationen der genannten Mineralstoffe in den Blattscheiden stärker als in den Blattspreiten erniedrigt. Eine Berechnung der Nährstoffflüsse zeigte, dass Rhinanthus dem Xylemsaft des Wirtes jeweils ähnliche Anteile der Nährstoffe entzog: 18% des insgesamt aufgenommenen N, 22% des P und 20% des K. Innerhalb der Wirtspflanze Gerste waren die Nettoflüsse fast aller mineralischen Nährstoff-Ionen in den Leitbahnen infolge des Parasitenbefalles erniedrigt, aber die Retranslokation im Phloem vom Spross zur Wurzel war für alle Nährstoffe – in Bezug auf den Xylemtransport - geringfügig erhöht. Quantitative Daten deuten an, dass das drastisch gesteigerte Sprosswachstum in parasitisch ernährtem Rhinanthus sowie das vermindere Sprosswachstum bei der Gerste nach dem Parasitenbefall kausal einerseits mit der beträchtlich erhöhten Zufuhr von gebundenem Stickstoff und Phosphor an den Parasiten und andererseits mit einem einsetzenden Mangel an diesen Nährstoffen in der befallenen Wirtspflanze verbunden ist. Insgesamt werden die Nährstoff-Flüsse von der Wirtspflanze zum Parasiten im Lichte einer nur geringfügigen Selektivität des Entzuges von Nährstoff-Ionen zusammen mit dem Xylemsaft aus dem Xylem des Wirtes durch die Haustorien des Wurzelparasiten Rhinanthus minor diskutiert. Düngung mit 1 mM NO3- oder 1 mM NH4+ Das als Trockenmassezunahme gemessene Sprosswachstum von parasitisch ernährtem Rhinanthus war 19-fach (1 mM NO3-) bzw. 15-fach (1 mM NH4+) , das Wurzelwachstum aber nur 2-fach (1 mM NO3-) bzw. 2.9-fach (1 mM NH4+) im Vergleich zur selbständig wachsenden Kontrolle erhöht. In der Wirtspflanze Gerste war das Sprosswachstum deutlich vermindert, während das Wurzelwachstum nur wenig beeinflusst war. Die mit dem Wachstum verbunden Zunahme an gebundenem N und P sowie an K, Ca und Mg waren im Spross von parasitisch ernährtem Rhinanthus stark vermehrt, und zwar besonders die Zunahme an gebundenem N bzw. P, die 20- bzw. 53-fach (bei 1 mM NO3-) und 18- bzw. 51-fach (bei 1 mM NH4+) im Vergleich zu selbständig wachsenden Rhinanthus- Pflänzchen erhöht waren. Innerhalb der Wirtspflanze Gerste waren fast alle Nettoflüsse der verschiedenen Nährstoff-Ionen infolge des Parasitenbefalles erniedrigt. Flüsse von Mannit im Parasiten Rhinanthus und von Saccharose in der Wirtspflanze Gerste. Im Falle einer Stickstoffernährung mit 5 mM NO3- war die Biosynthese von Mannit in den Blättern von parasitisch ernährtem Rhinanthus 16-fach im Vergleich zum selbständig wachsenden Pflänzchen erhöht und das führte zu einem 15-fach gesteigerten Phloemtransport zur Wurzel und einer 10-fach erhöhten Einlagerung von Mannit im Spross. Auch der Rücktransport von Mannit im Xylem von der Wurzel zum Spross war 10-fach erhöht. Im Falle einer Stickstoffernährung mit geringerer Konzentration war die Einlagerung von Mannit im Spross und in der Wurzel sowohl bei selbständig wachsendem als auch bei parasitisch ernährtem Rhinanthus im Vergleich zu 5 mM NO3- erhöht. In der Wirtspflanze Gerste konnte kein Mannit detektiert werden, auch nicht in den Wurzeln von Rhinanthus-befallenen Pflanzen, selbst nicht in direkter Nachbarschaft zu den Haustorien des Parasiten; das bedeutet, es erfolgte kein Rücktransport von Xylemsaft vom Parasiten zur Wirtspflanze. In den Gerstenpflanzen – bei Ernährung mit 5 mM oder mit 1 mM NO3- – wurde die Nettosynthese von Saccharose sowie ihre Einlagerung im Spross und ihr Transport im Phloem zur Wurzel erheblich infolge eines Befalles mit Rhinanthus erniedrigt. Im Xylemsaft von Gerste war die Konzentration von Saccharose unterhalb der Nachweisgrenze und folglich gab es keinen Hinweis auf einen Transfer von Saccharose aus dem Wirt in den Parasiten. Eine mögliche Bedeutung von Mannit für die hohen ABA-Konzentrationen in Rhinanthus wird diskutiert. Konzentrationen und Flüsse von ABA. Bei einer Stickstoffernährung mit 5 mM NO3- hatte ein parasitischer Befall mit Rhinanthus nur geringen oder keinen Einfluss auf die Flüsse, die Biosynthese oder den metabolischen Abbau von ABA in der Gerstenpflanze. Wohl aber wurde die wachstumsbedingte Einlagerung von ABA in den Blattspreiten (3-fach) und den Blattscheiden (2.4-fach) vermehrt, diejenige in der Wurzel blieb aber unverändert. In Rhinanthus dagegen führte der erfolgreiche Befall einer Wirtspflanze zu drastischen Veränderungen der Flüsse, des Metabolismus und der Einlagerung von ABA in die Gewebe, jeweils gemessen im Bezug auf eine ganze Pflanze. Auf dieser Basis war die ABA-Biosynthese in den Wurzeln nach erfolgreichem Befall eines Wirtes 12-fach höher und dies führte zu 14-fach höherem ABA-Transport im Xylem. Ein großer Anteil dieser ABA wurde im Spross metabolisiert, ein kleiner Anteil wurde in die Gewebe eingelagert. Auch die ABA-Flüsse im Phloem wurden 13-fach erhöht. Gleichzeitig waren die ABA-Konzentrationen in den Geweben und im Xylemsaft der parasitierenden Rhinanthus-Pflanze um eine Größenordnung höher als in den Geweben und im Xylemsaft der Wirtspflanze. Dasselbe gilt auch für einen Vergleich zwischen den hohen ABA-Konzentrationen im Xylemsaft von selbstständig wachsendem Rhinanthus und den niedrigen in nicht vom Parasiten befallener Gerste. Im Vergleich zur Ernährung mit 5 mM NO3- führte 1 mM NO3- oder auch 1 mM NH4+ zu einer Verdoppelung der ABA-Konzentrationen in den Blattspreiten von Gerste, hatte aber nur geringe oder keine Wirkung in den anderen Organen. Mögliche spezielle Funktionen von ABA für den Parasiten werden diskutiert. Cytokinine vom Zeatin-Typ Ein parasitischer Befall verminderte bei Zeatin (Z) seine Synthese in der Wurzel der Wirtspflanze Gerste (um 57%), den Xylemtransport (um 56%) und den metabolischen Umbau in den Blattspreiten (um 71%), jedoch vergrößerte er zugleich substantiell (3-fach) den Phloemtransport von Zeatin in der Gerste. In Rhinanthus wurde die Einlagerung von Zeatin in der Wurzel und seine auf eine ganze Pflanze bezogenen Flüsse im Xylem und im Phloem 24-, 12- bzw. 29-fach nach erfolgreichem Befall von Gerste erhöht. Jedoch die Netto-Biosynthese von Zeatin in der Wurzel von Rhinanthus verminderte sich um 39% nach erfolgreichem Befall des Wirtes. Das bedeutet, dass ein großer Anteil (70 %) des im Xylem von Rhinanthus transportierten Zeatin zuvor dem Xylem der Wirtspflanze Gerste entzogen wurde. Im Spross selbständig wachsender Rhinanthus-Pflänzchen war die Einlagerung von Zeatin in die Sprossgewebe in der Bilanz negativ, d.h. Zeatin wurde abgebaut bzw. im Phloem abtransportiert. Die Flüsse von Zeatinribosid (ZR) im Xylem von Gerste wurden nach einem Befall durch Rhinanthus um 39% erniedrigt, aber seine Retranslokation vom Spross zur Wurzel im Phloem, die 117% des Xylemtransportes betrug, wurde nur schwach (um 13%) nach dem Befall erniedrigt. Die Einlagerung von ZR in die Gewebe wurde in den Blattspreiten, den Blattscheiden und den Wurzeln nicht signifikant beeinflusst. Andererseits waren nach einem erfolgreichen Befall von Gerste in Rhinanthus die Einlagerung von ZR in Wurzelgewebe und seine Flüsse im Xylem und im Phloem, alle im Bezug auf die ganze Rhinanthus-Pflanze, 12-, 18- bzw. 88-fach erhöht. Ein beträchtlicher Anteil (57%) des im Xylem von Rhinanthus transportierten ZR entstammte freilich wiederum dem Xylem der Wurzel der Wirtspflanze Gerste. Im Spross selbständig wachsender Rhinanthus-Pflänzchen nahm die Menge an ZR (wie die von Zeatin) im Laufe des Untersuchungs-Intervalles ab, wobei ein beträchtlicher Anteil im Spross metabolisiert wurde und der Rest mit dem Phloem in die Wurzel transportiert. In die an den Gerstenwurzeln sitzenden Haustorien des Parasiten Rhinanthus wurden beträchtliche Mengen an Zeatin und an ZR eingelagert. Auch die Flüsse und die Einlagerung der Zeatinnukleotide in die Gewebe sind untersucht worden. Eine mögliche physiologische Funktion der aus dem Wirt stammenden großen Mengen an Zeatin und an ZR für das gesteigerte Wachstum und die Stomata-Öffnung im parasitierenden Rhinanthus wird diskutiert. KW - Hemiparasit KW - Klappertopf KW - Gerste KW - Stofftransport KW - water KW - mineral nutrient KW - Rhinanthus KW - hemiparasite Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9863 ER - TY - THES A1 - Riedel, Michael T1 - Rutschige Oberflächen von karnivoren Kannenpflanzen (Nepenthaceae) : Physikalisch-chemische Eigenschaften und mikroskopische Struktur epikutikulärer Wachskristalle von Nepenthes alata, N. albomarginata und N. intermedia T1 - Slippery surfaces of carnivorous pitcher plants (Nepenthaceae): physico-chemical properties and microscopic structure of epicuticular wax crystals in Nepenthes alata, N. albomarginata and N. intermedia N2 - Pflanzen der Gattung Nepenthes decken einen erheblichen Anteil ihres Nährstoffbedarfs durch den Fang und die Verdauung tierischer Beute, insbesondere von Insekten. Als Fangorgane dienen kannenförmig umgewandelte Blattspreiten. Die Kanneninnenseiten sind in einer breiten Zone dicht mit epikutikulären Wachskristallen besetzt. Die Oberflächen dieser so genannten Gleitzone sind extrem rutschig für die meisten Insekten und spielen eine zentrale Rolle beim Fang und der Zurückhaltung der Beute in der Kanne. Frühere Untersuchungen beschrieben die Kristalle dabei als extrem fragil, wodurch diese unter der mechanischen Belastung eines Insekts leicht abrechen und somit der Kontakt zur Pflanzenoberfläche verloren geht. Um diese Hypothese zu überprüfen und den Mechanismus der Rutschigkeit verstehen zu können, hatte die vorliegende Arbeit zum Ziel, sowohl die strukturellen als auch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Wachskristalle in den Kannen von drei Nepenthes-Arten vergleichend zu charakterisieren. Diese Eigenschaften können jedoch nur dann bewertet werden, wenn die chemische Zusammensetzung der Wachskristalle verlässlich bestimmt werden kann. Um die gaschromatographische Trennung und massenspektrometrische Analyse der Komponenten zu erleichtern, werden hydroxyl-haltige Verbindungen häufig durch eine Derivatisierung mit N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA) in die entsprechenden Trimethylsilyl-Ether bzw. -Ester überführt. Dabei können jedoch auch unerwünschten Nebenreaktionen carbonyl-haltiger Verbindungen auftreten, die eine quantitative Analyse der ursprünglichen Komponenten erschweren. Im ersten Teil dieser Arbeit ergab die Überprüfung der Derivatisierungsreaktion, dass aliphatische Aldehyde mit BSTFA zu cis-trans isomeren Alkenyl-Trimethylsilyl-Ethern und Alkenyl-Acetamid-Addukten reagierten. Weiterhin bildeten sich aus Aldehyden und primären Alkoholen unter den gegebenen Bedingungen, cis-trans isomere Alkenyl-Alkyl-Ether. Es konnte gezeigt werden, dass eine verlässliche und quantitative Bestimmung der ursprünglich vorhandenen Aldehyd- und Alkoholmengen nur unter einer Quantifizierung der in den resultierenden Nebenprodukten gebundenen Mengen möglich war. Im zweiten Teil dieser Arbeit zeigten rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen an den Gleitzonenoberflächen von drei Nepenthes-Arten, dass die epikutikulären Wachskristalle ein Netzwerk aus glattrandigen Plättchen bilden und senkrecht aus den Oberflächen herausstehen. Es wurden Methoden etabliert, die eine mechanische Präparation der Wachs-kristalle von den Gleitzonenoberflächen erlaubten. Dabei zeigten die Kristalle eine hohe strukturelle Integrität. Die Beprobungsstrategien erwiesen sich als selektiv für die epikutiku-lären Wachse und somit für die Schnittstelle der Pflanze-Insekten-Wechselwirkung. Die anschließenden chemischen Analysen zeigten deutliche Gradienten zwischen den Zusammen-setzungen der epikutikulären und intrakutikulären Wachskompartimente. Die epikutikulären Kristalle bestanden aus Mischungen aliphatischer Komponenten und waren von sehr lang-kettigen Aldehyden dominiert. Triacontanal war in allen Fällen die Hauptkomponente und weitgehend für die Kristallbildung verantwortlich. Diese Ergebnisse quantifizierten erstmalig direkt die Zusammensetzung epikutikulärer Wachskristalle und bestätigten die für deren Bildung ursprüngliche Hypothese einer spontanen Phasentrennung eines hochkonzentrierten Bestandteils. Die schlechte Löslichkeit der Kristalle von verschiedenen Nepenthes-Arten in Chloroform wies zudem darauf hin, dass sie polymere Formen der Aldehyde beinhalteten. Diese Vermutung konnte im dritten Teil dieser Arbeit durch ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden. Die Kombination dieser Analysetechnik mit einer der mechanischen Beprobungsstrategien zeigte, dass weder isolierte Kristalle, noch Kristalle auf nativen Oberflächen, monomere Aldehyde beinhalteten. Diese konnten jedoch durch Tempe-raturerhöhung oder Lösen in Chloroform unter erhöhter Temperatur freigesetzt werden. Auf Grund charakteristischer Absorptionseigenschaften, der molekularen Anordnung sowie dem Phasenverhalten der beteiligten Komponenten konnte geschlossen werden, dass die Aldehyde in nativen Kristallen in Form von Polyacetalen vorliegen. Dies lässt vermuten, dass die epikutikulären Wachskristalle dadurch nicht nur thermisch und chemisch, sondern auch mechanisch verstärkt werden. Werden alle Daten zusammengefasst, können die strukturellen sowie physikalisch-chemischen Eigenschaften der epikutikulären Wachskristalle auf den Gleitzonenoberflächen verschiedener Nepenthes-Arten im Kontext ihrer ökologischen Funktion neu beurteilt werden. Auf diesen Ergebnissen basierend kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Kristalle im Kräftebereich, den ein Haftorgan eines Insektes auf sie ausübt, mechanisch stabil sind und somit andere Mechanismen die Rutschigkeit verursachen. N2 - Plants in the genus Nepenthes obtain a substantial nutrient supply by trapping and digesting animal prey, especially insects. The trapping organs are highly modified leaf blades forming pitcher-like pitfalls. A broad zone of the inner surface of these traps is densely covered with epicuticular wax crystals. It was long known that these surfaces are extremely slippery for most insects and play a pivotal role in trapping and retaining of pray in the pitcher. Earlier investigations described the crystals as extremely fragile, breaking easily under the mechanical load of an insect and hence preventing contact to the plant surface. To test this hypothesis and to understand the mechanism of slipperiness, this work aimed to comparatively characterize the structural as well as the physico-chemical properties of the wax crystals in the pitchers of N. alata, N. albomarginata and N. intermedia. However, these properties can only be judged if the chemical composition of the crystals can be determined reliably. Cuticular waxes commonly represent complex mixtures of cyclic and aliphatic substances with different functional groups. To facilitate the gas chromato-graphic separation and mass spectrometric identification of the components, hydroxyl-containing compounds are often transformed into the corresponding trimethylsilyl ethers or esters by derivatization with N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA). During this reaction however, also undesired side products of carbonyl-containing compounds may occur, impeding a quantitative analysis of the original compounds. In the first part of this work the examination of the derivatization reaction showed that aliphatic aldehydes reacted with BSTFA to cis-trans isomeric alkenyltrimethylsilyl ethers and alkenylacetamide adducts. Furthermore, aldehydes formed cis-trans isomeric alkenylalkyl ethers with primary alcohols under the given conditions. It was shown that reliable and quantitative determinations of the original aldehyde and alcohol contents were only possible by quantification also of their amounts present in side products. In the second part of this work scanning electron microscopic studies on the inner surfaces of the pitchers revealed the crystals to form a network of entire platelets protruding perpen-dicularly from the surfaces. Methods for the mechanical preparation of the wax crystals were established in which the crystals showed a high structural integrity. The sampling strategies proved to be highly selective for the epicuticular wax material and hence, for the interface of the plant-insect interaction. The following chemical analyses revealed distinct gradients between the compositions of the epicuticular and intracuticular compartments. The epi-cuticular crystals consisted of a mixture of aliphatic components that was dominated by very long-chain aldehydes. In all cases, triacontanal was the major constituent and largely responsible for crystal formation. These results for the first time directly quantified the composition of epicuticular wax crystals and confirmed the original hypothesis that described crystal formation as a spontaneous phase separation of one highly concentrated constituent. The low solubility of the crystals from different Nepenthes species indicated moreover, that they contained polymeric forms of the aldehydes. This assumption could be verified by ATR-FTIR spectroscopic studies. The combination of this analytical technique with one of the mechanical sampling strategies showed that neither isolated crystals nor those crystals on native surfaces contained monomeric aldehydes. These however could be released by heating or dissolving the crystals in chloroform at elevated temperatures. From the characteristic absorption properties, the molecular arrangement as well as the phase behaviour of the involved components it was concluded that the aldehydes in native crystals existed as polyacetals. From this the epicuticular wax crystals are assumed not only to be reinforced thermally and chemically but also mechanically. Combining all data, the structural and physico-chemical properties of the epicuticular wax crystals on the slippery surfaces of different Nepenthes species can be newly judged with regard to their ecological function. Based on these results, it is hypothesized that the crystals are mechanically stable in the force range applied by an insect attachment device and therefore other mechanisms cause the slipperiness. KW - Kannenpflanze KW - Kutikularwachs KW - Aldehyde KW - Nepenthes KW - epikutikuläre Wachskristalle KW - Aldehyde KW - Nepenthes KW - epicuticular wax crystals KW - aldehydes Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9467 ER - TY - THES A1 - Planchet, Elisabeth T1 - Nitric oxide production by tobacco plants and cell cultures under normal conditions and under stress N2 - Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges freies Radikal. In tierischen Geweben ist NO an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. In den letzten zehn Jahren wurde immer wahrscheinlicher, dass NO auch in Pflanzen als „second messenger“ fungiert. Besonderes Interesse fanden Berichte, dass NO als intermediäres Signal bei der Induktion der hypersensitiven Antwort (HR) von Pflanzen auf Pathogene involviert ist. Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzen wahrscheinlich eine Reihe verschiedener Systeme, die NO produzieren können. Potentielle Kandidaten dafür sind: cytosolische Nitratreduktase (NR; EC 1.6.6.1), PM-gebundene Nitrit: NO Reduktase (Ni:NOR), NO-Synthase (NOS; EC 1.14.13.39) und Xanthindehydrogenase (XDH; EC 1.1.1.204). Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die NO-Produktion von Pflanzen zu quantifizieren und die beteiligten enzymatischen Schritte zu identifizieren. Als wichtigste Methode zur NO-Messung wurde die Chemilumineszenz verwendet, mit der die NO Emission aus Pflanzen, Zellsuspensionen oder Enzymlösungen in NO-freie Luft oder N2 in Echtzeit verfolgt werden konnte. Wir benutzten für unsere Analyse: Tabak Wildtyp (N. tabacum cv Xanthi oder cv Gatersleben) und Zellsuspensionskulturen davon, NR-freie Mutanten oder WT Pflanzen, die auf Ammonium angezogen wurden um NR-Induktion zu vermeiden, Pflanzen die auf Wolframat an Stelle von Molybdat wuchsen um die Synthese funktionierender MoCo-Enzyme zu unterdrücken, und eine NO-überproduzierende, Nitritreduktase (NiR)-defiziente Transformante. Normale Blätter von nitraternährten Pflanzen zeigten eine typisches NO-Emissionsmuster,bei dem die NO-Emission im Dunkeln niedrig, im Licht viel höher, und unter anoxischen Bedingungen im Dunkeln mit weitem Abstand am höchsten war. Aber selbst nach Erreichen maximaler Raten war die NO-Emission höchstens 1 % der extrahierbaren NR Aktivität. Auch eine Lösung hochgereinigter Nitratreduktase produzierte NO aus den Substraten Nitrit und NADH, und auch hier war die Rate der NO-Emission nur maximal 1% der vorhandenen NR-Aktivität. Dieses übereinstimmende Verhältnis von NR Aktivität und NO-Emission in Blättern, Zellsuspensionen und einer NR-Lösung zeigt an dass die NO-Löschung nur gering war und dass deshalb die NO-Emissionsmessung eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung der NO Produktion sein sollte. Die NO-Emission aus einer NiR-defizienten, nitritakkumulierenden Transformante warimmer sehr hoch. NR-freie Pflanzen oder Zellsuspensionen produzierten dagegen normalerweise kein NO, woraus geschlossen werden konnte, dass hier NR die einzige NOQuelle war. Die Rate war in der Regel korreliert mit der Nitritkonzentration, aber cytosolisches NADH erschien als ein weiterer wichtiger limitierender Faktor.Überraschenderweise reduzierten aber auch NR-freie Pflanzen oder Zellkulturen unter anoxischen Bedingungen Nitrit zu NO. Das beteiligte Enzymsystem war kein MoCo-Enzym und war Cyanid-sensitiv. Der pilzliche Elicitor Cryptogein induzierte nach Infiltration in Blätter oder nach Zugabe zu Zellsuspensionen bereits in nanomolaren Konzentrationen den Zelltod. Diese Antwort wurde verhindert oder zumindest stark verzögert durch den NO-Scavenger PTIO oder c-PTIO. Die Schlussfolgerung war zunächst, das NO tatsächlich an der HR-Induktion involviert war. Da aber das Reaktionsprodukt von c-PTIO und NO, c-PTI, den HR ebenfalls verhinderte ohne jedoch NO zu löschen, scheint die weit verbreitete Verwendung von c-PTIO und seinen Derivaten für die Beweisführung einer Beteiligung von NO zumindest fragwürdig. Der HR wurde unterschiedslos sowohl in WT-Pflanzen als auch in NR-freien Pflanzen bzw. Zellsuspensionen induziert. NR ist also offensichtlich für den HR nicht erforderlich. Im Gegensatz zur publizierten Literaturdaten verhinderte auch eine kontinuierliche hohe Überproduktion von NO die Ausprägung des HR nicht. Besonders überraschend war der Befund, dass trotz der Hemmung des HR durch PTIO keinerlei Cryptogein-induzierte NO Produktion in Blättern messbar war. Allerdings wurde in nitraternährten Zellsuspensionskulturen ca. 3-6 h nach Cryptogein-Gabe eine -wenn auch geringe-NOEmission beobachtet, die von einer Nitritakkumulation begleitet war. Beides blieb in Ammonium-ernährten Kulturen aus. Hier schien also eine gewisse Relation zwischen Cryptogein-induzierter NO Emission, NR und Nitrit zu bestehen, die im Detail noch nicht verstanden ist. Da der Zelltod aber auch in NR-freien Zellsuspensionskulturen auftrat, besteht offensichtlich kein kausaler Zusammenhang zwischen dieser NO-Emission, Nitritakkumulation und der Cryptogein-Wirkung. Da NOS-Inhibitoren weder den Zelltod noch die nitritanhängige NO-Emission verhinderten, scheint eine NOS-artige Aktivität ebenfalls keine Rolle zu spielen. Insgesamt werden damit die in der Literatur etablierte Rolle von NO als Signal beim HR und die Rolle von NOS als NO-Quelle stark in Frage gestellt. N2 - Nitric oxide (NO) is a gaseous free radical involved in the regulation of diverse biochemical and physiological processes in animals. During the last decade, evidence has accumulated that NO might also play an important role as a second messenger in plants. Of special interest were observations that NO was involved in a signal chain leading to the hypersensitive response (HR) in incompatible plant-pathogen interactions. In contrast to animals, plants have probably several enzymes that may produce NO. Potential candidates are: Cytosolic nitrate reductase (NR; EC 1.6.6.1), plasma-membrane (PM)-nitrite: NO reductase (Ni:NOR), nitric oxide synthase (NOS; EC 1.14.13.39) and Xanthine dehydrogenase (XDH; EC 1.1.1.204). The major goal of this work was to quantify NO production by plants, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by tobacco leaves or cell suspensions was followed under normal, non-stress conditions, and under biotic stress, through on-line measurement of NO emission into the gas phase (chemiluminescence). Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCoenzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant. Induction of HR in tobacco leaves and in cell suspensions was achieved using the fungal peptide elicitor cryptogein. Non-elicited leaves from nitrate-grown plants showed a typical NO-emission pattern where NO-emission was low in dark, higher in the light and very high under dark-anaerobic conditions. Even at maximum rates, NO production in vivo was only a few percent of total NR activity (NRA). Consistent with that, with a solution of purified NR as a simple, “low quenching” system, NO-emission was also about 1 % of NRA. Thus, NO scavenging by leaves and stirred cell suspensions appeared small and NO-emission into purified air should give a reliable estimate of NO production. NO-emission was always high in a NiR-deficient transformant which accumulated nitrite, and NO-emission was completely absent in plants or cell suspensions which did not contain NR. Thus, in healthy plants or cell suspensions, NO-emission was exclusively due to the reduction of nitrite to NO, mainly by cytosolic NR. In addition to nitrite, cytosolic NADH appears as an important factor limiting NO production. Unexpectedly, plants (in absence of NR) were able to reduce nitrite to NO under anaerobic conditions through an unknown enzyme system that was not a MoCo-enzyme and was cyanide-sensitive. When infiltrated into leaves at nanomolar concentrations, the fungal elicitor cryptogein provoked cell death in tobacco leaves and cell suspensions. The HR could be prevented by the NO-scavengers PTIO or c-PTIO, suggesting that NO production was indeed required for the HR. However, the product of the reaction of c-PTIO with NO, c-PTI, also prevented cell death without quenching NO emission. Thus, prevention of cell death by c- PTIO is no proof for an involvement of NO. No differences were found in the HR induction between NR-free plants and/or cell suspensions and WT plants. Thus, NR appears not necessary for the HR. Further, and in contrast to literature suggestions, a continuously high NO-overproduction by a NiR-free mutant did not interfere with the development of the HR. Most surprisingly, no additional NO-emission from tobacco leaves was induced by cryptogein at any phase of the HR. In contrast, some NO-emission, paralleled by nitrite accumulation, was detected 3-6 h after cryptogein addition with nitrate grown cell suspensions, but not with NR free, ammonium- grown cells. Thus, induction of NO-emission by cryptogein appeared somehow correlated with NR and nitrite, at least in cell suspensions. But since cryptogein induced the HR even in NR-free cell suspensions, this nitrite-related NO- emission was not required for cell death. NOS inhibitors neither prevented cell death nor did they affect nitrite-dependent NO-emission. Thus, in total these data question the often proposed role of NO as a signal in the HR, and of NOS as source for NO. KW - Tabak KW - Stickstoffmonoxid KW - Nitratreduktase KW - Stickstoffmonoxid KW - Nitratreduktase KW - Nicotiana tabacum KW - Cryptogein KW - Chemilumineszenz KW - Nitric oxide KW - Nitrate reductase KW - Nicotiana tabacum KW - Cryptogein KW - Chemiluminescence Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9339 ER - TY - THES A1 - Krischke, Markus T1 - Oxidativer Stress in Pflanzen : Untersuchungen zum D1-Phytoprostan-Signalweg T1 - Oxidative stress in plants: Investigating the D1-phytoprostane signalling pathway N2 - Phytoprostane (PP) können nichtenzymatisch in vitro und in vivo durch freie Radikal-katalysierte Peroxidation von alpha-Linolensäure entstehen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass über den D1-Phytoprostan-Weg zwei weitere Klassen von Phytoprostanen gebildet werden können, die D1-Phytoprostane (PPD1) und die Deoxy-J1-Phytoprostane (dPPJ1). PPD1 und dPPJ1 wurden erstmals durch Partialsynthese hergestellt. Zudem konnten diese Verbindungen durch Autoxidation von alpha-Linolensäure gewonnen werden. PPD1 und dPPJ1 wurden chromatographisch aufgetrennt und UV-spektroskopisch und massenspektrometrisch charakterisiert. Zum Nachweis von PPD1 und dPPJ1 in planta wurde eine neuartige Analysenmethode mittels Fluoreszenz-HPLC entwickelt. Mit dieser Methode konnten PPD1 und dPPJ1 in drei unterschiedlichen Pflanzenspezies nachgewiesen werden. Zudem wurde eine verstärkte Biosynthese von dPPJ1 in planta durch oxidativen Stress beobachtet, z.B. durch eine Belastung mit Schwermetallen oder einen kurzfristigen Kälteschock. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dPPJ1 sowohl in Pflanzen als auch in Tieren biologisch aktiv sind. N2 - Phytoprostanes (PP) are formed in vitro and in vivo by free radical-catalyzed peroxidation of linolenic acid. In this work it has been shown that two additional classes of phytoprostanes are formed via the D1-phytoprostane pathway, D1-phytoprostanes (PPD1) and deoxy-J1-phytoprostanes (dPPJ1). For the first time PPD1 and dPPJ1 were prepared by partial synthesis. Additionally, these compounds were also obtained by autoxidation of linolenic acid in vitro. PPD1 and dPPJ1 were separated by chromatographical methods and characterized by UV spectroscopy and mass spectrometry. A novel method for the quantitation of PPD1 and dPPJ1 in planta has been developed, using fluorescence HPLC. This method allowed the identification of PPD1 and dPPJ1 in three different plant species. Furthermore, enhanced formation of dPPJ1 in planta was observed after oxidative stress, e.g. treatment with heavy metals or short exposure to low temperatures. Furthermore, it has been shown that dPPJ1 display biological activity in plants as well as in animals. KW - Phytoprostane KW - Prostaglandin-ähnliche Verbindungen in Pflanzen KW - Lipidperoxidation KW - Jasmonate KW - ROS KW - phytoprostanes KW - prostaglandin-like compounds in plants KW - lipid peroxidation KW - jasmonates KW - ROS Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8599 ER - TY - THES A1 - Stuhlfelder, Christiane T1 - Reinigung, Klonierung und heterologe Expression der Methyljasmonat-Esterase aus Lycopersicon esculentum T1 - Purification, cloning and heterologous expression of methyl jasmonate esterase from Lycopersicon esculentum N2 - Aus Lycopersicon esculentum Zellsuspensionskulturen konnte ein bisher unbekanntes Enzym isoliert und beschrieben werden, das die Hydrolyse von Methyljasmonat (MeJA) zu Jasmonsäure (JA) katalysiert. Das Enzym wurde als Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase) bezeichnet. Mittels Methyl-[2-14C]JA und [Methyl-3H]MeJA wurden qualitative und quantitative Enzymtestsysteme etabliert, welche die Reinigung und Charakterisierung des Enzyms erlaubten. Methyljasmonat-Esterase Aktivität konnte in 18 taxonomisch unterschiedlichen Zellsuspensionskulturen höherer Pflanzen sowie in differenziertem Gewebe (Blüte, Wurzel, Stengel und Blatt) von Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker nachgewiesen werden. In einem 6-stufigen Reinigungsverfahren wurde das native Enzym mit einer Ausbeute von 2.2 % bis zur Homogenität 767-fach angereichert. Die native MeJA-Esterase kommt nativ als monomeres 26 kDa großes Protein vor. Unter denaturierenden Bedingungen konnte ein Molekulargewicht von 28 kDa bestimmt werden. Eine Analyse mittels ESI-TOF-Massenspektrometrie ergab ein Molekulargewicht von 28547 Da. Die native MeJA-Esterase hatte ein basisches pH-Optimum von 9.0. Optimale katalytische Aktivität zeigte die MeJA-Esterase bei einer Reaktionstemperatur von 40 C. Der isoelektrische Punkt lag bei pH 4.7. Eine vollständige und irreversible Hemmung der MeJA-Esterase konnte durch 5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), einem Serinprotease-Inhibitor erzielt werden. Dieses Ergebnis lieferte einen Hinweis darauf, dass die MeJA-Esterase eine katalytische Triade mit einem reaktiven Serin-Rest besitzt. N-Methylmaleimid, Iodacetamid, Bestatin, Pepstatin und Leupeptin konnten die MeJA-Esterase nicht inhibieren. Nach der Reinigung der MeJA-Esterase wurde das Protein partiell mit der Endoproteinase LysC verdaut. Mittels Sequenzierung der Spaltpeptide und N-terminaler Sequenzierung der MeJA-Esterase konnte von vier Peptiden die Sequenz bestimmt werden. Ein Datenbankvergleich (SwissProt und EMBL) dieser Peptide mit bekannten Sequenzen zeigte eine hohe Homologie (bis zu 80 %) zu verschiedenen Esterasen und α-Hydroxynitrillyasen. Die Peptide konnten somit eindeutig als Bestandteile einer Esterase identifiziert werden. Zur Identifizierung des MeJA-Esterase Gens wurden aus den Peptidsequenzen degenerierte Primer abgeleitet und zur weiteren Klonierung verwendet. Über eine Reverse Transkription mit anschließender PCR wurde ein internes cDNA-Fragment (513 bp) amplifiziert. Mittels RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) konnten das 5´-und 3´-Ende der MeJA-Esterase cDNA ermittelt werden. Die Nucleotidsequenz umfasste einen offenen Leserahmen von 786 bp. Die davon abgeleitete Aminosäuresequenz codierte ein offenes Leseraster für ein Protein von 262 Aminosäuren. Datenbankvergleiche der vollständigen Aminosäuresequenz zeigten Homologien von 33 – 47 % zu Esterasen und α-Hydroxynitrillyasen. Die Aminosäuren der katalytischen Triade, die in den homologen Proteinen hochkonserviert waren, konnten bei der MeJA-Esterase als Serin-83, Asparaginsäure-211 und Histidin-240 ermittelt werden. Diese drei Aminosäuren bilden vermutlich das katalytische Zentrum der MeJA-Esterase. Darüber hinaus konnte eine hochkonservierte Signatur, die allen Lipasen gemeinsam ist in der Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase identifziert werden. Diese Ergebnisse erlauben eine Einordnung der MeJA-Esterase in die Superfamilie der „alpha/beta-Fold“-Hydrolasen. Untersuchungen der Primärstruktur der MeJA-Esterase legten den Schluss nahe, dass es sich um ein cytosolisches Enzym handelt. Eine Southern-Blot Analyse mit genomischer DNA aus L. esculentum wurde zur Abschätzung der Kopienzahl der zum Protein der MeJA-Esterase korresporendierenden Gene durchgeführt. Dabei wurden zwei bis sieben DNA-Abschnitte ermittelt, die mit der Volllänge-Sonde der MeJA-Esterase hybridisierten. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die MeJA-Esterase zu einer Genfamilie gehört. Unklar bleibt jedoch, ob es sich um mehrere homologe Gene handelt, oder ob eine Hybridisierung der Volllänge-Sonde mit Pseudogenen erfolgte. Die heterologe Expression der MeJA-Esterase cDNA wurde erfolgreich durchgeführt. Hierdurch wurde der Beweis erbracht werden, dass die klonierte cDNA tatsächlich für das Gen der MeJA-Esterase codierte. Nach Klonierung der cDNA in den pQE70-Expressionsvektor und Transformation in kompetente E. coli (M15) konnte im Proteinrohextrakt eine spezifische Enzymaktivität von 1.64 pkat/mg detektiert werden. In einem 4-stufigen Reinigungsverfahren wurde das heterolog exprimierte Enzym mit einer Ausbeute von 0.8 % bis zur Homogenität 283-fach angereichert. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten, dass native und heterolog exprimierte MeJA-Esterase Methyljasmonat zu Jasmonsäure hydrolysierten. In beiden Fällen handelte es sich jedoch um kein hochspezifisches Enzym. Für die native MeJA-Esterase konnte ein KM-Wert von 14.7 ± 0.8 µM und für die heterolog exprimierte MeJA-Esterase ein KM-Wert von 24.3 ± 2.3 µM ermittelt werden. N2 - From cell suspension cultures of Lycopersicon esculentum a so far unknown enzyme was purified, catalyzing the cleavage of methyl jasmonate to jasmonic acid. The isolated enzyme was termed as methyl jasmonate esterase (MeJA esterase). Qualitative and quantitative enzyme assays using methyl-[2-14C]jasmonic acid and [methyl-3H]methyl jasmonate as substrates were established for purification and characterization of the enzyme. Screening of 18 suspension plant cell cultures of taxonomically distant species revealed that MeJA-Esterase activity occurs in all plant species so far analyzed. MeJA esterase activity was also found in flowers, roots, stems and leaves of L. esculentum (cv. Moneymaker). MeJA esterase was purified in a six-step purification scheme. The enzyme was purified 767-fold to give a homogenous protein with a yield of 2.2 %. The native enzyme exhibited a Mr of 26 kDa (gel-filtration chromatography) which was similar to the Mr determined by SDS-PAGE (Mr of 28 kDa) and ESI-TOF MS analysis (Mr of 28547 kDa). MeJA esterase revealed a pH optimum of pH 9.0 and a temperature optimum of 40 C. Chromatofocussing of MeJA esterase gave an isoelectric point (pI) of 4.7. Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), a serine protease inhibitor, led to irreversible and complete inhibition of MeJA esterase at a concentration of 5 mM. This result suggests that the enzyme has a catalytic triade with an active serine residue. N-Methylmaleimide, iodacetamide, bestatin, leupeptin and pepstatin did not inactivate the enzyme. Proteolysis of the purified and pure enzyme with endoproteinase LysC and subsequently sequencing revealed three peptide fragments. N-Terminal sequencing yielded an additional peptide fragment. Sequence alignment of these fragments showed high homologies (up to 80 %) to certain esterases and hydroxynitrile lyases. MeJA esterase peptides could be identified as components of an esterase. For the identification of the MeJA esterase gene degenerated primers were designed on the basis of the partial amino acid sequences obtained from the purified MeJA esterase. Degenerated primers were used for cloning. Reverse transcription followed by PCR amplified an internal cDNA fragment (513 bp). Full-length cDNA of MeJA esterase was amplified using RACE (Rapid amplification of cDNA ends). Sequencing and annealing of the 5´- and the 3´-sequence revealed an open reading frame of 789 bp encoding a 262 amino acid protein. Sequence analysis and alignment with known proteins from Genbank showed high overall-homology of 33 – 47 % to esterases and hydroxynitrile lyases. Since all the aligned proteins belong to the extremely divergent family of alpha/beta-hydrolase fold proteins it could be assumed that MeJA esterase is a member of this protein family. MeJA esterase shows the highly conserved amino acid residues forming the catalytic triad – nucleophile, acid and a histidine – represented by serine-83, aspartic acid-211 and histidine-240. Additionally a higly conserved lipase motive could be identified in the MeJA esterase amino acid sequence. Analysis of the primary structure of the enzyme makes a cytosolic location probably. Southern blot analysis of genomic cDNA from cell suspension cultures of L. esculentum was carried out to estimate gene copies of MeJA esterase. MeJA esterase coding sequence hybridized with two to seven cDNA fragments. It might be possible that MeJA esterase belongs to a gene family. It remains still unclear if there are several homologous genes or pseudogenes hybridized with the MeJA esterase sequence. To get unequivocal evidence of the identity of cloned sequence, MeJA esterase cDNA was successfully subcloned into a bacterial vector (pQE70) for heterologous expression. Crude extracts of E. coli M15 cells harbouring the pQE-MeJA esterase plasmid showed MeJA esterase activity (1.64 pkat/mg) while wild type M15 cells did not show any MeJA esterase activity. A four step purification protocol was employed to purify the enzyme to homogeneity (283-fold) with a yield of 0.8 %. Analysis of substrate specifity showed that native and heterologously expressed MeJA esterase cleaved methyl jasmonate to jasmonic acid. However MeJA esterase is not a highly specific enzyme. Enzyme kinetics of native MeJA esterase revealed a KM value of 14.7 ± 0.8 µM while heterologous expressed MeJA esterase revealed a KM value of 24.3 ± 2.3 µM. Northern blot analysis was used to determine MeJA esterase expression in different plant organs. MeJA esterase transcripts were present in all tomato plant tissues. High levels of MeJA esterase mRNA could be found in roots and flowers while low to moderate amounts where present in leafs and stems of tomato plants. KW - Tomate KW - Methylglasmonat KW - Esterasen KW - Methyljasmonat Esterase KW - Solanaceae KW - Lycopersicon esculentum KW - Proteinreinigung KW - Heterologe Expression KW - Methyl jasmonate esterase KW - Lycopersicon esculentum KW - Solanaceae KW - protein purification KW - heterologous expression Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8433 ER - TY - THES A1 - Richter, Claudia T1 - Phytopharmaka und Pharmazeutika in Heinrich von Pfalzpaints "Wündärznei" (1460) T1 - Phytopharmaka and Pharmaceutics in Heinrich von Pfalzpaints Wündärznei (1460) N2 - Bis heute wurden acht Handschriften der Wundarznei des Heinrich von Pfalzpaint entdeckt. Nach einer Revision der „Breslauer Handschrift“ wurde am Medizinhistorischen Institut der Universität Würzburg bereits mit einer textkritischen Gesamtedition aller bisher bekannten Pfalzpaint-Texte begonnen. Was nun die Konzeption und die Makrostruktur der vorliegenden Studie angeht, hat sich die Grobgliederung in einen allgemeinen Teil, einen Kommentar zur ‚Wündärznei‘ und einen pflanzenmonographischen Abschnitt bewährt. Somit kann sowohl über den Pfalzpaintschen Text ein schneller Zugriff auf den alphabetisch geordneten Pflanzenteil erfolgen. Aber auch der umgekehrte Weg ist möglich, da in den einzelnen Monographien stets sämtliche Synonymnamen sowie die Indikationsbereiche mit genauer Kapitelnummer angegeben wurden. Durch Erstellen eines Kommentars konnten zunächst zahlreiche wundärztliche Begriffe geklärt und der Textinhalt in eine heute verständliche Sprache gebracht werden. Dabei muß festgehalten werden, daß die am Ende der ‚Wündärznei‘ positionierten Pestrezepte mit großer Wahrscheinlichkeit nicht von Pfalzpaint stammen, sondern zu einem späteren Zeitpunkt angehängt wurden. Textaufbau, Schreibstil, verwendete Fachtermini und das Fehlen in Pfalzpaints Register sprechen für diese Annahme. In der vorliegenden Studie wurden alle arzneilich verwendeten Pflanzen registriert, auch wenn es nicht möglich war, jede mit absoluter Sicherheit zu identifizieren. Hier hat sich das bereits in der Einleitung erwähnte Differenzierungsschema bewährt. Es ermöglicht, daß man schon bei Betrachtung der Pflanzenkapitel anhand der Identifikationsklassen I-V sofort erkennen kann, ob es sich um eine eindeutig identifizierte Pflanze handelt. Bei unsicherer Zuordnung erfolgt in der Monographie jeweils eine argumentative Abwägung der konkurrierenden Identifikationsmöglichkeiten. Nun möchte ich, um hinsichtlich der Identifizierung der Statistik zu genügen, noch einige Prozentangaben bereitstellen: Bei der Auswertung der fünf erwähnten Identifikationsklassen konnte festgestellt werden, daß fast zwei Drittel der verwendeten Pflanzen (65%) bereits über den Namen zu identifizieren waren. Durch Pfalzpaints Nennung von Synonymen, botanischen Beschreibungen und Indikationen wurde es weiterhin möglich, weitere 18% sicher zuzuordnen. In 25 Fällen (15%) konkurrierten mehrere Lösungsansätze, und es mußte eine eindeutige Identifizierung unterbleiben. Von den 171 bearbeiteten Pflanzen sind heute noch 20% (34 Drogen) offizinell im Europäischen Arzneibuch, Nachtrag 2001, verzeichnet; hier seien beispielhaft die Enzianwurzel, der Tormentillwurzelstock, die Gewürznelken und die Salbeiblätter genannt. Beim Vergleich mit dem „Leitfaden Phytotherapie“ von Schilcher/Kammerer fällt auf, daß etwa 40% des Pfalzpaint-Repertoires heute noch verwendet werden und daß weitere 17% zwar erwähnt, aber mit einer Negativmonographie belegt sind. Bei etwa 15% der Arzneipflanzen handelt es sich um importierte Drogen (z.B. Mastix, Zitwer, Ingwer), die stets eindeutig identifiziert werden konnten. In diesem Zusammenhang vermute ich - gestützt auf das ‚Circa instans‘ -, daß durch den Import und die damit verbundenen Handelsgeschäfte die Identifizierung bereits beim Kauf erfolgte (auch wenn es sich möglicherweise um Fälschungen wie z.B. beim Safran handeln konnte). Was machte die Bearbeitung der ‚Wündarznei‘ des Heinrich von Pfalzpaint so interessant und einmalig? Zum einen enthält der Text einen überraschenden Reichtum an wundchirurgischen Arbeitsweisen - angefangen mit der Versorgung einer einfachen Schnittwunde bis hin zu progressiven operativen Verfahren: ich erinnere an die Nasenersatzplastik, an die Hasenschartenoperation oder an das Vorgehen bei Darmoperationen. Bei der Nasenersatzplastik handelt es sich um eine Erstbeschreibung eines hochkomplexen Verfahrens, was erkennen läßt, daß Pfalzpaint ein Meister im Umgang mit der Sprache ist und erstmals solch schwierige Techniken zu erklären vermag. Auch auf dem Gebiet der Arzneistoffkenntnis und der galenischen Herstellungstechnik von Salben, Pflastern und anderen Arzneiformen kennt sich Pfalzpaint sehr gut aus. Auch durch die politische Situation bedingt, nämlich durch die Belagerung der Marienburg, erhält man Einblick in die medizinische und arzneiliche Versorgung von Kranken in Notzeiten. Alle diese Aspekt machen die ‚Wündärznei‘ Heinrich von Pfalzpaints zu einem wichtigen Dokument des medizinischen Systems des Spätmittelalters. N2 - Today we know of eight manuscripts of ‚Heinrich von Pfalzpaint‘. Let’s now turn to the concept and macrostructure of the study at hand. The following method proved to be most rewarding: a division into a general part, a comment on ‚Wündärznei‘ and a section on botanical monographs. Hence, the Pfalzpaint text provides quick access to the alphabetically arranged section on plants. Nevertheless, the reverse method is also possible because the single monographs specify all synonyms and the indication fields with the exact chapter numbers. In creating a commentary one could identify numerous terms in the area of medicinal wound treatment and translate their respective meanings into an easily comprehensible present-day language. While doing so, it has to be kept in mind, however, that in all probability the prescriptions on plague treatment situated at the end of the ‚Wündärznei‘ do not go back to Pfalzpaint. They were added at a later time. Text structure, writing style, used terminology and the lack of a Pfalzpaint index support this presumption. The study at hand registers all medicinally used plants although it was not possible to classify all of them with absolute certainty. The system of differentiation mentioned in the introduction, proved to be very useful in that regard. Consequently, using the categories of identification no. I-V for a closer inspection of the chapters on plants, one is able to find out immediately if the respective plant is clearly identifiable or not. In case of uncertain classification, the monograph uses an argumentative approach to deal with the various competing possibilities of identification. I would like to meet the requirements of statistical identification methods and provide some proportional data. The examination of the five given possibilities of identification revealed that almost two thirds of the used plants (65 %) could be identified by their names. In addition, Pfalzpaint‘s naming of synonyms, botanical descriptions and indications made it possible to clearly categorize an additional 18 % of the plants. In 25 cases (15 %), however, several suggested solutions compete with each other which makes an absolute classification impossible. 20 % (34 drugs) of the 171 plants dealt with in this study are still listed in the European drugs register (supplement 2001); for example „Gentianae radix“, „Tormentillae rhizoma“, „Caryophylli flos“ and „Salviae folium“. A comparison with the „Phytotherapy Guide“ reveals, that about 40 % of the Pfalzpaint repertoire is still used today. In addition, about 17 % are mentioned there; however, they are listed with a negative monograph. About 15 % of the medicinal plants are imported drugs and therefore clearly identifiable (e.g. „Mastix resina“, „Zedoaria rhizoma“, „Zingiberis rhizoma“). Using the „Circa Instans“ as basis for my argument, I suppose that in cases of import and respective trade business the identification of medicinal plants happened at the time of purchase (although fake identification was likely to take place here as well, as in the case of saffron). Now, why is it that work on the ‚Heinrich von Pfalzpaint’s‘ ‚Wündärznei‘ appears to be that interesting and unique? On the one hand, this document lists an astonishing variety of methods in the area of wound surgery: from the treatment of ordinary cuts to progressive surgery methods. Let’s just recall the nose spare part surgery, the hare lip surgery, or the intestinal surgery in that regard. The nose spare part surgery, for example, is considered to be the first description of a very complex scientific method. It shows Pfalzpaint’s excellency in handling the language and his ability to explain such highly difficult techniques. Pfalzpaint is also very well-informed in the area of drug knowledge and familiar with the Galenic method of producing ointments, plasters and other types of medicine. Besides, the political situation of the time, namely the siege of the fortress Marienburg, provides further insight into the medical and medicinal treatment of ill people in times of need. All these fore-mentioned aspects illustrate why the ‚Heinrich von Pfalzpaint’s‘ ‚Wündärznei‘ is such an important document of the medical system in the Late Medieval Age. KW - Heilpflanzen KW - Arzneibuch KW - Mittelalter KW - Wundarznei KW - Chirurgiegeschichte KW - Arzneipflanzen KW - Mittelalter KW - Medicinal Plant KW - Surgeon KW - History of the medicine KW - Middle Age Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7303 ER - TY - THES A1 - Stölzle, Sonja T1 - Licht- und Redoxregulation von Calcium-permeablen Kanälen in Arabidopsis thaliana Mesophyllzellen T1 - Light- and redoxregulation of calcium-permeable channels in Arabidopsis thaliana mesophyll cells N2 - 1. Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana sind mit Hyperpolarisations-ab-hängigen, Calcium-permeablen Kanälen ausgestattet. In Ca2+-haltigen Lösungen folgte die Nullstromspannung der Nernst-Spannung mit 27 mV bei einer zehnfachen Erhöhung der Ca2+-Konzentration. Die Sequenz an relativen Stromamplituden ergab Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). Der makroskopische Strom wurde auf der Basis einer 7,2 ± 1 pS-Leitfähigkeit bei einer Pipettenlösung mit 10 mM Ba2+ in der cell-attached Konfiguration gebildet. Die Kanäle waren sensitiv gegenüber Lanthan und Gadolinium, wobei die Stromamplitude bei 100 µM Lanthan um 97,2 ±7 % und bei 100 µM Gadolinium um 95,2 ± 7 % reduziert wurde. 2. Blaulicht induzierte den Hyperpolarisations-abhängigen, Calcium-permeablen Kanal in dunkeladaptierten, intakten Mesophyll-Protoplasten. Die Aktivierung war zeitabhängig und der Stromanstiegs erreichte eine Sättigung nach 11-16 Minuten. Weiterhin wurde bestimmt, dass eine Kanalaktivität erst bei einer Intensität an Blaulicht > 50 µmol/m2s1 induziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass der photosynthetische Elektronentransport-Entkoppler DCMU die Aktivierung nicht verhinderte, konnte eine Beteiligung des Photosyntheseapparates ausgeschlossen werden. Eine Inhibierung der Aktivierung nach Inkubation mit dem Kinase-Inhibitor K252a war ein erster Hinweis für die Beteiligung von Phototropinen als relevante Blaulicht-Rezeptoren, da Phototropine eine Kinase-Funktion besitzen. Diese Hypothese bestätigte sich nach Überprüfung der Phototropin-knockout-Mutanten phot1-5 und phot1-5 phot2-1. Da die Aktivierung in phot1-5 reduziert war, und in phot1-5 phot2-1 keine Aktivierung der Kanäle durch Blaulicht mehr möglich war, konnte auf eine überlappende Funktion beider Photorezeptoren bezüglich der Aktivierung von Calcium-permeablen Kanälen geschlossen werden. Dagegen konnte eine Beteiligung weiterer Blaulicht-Rezeptoren, der Cryptochrome, ausgeschlossen werden. 3. Neben Blaulicht aktivierten auch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) Hyper-polarisation-abhängige, Calcium-permeable Kanäle. Protoplasten mit intaktem Cytoplasma (cell-attached Konfiguration) zeigten nach Applikation von 5 mM H2O2 eine zeitabhängige Aktivierung der Lanthan-sensitiven Kanäle. Eine Sättigung des Stromanstiegs wurde nach ca. 25 Minuten erreicht. Neben dem Wildtyp (Col-0) wurde die Mutante dnd1 hinsichtlich Calcium-permeabler Kanäle überprüft. Sie besitzt einen nicht-funktionellen putativen cyclisch-Nukleotid-aktivierten Kanal, CNGC2, und zeigt Phänotypen bei der Pathogenabwehr. Eine histochemische DAB-Färbung ergab, dass dnd1 eine dem Wildtyp vergleichbare ROS-Produktion nach Inokulation mit avirulenten Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB besitzt. Da eine ROS- bzw. H2O2-Produktion, ein wichtiger initiierender Schritt bei Abwehrmechanismen, in der Mutante nicht beeinträchtigt war, wurde überprüft, ob ROS-aktivierte, Calcium-permeable Kanäle in dnd1 beobachtet werden konnten. Nach Applikation von 5 mM H2O2 zu intakten Protoplasten wurde keine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung Calcium-permeabler Kanäle festgestellt. Daraufhin konnte spekuliert werden, dass CNGC2 im Wildtyp den Calcium-permeablen Kanal repräsentiert. Eine Blaulicht-Aktivierung der Calcium-permeablen Kanäle in der Kanal-Mutante war jedoch möglich, was die Frage aufkommen ließ, ob es sich um verschiedene Kanäle mit denselben elektrophysiologischen Charakteristika handelt, oder ob es sich bei dem H2O2-aktivierten und dem Blaulicht-aktivierten Kanal um denselben Kanal handelt, der durch verschiedene Signalketten angeschaltet wird. Cyclische Nukleotide (cAMP) konnten die Kanäle in Wildtyp-Protoplasten nicht aktivieren, was dagegen sprach, dass es sich um CNGC2 handelte. Eine Inhibierung der H2O2-aktivierten Ströme durch den Calmodulin-Inhibitor W7 wies auf eine Beteiligung eines Calmodulin-abhängigen Schritts in der Signalkette hin. Untersuchungen des Calcium-permeablen Kanals in der outside-out Konfiguration mit einer dem Cytoplasma ähnlichen internen Lösung ergab, dass eine Kanalaktivität durch eine erhöhte Calcium-Konzentration (21 µM) bei Vorhandensein von Calmodulin induziert werden konnte. Cyclische Nukleotide aktivierten wie erwartet keine Hyperpolarisation-abhängigen, Calcium-permeablen Kanäle. Dies deutete darauf hin, dass CNGC2 die Calcium-permeablen Kanäle über einen Ca2+/Calmodulin-abhängigen Schritt in einer H2O2-induzierten Signalkette regulieren könnte. Lokalisationsstudien mit einem GFP-CNGC2-Fusionskonstrukt (CNGC2::mGFP4 /pPILY) zeigten, dass der Kanal in vivo im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein könnte. Dies bestätigte die Hypothese, dass CNGC2 nicht den Calcium-permeablen Kanal in der Plasmamembran repräsentiert und dass der Verlust der Kanalaktivität in dnd1 in einer beeinträchtigten Signalkette zu suchen ist. N2 - 1. Hyperpolarisation-dependent, calcium-permeable channels have been found in Arabidopsis thaliana mesophyll cells. In Ca2+-containing solutions, the reversal potential shifted 27 mV with a tenfold increase of the Ca2+-concentration. The relative sequence of permeability was Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). The macroscopic current in the cell-attached configuration was based on a 7,2 ± 1 pS-conductance with 10 mM Ba2+ in the pipette solution. The channels were sensitive to lanthanum and gadolinium. Current amplitudes decreased 97,2 ±7 % after application of 100 µM La3+ and 95,2 ± 7 % after application of 100 µM Gd3+. 2. Blue-light (450-490 nm) induced hyperpolarisation-dependent, calcium-permeable channels in dark-adapted mesophyll-protoplasts with intact cytoplasm. The current increase was time-dependent and saturated after 11-16 minutes. Examining the dose dependence of channel activation revealed that > 50 µmol/m2s1 blue-light induces channel activity. Phototsynthesis was shown to be not involved in the signaling cascade since the photosynthetic electron-transport inhibitor DCMU did not inhibit channel activation. The inhibition of channel activation with the kinase inhibitor K252a pointet to the involvement of phototropins. This hypothesis proved to be true when the phototropin knockout mutants phot1-5 and phot1-5 phot2-1 were examined. In phot1-5, the activation was clearly reduced and in phot1-5 phot2-1 no blue-light activation was observed anymore. Furthermore, this pointed to an overlapping function of both photoreceptors. The involvement of cryptochromes, further blue-light receptors, could be excepted. 3. Beside blue-light, also reactive oxygen species (ROS) were shown to activate calcium-permeable channels in intact mesophyll protoplasts. After application of 5 mM H2O2, lanthanum-sensitive channels showed a time-dependent current increase with a saturation after approx. 25 minutes. Beside wildtype-plants (Col-0), also the mutant dnd1 has been tested. dnd1 is characterized by a truncated protein of a putative cyclic-nucleotide-gated channel, CNGC2. The plants are dwarfed in stature, have an elevated level of salicylic acid and exhibit a resistance against a variety of virulent bacterial, fungal and viral phatogens without developing a hypersensitive response. After inoculation of leaves with Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB, dnd1 showed a production of ROS like the wildtype. In contrast, an activation of calcium-permeable channels by ROS was not observed. A blue-light-dependent activation of calcium-permeable channels was still possible. This raised the question if blue-light and H2O2 activate the same channel via different signaling cascades or if there are two calcium-permeable channels. Cyclic nucleotides alone did not activate the channels, pointing to the possibility that CNGC2 does not represent the calcium-permeable channel. Furthermore, when the intact cytoplasm was lost (outside-out configuration), H2O2-induced channel activity was also observed in dnd1, possibly due to the loss of a composition of regulating compounds in the cytoplasm. Therefore it was concluded that CNGC2 does not represent the observed calcium-permeable channel and that CNGC2 is placed upstream of the activation of these channels. An inhibition of the H2O2-induced channel activation by the calmodulin (CaM) inhibitor W7 pointet to the involvement of a CaM-dependent step in the signaling cascade. When the cytoplasm was replaced with a pipette solution containing an elevated level of Ca2+ (21 µM) and CaM, channel activity was induced. Ca2+, cyclic nucleotides or CaM alone did not have this effect. This pointed to the possibility, that CNGC2 might activate calcium-permeable channels via a Ca2+/CaM-dependent signaling pathway. Subcellular localisation studies with a GFP-fusionconstruct (CNGC2::mGFP4 /pPILY) revealed that CNGC2 might be located in the endoplasmatic reticulum. This reeinforced the hypothesis that CNGC2 does not represent the calcium-permeable channel in the plasma membrane and that the loss of channel activity in dnd1 is due to an impaired signaling cascade. Also the expression of GFP-labeled CNGC2 in a heterolguous system (HEK293 cells) showed that neither the full-length nor a mutant containing a partly deletion of the N-terminal end (CNGC2::EGFP/pcDNA3.1 or CNGC2-D112::EGFP/pcDNA3.1) is transported to the plasma membrane. Therefore no electrophysiological characterization of CNGC2 in this cell line was possible. KW - Ackerschmalwand KW - Mesophyll KW - Calciumkanal KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Blaulicht KW - Patch-Clamp-Methode KW - Kanäle KW - Calcium KW - Patch-Clamp KW - Blaulicht KW - ROS KW - channels KW - calcium KW - patch-clamp KW - bluelight KW - ROS Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6975 ER - TY - THES A1 - Langer, Katharina T1 - K+-Homöostase und kaliumabhängige Xylogenese in Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx T1 - K+ homeostasis and potassium dependent xylogenesis in Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx. N2 - Mit molekularbiologischen und biophysikalischen Analysen sowie immunologischen Nachweisen wurden Grundlagen des kaliumabhängigen Holzwachstums erforscht. Aus Holz-Kambium-Bast-Gewebe wurden mit PTK2 (Populus tremula K+ channel 2), KPT1 (K+ channel Populus tremula 1) und PtKUP1 (Populus tremula K+ uptake transporter 1) drei Volllängen putativer Kaliumtransporter isoliert. PTK2 ließ sich anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT2/3-Unterfamilie und KPT1 dem KAT1-Subtyp der Shaker-Familie zuordnen, während sich PtKUP1 in die Familie der KT/KUP/HAK-Transporter einreihte. Ein direkter Zusammenhang zwischen Kaliumtransport und holzbildenden Zellen konnte durch Verringerung der Gefäßweiten und signifikante Schrumpfung der Streckungszone nach lokal begrenzter Applikation des Kaliumkanalblockers TEA+ sowie durch Kaliumlimitierende Bedingungen hergestellt werden. Die Transkripte von PTK2 und PTORK (Populus tremula outward rectifying K+ channel) wurden in den Leitgeweben des Stammes, dort besonders im Phloem und in Schließzellen lokalisiert. KPT1 wurde fast ausschließlich in den Schließzellen nachgewiesen. Die mRNA von PtKUP1 war ubiquitär in geringen Mengen vorhanden. Funktionell wurde PTK2 als schwach spannungsabhängiger, K+-selektiver, nicht-gleichrichtender Kaliumkanal charakterisiert. Wie AKT2/3-ähnliche Kaliumkanäle, wurde PTK2 durch Protonen und spannungsabhängig durch Calcium geblockt. KPT1 und PtKUP1 komplementierten einen Bakterienstamm in seiner Kalium-Aufnahmedefizienz und repräsentieren demnach Kalium-Aufnahmesysteme. In Protoplasten einer Pappel-Suspensionskultur konnte ein auswärtsgleichrichtender, kalium- und spannungsabhängiger, K+-Kanal nachgewiesen werden. Dieser Auswärtsgleichrichter zeigte langsame, sigmoidale Aktivierungskinetiken, ähnlich den Kaliumströmen PTORK-exprimierender Oocyten. Des Weiteren wurde in der Suspensionskultur ein einwärtsgleichrichtender, spannungsabhängiger K+-selektiver Kanal detektiert, der, wie PTK2 in Xenopus-Oocyten, spannungsabhängig durch Calcium geblockt wurde. Nach Zugabe extrazellulären Cäsiums kam der Einwärtsstrom vollständig zum Erliegen. Für alle drei Kaliumkanäle der Pappel sowie den Kalium-Carrier wurden die Promotorregionen isoliert. Sie enthielten Motive für licht- und temperaturabhängige Transkription, gewebespezifische Expression im Leitgewebe, in Schließzellen und in Wurzeln, sowie hormonabhängige Transkription. Die Genaktivitäten von PTORK und PTK2 wurden nach Transformation von A. thaliana mit geeigneten Promotor-GUS-Konstrukten im Phloem und Xylemparenchym von Blattstielen nachgewiesen. Erstmals für Pflanzen wurden mit PTORK und PTK2 Kaliumkanal-Proteine immunologisch durch Antikörper in Phloem- und Strahlzellen während des aktiven Holzwachstums lokalisiert. Während PTK2 gleichmäßig in den Strahlzellen verteilt war, wurde im gleichen Zelltyp für PTORK eine polare Anordnung zu den angrenzenden Gefäßen hin beobachtet. Um die verschiedenen Kaliumtransporter mit der kambialen Aktivität und dem Holzwachstum zu verknüpfen, wurden die Expressionsprofile mit jahreszeitlichen Änderungen der Kaliumgehalte im Stamm verglichen. Die Transkriptanalyse von PTORK, PTK2, KPT1 und PtKUP1 über den Zeitraum eines Jahres in Stamm- und Blattknospen zeigte eine transkriptionelle Korrelation von PTORK und PTK2 mit der saisonal begrenzten Holzbildung. Ihre hohen Transkriptmengen im Herbst lassen, zusammen mit ihrer Lokalisation im Leitgewebe und ihren funktionellen Eigenschaften, auf eine Beteiligung der beiden Kaliumkanäle an Speicherungsvorgängen in die lebenden Mark- und Baststrahlen im Herbst schließen. Im Frühjahr dagegen, wenn sich die Kaliumströme umkehren, um „sink“-Gewebe mit Kalium zu versorgen, wird das Kalium vermutlich hauptsächlich über PTK2, der dann maximal exprimiert wird, aus den Strahlen und Gefäßen zu den Meristemen in Stamm und Knospen transportiert. Die hauptsächlich in Schließzellen lokalisiert KPT1 wurde zur Knospenöffnung transient induziert. Damit könnte gesichert werden, dass ausreichend osmotisch aktives Kalium für Zellexpansion und Stomaöffnung in die Schließzellen gelangt. PtKUP1 war in allen Geweben während des gesamten Jahres niedrig exprimiert und sichert daher vermutlich eine Kaliumversorgung auch unter limitierenden Bedingungen. Zur Vermehrung und Schaffung neuen Pflanzenmaterials wurde eine sterile Agarkultur aus P. tremula x P. tremuloides sowie eine Pappel-Suspensionskultur aus oberirdischem, sich teilendem Sprossgewebe etabliert. Die Expressionsanalyse der Zellkultur deutete auf eine Ausstattung an Kaliumkanälen wie in Wurzelhaaren hin, mit hohen Transkriptzahlen für PTORK, geringer Expression von PTK2 und geringsten PtKUP1-Transkripten. N2 - The current work focussed on the elucidation of the molecular basis for K+-dependent wood formation. Using molecular techniques in combination with biophysical and immu-nological approaches the results can be summarised as follows: The cDNA’s of three putative potassium transporter, PTK2 (Populus tremula K+ channel 2), KPT1 (K+ channel Populus tremula 1) and PtKUP1 (Populus tremula K+ uptake trans-porter 1), were isolated from wood-cambium-phloem tissue. Based on the deduced amino acid sequences, PTK2 was assigned to the AKT2/3-subfamily and KPT1 to the KAT1-suptype of Shaker channels, while PtKUP1 was grouped into the family of the KT/KUP/HAK-transporters. The contribution of potassium channels for wood formation was shown by local application of the K+ channel blocker TEA+ as well as under limiting K+ conditions. Both treatments resulted in a decrease of vessel lumen area, a significant reduction of the zone of expanding xylem cells and a premature initiation of secondary cell wall synthesis. The transcripts of PTK2 and PTORK (Populus tremula outward rectifying K+ channel), were mainly localised in the phloem of the vascular tissue and in guard cells while KPT1 was restricted to guard cells. In contrast, the mRNA of PtKUP1 was ubiqui-tously present at low levels. PTK2 was functionally characterised as a weakly voltage-dependent, K+-selective channel mediating potassium currents into and out of the cell. Reminiscent to AKT2/3-like channels, PTK2 was sensitive to extra cellular protons and blocked by calcium in a voltage-dependent manner. KPT1 and PtKUP1 were able to com-plement a potassium uptake deficient strain of E. coli. Therefore KPT1 und PtKUP1 repre-sent potassium uptake transport proteins. Protoplasts from poplar suspension cultures dis-played an outward rectifying, potassium- and voltage-dependent, K+-selective channel. This outward rectifier exhibiting slow sigmoidal activation kinetics, reminiscent of PTORK when heterologously expressed in Xenopus oocytes. In addition, an inward rectify-ing, voltage-dependent, K+-selective channel was detected in suspension cultured cells, showing a voltage-dependent calcium block like PTK2 expressed in Xenopus oocytes. The currents carried by this channel were completely abolished after application of extra cellu-lar caesium. The promotor regions of all three poplar potassium channels and the potas-sium transporter were isolated. Sequence analysis revealed signal motifs for temperature- and light-dependent regulation as well as tissue-specific expression in vascular tissue, guard cells and roots and motifs for hormonal dependent transcription. Transformation of A. thaliana with promotor-GUS-constructs showed that PTORK and PTK2 gene activities were predominantly observed in the phloem and xylem parenchyma of petioles. For the first time in plants the K+ channel proteins PTORK and PTK2 were immunologically local-ised with antibodies in phloem and rays during the active wood forming period. In contrast to PTK2 which was equally distributed within ray cells PTORK was polar arranged to neighbouring vessels. In order to link the different potassium transporters to cambial activ-ity and wood formation expression profiles were compared to seasonal changes of potas-sium content of the stems. The annual expression analysis of PTORK, PTK2, KPT1 und PtKUP1 in stems and buds revealed a correlation of PTORK und PTK2 with seasonally limited wood formation. Their induction in autumn, as well as their localisation in vascular tissues and their functional properties, indicated an involvement of both potassium chan-nels in loading the still living pit and phloem rays in autumn. In contrast in spring, when K+ fluxes reverse from the rays and vessels to the meristematic tissues to ensure cambial activ-ity, this ion is probably transported via PTK2, which is maximal expressed at this time. KPT1, which is mainly localised in guard cells, was induced transiently when buds open and therefore probably ensures that sufficient, osmotic active potassium comes into guard cells for expansion and stomatal opening. Finally, PtKUP1 may represent a gene that is important for potassium nutrition under limiting conditions since transcript levels were low in all tissues throughout the year. A sterile agar culture of P. tremula x P. tremuloides was generated for propagation and a sterile poplar suspension culture was established from over ground dividing stem tissue. The K+-channel expression profile of the cell culture was similar to that described for root hairs showing high transcript levels of PTORK, little ex-pression of PTK2 and minimal amounts of PtKUP1 transcripts. KW - Pappel KW - Kalium KW - Holz KW - Wuchsleistung KW - Molekularbiologie KW - Populus KW - Kaliumtransporter KW - Holzbildung KW - Blattknospen KW - Populus KW - potassium carrier KW - wood formation KW - buds Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7068 ER - TY - THES A1 - Thoma, Ingeborg T1 - Cyclopentenon-Phytoprostane als Induktoren von pflanzlichen Abwehrreaktionen T1 - Cyclopentenone phytoprostanes as inducers of plant defense reactions N2 - Lipidperoxidation kann entweder durch Lipoxygenasen oder reaktive Sauerstoffspezies ausgelöst werden. Enzymatische Oxidation von alpha-Linolensäure kann zur Biosynthese von zyklischen Oxylipinen vom Typ der Jasmonate führen, wohingegen durch freie Radikal-katalysierte Oxidation von alpha-Linolensäure mehrerere Klassen zyklischer Oxylipine, den Phytoprostanen entstehen können. Eine dieser Phytoprostanklassen, Phytoprostane E1 (PPE1), kommen ubiquitär in Pflanzen vor. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PPE1 in planta in neuartige Cyclopentenon-Phytoprostane, die PPA1 und PPB1 umgewandelt werden. Eine gesteigerte Bildung von PPE1, PPA1 und PPB1 wurde sowohl nach Peroxid-Behandlung von Tabak-Zellkulturen als auch nach Behandlung von Tomatenpflanzen mit dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea beobachtet. Darüberhinaus besitzen PPA1 und PPB1 biologische Wirkung. Sie stimulierten beispielsweise die Bildung von Phytoalexinen in mehreren Zellkulturen. Diese Daten implizieren, dass die Bildung von Phytoprostanen eine Folge von oxidativem Stress in Pflanzen ist und dass Phytoprostane pflanzliche Abwehrmechanismen induzieren können. N2 - Lipid peroxidation may be initiated by lipoxygenases or by reactive oxygen species. Enzymatic axidation of alpha-linolenic acid can result in the biosynthesis of cyclic oxylipins of the jasmoate type while free-radical-catalyzed oxidation of alpha-linolenate may yield several classes of cyclic oxylipins termed phytoprostanes in vivo. One of these classes, the E1-phytoprostanes (PPE1) occur ubiquitously in plants. In this work it is shown that PPE1 are converted to novel cyclopentenone A1- and B1-phytoprostanes in planta. Enhanced formation of PPE1, PPA1 and PPB1 is observed after peroxide stress in tobacco cell cultures as well as after infection of tomato plants with a necrotrophic fungus botrytis cinerea. Furthermore PPA and PPB1 display powerfull biological activity, i.e. they stimulate biosynthesis of phytoalexins in several cell cultures. Data collected so far infer that enhanced phytoprostane formation is a general consequence of oxidative stress in plants. Futhermore phytoprostanes are potent inducers of plant defens mechanisms. KW - Pflanzen KW - Oxidativer Stress KW - Abwehrreaktion KW - Phytoprostane KW - Abwehr KW - Fettsäuren KW - Jasmonsäure KW - ROS KW - phytoprostanes KW - plant defense KW - fatty acid KW - jasmonic acid KW - ROS Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6857 ER - TY - THES A1 - Kolb, Christiane T1 - Untersuchungen zur Erfassung und Bewertung der UV-Abschirmung bei Kulturvarietäten verschiedener Nutzpflanzenarten T1 - Investigations on recording and evaluation of UV-screening in varieties of different crops N2 - In dieser Arbeit wurden unter naturnahen Bedingungen die Effekte von UV-Strahlung auf die Akkumulation löslicher phenolischer Komponenten und die epidermale UV-Transmission in vivo bei Kulturvarietäten di- und monokotyler Arten untersucht. Durch die Versuchsanordnungen konnten die Effekte der spektralen Bereiche der UV-A- und UV-B-Strahlung von denen des sichtbaren Bereichs getrennt betrachtet werden. Visuelle Schadensevaluierungen und die Erfassung der variablen Chlorophyllfluoreszenz dienten der Beurteilung einer durch Strahlungseinflüsse bedingten Schädigung der untersuchten Organe. In kurzfristigen Experimenten erfolgte bei unter Schwachlichtbedingungen angezogenen Pflanzen eine rasche Verringerung der epidermalen UV-Transmission, die durch UV-Strahlung induziert oder verstärkt wurde. Dies stimmte für alle untersuchten Arten (Vitis vinifera, Hordeum vulgare, Avena sativa und Triticum aestivum) überein. Hingegen war in keinem Fall eine durch UV verstärkte Inhibierung der Photosynthese, bestimmt über die variable Chlorophyllfluoreszenz (FV/FM), zu erkennen. Zwischen der epidermalen Transmission für UV-A- und UV-B-Strahlung wurde bei allen drei monokotylen Arten ein strikt linearer Zusammenhang festgestellt. Dieser Zusammenhang bestand jedoch nicht für die untersuchten Organe in V. vinifera. Bei Vitis vinifera und Hordeum vulgare wurde über HPLC- Analytik eine positive Wirkung besonders der UV-B-Strahlung auf die Akkumulation der Flavonoide sowohl kurz- als auch langfristig nachgewiesen. Bei V. vinifera wurden die für Blätter bereits festgestellten Zusammenhänge (Kolb et al., 2001) an Beeren untersucht. Es wurden einerseits allgemeine Reaktionsmuster auf kurz- und langfristige UV- Exposition erfasst, und andererseits zwei Kulturvarietäten (cv. Bacchus und Silvaner) verglichen, deren Anfälligkeit für ein strahlungsbedingtes Schadsymptom unterschiedlich war. In allen Experimenten konnten ohne UV-Strahlung keine nennenswerten Mengen an Flavonoiden gebildet werden. Die löslichen Hydroxyzimtsäurederivate (HZS) hingegen waren bei den Beeren von der Art der Exposition weitgehend unabhängig. Die Identität der phenolischen Komponenten wurde über HPLC, UV-Spektroskopie, sowie Massenspektrometrie abgeklärt. Ihre Lokalisation in mehreren Zelllagen der Beerenhaut wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie gezeigt. Der Einfluss des physiologischen Stadiums der Beeren auf die Akkumulation einzelner phenolischer Komponenten wurde durch Verwendung verschiedener Reifeindikatoren belegt. Im Vergleich zu den Blättern wurden Unterschiede bezüglich der Akkumulation der HZS festgestellt, während für die Akkumulation der Flavonoide weitgehend Übereinstimmung herrschte. Anders als bei den Blättern konnte bei den Beeren die fluorometrisch bestimmte epidermale Transmission nur zum Teil auf die Absorption der phenolischen Extrakte zurückgeführt werden. Die qualitativen Substanzmuster stimmten zwischen den Beeren der beiden Sorten überein, es konnten aber signifikante Unterschiede bezüglich der Quantität einzelner Komponenten festgestellt werden. Zwei bisher unter "Sonnenbrand" zusammengefasste Schadbilder konnten voneinander getrennt dargestellt werden. Eines der beiden wurde eindeutig durch UV- Strahlung induziert, wobei UV-B die Intensität verstärkte. Das Ziel, einen praxisrelevanten Bezug zwischen dem Schadbild der nicht-parasitär bedingten Blattverbräunung (NBV) bei Gerste und der Akklimatisation an verschiedene Strahlungsbedingungen herzustellen, bedingte eine Festlegung auf ausdifferenzierte Blätter adulter Pflanzen anstelle von Primärblättern. Die Auswahl der Kulturvarietäten bei H. vulgare erfolgte im Hinblick auf unterschiedliche Anfälligkeit für NBV. Zwischen den Sorten konnte jedoch bezüglich der Anpassungsfähigkeit der epidermalen UV-Transmission an die unterschiedlichen Strahlungsbedingungen kein eindeutiger Unterschied ermittelt werden. Die epidermale UV-Transmission in vivo wurde bei H. vulgare ebenfalls mit der Absorption von Extrakten löslicher phenolischer Komponenten in Beziehung gesetzt und mit der für die Blätter von V. vinifera gefundenen Relation verglichen. Übereinstimmend konnten ca. 80% der Transmissionseigenschaften über die Absorption der Extrakte erklärt werden. Dennoch bestanden deutliche Unterschiede in der Art der Relationen. Über HPLC-Analytik und UV-Spektroskopie wurden bei H. vulgare die löslichen phenolischen Komponenten in Derivate einzelner Flavonoide unterteilt. Die löslichen HZS hatten im Gegensatz zu V. vinifera nur einen geringen Anteil an der Gesamtmenge der phenolischen Substanzen. Das Substanzmuster der beiden Varietäten stimmte überein; teilweise auftretende Konzentrationsunterschiede bezüglich der Flavonoide insgesamt bzw. einzelner Komponenten waren zwischen den verschiedenen Experimenten nicht konsistent. Ein Zusammenhang zwischen der UV-Exposition und dem Auftreten oder der Intensität des Schadbildes NBV konnte nicht festgestellt werden. N2 - In this study, the effects of UV radiation on accumulation of soluble phenolic compounds and on epidermal UV transmittance in vivo were investigated under close to nature conditions. Varieties of different crop species, of both dicots and monocots, were examined. The experimental design allowed to distinguish between effects of UV-B, UV-A and visible radiation. Inhibition of photosynthesis, measured by FV/FM, and observable damage caused by exposure to the different light regimes were determined. In plants grown under shaded conditions in the greenhouse, short time outdoor exposure resulted in fast reduction of epidermal UV transmittance. This effect was spe-cifically enhanced by UV radiation and was observed in all species investigated (V. vinifera, H. vulgare, A. sativa and T. aestivum). In contrast, inhibition of photosynthesis did not occur in all species. A good correlation was found between epidermal transmittance for UV-B and UV-A radiation in all of the monocot species investigated. This correlation, however, was not observed in V. vinifera. Flavonoid contents were determined in V. vinifera and H. vulgare by HPLC. Flavonoid synthesis was particularly enhanced by exposure to UV-B radiation. For V. vinifera, the study concentrated on long and short term effects of UV exposure on grapes and the data were related to recently reported UV effects on grape leaves (Kolb et al., 2001). Two white grapevine varieties (cv. Bacchus and cv. Silvaner) were compared. The two varieties differ in their sensitivity for "sunburn" a syndrome which typically occurs during periods of high light intensities. Phenolic compounds were examined by HPLC analysis, UV spectroscopy, and mass spectrometry. Phenolics of berries of the two varieties were similar and agreed with the phenolic substances determined in leaves. In all experiments, the amounts of flavonoids synthesised in absence of UV radiation were negligible. Under outdoor conditions, however, significant differences between the two berry types in the amount of phenolic compounds were determined. It was also shown that these variations are modulated by the prevailing developmental stage of grapes. Similar to leaves, UV-B radiation stimulated flavonoid synthesis in grapes. Different from leaves, synthesis of soluble hydroxycinnamic acids was not stimulated by high visible radiation. Furthermore, in leaves fluorescence microscopy demonstrated that phenolics are especially concentrated in the epidermal layer, whereas in grapes, phenolics appear to occur at elevated concentrations in several layers of the skin. The relationship between fluorometrically determined UV absorbance of grape skins and UV absorbance of extracted phenolics was statistically significant, but not all of the variations in absorbance by skin could be explained by phenolics. In leaves, damage during outdoor exposure was clearly enhanced by UV radiation. In grapes, sunburn, which was originally considered as a homogeneous syndrome after exposure to strong radiation, could be divided in two classes of stress reactions. One of these can be seen as strictly UV related, while the other is only enhanced by UV radiation, and occurred also under visible light conditions. Further studies investigated relations between the PLS (physiological leaf spot) syndrome occurring in fully developed leaves of barley and UV radiation. The crop varie-ties investigated showed a different sensitivity for PLS. However, acclimation to the different light conditions, determined as UV transmittance, revealed no clear difference between the cultivars. The relationship between fluorometrically determined UV absorbance of barley leaves and UV absorbance of extracted phenolics were examined. Similar as observed with V. vinifera leaves, about 80% of the variations of epidermal UV transmittance were explained by soluble phenolics. In H. vulgare, soluble phenolic compounds as identified by UV/VIS spectroscopy could be divided in two different groups of flavonoids while, in contrast to V. vinifera, soluble hydroxycinnamic acids are minor compounds in H. vulgare. HPLC profiles were similar for the two varieties of H. vulgare, and concentrations of flavonoids were almost comparable in both varieties in all experiments. These data together with UV exclusion experiments showed that PLS is not caused by UV-radiation. KW - Getreide KW - Weinrebe KW - Ultraviolett KW - Abschirmung KW - Flavonoide KW - Ultraviolett KW - Vitis KW - Gerste KW - Fluorimetrie KW - flavonoids KW - ultraviolet KW - Vitis KW - barley KW - fluorometry Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5365 ER - TY - THES A1 - Tsai, Chyn-Bey T1 - Molecular cloning and characterization of nitrate reductase from Ricinus communis L. heterologously expressed in Pichia pastoris N2 - Zusammenfassung Hintergrund: In einer vorhergehenden Studie wurde gezeigt, dass die Nitratreduktase (NR, EC 1.6.6.1) aus Blättern von Ricinus communis L. im Vergleich zu NRs der meisten anderen höheren Pflanzen durch verschiedene Faktoren unterschiedlich reguliert wird. Die Aktivität ist ungewöhnlich Mg2+-sensitiv, zeigt ein verändertes pH-Profil und ist nur gering ATP-abhängig inaktivierbar. Das Ziel dieser Arbeit war, die abweichenden Eigenschaften von Ricinus NR, aus molekularer und physiologischer Sicht detaillierter aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde das NR Gen von R. communis geklont, heterolog exprimiert und charakterisiert. Ergebnisse: Die abgeleitete Proteinsequenz zeigte, dass Ricinus NR hohe Ähnlichkeit mit anderem NRs teilte, abgesehen von der N-terminalen Region. In der N-terminalen Region besitzt die Ricinus NR eine säurehaltige Sequenz, die nur in den höheren Pflanzen konserviert ist. In der Moco-bindenden Region waren einige in 17 Pflanzen NRs konservierte Aminosäurepositionen verändert. Zu diesen Positionen gehörten His103, Gln123, Val266 und Ala284, die Asparagin, Arginin, Aspartat und Prolin in den anderen Pflanzen ersetzten. Auch an der Dimerisierungs- und Hinge 1-Region, zeigte die Ricinus NR eine veränderte Aminosäuresequenz. Anstatt Isoleucin und Glycin, besaß die Ricinus NR an den Stellen 460 und 498 Asparagin und Alanin. Durch ein Arg an der Stelle 482 kommt es zu einer zusätzliche Trypsinschnittstelle innerhalb des 481KRHK484-Motivs (die meisten NR besitzen hier KPHK). Zusätzlich enthält die Ricinus NR eine Serinphosphorylierungsstelle (Ser-526) innerhalb des möglichen 14-3-3 Bindemotivs 523KSVS*TP528, was eine allgemeine Eigenschaft von Nitratreduktasen ist. Im C-Terminus von Ricinus NR bestätigte die Sequenz 886CGPPP890, dass die Ricinus NR ein NADH-spezifisches Enzym ist. Die Ricinus NR und Arabidopsis NR2 (AtNR2) wurden in Pichia pastoris funktionell exprimiert und die Eigenschaften miteinander verglichen. Die rekombinante Ricinus NR (RcNR) selbst wurde nicht durch die Inkubation mit MgATP inhibiert, ebenso AtNR2. Da der Hefeextrakt vermutlich die Faktoren zur Regulierung der NR nicht enthält, wurden entsalzte Blattextrakte von Arabidopsis (ADL), Spinat (SDL) und Ricinus (RDL) zugesetzt, die Kinasen und 14-3-3 Proteine enthielten. Damit keine endogenen NRs sich im Extrakt befinden wurden die Blätter vor Extraktion 4 Tage im Dunkeln gehalten. In Bezug auf die Inhibierung der NR durch ATP wurde festgestellt, dass die RcNR gegenüber einer solchen Inhibierung unempfindlich ist, AtNR2 dagegen in jedem Fall durch ATP inaktiviert wird. Bei Kombination von RcNR mit NR-freien Extrakten aus Pflanzen zeigte sich die erhöhte Mg2+-Sensitivität nur, wenn man RcNR mit RDL inkubierte, nicht aber wenn man RcNR mit SDL oder ADL inkubierte. Es liegt auf der Hand, dass ein oder einige Faktoren in RDL vorkommen, die mit RcNR interagieren und seine hohe Mg2+-Sensitivität hervorrufen. Außerdem, ergab eine Inkubation von AtNR2 mit unterschiedlichen NR-freien Blattextrakten eine bedeutende Aktivierung der Enzymaktivitäten, sowohl in Anwesenheit von Mg2+ als auch EDTA. Dies wurde jedoch nicht für die RcNR festgestellt. Nach Verwendung von Ammoniumsulfat zur Fraktionierung des RDL, fand man zusätzlich heraus, dass ungefähr 0,2 mg des Proteins der Fraktion die mit 0-35% Ammoniumsulfat gefällt wurde ausreichten die maximale Hemmung des RcNR hervorzurufen. Schlussfolgerungen: Die Unempfindlichkeit gegenüber ATP erscheint eine angeborene Eigenschaft von Ricinus NR, während die hohe Mg2+-Sensitivität von einem oder einigen Faktoren in den Blättern von Ricinus abhängt. Diese(r) bis jetzt unbekannte Faktor(en) war Hitze-sensitiv und konnte durch Ammoniumsulfat ausgefällt werden. Er scheint spezifisch auf die rekombinante Ricinus-NR einzuwirken, und liefert eine Mg2+-Sensitivität vergleichbar dem authentischen Blattenzym. Außerdem gibt es vermutlich auch positiv regulierende Faktor(en) für die Nitratreduktase aus Blättern höherer Pflanzen. N2 - Summary Background: In a previous study, nitrate reductase (NR, EC 1.6.6.1) from leaves of Ricinus communis L. showed different regulatory properties from most other higher plants NR's by an unusually strong Mg2+-sensitivity, a different pH-activity profile and only little ATP-dependent inactivation. The aim of this work was to elucidate the deviating properties of Ricinus NR in more details, from both molecular and physiological aspects. For that purpose, the NR gene from R. communis was cloned, expressed heterologously and characterized. Results: The deduced protein sequence showed that Ricinus NR shared high similarity with other NRs, apart from the N-terminal region. In the N-terminal region, the Ricinus NR possesses an acidic stretch which is conserved only in higher plants. Within the Moco-binding domain the Ricinus NR contained few amino acid residues which were unique in comparison with 17 plant NRs, including His103, Gln123, Val266 and Ala284 where other NRs possess asparagine, arginine, aspartate and praline. In the Dimer interface and Hinge 1 regions, the Ricinus NR also had some unique residues like Asn460 and Ala498 where other NRs have isoleucine and glycine instead. The Ricinus NR possesses an Arg482 which provides an additional predicted Trypsin cleavage site within 481KRHK484 (while most of plant-NRs possess KPHK). Additionally, the Ricinus NR contains a serine phosphorylation site (Ser-526) within the potential 14-3-3 binding motif 523KSVS*TP528, which is a common characteristic of nitrate reductases. In the C-Terminus of Ricinus NR a sequence 886CGPPP890 confirmed that Ricinus NR is a NADH-specific enzyme. Functional Ricinus NR protein was expressed in Pichia pastoris and compared with the features of Arabidopsis NR2 synthesized by the same expression system (AtNR2). The recombinant Ricinus NR (RcNR) itself was unresponsive to the incubation with MgATP, and so was AtNR2. As yeast extracts might lack factors required for NR regulation, desalted leaf extracts containing NR kinases and 14-3-3s were prepared from 4-day darkened (and therefore NR-free) leaves of Arabidopsis (ADL), spinach (SDL) and Ricinus (RDL), and added to the assay of RcNR and AtNR2 to check for ATP-dependent inactivation and Mg2+-sensitivity. When RcNR was combined with the NR-free extracts described above, it's unusually high Mg2+-sensitivity was restored only by incubation with RDL, but it remained unresponsive to ATP. In contrast, AtNR2 became inactive when incubated with the protein mixtures and ATP. It is obvious that one or some factors existing in RDL could interact with RcNR and therefore provide its high Mg2+-sensitivity. Interestingly, incubation of AtNR2 with different NR-free leaf extracts gave a significant activation of the enzyme activities, both in Mg2+ and EDTA, which were not observed in the case of RcNR. Moreover, using ammonium sulfate to fractionation the RDL revealed that about 0.2 mg of the protein factor(s) from 0-35% of ammonium sulfate precipitation was sufficient to provide the maximum inhibition of the RcNR. Conclusions: The insensitivity to ATP appears an inherent property of Ricinus NR, whereas the high Mg2+-sensitivity depends on one or several factors in Ricinus leaves. This as yet unknown factor(s) was boiling-sensitive and could be precipitated by ammonium sulfate. It appeared to interact specifically with recombinant Ricinus-NR to provide the Mg2+-sensitivity of the authentic leaf enzyme. Presumably, there is also a positive regulatory factor(s) for nitrate reductase existing in the leaves of higher plants. KW - Rizinus KW - Nitratreduktase KW - Enzymatische Regulation KW - Nitratreduktase KW - Ricinus communis KW - 14-3-3s KW - Pichia pastoris KW - Nitrate Reductase KW - Pichia pastoris KW - Ricinus communis KW - 14-3-3s Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5544 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Markus T1 - Signal transduction during defense response and source-sink transition in tomato T1 - Signaltransduktion während source-sink-Übergang und Pathogenabwehr in Tomate N2 - Plants have evolved an elaborate system to cope with a variety of biotic and abiotic stresses. Typically, under stress conditions an appropriate defense response is invoked which is accompanied by changes in the metabolic status of the plant. Photosynthesis is downregulated and sucrose is imported into the tissue, which provides a faster and more constant flux of energy and carbon skeletons to perform the defense response. Interestingly, these processes are co-ordinately regulated and the signal transduction chains underlying these cellular programs appear to share at least some common elements. Both the induction of sink metabolism and defense response is dependent on signal transduction pathways involving protein phosphorylation. Furthermore, regulation of extracellular invertase (INV) and phenylalanine ammonia lyase (PAL) which are markers for sink metabolism and defense response is preceded by the transient activation of MAP kinases. In depth analysis of MAP kinase activation by partial purification led to the discovery that, depending on the stimulus, different subsets of MAP kinases are activated. This differential MAPK activation is likely to possess a signal encoding function. In addition, the partial purification of MAP kinases was found to be suitable to address specific cellular functions to individual MAP kinase isoenzymes. By this way, LpWIPK was identified as the major MAP kinase activity induced after stimulation of tomato cells with different elicitors. LpWIPK is thus considered as a key regulator of defense response together with sink induction in tomato. A study using nonmetabolisable sucrose analogs revealed that the regulation of photosynthesis is not directly coupled to this signal transduction pathway since it is independent of MAP kinase activation. Nonetheless, downregulation is induced by the same stimuli that induce the defense response and sink metabolism and it will therefore be interesting to uncover the branch points of this signalling network in the future. MAP kinases are not only central components regulating the response to biotic stresses. In addition to e.g. pathogens, MAP kinases are as well involved in signal transduction events invoked by abiotic stresses like cold and drought. In a recent study, we could show that a MAP kinase is activated by heat stress, under conditions a plant will encounter in nature. This previously unknown MAP kinase is able to specifically recognise the heat stress transcription factor HsfA3 as a substrate, which supports a role of this MAP kinase in the regulation of the heat stress response. Moreover, the observation that HsfA3 is phosphorylated by the heat activated MAP kinase in vitro provides a promising basis to identify HsfA3 as the first physiological substrate of a plant MAP kinase. Intracellular protons have been implicated in the signal transduction of defense related signals. In a study using Chenopodium rubrum cells, we could show that cytosolic changes in pH values do not precede the regulation of the marker genes INV and PAL. Depending on the stimulus applied, cytosolic acidification or alkalinisation can be observed, which excludes a role for protons as signals in this pathway. Together with the concomitant changes of the pH value of the extracellular space, these variations can thus be considered as terminal part of the defense response itself rather than as a second messenger. WRKY transcription factors have only recently been identified as indirect targets of a central plant MAP kinase cascade. In addition, the identification of cognate binding sites in the promoters of INV and PAL supports a role for these proteins in the co-ordinate regulation of defense response and sink induction. A novel elicitor responsive WRKY transcription factor, LpWRKY1, was cloned from tomato and characterised with respect to its posttranslational modification. This immediate early transcription factor is transiently induced upon pathogen attack and the induction is dependent on phosphorylation. Furthermore, it was shown for the first time with respect to WRKY transcription factors, that LpWRKY1 is phosphorylated in vivo. Analysis of the role of this phosphorylation by in gel assays using recombinant WRKY protein as the substrate revealed two protein kinases that are transiently activated during the defense response to phosphorylate LpWRKY1. This data demonstrates that WRKY proteins require phosphorylation to modulate their DNA binding or transactivating activity. N2 - Pflanzen haben ein aufwendiges System entwickelt um auf verschiedene Umweltreize zu reagieren. Meist wird unter Stressbedingungen ein passendes Abwehrprogramm aktiviert. Gleichzeitig wird die Photosynthese im jeweils betroffenen Gewebe abgeschaltet und stattdessen Saccharose importiert. Dieser Source-Sink Übergang stellt sicher, dass Energie und Kohlenstoffbausteine für die Abwehr schnell zur Verfügung stehen. Diese beiden Prozesse sind koordiniert reguliert und die zugrundeliegenden Singnaltransduktionswege scheinen wenigstens einige Komponenten gemeinsam zu haben. Sowohl die Induktion des Sink Metabolismus (gemessen an der Induktion der extrazellulären Invertase, INV) als auch des Abwehrprogramms (gemessen an der Induktion der Phenylalanin Ammonia-Lyase, PAL) sind von Phosphorylierungen abhängig. Außerdem geht der Induktion beider Gene die transiente Aktivierung von MAP Kinasen voran. Eine genauere Analyse der MAP Kinase Aktivierung durch partielle Reinigung zeigte, dass abhängig vom Stimulus mehrere MAP Kinasen aktiviert werden. Diese differentielle MAP Kinase Aktivierung stellt somit eine Möglichkeit der Signalcodierung dar. Die partielle Reinigung der MAP Kinasen wurde auch verwendet, um einzelnen MAP Kinase Isoenzymen spezifische zelluläre Funktionen zuzuweisen. Dadurch konnte LpWIPK (wound induced protein kinase) als Hauptaktivität nach Stimulation on Tomatenzellen mit Elicitoren bestimmt werden. LpWIPK könnte also sowohl die Pathogenabwehr als auch den source-sink Übergang gleichzeitig steuern. Allerdings ist die Regulation der Photosynthese unabhängig von diesem Signaltransduktionsweg. Eine Untersuchung mit nichtmetabolisierbaren Saccharose-Analoga zeigte, dass die Regulation der Photosynthese unabhängig von einer MAP Kinase Aktivierung stattfindet. Das abschalten der Photosynthese wird durch die gleichen Stimuli hervorgerufen, die auch Pathogenabwehr und Sink Metabolismus induzieren. Eine Interaktion der beiden Signaltransduktionswege ist somit wahrscheinlich. MAP Kinases spielen nicht nur bei der Antwort auf biotischen Stress eine wichtige Rolle. Zusätzlich werden MAP Kinasen auch durch abiotischen Stress wie Kälte und Dürre aktiviert. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Hitzestress unter natürlichen Bedingungen ebenfalls eine MAP Kinase aktiviert. Diese bisher unbekannte MAP Kinase akzeptiert den Hitzestress Transkriptionsfaktor HsfA3 als in vitro Substrat. Dies unterstützt die Vermutung, dass diese MAP Kinase eine Rolle in der Regulation der Hitzestress Antwort spielt. Außerdem stellt die Beobachtung, dass die hitzeaktivierte MAP Kinase HsfA3 in vitro phosphoryliert eine vielversprechende Ausgangssituation dar, um HsfA3 als erstes physiologisches MAP Kinase Substrat in Pflanzen zu identifizieren. Intrazelluläre pH Änderungen wurden als Komponenten der Signaltransduktion für die Pathogenabwehr diskutiert. In Zellen von Chenopodium rubrum konnten wir zeigen, dass solche Änderungen nicht in Zusammenhang mit der Induktion der beiden Markergene INV und PAL stehen. Die Änderung des intrazellulären pH Wertes erfolgt nach der Induktion der Markergene, und kann je nach Stimulus Alkalisierung oder Ansäuerung zur Folge haben. Diese Beobachtungen schließen eine Rolle der pH Änderungen in der Signaltransduktion von Stressreizen aus. Die gefundenen pH Wert Änderungen sind somit eher als Teil der Pathogenabwehr und nicht als vorgelagerte Komponente zu verstehen. WRKY Transkriptionsfaktoren wurden erst kürzlich als indirekte Ziele einer MAP Kinase Kaskade beschrieben. Außerdem finden sich in den Promotoren von INV und PAL Bindestellen für WRKY Transkriptionsfaktoren, was eine Beteiligung dieser Proteine an der koordinierten Regulation von Abwehr und Sink Metabolismus wahrscheinlich macht. Ein neuer WRKY Transkriptionsfaktor, LpWRKY1 wurde aus Tomate kloniert und in Hinblick auf mögliche posttranslationelle Modifikationen charakterisiert. Dieser Trankriptionsfaktor zählt zu den schnellen frühen Genen und wird in Antwort auf Elicitoren transient induziert. Die Induktion des Faktors in abhängig von Phosphorylierungen. Es konnte weiterhin erstmalig gezeigt werden, dass LpWRKY1 in vivo phosphoryliert wird. Eine weitere Analyse durch in gel Kinase Tests mit rekombinantem LpWRKY1 als Substrat zeigte, dass zwei Proteinkinasen während der Abwehrantwort transient aktiviert werden und LpWRKY1 phosphorylieren. Diese Daten legen nahe, dass die DNA Bindeaktivität oder die Transaktivierungsaktivität von WRKY Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierung gesteuert wird. KW - Tomate KW - WRKY KW - MAP Kinase KW - Signaltransduktion KW - tomato KW - WRKY KW - MAP kinase KW - signal transduction Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5421 ER - TY - THES A1 - Visan, Ioana Andreea T1 - The CD23 receptor-regulation of expression and signal transduction N2 - Bisher sind zwei Isoformen des humanen CD23 (CD23a und CD23b) beschrieben. Beide unterscheiden sich lediglich in 6-7 Resten im N-terminalen, zytoplasmatischen Anteil. CD23a wird ausschließlich auf B-Zellen exprimiert, während CD23b sowohl auf B-Zellen als auch auf Monozyten, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen und zahlreichen anderen Zelltypen durch Stimulation mit IL-4 induziert werden kann. Die beiden Isoformen vermitteln wahrscheinlich unterschiedliche Funktionen. CD23a gilt als Isoform, welche vornehmlich mit der Endozytose von IgE-Immunkomplexen und der Vermittlung von Antigen-Präsentation auf B-Zellen assoziiert ist. CD23b besitzt ein Phagozytose-Motiv und scheint bei der Phagozytose IgE besetzter Partikel, der Freisetzung von Zytokinen und der Bildung von Peroxiden eine Rolle zu spielen. Frühere Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass die beiden Isoformen zwei getrennte Signalübertragungswege miteinander verbinden. Die Gegenüberstellung von Ereignissen, welche in Zellen, die nur eine einer oder beide Isoformen von CD23 besitzen, stattfinden, legt die Vermutung nahe, dass CD23b cAMP und iNOS hochreguliert, wohingegen CD23a einen Anstieg des intrazellulären Kalziums vermittelt. Im ersten Teil unserer Untersuchungen haben wir die Regulation der B-Zell-spezifischen Expression von CD23a analysiert. Pax-5 ist ein auf B-Zellen beschränkter Transkriptionsfaktor, welcher für die frühe und späte B-Zellentwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Mögliche Pax-5 Bindungsstellen wurden in den proximalen Abschnitten des CD23a Promotors vermutet. Die Analyse des CD23a Promotors ergab drei mutmaßliche Pax-5 Bindungsstellen mit mehr als 50% Homologie zur Konsensus-Sequenz. Eine dieser Bindungsstellen, namens CD23-1, kann mit einer hochaffinen Pax-5 Bindungsstelle konkurrieren oder direkt das Pax-5 Protein in Elektromobilitäts Experimenten (EMSA) binden. Das Einfügen von Mutationen an dieser Stelle verhindert die Bindung. Ein weiterer Versuch, bei dem die gesamte Länge des CD23a Promotors durch überlappende Peptide in einem kompetitiven Verfahren gegenüber hoch affinen Bindungsstellen getestet wurde, zeigt ebenso CD23-1 als die einzige Stelle, welche direkt Pax-5 binden kann. In weiteren Experimenten führte die Expression von Pax-5 in 293 Zellen zu einer 7fachen Aktivierung eines CD23a Kernpromotor Konstrukts. Die Kotransfektion zusammen mit STAT6 zeigte, dass Pax-5 mit diesem Transkriptionsfaktor kooperiert, indem es die Transkriptionsrate eines vergrößerten CD23a Promotorkonstrukts erhöht. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die ektope Expression von Pax-5 in der monozytären Zelllinie U-937, die normalerweise nur die CD23b Isoform exprimiert, dann zu einer Expression von CD23a nach Stimulation mit IL-4 und PMA führte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Pax-5 in der auf B-Zellen beschränkten Expression der CD23 Isoform eine Schlüsselrolle zukommt. Im zweiten Teil des Projekts haben wir ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ (Cyto-Trap von Stratagene) verwendet, um nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern für den CD23 Rezeptor zu suchen. Das System wurde modifiziert um eine hohe Effizienz an Transformation zu erzielen. Unterschiedliche „Köder“-Vektorkonstrukte wurden hergestellt. Das Screening wurde mittels einer humanen Milzbibliothek mit dem Zielvektor des Systems durchgeführt. Die anfangs benutzten Konstrukte –pSosCD23a und pSosCD23b – exprimierten sehr kurze (22 Aminosäuren) zytoplasmatischen Reste der Isoformen am C-terminalen Ende des Fusionsproteins (humanes SOS). Verbesserte Konstrukte (pSos CD23a+Linker und pSosCD23b+Linker) exprimierten den zytoplasmatischen Anteil von CD23a/b am N-terminalen Ende des humanen SOS und hatten folglich den N-terminalen Anteil als Andockstelle frei, entsprechend den Bedingungen in vivo. Eine flexible Verbindungsregion trennte die Fusionsproteine, um auf diese Weise die kurze Aminosäurekette deutlich „sichtbar“ werden zu lassen. Annähernd drei Millionen Klone wurden mittels der verschiedenen Konstrukte untersucht. Dabei konnte keine tatsächlich positive Interaktion gefunden werden. Stattdessen fand sich eine vergleichsweise hohe Zahl falsch-positiver Klone. Diese wiederum wurden in einem zweiten “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ getestet. In Zukunft wird ein neues Konstrukt als Köder verwendet werden. Hierbei wurde ein Tyrosin-Rest im zytoplasmatischen Anteil von CD23a durch Glutamat ersetzt. Das System wurde bereits dazu verwendet, die Interaktion zwischen CD23 und p59fyn - einem Mitglied der Src-Familie von Proteinkinasen, welches mit CD23a assoziiert sein soll – zu testen. Jedoch konnte im CytoTrap “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ keine Wechselwirkung nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigt das zentrale Ergebnis der Arbeit, dass Pax-5 der Schlüsselregulator ist, der die B-Zell-spezifische Expression von CD23a ermöglicht. Zusätzlich wurde ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ etabliert, mit dem zytoplasmatische Interaktionspartner für die CD23 Isoformen gefunden werden können. N2 - Two isoforms of human CD23 (CD23a and CD23b) have been described. They differ by only 6-7 residues in the N-terminal cytoplasmic tail. CD23a is restrictively expressed on B-cells while CD23b is inducible on B-cells, as well as monocytes, eosinophils, macrophages and a variety of other cell types, after IL-4 stimulation. The two isoforms seems to have different functions. CD23a appears to be the isoform associated with endocytosis of IgE immune complexes and mediating antigen presentation on B-cells. CD23b has a phagocytosis motif and seems to be involved in the phagocytosis of IgE-coated particles, cytokine release and the generation of superoxides. Previous studies indicate that the two isoforms connect to different signal transduction pathways. Comparing the cells that express only one or both CD23 isoforms suggests that CD23b is involved in upregulating cAMP and iNOS, whereas CD23a mediates an increase in intracellular calcium. In the main part of the study we investigated how the CD23a B-cell specific expression is regulated. Pax-5 is a B-cell restricted transcription factor with an essential role in early and late B-cell development. Putative Pax-5 binding sites have been predicted in the CD23a proximal promoter. Analyses of the CD23a promoter revealed three putative Pax-5 binding sites with more than 50% homology to the consensus sequence. One of these sites, named CD23-1 can compete a high affinity Pax-5 binding site or can directly bind Pax-5 protein in electrophoretic mobility shift assays. Introducing mutations into this site abrogates the binding. A different approach, in which overlapping peptides covering the length of the CD23a promoter were tested in competition assays against a high affinity binding site, also revealed CD23-1 as the only site that directly binds Pax-5 protein. Expression of Pax-5 in 293 cells resulted in a 7-fold activation of a CD23a core promoter construct. Co-transfection together with STAT6 showed that Pax-5 cooperates with this transcription factor in enhancing the level of transcription of a CD23a extended promoter construct. Most importantly, ectopic expression of Pax-5 in the monocytic cell line U-937 that regularly expresses only the CD23b isoform enabled a significant CD23a expression after stimulation with IL-4 and PMA. Our results suggest that Pax-5 is a key regulator of the B-cell restricted expression of the CD23a isoform. In the second part of the project, we used a yeast two-hybrid system (CytoTrapTM from Stratagene) in order to look for cytoplasmic interaction partners for the CD23 receptor. The system was established in order to reach a high efficiency of transformation and different bait vector constructs were made. The screening was performed using a human spleen library cloned in the target vector of the system. The first bait constructs used (pSosCD23a and pSosCD23b) expressed the very short (22 amino acids) cytoplasmic tails of the isoforms at the C-terminal end of the fusion protein (human SOS). Improved bait constructs, (pSosCD23a+Linker and pSos CD23b+Linker) expressed the cytoplasmic tail of CD23a/b at the N-terminal side of the human SOS and had in consequence the N-terminal part free as a bait, as it occurs in vivo. A flexible linker region separated the fusion proteins in order to make the small amino acid bait chain more obvious. Approximately three million library clones were screened with these various constructs. No “true positive” interaction was detected. A relatively high number of “false positive” clones were obtained and checked in another two-hybrid system. A new bait construct, in which the tyrosine residue in the cytoplasmic tail of CD23a was replaced by a glutamic acid residue will be used for future screening. The system was also used in order to test the interaction between CD23 and p59fyn, a member of the Src family of protein kinases that was mentioned to associate with CD23a. No interaction was detected by using the CytoTrap two-hybrid system. In conclusion, the key result of the study demonstrates that Pax-5 is a main regulator of the B-cell specific expression of the CD23a isoform. In addition, a two-hybrid system was established and employed in order to look for cytoplasmic interaction partners for CD23. KW - Antigen CD23 KW - Promotor KW - Genregulation KW - CD23 KW - Pax-5 KW - Zwei-Hefen-Hybrid-System KW - Promotor Regulation KW - CD23 KW - Pax-5 KW - promoter regulation KW - two-hybrid system Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5556 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Klaus Dieter T1 - Struktur, Funktion und chemische Zusammensetzung superinisierter Transportbarrieren im Apoplasten höherer Pflanzen T1 - Structur, Function and Chemical Composition of Suberized Transport Barriers in the Apoplast of Higher Plants N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die für den radialen Stofftransport durch die Wurzel Höherer Pflanzen wichtigen apoplastischen Barrieren der Wurzeln von sieben Pflanzenarten (Vicia faba L.; Typha glauca Godr.; Ricinus communis L.; Quercus petraea (Matt.) Liebl.; Fagus sylvatica L.; Picea abies (L.) Karst.; Zea mays L.) mikroskopisch charakterisiert und chemisch analysiert. Nach enyzmatischer Isolation der Gewebe wurde die Biopolymerzusammensetzung von Suberin und Lignin der isolierten Zellwände nach Depolymerisierung durch Umesterungsreaktion (Abbau von Suberin) oder Thioacidolyse (Abbau von Lignin) mittels Gaschromatographie und Massenspektroskopie aufgeklärt. Außerdem wurde Sprossknollenperiderm der Kartoffel (Solanum tuberosum L.) verschiedener post harvest Luftfeuchtebedingungen, sowie neugeformtes Wundperiderm chemisch-analytisch und auf die Permeabilität für Wasser hin untersucht. Zusätzlich zu den mikroskopischen und chemischen Analysen wurden die hydraulischen Leitfähigkeiten von Maiswurzeln verschiedener Kulturbedingungen und die Aufnahme von Rubidium-Ionen über die Maiswurzeln untersucht. Dabei wurde die Auswirkung von Salzstress (100mM NaCl), und eine Applikation des Phytohormons Abscisinsäure (10µM ABA) bei der Aufzucht der Pflanzen auf apoplastische Barrieren untersucht. Auch die Rubidiumaufnahme von bei Nitratmangel (0.00 M NO3-) aufgewachsenen Rizinuspflanzen wurde ermittelt und mit der chemischen Zusammensetzung der apoplastischen Barrieren korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass: -monocotyle Pflanzen wesentlich höhere Aromatenanteile im Suberin apoplastischer Barrieren besitzen als dicotyle Pflanzen; -bei der Bewertung des Suberingehaltes apoplastischer Barrieren histochemische Methoden unzureichend sind; -die Flächenbelegung mit Suberin auch innerhalb gleicher Entwicklungsstadien bei verschiedenen Pflanzen stark unterschiedlich sein kann; -der Verknüpfungsgrad der Monomeren im Suberin stark unterschiedlich sein kann; -Suberin keine 100%ige Barriere für Wasser und Ionen darstellt; -Suberin auch eine Barriere gegen unkontrollierte Gasdiffusion darstellen kann; -der Stofftransport (z.B. Rb-Ionen) durch zusätzliche Suberinmengen verlangsamt werden kann, geringere Suberinmengen den Stofffluss aber nicht signifikant erhöhen wie bei Nitratmangelpflanzen gezeigt wurde; -eine direkte Ableitung der Funktion für den Wasser und Stofftransport aus dem Suberingehalt nicht ohne eine Extraktanalyse der Gewebe möglich ist, und in jedem Fall die Notwendigkeit besteht eine Flächenbelegung mit Suberin oder Wachsen zu ermitteln; -die Variabilität von Pflanzen verschiedenen Genotyps und die Entwicklung vieler verschiedener Anpassungsstrategien zum Schutz vor Stress eine Abschätzung funktioneller Aspekte aus monokausaler Sichtweise (z.B.: Suberingehalt) unmöglich macht. Um der Vielfältigkeit pflanzlicher Strategien gerecht zu werden, ist daher die Integration vieler unterschiedlicher Untersuchungsmethoden in interdisziplinärer Arbeitsweise notwendig. N2 - The aim of this thesis was to examine the chemical composition of suberised apoplastic barriers in roots of higher plants and to relate the obtained results to the function of these barrier tissues for the diffusive transport of ions and water. For the analysis of the chemical composition (mainly suberin and also lignin), the roots were digested enzymatically, and the remaining material was separated in two fractions: one fraction consisting of rhizodermal and hypodermal cell walls (RHCW) and the second one of endodermal cell walls (ECW). Xylem vessels were not analised. Suberin content of the isolated cell walls was determined after transesterification and GC/FID and GC/MS analysis of the monomers. Prior to the chemical analysis, the anatomical structures of the roots were thoroughly examined with light microscopy using histochemical dyes and UV-light as well as scanning electron microscopy. Analysis were performed on the roots of several species: Vicia faba L., Typha glauca Godr., Quercus petraea (Matt.) Liebl., Fagus sylvatica L., Picea abies (L.) Karst., Rhicinus communis L. and Zea mays L. To reveal functional aspects for the transport of water through suberised barriers, potato tuber (Solanum tuberosum L.) skin was used as a model system because it is easy to obtain and consists to more than 20% of suberin. Additionally it is impregnated with aliphatic wax like materials. Experiments with freshly harvested potatoes showed, that suberin and wax content increased in the first days after cutting the tubers from the stele, but no additional cell layers were build. As the content of aliphatic components increased in the peridermal cell walls, the water permeability decreased. Removal of the waxes increased the water permeability of potato periderm to more than a 100 fold from 5.4∙10-11 m s-1 to 8.0∙10-9 m s-1 for the extracted ones. Surprisingly, there was no significant difference in the water permeability of periderms with different suberin content. 28 day old periderms had approx. twice as much as the suberin from freshly harvested ones, but the difference in permeability was smaller than 0.4 units. These results are showing, that suberin is not a water tight barrier as it is discussed in common text books, but to a certain extend it controls the water flux. Suberin amounts and permeabilities where used to estimate hypothetical transport data for root tissues, but the calculated values were only roughly in the range of measured root hydraulic permeabilities obtained from pressure probe experiments. Pressure probe experiments with roots of 8 day old maize seedlings showed, that a higher suberin content in the exodermis significantly reduces the radial water flow through the roots. Even the ion flux in maize roots is reduced, when barrier tissues contained more suberin. These results were obtained in experiments with rubidium-ions as a tracer for potassium-ions in maize seedlings. Apoplastic root barrier tissues, especially the endodermis were strongly enhanced, when the plants were grown under 100 mM NaCl or with 10 µM of the stress-hormone abscisic acid in the hydroponic growth-solution. On the other hand, it was shown that plants of the same species but with different genotypes responded each in a different way to stress situations. For example, whilest maize genotype Pioneer 3906 was able to cope with high salt concentrations, without altering apoplastic barriers, the genotype Across 8023 showed strong enhancement with high suberin amounts of the endodermal cell walls at the same salt concentrations. Lack of nutrients (e.g.: nitrate) in castor bean hydroponic culture leads to low suberin content in the endodermis but the uptake ability for rubidium-ions was not affected at all. Analysis of broad bean root nodules showed the relevance of high suberin amounts as a barrier for water and solutes as well as for gases. Suberin content in nodules were much higher than in the root apoplastic barriers, for that it would concluded, that the uncontrolled diffusion of oxygen into the infected zone of the nodule was inhibited by large amounts of suberin in the nodule endodermis. Another hint to this idea was the analysis of Typha glauca roots and rhizomes, which had more suberin in the exodermis than in the endodermis (in maize it was vice versa), because the submerged tissues are full of air-filled intercellular spaces and the function of higher suberin amounts in the exodermis may be to prevent oxygen loss. The results of this thesis are showing that suberin is a variable material with several functions, not only as a transport barrier for water, ions and gases which controls to a certain extend the fluxes in and out of the apoplast, but also as a barrier against pathogens with high contents of aromatic materials. KW - Samenpflanzen KW - Wurzel KW - Stofftransport KW - Apoplast KW - Lignin KW - WURZEL KW - APOPLAST KW - SUBERIN KW - LIGNIN KW - ENDODERMIS KW - CASPARY-STREIFEN KW - Root KW - Apoplast KW - Suberin KW - Lignin KW - Endodermis KW - Casparian strip Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4999 ER - TY - THES A1 - Sauter, Angela T1 - Die Bedeutung von ABA-Konjugaten als hormonelles Langstreckensignal in Pflanzen T1 - The implication of ABA-conjugates for long distance signalling in plants N2 - Abscisinsäure-Glucoseester (ABA-GE) kann nach der vorliegenden Untersuchung nicht mehr ausschließlich als Endmetabolit der Abscisinsäure (ABA) gelten. Der unter Stressbedingungen im Xylem verstärkt transportierte ABA-GE trägt in Kombination mit einer extrazellulären ß-D-Glucosidaseaktivität im Blattapoplast zu einer Stabilisierung und Intensivierung des ABA-Langstreckensignals bei. N2 - The results presented in this study support te idea that abscisic acid glucose ester (ABA-GE) can not be considered exclusively as a final metabolite of ABA. While stress conditions intensify the ABA-GE-concentration in the xylem, and the existance of ß-D-glucosidase activity in the leaf apoplast suggest that ABA-GE stabilises and intensifies the ABA long-distance signal. KW - Abscisinsäure KW - Wurzel KW - Spross KW - Signaltransduktion KW - ABA-Konjugate KW - ABA-GE KW - Wurzel-Spross-Stresssignal KW - Xylem KW - ß-D-Glucosidase KW - ABA-conjugates KW - ABA-GE KW - root-to-shoot stress signal KW - xylem KW - ß-D-glucosidase Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3892 ER - TY - THES A1 - Jadulco, Raquel C. T1 - Isolation and structure elucidation of bioactive secondary metabolites from marine sponges and sponge-derived fungi T1 - Isolierung und strukturelle Identifizierung von biologisch aktiven Naturstoffen aus marinen Schwämme und aus Schwämmen isolierte Pile N2 - Low-molecular mass natural products from bacteria, fungi, plants and marine organisms exhibit unique structural diversity which are of interest for the identification of new lead structures for medicinals and agrochemicals. In the search for bioactive compounds from marine sponges and sponge-associated fungi, this research work resulted to the isolation of twenty-six compounds, eight of which are new metabolites. The sponges were collected from the Indo-pacific regions, particularly those from Indonesian and Philippine waters, as well as those from the Mediterranean Sea near the island of Elba in Italy. A combination of the chemically- and biologically-driven approach for drug discovery was employed, wherein extracts were screened for antibacterial, antifungal and cytotoxic activities. In addition to the bioassay-guided approach to purify the compounds responsible for the activity of the extract, TLC, UV and MS were also used to isolate the chemically most interesting substances. Hence, purified compounds which are not responsible for the initial bioscreening activity may have a chance to be evaluated for other bioactivities. Enumerated below are the compounds which have been isolated and structurally elucidated and whose bioactivities have been further characterized. 1. The extract of the fungus Cladosporium herbarum associated with the sponge Callyspongia aerizusa afforded seven structurally related polyketides, including two new twelve-membered macrolides: pandangolide 3 and 4, and a new acetyl congener of the previously isolated 5-hydroxymethyl-2-furoic acid. The two furoic acid analogues isolated were found to be responsible for the antimicrobial activity of the extract. The isolation of the known phytotoxin Cladospolide B from Cladosporium herbarum, which was originally known from Cladosporium cladosporioides and C. tenuissimum, indicates the possibility that Cladospolide B may be a chemotaxonomic marker of particular Cladosporium species. 2. The extract of the fungus Curvularia lunata associated with the Indonesian sponge Niphates olemda yielded three compounds, namely the new antimicrobially-active anthraquinone lunatin, the known bisanthraquinone cytoskyrin A, and the known plant hormone abscisic acid. The co-occurrence of the two structurally-related anthraquinones suggests that the monomeric lunatin may be a precursor in the biosynthesis of the bisanthraquinone cytoskyrin A. 3. The fungus Penicillium spp. associated with the Mediterranean sponge Axinella verrucosa yielded six compounds, namely the known antifungal griseofulvin and its less active dechloro analogue; the known toxin oxaline; and the known cytotoxic metabolite communesin B and its two new congeners communesin C and D. The new communesins were less active than communesin B in the brine-shrimp lethality test. 4. An unidentified fungus which was also isolated from the same Mediterranean sponge Axinella verrucosa as Penicillium spp. yielded the known compound monocerin which has been reported to possess phytotoxic and insecticidal activities. 5. The fungus Aspergillus flavus associated with the Philippine sponge Hyrtios aff. reticulatus yielded the known toxin a-cyclopiazonic acid. 6. The Indonesian sponge Agelas nakamurai yielded four bromopyrrole alkaloids namely the new compound 4-bromo-pyrrole-2-carboxylic acid, and the known compounds: 4-bromo-pyrrole-2-carboxamide, mukanadin B and mukanadin C. All of the four compounds except mukanadin B were found to be antimicrobially-active. Bromopyrrole alkaloids are well-known metabolites of the genus Agelas and are proven to play an important role in the chemical defense of the sponge against predation from fishes. 7. The Indonesian sponge Jaspis splendens yielded three known substances which are known for their antiproliferative activities, namely the depsipeptides jaspamide (jasplakinolide), and its derivatives jaspamide B and jaspamide C. N2 - Niedermolekulare Naturstoffe aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen und marinen Organismen weisen eine einzigartige strukturelle Diversität auf, die für die Identifizierung neuer Leitstrukturen für die Entwicklung von Arzneistoffen und Pflanzenschutzmitteln von großer Bedeutung ist. Im Rahmen der Suche nach bioaktiven Verbindungen aus marinen Schwämmen und mit diesen Schwämmen assoziierten Pilzen wurden in dieser Arbeit insgesamt 26 Sekundärstoffe isoliert, wobei es sich bei acht Substanzen um neue Verbindungen handelt. Die Schwämme wurden im indo-pazifischen Gebiet gesammelt, insbesondere aus Indonesien und den Philippinen, so wie aus dem Mittelmeer in der Nähe der Insel Elba in Italien. Für die Entdeckung neuer bioaktiver Substanzen wurde eine Kombination von chemischen und biologischen Methoden angewendet, wodurch Extrakte mit verschiedenen Screening-Methoden auf Bioaktivität getestet worden sind. Zum Einsatz kamen dabei Versuche mit Raupen des polyphagen Nachtfalters Spodoptera littoralis (Noctuidae; Lepidoptera) im Hinblick auf potentielle insektizide Wirkungen, antimikrobielle Untersuchungen mit gram-negativen und gram-positiven Bakterien und dem Pilz Candida albicans, Zytotoxizitätstests gegenüber menschlichen Krebszellen und Toxizitätstests mit dem Krebs Artemia salina. Zusätzlich zur bioaktivitäts-geleiteten Isolierung von Substanzen aus aktiven Extrakten wurden daneben auch DC, UV und MS als Kriterien herangezogen, um die aus chemischer Sicht interessantesten Verbindungen zu isolieren. Damit konnten auch solche Substanzen, die nicht für die Aktivität der Extrakte im Bioscreening verantwortlich waren, weiteren Biotests unterzogen werden. Im einzelnen wurden die folgenden Verbindungen isoliert, ihre Struktur aufgeklärt, und ihre biologische Aktivität näher charakterisiert: 1. Der antimikrobiell aktive Extrakt aus dem Pilz Cladosporium herbarum, der mit dem indonesischen Schwamm Callyspongia aerizusa assoziiert ist, ergab sieben Polyketide, die strukturell ähnlich sind, einschließlich der beiden neuen zwölf-gliedrigen Makrolide Pandangolid 3 und Pandangolid 4, sowie ein neues acetyliertes Derivat des bereits bekannten Naturstoffs 5-Hyroxymethyl-2-furancarbonsäure. Beide Furancarbonsäuren zeigten antimikrobielle Aktivität und dürften deshalb hauptsächlich für die antimikrobielle Aktivität des Extrakts verantwortlich sein. Daß Cladospolid B, ein bekanntes Phytotoxin, das bereits für die Arten Cladosporium cladosporoiodes und C. tenuissimum beschrieben wurde, ebenfalls aus C. herbarum isoliert wurde, deutet darauf hin, daß Cladospolid B als ein chemotaxonomischer Marker für bestimmte Cladosporium-Arten angesehen werden könnte. 2. Der antimikrobiell aktive Extrakt aus dem Pilz Curvularia lunata, der mit dem indonesischen Schwamm Niphates olemda assoziiert ist, ergab drei Substanzen, nämlich das neue antimikrobiell aktive Anthrachinon Lunatin sowie das bereits bekannte Bisanthrachinon Cytoskyrin A, und das bekannte Pflanzenhormon Abscisinsäure. Das gemeinsame Vorkommen der beiden strukturell verwandten Anthranoide könnte ein Indiz dafür sein, daß das Monomer Lunatin eine biogenetische Vorstufe des Bisanthrachinons Cytoskyrin A darstellt. 3. Ein mit dem im Mittelmeer gesammelten Schwamm Axinella verrucosa assoziierter Pilz der Gattung Penicillium ergab insgesamt sechs Substanzen, im einzelnen das bekannte Antimykotikum Griseofulvin und dessen weniger aktives Dechlor-Derivat, das bekannte Toxin Oxalin, sowie die als zytotoxisch beschriebene Verbindung Communesin B und deren neue Derivate Communesin C und Communesin D. Im Vergleich zu Communesin B erwiesen sich die neuen Communesin-Derivate als weniger aktiv gegenüber dem Krebs A. salina. 4. Ein bisher unidentifizierter Pilz aus dem gleichen Schwamm Axinella verrucosa lieferte die bekannte Substanz Monocerin, über deren phytotoxische und insektizide Eigenschaften bereits berichtet wurde. 5. Der mit dem philippinischen Schwamm Hyrtios aff. reticulatus assoziierte Pilz Aspergillus flavus ergab das bereits bekannte Toxin a-Cyclopiazonsäure. 6. Der indonesische Schwamm Agelas nakamurai lieferte vier bromierte Pyrrol-Alkaloide, nämlich die neue Substanz 4-Brompyrrol-2-carbonsäure sowie die bereits bekannten Verbindungen 4-Brompyrrol-2-carboxamid, Mukanadin B und Mukanadin C. Alle vier Substanzen außer Mukanadin B zeigten antimikrobielle Aktivität. Bromierte Pyrrol-Alkaloide wurden in vielen Untersuchungen als typische Sekundärstoffe der Schwammgattung Agelas beschrieben, die bei der chemischen Verteidigung der Schwämme gegen Fische eine wichtige Rolle spielen. 7. Der indonesiche Schwamm Jaspis splendens ergab drei bekannte Substanzen, die für ihre antiproliferative Aktivität bekannt sind, nämlich die Depsipeptide Jaspamid (Jasplakinolid) und dessen Derivate Jaspamid B und Jaspamid C. KW - Meeresschwämme KW - Pilze KW - Sekundärmetabolit KW - Marin KW - Schwämme KW - Pilze KW - Naturstoff KW - Marine KW - sponges KW - fungi KW - metabolites Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3565 ER - TY - THES A1 - Stoimenova, Maria T1 - Normoxic and anoxic metabolism of Nicotiana tabacum transformants lacking root nitrate reductase N2 - The aim of this work was to find out whether and how nitrate reduction in roots would facilitate survival of hypoxic and anoxic (flooding)-phases. For that purpose, we compared the response of roots of hydroponically grown tobacco wildtype (Nicotiana tabacum cv. Gatersleben) and of a transformant (LNR-H) with no nitrate reductase (NR) in the roots but almost normal NR in leaves (based on a nia2-double mutant). As an additional control we used occasionally a 35S-transformant of the same nia2-double mutant, which on the same genetic background constitutively expressed NR in all organs. In some cases, we also compared the response of roots from WT plants, which had been grown on tungstate for some time in order to completely suppress NR activity. The following root parameters were examined: 1) Growth and morphology 2) Root respiration rates and leaf transpiration 3) Metabolite contents in roots (ATP, hexosemonophosphates, free sugars, starch, amino acids, total protein) 4) Inorganic cation and anion contents 5) Lactate and ethanol production 6) Extractable LDH-and ADH-activities 7) Cytosolic pH values (by 31P-NMR) 8) NO Cation and anion contents of roots from WT and LNR-H were only slightly different, confirming that these plants would be better suited for our purposes than the widely used comparison of nitrate-versus ammonium-grown plants, which usually show up with dramatic differences in their ion contents. Normoxia: LNR-H-plants had shorter and thicker roots than WT with a lower roots surface area per leaf FW. This was probably the major cause for the significantly lower specific leaf transpiration of LNR-H. WT-roots had lower respiration rates, lower ATP-and HMP-contents, slightly lower sugar- and starch contents and somewhat lower amino acid contents than LNR-H roots. However, total protein/FW was almost identical. Obviously the LNR-H transformants did not suffer from N-defciency, and their energy status appeared even better than that of WT-roots. Data from the 35S-transformant were similar to those of WT. This indicates that the observed differences between WT and LNR-H were not due to unknown factors of the genetic nia2-background, but that they could be really traced back to the presence resp. absence of nitrate reduction. Anoxia: Under short-term anoxia (2h) LNR-H plants, but not WT-plants exhibited clear symptoms of wilting, although leaf transpiration was lower with LNR-H. Reasons are not known yet. LNR-H roots produced much more ethanol (which was excreted) and lactate compared to WT, but extractable ADH and LDH activities, were not induced by anoxia. However, the LDH activity background was twice as high as that of the WT troughout the time period studied. Tungstate-treated WT-roots also gave higher fermentation rates than normal WT roots. Sugar- and HMP-contents remained higher in LNR-H roots than in WT. NR in WT roots was activated under anoxia and roots accumulated nitrite, which was also released to the medium. 31P-NMR spectroscopy showed that LNR-H- roots, in spite of their better energy status, acidified their cytosol more than WT roots. Conclusions: Obviously nitrate reduction affects - by as yet unknown mechanisms - root growth and morphology. The much lower anoxic fermentation rates of WT-roots compared to LNR-H roots could not be traced back to an alternative NADH consumption by nitrate reduction, since NR activity was too low for that. An overall estimation of H+-production by glycolysis, fermentation and nitrate reduction (without nitrite reduction, which was absent under anoxia) indicated that the stronger cytosolic acidification of anoxic LNR-H roots was based on their higher fermentation rates. Thus, nitrate reduction under anoxia appears advantageous because of lower fermentation rates and concomitantly lower cytosolic acidification. However, it remained unclear why fermentation rates were so different. Perspective: Preliminary experiments had indicated that WT-roots produced more nitric oxide (NO) under anoxia than LNR-H-roots. Accordingly, we suggest that nitrate reduction, beyond a merely increased NADH-consumption, would lead to advantageous changes in metabolism, eventually via NO-production, which is increasingly recognized as an important signaling compound regulating many plant functions. N2 - Ziel der Arbeit war es herauszufinden, ob und wie Nitratreduktion in der Wurzel das Überleben von hypoxischen und anoxischen (Überflutungs)-Phasen erleichtert. Hierzu wurden Wurzeln eines hydroponisch angezogenen Tabak-Wildtyps (Nicotiana tabacum cv. Gatersleben), sowie einer Tabaktransformante auf der Basis der nia Doppelmutante, welche Nitratreduktase nur noch in den Blättern exprimierte (LNR-H), im Hinblick auf verschiedene Parameter verglichen. Als zusätzliche Kontrolle wurde eine 35S-Transformante der nia-Doppelmutante gelegentlich in die Vergleiche mit einbezogen, da diese auf dem genetischen Hintergrund der nia Doppelmutante NR in Blättern und Wurzeln konstitutiv exprimierte mit Aktivitäten, die in etwa denen des Wildtyps entsprachen. In einigen Fällen wurde die Nitratreduktase des WT durch Aufzucht auf Wolframat (an Stelle von Molybdat) gehemmt, und diese Pflanzen wurden ebenfalls mit normalen WT-Wurzeln verglichen. Folgende Parameter wurden untersucht: 1) Wachstum und Wurzelmorphologie 2) Atmungsraten, Transpirationsraten 3) Metabolitgehalte (ATP, Hexosemonophosphate, freie Zucker, Aminosäuren) 4) Gehalte anorganischer Kationen und Anionen 5) Lactat- und Ethanolproduktion 6) LDH und ADH-Aktivitäten in Wurzelextrakten 7) Cytosolische pH-Werte mittels 31P-NMR 8) NO Die Analyse des Kationen- und Anionengehaltes der Wurzeln bestätigte zunächst, das die LNR-H-Transformante und der WT sich in dieser Hinsicht nur unwesentlich unterschieden und von daher zum weiteren Vergleich besser geeignet waren als die vielfach verwendete Paarung von nitrat-bzw- ammoniumernährten Pflanzen. Normoxia: LNR-H-Pflanzen hatten kürzere und dickere Wurzeln mit einer niedrigeren Wurzeloberfläche pro Blattfrischgewicht als WT. Dies war vermutlich die Hauptursache für die deutlich niedrigeren Transpirationsraten von LNR-H. WT-Wurzeln hatten unter normoxischen Bedingungen niedrigere Atmungsraten, niedrigere ATP und HMP-Gehalte, etwas niedrigere Zucker und Stärkegehalte und etwas niedrigere Gesamt-Aminosäuregehalte als LNR-H-Wurzeln. Andererseits waren die Gesamt-Proteingehalte (pro FG) praktisch identisch. Offensichtlich litt die LNR-H-Transformante nicht unter N-Mangel, und ihr energetischer Zustand war unter Normalbedingungen eher besser war als der des WT. Die Daten der 35S-Transformante entsprachen weitgehend denen des WT. Dies zeigt, dass die beobachteten Unterschiede nicht auf unbekannten Faktoren des nia2-Hintergrunds beruhten, sondern definitiv auf dem Vorhandensein (bzw. der Abwesenheit) von Nitratreduktion. Anoxia: Unter Anoxia (4h) traten bei LNR-H deutliches Welken der Blätter auf, bei WT dagegen nicht. Die Ursachen sind unklar. Unter Anoxia produzierten LNR-H-Wurzeln sehr viel mehr Ethanol und Lactat als WT, obwohl weder ADH-noch LDH Aktivitäten in Wurzelextrakten unter Anoxia erhöht wurden. Allerdings besaß die LNR-H Transformante permanent doppelt so hohe LDH Aktivitäten wie der WT.h. Auch Wolframat-versorgte WT-Wurzeln produzierten unter Anoxia mehr Lactat und Ethanol als der normale WT. Zucker und HMP-Gehalte blieben in LNR-H höher als in WT. Die NR von WT-Wurzeln wurde unter Anoxia aktiviert und die Wurzeln akkumulierten Nitrit, das großteils an die Nährlösung abgegeben wurde. 31P-NMR-Messungen zeigten, dass LNR-H-Wurzeln trotz ihres besseren Energiezustandes unter Anoxia das Cytosol stärker ansäuerten als WT-Wurzeln. Schlussfolgerungen: Offensichtlich beeinflusst Nitratreduktion auf noch unbekannte Weise Wachstum und Morphologie der Wurzeln unter Normoxia. Die viel niedrigeren Gärungsraten der WT-Wurzeln unter Anoxia konnten nicht auf einen alternativen NADH-Verbrauch der Nitratreduktion zurückgeführt werden, weil dazu die NR-Aktivitäten zu niedrig waren. Bilanzierung der H+-Produktion durch Glycolyse, Gärung und Nitratreduktion zeigte, dass die stärkere cytosolische Ansäuerung der anoxischen LNR-H Wurzeln auf den insgesamt höheren Gärungsraten der LNR-H-Wurzeln beruhen muss. Nitratreduktion ist unter Anoxia also vorteilhaft, weil sehr viel weniger Gärung abläuft und damit cytosolische Ansäuerung abgeschwächt wird. Warum allerdings die Gärungsraten so unterschiedlich waren, blieb unklar. Ausblick: Vorversuche hatten ergeben, dass WT-Wurzeln unter Anoxia mehr Stickstoffmonoxid (NO) produzierten als LNR-H-Wurzeln. Es wird deshalb hypothetisch vorgeschlagen, dass die Nitratreduktion über den bloßen NADH-Verbrauch hinaus durch eine anoxische NO-Produktion ein Signal erzeugt, das vorteilhaft regulierend in Stoffwechsel und Wachstum eingreift. KW - Tabak KW - Wurzel KW - Nitratreduktase KW - Anoxie KW - nitrate reductase KW - anoxia KW - roots KW - NMR KW - fermentation Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3498 ER - TY - THES A1 - Beckert, Cornelia T1 - Biosynthese, Akkumulation und Strukturen von Styrylpyronen in gametophytischen und sporophytischen Geweben von Equisetum T1 - Styrylpyrone biosynthesis, accumulation and structures of styrylpyrones in gametophytic and sporophytic tissues of Equisetum N2 - Untersuchungen zur Akkumulation phenolischer Inhaltsstoffe von Equisetum an gametophytischen und unterirdisch wachsenden sporophytischen Geweben vervollständigten den Kenntnisstand der phenolischen Inhaltsstoffe in dieser Gattung. In beiden Geweben konnten – wie in oberirdischen sporophytischen Geweben – Hydroxyzimtsäurederivate nachgewiesen werden. Styrylpyrone und Protoflavonoide ersetzen hier die in oberirdischen sporophytischen Geweben nachgewiesenen Flavonoide. Hydroxyzimtsäurederivate wurden in Prothallien aller untersuchter Arten gefunden wohingegen in Rhizomen der jeweiligen Arten einzelne Hydroxyzimtsäurederivate fehlten. Die Inhaltsstoffmuster der Styrylpyrone bei verschiedenen Arten entsprachen sich weitgehend. Die sukzessive Analyse des Übergangsbereiches - unterirdisch wachsendes Rhizom zu oberirdischem Spross - zeigte einen ebenso sukzessiven Wechsel im Akkumulationsmuster. Der Gehalt löslicher Styrylpyrone nahm - von unten nach oben betrachtet - in gleichem Maße ab, wie der Gehalt an Flavonoiden anstieg. In lokal braun pigmentierten Sprossbereichen, die vereinzelt an oberirdisch wachsenden Sporophyten auftraten, wurden neben den in Rhizomen konstitutiv akkumulierten Styrylpyronen auch, offenbar durch Verwundung induziert, Styrylpyrone detektiert. In den grünen, nicht pigmentierten Bereichen dieser Sprosse wurden dagegen ausschließlich Flavonoide und Hydroxyzimtsäurederivate detektiert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen belegten eine vakuoläre Speicherung der löslichen Inhaltsstoffe Styrylpyrone und Hydroxyzimtsäurederivate in Rhizomen und Prothallien. Hydroxyzimtsäurederivate wurden vorwiegend in zentral liegenden Rhizombereichen detektiert, während Styrylpyrone über den gesamten Rhizomquerschnitt verteilt sichtbar gemacht werden konnten. Folgende Styrylpyrone wurden aus Rhizomen von E. arvense isoliert und mit Hilfe spektroskopischer Methoden in ihrer Struktur aufgeklärt: 3,4-Dihydroxy-6-(4´-hydroxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-ß-D-glucopyranosid und 3,4-Dihydroxy-6-(3´-hydroxy-4´methoxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-ß-glucopyranosid. Untersuchungen zur Biosynthese von Styrylpyronen zeigten eine enzymkatalysierte Bildung von Hispidin und Bisnoryangonin in Gametophyten verschiedener Equisetum-Arten sowie in Rhizomen und fertilen Sporophyten von E. arvense. Ebenso gelang der Nachweis der enzymatischen Glycosilierung von 3-Hydroxyhispidin zu Equisetumpyron in Gametophyten von E. arvense. Eine Styrylpyronsynthase wurde charakterisiert: Das pH-Optimum für die Bildung von Bisnoryangonin lag bei pH 7,5-7,8 und für die Bildung von Hispidin bei 6,8-7,0, jeweils in 0,5 M KPi-Puffer. Das Temperaturoptimum für die Bildung von Bisnoryangonin betrug 30° C bzw. 37°C für die Bildung von Hispidin. Die Substanzen Natriumascorbat in einer Konzentration von 20 mM, BSA (0,1 % w/V), Dithiothreitol (2,5 mM) bzw. Mercaptoethanol (7 mM) konnten die Enzymaktivität deutlich steigern. Die Km﷓Werte wurden für die Substrate Kaffeoyl-CoA und Malonyl-CoA bei 116 µM bzw. 141 µM ermittelt. Für die Substrate p-Cumaroyl-CoA und Malonyl-CoA lagen die Km﷓Werte bei 182 µM bzw. 238 µM. Das relative Molekulargewicht des nativen Enzyms wurde mittels Gelfiltration mit 78-80 kD bestimmt. Im Rahmen der Proteinreinigung wurde eine auf chromatographischen Techniken basierende Methode entwickelt, mit der die Styrylpyronsynthase mit einem Anreicherungsfaktor von 1107 bei einer Ausbeute von 0,08 % gereinigt werden konnte. N2 - Investigations to the accumulation of phenolic compounds in gametophytic and underground sporophytic tissues of Equisetum completed the data of phenolic compounds in Equisetum. Hydroxycinnamic acids were detected both in underground sporophytic and gametophytic tissues as found before in aboveground sporophytic tissues. In rhizomes styrylpyrones and protoflavonoides replaced flavonoids, detectable in aboveground sporophytic parts. Hydroxycinnamic acids were found in gametophytes of all examined species. The intermediate segments between underground rhizome and aboveground parts showed a gradual change in the accumulation of phenolics. Looking from the rhizome to the aboveground parts, the content of soluble styrylpyrones decreased in the same degree as the flavonoid content increased. However, hydroxycinnamic acids were detected in all examined parts with approximately equal contents. Styrylpyrones were also detected in brown pigmented spots of barren sprouts, which occurred occasionally at aboveground sporophytes. These styrylpyrones were probably induced due to wounding. In the green, not pigmented areas of these sprouts however, only flavonoids and hydroxycinnamic acids were found. The results suggested a contribution of styrylpyrones to non-specific constitutive and inducible defence mechanisms against microorganisms. Fluorescent microscopic examinations proved the vacuol storage of soluble styrylpyrones and hydroxycinnamic acids in rhizomes and gametophytes. The isolation of styrylpyrones from rhizomes of E. arvense revealed the following new structures confirmed by spectroscopic methods: 3,4-dihydroxy-6-(4´-hydroxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-b-D-glucopyranosid, 3,4-dihydroxy-6-(3´-hydroxy-4´methoxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-b-glucopyranosid. Investigations on the biosynthesis of styrylpyrones proved an enzyme-catalyzed formation of hispidin and bisnoryangonin from malonyl-CoA and hydroxycinnamoyl-CoA precursors in gametophytes of different Equisetum species as well as in rhizomes and fertile sporophytes of E. arvense. Additionally the enzymatic glycosilisation of 3-hydroxyhispidin to equisetumpyrone at gametophytes of E. arvense could be proved. Styrylpyronesynthase was detected in cell free extracts from gametophytes of Equisetum arvense. The enzyme activity was characterized in partially purified protein extracts: p-Coumaroyl-CoA was accepted as substrate at pH 6.0-9.0 in various buffer systems with the formation of bisnoryangonin (optimum enzyme activity in potassium phosphate buffer at pH 7.5-7.8, temperature optimum 37° C). Caffeoyl-CoA was accepted as substrate only in potassium phosphate buffer at pH 6.0-7.5 with formation of Hispidin (optimum enzyme activity at pH 6.8-7.0, temperature optimum 30° C). The substances sodiumascorbate at a concentration of 20 mM, bovine serum albumin (0.1 % w/V), dithiothreitol (2.5 mM) and mercaptoethanol (7 mM) increased the enzyme activity markable. The apparent Km values for the substrates caffeoyl-CoA and malonyl-CoA of 116 µM res. 141 µM were calculated, whereas for the substrates p-cumaroyl-CoA and Malonyl-CoA Km-values of 182 µM res. 238 µM were determined. The relative molecular weight of the native enzyme was determined at 78-80 kD by gel filtration methods. Using a developed protein purification method based on chromatographic techniques the styrylpyronsynthase was purified with an enrichment factor of 1107 and a yield of 0.08%. KW - Schachtelhalm KW - Styrylpyrone KW - Equisetum KW - Schachtelhalme KW - Styrylpyrone KW - Biosynthese KW - Phenole KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Proteinreinigung KW - Equisetum KW - horsetail KW - styrylpyrones KW - biosynthesis KW - phenolics KW - fluorescent microscopy KW - protein purification Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3454 ER - TY - THES A1 - Biela, Alexander T1 - Molekulare und funktionelle Charakterisierung von pflanzlichen Aquaporinen T1 - Molecular and functional characterization of plant aquaporins N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Aquaporine aus Nicotiana tabacum und Samanea saman mit molekularbiologischen Methoden analysiert und durch heterologe Expression in Oozyten von Xenopus laevis funktionell charakterisiert. Das aus Tabak isolierte Aquaporin NtAQP1 wird am höchsten in Wurzeln exprimiert, ist trotz vorhandener Cysteine nicht quecksilbersensitiv und permeabel für Glycerin und Harnstoff. Sowohl eine Ionenleitfähigkeit, als auch eine Regulation auf Proteinebene konnten im Oozytensystem nicht nachgewiesen werden. Die Leguminose Samanea saman bewegt im Tag-/Nachtrhythmus ihre Fiederblätter und -stengel. Dieses wird durch Variieren des Turgors im Flexorgewebe von Pulvini realisiert. Während SsAQP1 in seinen Charakteristika mit NtAQP1 übereinstimmt, ist SsAQP2 quecksilbersensitiv und hoch selektiv für Wasser. Der für SsAQP2 ermittelte Permeabilitätskoeffizient war um den Faktor 10 höher als der von SsAQP1. Northern Experimente zeigten, dass SsAQP2 ausschließlich im Flexorgewebe exprimiert wird. Die Expression ist zum Zeitpunkt der Streckungsbewegung des Pulvinus um 7 Uhr am stärksten. Dagegen wurde SsAQP1 zu allen untersuchten Zeitpunkten nur schwach in Pulvini exprimiert. N2 - Plant aquaporins from Nicotiana tabacum and Samanea saman were analysed with molecular techniques and functionally characterised by heterologous expression in Xenopus laevis oocytes. The tobacco aquaporin NtAQP1 is highly expressed in roots and flowers. Though it possesses several cysteines residues it is not sensitive to mercurials. Additionally NtAQP1 is permeable for glycerol and urea, but not for ions. A regulation on the protein level could not be detected. The leguminose Samanea saman moves its leaflets by bending or stretching of motor organs called pulvini. This turgor related movement is restricted to the flexor and accompanied by a high flow of water. While the characteristics of SsAQP1 resemble those of NtAQP1, SsAQP2 is sensitive to mercurials and highly selective for water. The calculated permeability coefficient of SsAQP2 was ten times higher than that for SsAQP1. Northern experiments revealed a high expression of SsAQP2 exclusively in the flexor tissue, when the pulvinus is stretching in the morning. In contrast, SsAQP1 is poorly expressed in pulvini. KW - Tabak KW - Regenbaum KW - Porin KW - Wassertransport KW - Molekularbiologie KW - Aquaporin KW - NtAQP1 KW - SsAQP1 KW - SsAQP2 KW - Glycerin KW - Quecksilber KW - Oozyten KW - Pulvini KW - aquaporin KW - NtAQP1 KW - SsAQP1 KW - SsAQP2 KW - glycerol KW - mercury KW - oocytes KW - pulvini Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3207 ER - TY - THES A1 - Siefritz, Franka T1 - Expression and Function of the Nicotiana tabacum Aquaporin NtAQP1 T1 - Expression und Funktion des Nicotiana tabacum Aquaporins NtAQP1 N2 - Die vorliegende Arbeit zeigt die Korrelation zwischen räumlichem und zeitlichem Expressionsmuster von dem Aquaporin NtAQP1 und seiner Funktion im Wasserhaushalt in planta. Immunologische in situ-Studien deuteten auf eine NtAQP1-Protein-Akkumulation in der Wurzelexodermis und -endodermis, im Cortex, in der Nähe der Leitbündel, im Xylemparenchym und in Zellen der Atemhöhle hin. Das Aquaporin wurde auch in longitudinalen Zellreihen der Petiolen in erhöhten Mengen gefunden. Expressionsstudien mit transgenen Pflanzen (Ntaqp1-Promotor::gus oder ::luc) bestätigten die NtAQP1-Akkumulation in der Wurzel, dem Spross und den Petiolen, lokalisierten dessen Expression aber auch in Pollen, Adventivwurzel und Blatthaaren. Die Ntaqp1-Expression wurde während Wachstumsprozessen wie Sprossorientierung nach Gravistimulation oder Photostimulation, Samenkeimung, aber auch während der vergleichsweise schnellen circadianen Blattbewegung induziert. Die Expression wurde weiterhin durch Phytohormone, im Speziellen durch Gibberellinsäure (GA) und osmotischen Stress stimuliert. Weitere Analysen hoben eine diurnale und sogar circadiane Expression von Ntaqp1 in Wurzeln und Petiolen hervor. Die funktionelle Analyse des Aquaporins wurde mittels reverser Genetik und biophysikalischen Studien durchgeführt. Die Antisense-Technik wurde benutzt, um die NtAQP1-Expression in Tabakpflanzen zu reduzieren. Die Antisense (AS)-Pflanzen zeigten eine starke Verringerung der Ntaqp1-mRNA, eine weniger ausgeprägte Verminderung der hoch homologen NtPIP1a-mRNA und keinen Effekt auf die Expression anderer Aquaporin-Genfamilien (PIP2, TIP). Die Funktion von NtAQP1 auf zellulärer Ebene wurde mit einer hierfür neuentwickelten Apparatur untersucht. Der experimentelle Aufbau ermöglichte die Aufzeichnung der osmotisch induzierten Protoplasten-Volumenzunahme. Die Reduktion von NtAQP1 durch die Antisense-Expression verminderte die zelluläre Wasserpermeabilität um mehr als 50 %. Die Funktion von NtAQP1 in der Gesamtpflanze wurde z.B. durch die "High-pressure flow meter" Methode bestimmt. Diese Messungen ergaben eine Reduktion der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit pro Wurzeloberflächeneinheit (KRA) der Wurzeln der AS-Linien um mehr als 50 %. Die KRA wies eine starke diurnale und circadiane Schwankung auf, mit einem Maximum in der Mitte der Lichtperiode, ähnlich dem Verlauf des Expressionsmusters von Ntaqp1 in Wurzeln. Unter gut gewässerten Bedingungen ergaben Gaswechsel-, Spross- (Ystem) und Blatt- Wasserpotenial (Yleaf)-Messungen unterschiedliche Werte in AS- und Kontrollpflanzen. In wasserlimitierender Umgebung zeigten AS-Pflanzen jedoch ein stärker negativeres Y als Kontrollpflanzen, obwohl eine weitere Abnahme der Transpiration in AS-Pflanzen beobachtet werden konnte. Quantitative Analysen belegten eine stärker ausgeprägte Welkreaktion in den AS- als in den Kontrollpflanzen. Quantitative Studien der Blattbewegung von AS- verglichen mit Kontrollpflanzen hoben eine drastische Reduktion in Geschwindigkeit und Ausmaß der Reaktion hervor. Folgende Schlussfolgerungen konnten gezogen werden. NtAQP1 wurde an Orten mit erwartet hohem Wasserfluss von und zum Apoplasten oder Symplasten exprimiert. Außerdem deuteten das spezifische Verteilungsmuster und die zeitliche Expression von NtAQP1 in Petiolen und dem sich biegenden Spross auf eine Beteiligung in der transzellulären Wasserbewegung hin. Die Reduktion von NtAQP1 durch die Antisense-Expression verringerte die zelluläre Pos. Die NtAQP1-Funktion erhöht also eindeutig die Membranwasserpermeabilität von Tabak-Wurzelprotoplasten. Die Abnahme der spezifischen hydraulischen Wurzelleitfähigkeit (KRA) befand sich in der gleichen Größenordnung wie die Verringerung der mittleren zellulären Wasserpermeabilität. Dies weist darauf hin, dass die Aquaporin-Expression essentiell für die Aufrechterhaltung der natürlichen Wurzelleitfähigkeit ist. Die Verringerung von KRA in AS -Pflanzen könnte der erste sichere Beweis dafür sein, dass der Weg der Wasseraufnahme von der Wurzeloberfläche in das Xylem den Übergang über Membranen einschließt. Die Reduktion von NtAQP1 resultierte in einem Wasserstresssignal, das ein Schließen der Stomata zur Folge hatte. NtAQP1 scheint an der Vermeidung von Wasserstress in Tabak beteiligt zu sein. NtAQP1 spielt eine essentielle Rolle bei schnellen Pflanzenbewegungen und der transzellulären Wasserverschiebung. N2 - The presented work shows the analysis of the correlation between the spatial and temporal expression pattern of NtAQP1 and its function in water relation in planta. In situ immunological studies indicated NtAQP1-protein accumulation in the root exodermis and endodermis, in the cortex, close to vascular bundles, in the xylem parenchyma and in cells of the stomatal cavities. The aquaporin was also found to be abundant in longitudinal cell-rows in the petioles. Expression studies with generated transgenic plants (Ntaqp1-promoter::gus or luc) confirmed the Ntaqp1 accumulation in the root, stem and petioles but also revealed further localization in pollen grains, adventitious roots and leaf glandular hairs. Ntaqp1-expression was induced during growth processes, like stem bending after gravistimulation or photostimulation, seed germination and hypocotyl elongation as well as during the comparatively fast circadian leaf movement. The expression was further stimulated by phytohormones, especially gibberellic acid (GA) and osmotic stress. Further analysis displayed a diurnal and even circadian expression of Ntaqp1 in roots and petioles. The functional analysis of the aquaporin was accomplished by reverse genetics and biophysical studies. The antisense technique was used to reduce NtAQP1-expression in tobacco plants. The antisense (AS) plants exhibited a severe reduction of Ntaqp1-mRNA, less reduction of the highly homologous NtPIP1a RNA and no effect on expression of other aquaporin family genes (PIP2, TIP). The function of NtAQP1 at the cellular level was investigated by a newly developed experimental setup to record the osmotically induced increase in protoplast volume. The reduction of NtAQP1 by the antisense expression decreased the overall cellular waterpermeability Pos for more than 50 %. Function of NtAQP1 at the whole plant level was e.g. measured by the “high-pressure flow meter method”. Those measurements revealed that the root hydraulic conductivity per unit root surface area (KRA) of roots from the AS-lines was reduced by more than 50 %. KRA displayed a strong diurnal and circadian variation with a maximum in the middle of the light period, similar to the expression pattern of Ntaqp1 in roots. Gas exchange-, stem (Ystem) and leaf (Yleaf) water potential measurement gave dissimilar values in AS and control plants under well-watered conditions. Under a water-limiting environment the Y of AS-plants remained at more negative water values, even though a further decrease in transpiration of AS-plants was detected. Quantitative analysis displayed a much stronger wilting reaction in the AS than in the control plants. Quantitative studies of the leaf movement in AS compared to control plants exhibited a dramatic reduction in velocity and also in the extent of the process. The following conclusions can be drawn. NtAQP1 was expressed at sites of anticipated high water fluxes from and to the apoplast or symplast. Additionally, the specific distribution pattern and temporal expression of NtAQP1 in petioles and the bending stem strongly indicate a role in transcellular movement of water. The reduction of NtAQP1 by the antisense expression decreased the overall cellular Pos. Conclusively, NtAQP1-function increases membrane water permeability of tobacco root protoplasts. The decrease of the specific root hydraulic conductivity (KRA) was in the same order of magnitude as the mean cellular water permeability reduction, indicating that aquaporin expression is essential in maintaining a natural root hydraulic conductance. Reduction of KRA in AS plants might be the first definitive proof that the pathway of water uptake from the root surface to the xylem involves passage across membranes. The absence of NtAQP1 resulted in a water stress signal, causing a certain stomatal closure. NtAQP1 seems to contribute to water stress avoidance in tobacco. NtAQP1 plays an essential role in fast plant movements and transcellular water shift. KW - Tabak KW - Aquaporine KW - Aquaporin KW - Tabak KW - Antisense KW - Wasserpermeabilität KW - Stress KW - Aquaporin KW - tobacco KW - antisense KW - waterpermeability KW - stress Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3053 ER - TY - THES A1 - Woitke, Markus T1 - Artenkombination, Etablierungsstadium und anthropogenes Störungsregime als Einflußfaktoren auf die Bestandsentwicklung der invasiven Brassicaceae Bunias orientalis L. und Rorippa austriaca (Crantz)Besser in experimenteller Vegetation T1 - Species composition, life stage composition and anthropogenic disturbance regime as determinating factors of stand development of two invasive Brassicaceae Bunias orientalis L. and Rorippa austriaca (Crantz)Besser in experimental vegetation N2 - Einerseits werden anthropogene Störungen oft genannt, um erfolgreiche Invasionen von invasiven Organismen in ihren neuen Arealen zu erklären. Andererseits sind gängige Theorien pflanzlicher Invasionen häufig für ihren limitierten erklärenden und voraussagenden Wert kritisiert worden, hauptsächlich aus Gründen der ökologisch komplexen Zusammenhänge, die Invasionen zu Grunde liegen. Die ökologische Komplexität eines andauernden Invasionsprozesses zweier invasiver Brassicaceen berücksichtigend, wurde diese Studie durchgeführt, um experimentell die wichtigsten Faktoren zu bestimmen, die den an Feldstandorten zu beobachtenden variablen Dominanz-Mustern der Arten im Vergleich zu vergesellschafteten indigenen Arten zugrunde liegen. Das Vorkommen, die relative Häufigkeit und die Dynamik der genannten Arten in spontanen Beständen stand daher im Zentrum dieser Arbeit. Ziel der Arbeit war es, auf der Basis des erlangten Verständnisses der funktionellen Ökologie der Kodominanzgesellschaften Vorhersagen zum gegenwärtig fortschreitenden Invasionsprozeß zu machen. Die Bestandsentwicklung (Wachstum und Fitneß) der zwei invasiven Arten wurde in Abhängigkeit unterschiedlicher Artenkombination, Etablierungsstadium und anthropogenem Störungsregime in experimenteller Vegetation untersucht. Diese Untersuchungen sind von unmittelbarer Bedeutung für das untersuchte System, weil eine möglichst 'naturgetreue' Artenvergesellschaftung an einem geeigneten Standort gewählt wurde. Darüber hinaus sollte durch die Dauer des Experiments (3 volle Vegetationsperioden) vermieden werden, daß es zu Fehleinschätzungen von Bestandsentwicklungsdynamiken kommt, die aus zu kurzen Beobachtungszeiträumen resultieren können und für prädiktive Aussagen bedeutungslos sind. Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Fragen und Hypothesen waren: (?) Werden die invasiven relativ zu den indigenen Arten durch Störungsmanagements gefördert? Führt wiederholte Störung zu einer Verstärkung der Effekte über die Zeit? (!) Hypothese: Die invasiven können relativ zu den indigenen Arten unter dem Einfluß von Störungsmanagements profitieren, wobei die Unterschiede mit der Zeit stärker werden. (.)Die Hypothese wird durch die Ergebnisse bestätigt. Kumulative, durch wiederholte Störungen verursachte Effekte, fördern die Invasiven relativ zu den Indigenen. (?) Unterscheiden sich die unterschiedlichen Störungsregime in ihren Effekten voneinander? (!) Hypothese: Beide invasive Arten reagieren in ähnlicher Weise. Eine zunehmende Störungsintensität (P>M2>M1>K) verstärkt die Effekte. (.)Diese Hypothese wird durch die Ergebnisse teilweise bestätigt. Insgesamt gesehen werden die Invasiven durch eine zunehmende Intensität der Störung stärker gefördert. Allerdings unterscheiden sich die beiden Arten in ihrer Reaktion auf unterschiedliche Störungen erheblich. B. orientalis profitierte nur mäßig, sowohl von Mahd als auch von Bodenabtragung. R. austriaca dagegen wurde von Mahd eher beeinträchtigt und profitierte sehr stark von Bodenabtragung. (?) Wie wirken sich Variationen in der Zusammensetzung von Etablierungsstadien zu Beginn einer Bestandsentwicklung aus? (!)Hypothese: Ein Entwicklungsvorsprung, i.a. ein weiter fortgeschrittenes Etablierungssstadium im Vergleich zu den vergesellschafteten Indigenen, sollte für die Invasiven von Vorteil sein. Im Falle, daß beide Gruppen durch gleiche Etablierungsstadien vertreten sind, sollte die Etablierung aus juvenilen Stadien vorteilhafter sein als jene aus adultem Pflanzenmaterial, weil angenommen wird, daß invasive Arten hohe anfängliche Wachstumsraten juveniler Stadien aufweisen. (.) Auch diese Hypothese kann durch die Ergebnisse nur teilweise bestätigt werden. Ein Etablierungsvorsprung ist für die Invasiven nur zu Beginn der Bestandsentwicklung bedeutend. Darüber hinaus profitiert R. austriaca relativ stärker von der Regeneration aus adultem Pflanzenmaterial. Zurückzuführen ist das auf das enorme Potential dieser Art, aus fragmentierten Pflanzen erfolgreich zu regenerieren. (?) Haben unterschiedliche Artenkombinationen einen Einfluß auf die Reaktion der Invasiven auf die unterschiedlichen Störungsregime und Etablierungsstadien? (!) Hypothese: Ein Unterschied in der Reaktion wird erwartet, aber keine Veränderung der wesentlichen Muster. (.) Der Austausch einer Art (funktioneller Ökotyp) der fünf (sechs) vergesellschafteten Arten in experimenteller Vegetation hatte einen stärkeren Effekt auf die Ergebnisse als erwartet. Es zeigt sich, daß die An- oder Abwesenheit eines funktionellen Ökotyps dafür verantwortlich ist, ob die invasive Art in ihrer Bestandsentwicklung prosperiert oder beeinträchtigt wird. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Invasiven schwache Konkurrenten sind, aber von anthropogener Störung opportun profitieren. Ihre Entwicklung in den weit verbreiteten 'Co-Dominanzgesellschaften', welche Betrachtungsgegenstand dieser Untersuchung waren, hängt eindeutig mit allen vier untersuchten Faktoren zusammen und ist von diesen abhängig: Artidentität, Art der Störung, Etablierungsstadium und Artkombination. Die Effekte dieser Faktoren interagieren in komplexer Art und Weise. Zieht man die gegenwärtige Art der Landnutzung in der Region in Betracht, muß davon ausgegangen werden, daß beide Arten in mäßig bis stark gestörten krautigen Gesellschaften mit ausreichender Nährstoffversorgung weiter zunehmen werden. Der Invasionserfolg von R. austriaca wird stärker von Bodenstörung und Bodentranslokation abhängen, während für B. orientalis zu erwarten ist, daß sie vor allem an gemähten Standorten mit nicht zu dichtem Bestand an Gräsern weiter expandieren wird. N2 - On the one hand anthropogenic disturbance is often adressed explaining successful invasions of non-indigenous species in their new locations. On the other hand current theories of plant invasion have been criticized for their limited heuristic and predictive value for different reasons referring to their ecological complexity. Including the ecological complexity of an ongoing invasion process of two invasive Brassicaceae, the purpose of this study was to analyse experimentally the most important factors that determine the varied dominance patterns of the invasives as compared to the co-occurring indigenous species that can be observed in the field. Therefore, this study focused on the occurrence, the relative abundance and dynamics of the species in spontaneous stands. The main objective was to predict the further invasion process of the neophytes based on an understanding of the functional ecology of the surveyed co-dominance stands. The development of the stands (growth and fitness) of the two invasives, B. orientalis and R. austriaca, was examined in experimental vegetation in dependence on species association, life stage composition and anthropogenic disturbance regime. These investigations are directly relevant for evaluating the processes in spontaneous field stands that are composed of the same species. The experiment was run over a period of 3 years to avoid misinterpretations by premature results. The underlying questions and hypotheses of this study and the corresponding results were: (?) Do the invasive species profit from anthropogenic disturbance regimes relative to the indigenous species? Do repeated disturbances add up in their effects (cumulative effects)? (!) Hypothesis: the invasive species do profit from disturbances relative to the indigenous species and the differences between the groups will increase if disturbances are repeated. (.) This hypothesis is confirmed by the results. Cumulative effects by repeated distur-bances promote the invasives relative to the indigenous. (?) Do the different disturbance regimes differ from each other in their effects? (!) Hypotheses: both invasive species will benefit in a similar way. A higher disturbance intensity (P>M2>M1>K) will strengthen the effects. (.) These hypotheses are only partly confirmed by the results. On the whole, increased disturbance intensity had a stronger beneficial effect on the invasives. Still, the two species differed strikingly with respect to their response to the various treatments. Whereas B. orientalis profited only moderately by both mowing and soil disruption, R. austriaca rather suffered from mowing but was greatly benefitted by soil disruption. (?) What is the effect of variations in the composition of life stages at the beginning of stand development? (!) Hypotheses: a head start, i.e. an advanced life stage relative to the co-occurring indigenous, should be advantageous for the invasive species. In case both groups co-occur in the same life stage, stand initiation by juveniles should favour the invasives over stand initiation by regeneration of adult plant material because invasive species are supposed to have rapid initial growth. (.) Again, these hypotheses are only partly confirmed by the results. A head start is important for the development of the invasive species, at least initially. However, at least R. austriaca appears to profit relatively more from regeneration by adult plant material. This is due to the enormous regeneration Potential of fragmented plants. (?) Are the responses of the invasive species to the different disturbance regimes and life stage compositions dependent on the association of co-occurring indigenous species? (!) Hypothesis: the responses may vary somewhat but there will be no changes in the major patterns. (.) An exchange of one species (functional type) out of the five (six) species mixed in the experimental stands had a more pronounced effect on the outcome of the results than expected. It appears that the presence or absence of just one functional type (species) in a stand can determine whether the invasive species can thrive under the given site conditions or whether it will be impaired in its development. In sum, the results show that the two invasive species are weak competitors but profit opportunistically from anthropogenic disturbance. Their development in the widespread 'co-dominance stands' that were in the focus of this study is clearly related to and dependent on all four investigated factors, species identity, type of disturbance, life stage composition and species association. The effects of these factors may interact in a complex way. In general, given the present situation of land use in the region, the results suggest that both species will further advance their presence in moderately to intensively disturbed forb communities at sites with sufficient nutrient availability. Invasion success of R. austriaca will be more dependent on soil disruption, transport and deposition while B. orientalis is expected to particularly expand at mown sites that do not have dense cover by meadow grasses. KW - Österreichische Sumpfkresse KW - Morgenländisches Zackenschötchen KW - Invasion KW - Vegetationsentwicklung KW - Anthropogener Einfluss KW - Bunias orientalis KW - Rorippa austriaca KW - Invasive KW - Artenkombination KW - Etablierungsstadium KW - Anthropogene Störung KW - experimentelle Vegetation KW - species composition KW - successional stage KW - anthropogenic disturbance KW - experimental vegetation KW - alien KW - non-indigenous KW - invasive Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2500 ER - TY - THES A1 - Werner, Monika T1 - Molekulare Charakterisierung der Reaktion von Lycopersicon esculentum auf den phanerogamen Parasiten Cuscuta reflexa T1 - Molecular characerisation of the tomato reaction against the phanerogamic parasite Cuscuta reflexa N2 - In der inkompatiblen Interaktion von Lycopersicon esculentum und Cuscuta reflexa wird die Ausbildung von Haustorien, spezieller Organe, die der Nahrungsaufnahme durch den Parasiten dienen,bereits in einem sehr frühen Stadium der Infektion gehemmt. Um einen Einblick in die Regulationsmechanismen der Tomatenreaktion zu gewinnen, wurde eine Subtraktive Hybridisierung durchgeführt und es konnten 20 Gene identifiziert werden, deren Transkripte nach Cuscuta-Befall im Wirtsgewebe akkumulieren. Entsprechend ihrer möglichen Proteinfunktion lassen sich die mRNAs verschiedenen Bereichen der Tomatenreaktion im Infektionsprozess zuordnen: (a) Abwehr-assoziierte Proteine, (b) Signaltransduktionsassoziierte Proteine, (c) Zellstreckungsassoziierte Proteine und (d) Proteine mit bislang vollständig unbekannter Funktion. Einige der identifizierten mRNAs wurden durch Northern Analysen näher charakterisiert. Da eine der mRNAs eine mögliche Xyloglucanendotransglycosylase (XET) kodiert, wurde die XET-Aktivität im Tomatengewebe nach Infektion bestimmt. Außerdem wurde der Einfluß des Phytohormons Auxin auf die Akkumulation der Xyloglucanendotransglycosylase LeEXT1 sowie des Aquaporins LeAqp2 untersucht. Trotz auxinregulierter Transkription nach Cuscuta-Befall zeigte die auxininsensitive Tomatenmutante diageotropica im Vergleich zum Wildtyp keine veränderte Kompatibilität. N2 - The resistant host tomato prevents the development of haustoria, specialised parasitic organs for the uptake of water and assimilates, at early stages of infection with the phanerogamic parasite Cuscuta reflexa. In order to elucidate molecular mechanisms involved in tomato response to the attack by Cuscuta reflexa a suppressive subtractive hybridisation technique was used thereby identifying genes expressed following parasitic attachment. The twenty cDNA clones obtained represent mRNAs which possibly encode proteins of several functions during the infection process: (a) defence-related proteins, (b) proteins involved in signal transduction, (c) cell expansion-associated proteins, and (d) proteins with so far unknown function. Of these clones initially identified to have elevated transcript levels within 12 hours after onset of infection, several were further characterised by Northern analysis. One of the genes identified encode a putative xyloglucan endotransglycosylase (XET). The XET activity in tomato tissue was estimated following parasitic onset. After auxin treatment, both the xyloglucan endotransglycosylase LeEXT1 and the aquaporin LeAqp2 mRNA showed elevated transcript levels in cortical cells of tomato stems suggesting a potential in auxin-mediated cell expansion which occurred after parasitic attack. Analysis of the auxin insensitive tomato mutant diageotropica indicated no changes in the degree of compatibility in comparison to the wildtyp. KW - Tomate KW - Cuscuta reflexa KW - Wirt KW - Parasit KW - Genexpression KW - Indonylessigsäure <3-> KW - Molekularbiologie KW - Inkompatible Parasit-Wirt-Interaktion KW - Lycopersicon esculentum KW - Cuscuta reflexa KW - Subtraktive Hybridisierung KW - Auxin KW - Incompatible parasite-host interaction KW - Lycopersicon esculentum KW - Cuscuta reflexa KW - Subtractive hybridisation KW - auxin Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2462 ER - TY - THES A1 - Stuntz, Sabine T1 - The influence of epiphytes on arthropods in the tropical forest canopy T1 - Der Einfluss von Epiphyten auf Arthropoden in tropischen Baumkronen N2 - The understanding of the mechanisms underlying the establishment and maintenance of the extraordinary biodiversity in tropical forests is a major challenge for modern biology. In this context, epiphytes are presumed to play an important role. To investigate the biological reality of this persistent yet insufficiently investigated notion, I conducted the present study. The main questions I intended to clarify were: (1) do epiphytes affect arthropod abundance and diversity in tropical tree crowns? and (2) what might be the driving forces behind this potential influence? I studied the arthropod fauna of 25 tree crowns bearing different epiphyte assemblages, and the resident fauna of 90 individual epiphytes. I also quantified the mitigating influence of epiphytes on the microclimate in tree crowns. In total, more than 277,000 arthropods were collected and about 700 morphospecies determined. Epiphytes had a significant moderating influence on canopy microclimate (Chapter 3), both at various microsites within a tree crown and among tree crowns with different epiphyte growth. On hot dry season days, they provided microsites with lower temperatures and reduced evaporative water loss compared to epiphyte-free spaces within the same tree crown. Quantitative sampling of the arthropods inhabiting three different epiphyte species provided compelling evidence for the specificity of epiphyte-associated faunas (Chapter 4). Epiphytes proved to be microhabitats for a diverse and numerous arthropod fauna, and different epiphyte species fostered both taxonomically and ecologically very distinct arthropod assemblages: among epiphyte hosts, the inhabitant faunas showed remarkably little species overlap, and guild composition differed strongly. In the subsequent chapters I investigated if this pronounced effect scaled up to the level of entire tree crowns. Arthropods were captured with three different trap types to obtain an ample spectrum of the canopy fauna (Chapter 2). Four tree categories were classified, three of which were dominated by a different species of epiphyte, and an epiphyte-free control group. On a higher taxonomic level, there were no detectable effects of epiphytes on the fauna: the ordinal composition was similar among tree categories and indifferent of the amount of epiphytes in a tree crown (Chapter 5). I examined three focal groups (ants, beetles and spiders) on species level. The diversity and abundance of ants was not influenced by the epiphyte load of the study trees (Chapter 6). Although many species readily used the epiphytes as nesting site and shelter, they seemed to be highly opportunistic with respect to their host plants. Likewise, the species richness and abundance of beetles, as well as their guild composition were entirely unaffected by the presence of epiphytes in the study trees (Chapter 7). Focusing on herbivorous beetles did not alter these results. Spiders, however, were strongly influenced by the epiphyte assemblages of the host trees (Chapter 8). Overall spider abundance and species richness did not differ among trees, but particular families and guilds exhibited marked differences in abundance between the tree categories. Most remarkable were the substantial differences in spider species composition across trees with different epiphyte assemblages. Conclusion Thus, the prevalent notion that epiphytes positively influence arthropod diversity in tropical canopies seems justified, but not without reservation. Whether an influence of epiphytes on the fauna was discernible depended greatly on (1) the scale of the investigated system: clear faunal distinctions at the microhabitat level were absent or much more subtle at the level of tree crowns. (2) the focal taxa: different arthropod orders allowed for completely different statements concerning the importance of epiphytes for canopy fauna. I therefore recommend a multitaxon approach for the investigation of large-scale ecological questions. In conclusion, I resume that epiphytes are associated with a species-specific inhabiting fauna,and that epiphytes impose an influence on certain, but not all, taxa even at the level of entire tree crowns. Although I could only hypothesize about the potential causes for this influence, this study provided the first comprehensive investigation of the role of epiphytes in determining arthropod abundance and diversity in tropical tree crowns. N2 - Eines der zentralen Themen der modernen Biologie ist die Erforschung der Ursachen für die außerordentlich hohe Biodiversität tropischer Regenwälder. In diesem Zusammenhang wird den Epiphyten häufig eine bedeutsame Rolle zugeschrieben. In der vorliegenden Studie sollte diese gängige aber unzulänglich belegte Vorstellung erforscht werden. Zwei Fragen standen dabei im Mittelpunkt: (1) Beeinflussen Epiphyten den Arten- und Individuenreichtum in tropischen Baumkronen? (2) Was könnten die treibenden Kräfte für diesen potentiellen Einfluss sein? Um diesen Fragen auf den Grund zu gehen, erforschte ich die Arthropodenfaunen von 25 Baumkronen mit verschiedenem Epiphytenbewuchs, sowie die Zönosen im Inneren von 90 einzelnen Epiphyten. Darüber hinaus quantifizierte ich den mildernden Einfluss von Epiphyten auf das Mikroklima in Baumkronen. Insgesamt wurden mehr als 277.000 Arthropoden gesammelt und ca. 700 Arten (Morphospezies) bestimmt. Die Untersuchungen bestätigten den mäßigenden Einfluss von Epiphyten auf die extremen mikroklimatischen Verhältnisse der Baumkronen (Kapitel 3). An heißen Tagen der Trockenzeit waren in der unmittelbaren Umgebung von Epiphyten deutlich niedrigere Temperaturen sowie geringerer evaporativer Wasserverlust zu verzeichnen, verglichen mit exponierten Mikro-Standorten in derselben Baumkrone. Die quantitative Erfassung der Arthropoden, die verschiedene Epiphyten bewohnten, belegte klar die Spezifität der epiphyten-assoziierten Fauna (Kapitel 4). Epiphyten erwiesen sich als Mikrohabitate für eine diverse und individuenreiche Arthropodengesellschaft. Die Zönosen verschiedener Arten von Epiphyten unterschieden sich erheblich in ihrer Arten- und Gildenzusammensetzung. Parallel dazu erforschte ich, ob sich solchermaßen starke Effekte der epiphytischen Flora auch auf dem Niveau ganzer Baumkronen weiterverfolgen ließen. Arthropoden wurden mittels verschiedener Fallentypen gesammelt, um ein möglichst breites Spektrum der Kronenfauna zu erhalten (Kapitel 2). Ich teilte die Untersuchungsbäume in drei Kategorien mit jeweils unterschiedlichem Epiphytenbewuchs ein und in eine vierte, epiphyten-freie Kontrollgruppe. Auf höherem taxonomischen Niveau ließen sich keinerlei Effekte der Epiphyten auf die Fauna nachweisen (Kapitel 5): die ordinale Zusammensetzung der Arthropoden zeigte sich unabhängig vom Epiphytenbewuchs. Drei Tiergruppen (Ameisen, Käfer und Spinnen) wurden des Weiteren auf Artebene untersucht. Diversität und Abundanz der Ameisen blieben unbeeinflusst vom Epiphytenbewuchs der Bäume (Kapitel 6). Obwohl viele Ameisenarten die Epiphyten als Niststandort und Rückzugsort beanspruchten, schienen sie in Bezug auf ihre Wirtspflanzen eher opportunistisch zu sein. Ebenso waren Diversität, Häufigkeit und Gildenzusammensetzung der Käfer unabhängig von den Epiphyten in den untersuchten Baumkronen (Kapitel 7). Die gesonderte Betrachtung der phytophagen Käfer änderte nichts an diesen Resultaten. Spinnen jedoch wurden deutlich beeinflusst vom Epiphytenbewuchs der Bäume (Kapitel 8). Sowohl auf der Ebene einzelner Familien als auch auf Gilden- und Artniveau waren signifikante Unterschiede zwischen den Kategorien zu verzeichnen. Bemerkenswert war vor allem die unterschiedliche Artenzusammensetzung der Spinnengemeinschaften in Bäumen mit verschiedenem Epiphytenbewuchs. Fazit Die Hypothese, Epiphyten würden die Arthropodendiversität tropischer Baumkronen positiv beeinflussen, scheint gerechtfertigt, allerdings nicht ohne Vorbehalt. Die genannten Ergebnisse ließen zwei Haupttendenzen feststellen. Ob ein Effekt der Epiphyten auf die Fauna erkennbar ist hing ab von 1) dem Maßstab des Untersuchungssystems. Der klare Einfluss der Epiphyten auf Mikrohabitat-Niveau war auf dem Niveau ganzer Baumkronen nicht mehr nachweisbar oder wesentlich schwächer ausgeprägt. 2) den untersuchten Tiergruppen. Verschiedene Tiergruppen ließen sehr unterschiedliche Schlussfolgerungen in bezug auf den Einfluss der Epiphyten auf die Kronenfauna zu. Epiphyten sind mit einer artspezifischen Arthropodenfauna assoziiert, und beeinflussen darüber hinaus einige Tiergruppen auch auf der Ebene ganzer Baumkronen. Die Mechanismen dieser Wirkungen blieben weitgehend unerklärt, und aus meinen Ergebnissen und Hypothesen ergaben sich viele Fragen, die näher erforscht werden müssten. Dennoch ist durch diese Studie zum ersten Mal die Bedeutung von Epiphyten für den Arten- und Individuenreichtum von Arthropoden in tropischen Baumkronen umfassend untersucht worden. KW - Tropischer Regenwald KW - Epiphyten KW - Gliederfüßer KW - Baumkrone Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179126 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Gerold T1 - Plant size and intraspecific variability in vascular epiphytes T1 - Pflanzengröße und intraspezifische Variabilität bei vaskulären Epiphyten N2 - A central objective of many ecophysiological investigations is the establishment of mechanistic explanations for plant distributions in time and space. The important, albeit mostly ignored, question arises as to the nature of the organisms that should be used as representative in pertinent experiments. I suggest that it is essential to use a “demographic approach” in physiological ecology, because physiological parameters such as photosynthetic capacity (PC, determined under non-limiting conditions with the oxygen electrode) may change considerably with plant size. Moreover, as shown for nine epiphyte species covering the most important taxonomic groups, the intraspecific variability in PC was almost always higher than the interspecific variability when comparing only large individuals. In situ studies with the epiphytic bromeliad V. sanguinolenta revealed that besides physiological parameters (such as PC) almost all morphological, anatomical and other physiological leaf parameters studied changed with plant size as well. Likewise, important processes proved to be size-dependent on whole-plant level. For example, long-term water availability was clearly improved in large specimens compared to smaller conspecifics due to the increased efficiency of the tanks to bridge rainless periods. As model calculations on whole-plant level for V. sanguinolenta under natural conditions have shown photosynthetic leaf carbon gain as well as respiratory losses of heterotrophic plant parts scaled with plant size. The resulting area related annual carbon balances were similar for plants of varying size, which corresponded to observations of size-independent (and low) relative growth rates in situ. Under favorable conditions in the greenhouse, however, small V. sanguinolenta exhibited surprisingly high relative growth rates, similar to annuals, which clearly contradicts the prevalent, but barely tested notion of epiphytes as inherently slow growing plants and simultaneously illustrates the profound resource limitations that epiphytes are subjected to in the canopy of a seasonal rain forest. From habitat conditions it seems that size-related differences in water availability are the driving force behind the observed size-dependent ecophysiological changes: the larger an epiphyte grows the more independent it is with regard to precipitation patterns. In conclusion, the results strongly emphasize the need to treat plant size as an important source of intraspecific variability and thus urge researchers to consider plant size in the design of ecophysiological experiments with vascular epiphytes. N2 - Eines der Hauptziele zahlreicher ökophysiologischer Studien ist eine mechanistische Erklärungen für Pflanzenverteilungen in Raum und Zeit. Eine für diese Zielsetzung zentrale Frage, nämlich nach den Pflanzen, die in entsprechenden Experimenten als Repräsentanten einer Art verwendet werden sollen, wurde bisher allerdings meist vernachlässigt. Den Resultaten dieser Dissertation folgend, ist bei Arbeiten mit vaskulären Epiphyten eine „demographische Herangehensweise“ auch für Belange der Ökophysiologie notwendig, da sich z.B. physiologische Parameter wie Photosynthesekapazität (PC, unter nicht limitierenden Bedingungen in der Sauerstoffelektrode gemessen) regelhaft mit der Pflanzengröße änderten. Darüber hinaus war die intraspezifische Variabilität von PC meist höher als zwischenartliche Unterschiede, wie für neun Epiphyten aus den wichtigsten taxonomischen Gruppen gezeigt wurde. In situ Studien mit der epiphytischen Tankbromelie Vriesea sanguinolenta ergaben, dass sich neben physiologischen Parametern wie PC fast alle untersuchten morphologischen, anatomischen und anderen physiologischen Blattparameter mit der Pflanzengröße ändern. Auch auf der Ebene gesamter Pflanzen erwiesen sich wichtige Prozesse als stark größenabhängig. Zum Beispiel war die Wasserverfügbarkeit aufgrund einer steigenden Effizienz der Wassertanks für große Individuen deutlich verbessert gegenüber kleineren Artgenossen. Desweiteren ergaben Modellberechnungen für V. sanguinolenta unter natürlichen Bedingungen, dass der photosynthetischen Kohlenstoffgewinn der Blätter, ebenso wie Respirationsverluste heterotropher Organe regelhaft mit der Pflanzengröße anstiegen. Die resultierenden Blattflächen bezogenen Jahreskohlenstoffbilanzen waren für Pflanzen verschiedener Größen ungefähr gleich, was Beobachtungen von größenunabhängigen (und niedrigen) relativen Wachstumsraten in situ entsprach. Unter günstigen Bedingungen im Gewächshaus stiegen die relativen Wachstumsraten kleiner V. sanguinolenta auf ein überraschend hohes Niveau, vergleichbar dem von terrestrischen, anuellen Pflanzen. Dies widerspricht klar der gängigen, aber kaum belegten Vorstellung von Epiphyten als inherent langsam wachsende Organismen und zeigen gleichzeitig auf, dass Epiphyten im Kronenraum eines saisonalen Regenwaldes aufgrund erheblicher Ressourcenlimitierung ihr Wachstumspotential bei weitem nicht ausschöpfen können. Von den Habitatsbedingungen scheint der systematische Unterschied in der Wasserverfügbarkeit bei verschieden großen Artgenossen die treibende Kraft für die beobachteten größenabhängigen Veränderungen zu sein: Je größer eine Pflanze wird, desto weniger wird sie von unterschiedlichen Niederschlagsmustern beeinflusst. Die Ergebnisse verdeutlichen den nachhaltigen Einfluss von Pflanzengröße auf die intraspezifische Variabilität ökophysiologischer Parameter und unterstreichen somit die Dringlichkeit Pflanzengröße in experimentellen Designs von ökophysiologischen Studien mit vaskulären Epiphyten zu integrieren. KW - Gefäßpflanzen KW - Epiphyten KW - Autökologie KW - Pflanzenwachstum KW - Pflanzengröße KW - Epiphyten KW - Ökophysiologie KW - Photosynthese KW - Wasserhaushalt KW - plant size KW - epiphytes KW - ecophysiology KW - photosynthesis KW - water relations Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2000 ER - TY - THES A1 - Scheerer, Jochen T1 - Untersuchungen zum Einfluss exogener und endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von Pilocarpus microphyllus Stapf ex Wardleworth unter natürlichen Bedingungen N2 - Mit dieser Arbeit sollten, vor anwendungsbezogenem Hintergrund, die Einflüsse endogener und exogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von P. microphyllus Stapf unter natürlichen Bedingungen untersucht werden. Die Bestimmung der Pilocarpingehalte der entsprechenden Proben erfolgte mit Hilfe von HPLC –Analysen der, zuvor durch Festphasenextraktion aufgereinigten, Pflanzenextrakte. Mit dem Ziel, Pflanzenmaterial gleicher genetischer Herkunft untersuchen zu können, wurde versucht, die Pflanzen über Keimlinge und Sprosstecklinge zu vermehren. Während erstere Versuche zu Keimraten von bis zu mehr als 80 Prozent führten, blieben die Bemühungen einer Stecklingsvermehrung trotz unterschiedlicher Ansätze erfolglos. Im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Einfluß endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt in den Blättern, wurden vegetative Merkmale (Blüten, Knospen, Früchte und Blattaustriebe) den jeweiligen Gehalten gegenübergestellt. In einem Zeitraum von zehn Monaten konnten bei keiner der Versuchspflanzen ein Zusammenhang zwischen dem jeweiligen vegetativen Zustand und der Menge an Pilocarpin in den Blättern festgestellt werden. Während der vegetative Zustand von P.microphyllus Stapf keine offensichtlichen Auswirkungen auf den Pilocarpingehalt der Blätter hatte, ergaben die Versuchsreihen zum Blattalter einen deutlichen Einfluß dieses endogenen Faktors. In zahlreichen Analysen konnte gezeigt werden, daß junge Blätter durchschnittlich 70 Prozent mehr Pilocarpin enthalten als alte Blätter der jeweils selben Pflanze. Pilocarpin wurde in unterschiedlichen Konzentrationen in allen Teilen von P. microphyllus Stapf nachgewiesen. In Langzeitbeobachtungen über den Zeitraum eines Jahres, konnten in allen Fällen Schwankungen im Pilocarpingehalt der Blätter beobachtet werden. Bis auf eine Ausnahme verliefen diese Änderungen nach einem ähnlichen Muster, welches sich jedoch nicht mit klimatischen Faktoren in einen logischen Zusammenhang bringen ließ. Als ein exogener Faktor mit deutlichem Einfluß auf den Pilocarpingehalt der Blätter, wurden die Strahlungsverhältnisse identifiziert. Bei vergleichenden Analysen von Versuchspflanzen, welche in einem Schattenbeet wuchsen, mit solchen, die der vollen Sonneneinstrahlung ausgesetzt waren, wurde deutlich, daß die Schattenpflanzen durchschnittlich etwa 37 Prozent mehr Pilocarpin enthielten. In einem Düngungsversuch konnte gezeigt werden, daß sich die Nährstoffversorgung entscheidend auf den Pilocarpingehalt auswirken kann. Nach dreimaliger Zugabe eines Düngers, welcher vor allem die Phosphat- und Kaliumversorgung der Pflanzen verbesserte, wurden Mengen an Pilocarpin gefunden, welche um bis zu knapp 300 Prozent über den Werten vor der Düngung lagen. Experimente mit unterschiedlichen Methoden zur Trocknung von geernteten Pilocarpusblättern ergaben, daß die Art der Trocknung einen entscheidenten Einfluß auf den Gehalt an Pilocarpin in den Blättern nach der Ernte hat. Unter günstigen Lagerbedingungen konnten Pilocarpusblätter für mindestens ein Jahr ohne größere Verluste an Pilocarpin aufbewahrt werden. Im Laufe dieser Arbeit ergaben sich aus den Chromatogramspektren der verschiedenen Analysen Hinweise auf verschiedene, möglicherweise chemische, Varietäten innerhalb der Art P.microphyllus Stapf. N2 - In this dissertation the influence of endogenous and exogenous factors that possibly affect on the content of Pilocarpine in P. microphyllus Stapf under natural conditions has been analyzed. An HPLC method was developed to determine the content of Pilocarpine in respective plant extracts, which had been conditioned previously by solid phase extraction. To obtain genetically identical plant material, attempts were made to propagate plants by seedlings and stem-cuttings. The seedling experiments resulted in germination rates of more than 80 per cent, meanwhile various cutting attempts did not lead to any success. In studies regarding the influence of endogenous factors on the content of Pilocarpine in the leaves, vegetative features (flowers, buds, and fruits) were compared with the respective Pilocarpine contents. During a 10 months observation period no correlation could be determined between the vegetative characteristics and the content of Pilocarpine. Unlike vegetative features, the age of the leaves was determined as an endogenous factor with a significant influence on the Pilocarpine content. In numerous analyses it could be shown that young leaves contain in average 70 per cent more Pilocarpine than old ones of the same plant. Pilocarpine was found in all parts of P. microphyllus Stapf. In observations made during a period of time of one year, fluctuations of the Pilocarpine content in the leaves were found in all cases. Besides one exception, those fluctuations showed a similar pattern. However, no correlation with climatic factors could be found. Radiation conditions were identified as an external factor with significant influence on the Pilocarpine content of the leaves. In analysis comparing leaves of plants growing in full sunlight and those growing under shade, the average content of Pilocarpine of the latter was 37 per cent higher. In an experiment with a fertilizer it could be shown that the nutrient supply has a significant importance on the Pilocarpine content. After a three times application of a fertilizer, which mainly improved the phosphate and potassium supply of the plants, up to 300 per cent more Pilocarpine was found compared with contents before the application. Experiments with different drying techniques of harvested leaves revealed that the applied drying method has a decisive influence on the Pilocarpine content of the leaves. Under suitable conditions it has been possible to store dried Pilocarpus leaves for at least one year without important loss in Pilocarpine. Based on the chromatograms obtained during this dissertation, indications for different, possibly chemical, varieties of the species P.microphyllus Stapf were revealed. KW - Parna´iba KW - Pilocarpus microphyllus KW - Pilocarpin KW - Jaborandi KW - Pilocarpus KW - Pilocarpin KW - Glaukom KW - Xerostomia KW - Jaborandi KW - Pilocarpus KW - pilocarpine KW - glaucoma KW - xerostomia Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181463 ER - TY - THES A1 - Imbusch, Ruth T1 - Phytoprostane F1 T1 - Phytoprostanes F1 N2 - Isoprostane F2 sind Autoxidationsprodukte der Arachidonsäure, die über radikal-katalysierte Oxidation entstehen. Bei einigen Erkrankungen im Tier konnte gezeigt werden, daß die Konzentration von Isoprostanen F2 mit dem verstärkten Vorkommen von freien Radikalen korreliert, weshalb Isoprostane heute als Marker des oxidativen Streß genutzt werden. Darüber hinaus weisen einige Isoprostane eine biologische Aktivität auf, weshalb sie heute als Signalstoffe des oxidativen Streß im Tier diskutiert werden. Pflanzen hingegen können keine Isoprostane F2 synthetisieren, da ihnen der Precursor Arachidonsäure fehlt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß analog zu den Isoprostanen F2 Phytoprostane F1 in Pflanzen aus Linolensäure gebildet werden. Hierfür wurden HPLC- und Gaschromatographie-Massenspektroskopie-Methoden entwickelt, die eine Quantifizierung von Phytoprostanen F1 in Pflanzen ermöglichten. In frischen Pflanzenorganen wurden Phytoprostane F1 sowohl in freier als auch in veresterter Form detektiert. Darüber hinaus stieg die Konzentration sowohl freier als auch veresterter Phytoprostane F1 in Pfefferminzblättern nach Verwundung und in pflanzlichen Zellkulturen nach Zusatz von Agentien, von denen bekannt ist, daß sie pflanzliche Zellen oxidativ schädigen, an. In getrockneten Pflanzenmaterialien wurden extrem hohe Konzentrationen an Phytoprostanen F1 quantifiziert. Daher steht die Vermutung nahe, daß Phytoprostane F1 ähnlich wie die Isoprostane F2 im Tier als sensitiver Marker der oxidativen Zellverletzung in der Pflanze eingesetzt werden können. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß der Zusatz von Phytoprostanen F1 zu Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-Zellsuspensionskulturen zu einer Phytoalexinakkumulation führte. N2 - Isoprostanes F2 are arachidonate autoxidation products in mammals that have been shown to be induced during several human disorders associated with enhanced free-radical generation. Isoprostanes F2 represent not only extremely reliable markers of oxidative stress in vivo but also exert potent biological effects. Therefore, it has been postulated that isoprostanoids are mediators of oxidant injury in vivo. Plants, however, do not generate isoprostanes since they since they are generally unable to synthesize arachidonic acid. Here we show that a series of isoprostane F2 analogs termed phytoprostanes F1 are formed by an analogous pathway from a-linolenate in plants. HPLC and gas chromatography-mass spectrometry methods have been developed to quantify phytoprostanes F1. In fresh plant organs, phytoprostanes F1 were found in free and esterified form in lipids. In addition, wounding of peppermint leaves and oxidative stress, which was triggered by the addition oxidative agents to plant cell cultures significantly increased levels of free and esterified phytoprostanes F1. Extremely high levels of phytoprostanes F1 were found in autoxidised plant material. Thus, phytoprostanes F1 represent a sensitive measure of oxidative damage in plants similar to isoprostanes in animals and men. The addition of phytoprostanes F1 to Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-cell suspension cultures triggered a phytoalexine accumulation . KW - Pflanzen KW - Oxidativer Stress KW - Prostaglandine KW - Analoga KW - Phytoprostane KW - Prostaglandin-ähnliche Verbindungen in Pflanzen KW - Isoprostane KW - Phytoprostanes KW - prostaglandin-like compounds in plants KW - Isoprostanes Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182238 ER - TY - THES A1 - Hose, Eleonore T1 - Untersuchungen zum radialen Abscisinsäure- und Wassertransport in Wurzeln von Helianthus annuus L. und Zea mays L. N2 - Mit den Experimenten dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein Phytohormon wie Abscisinsäure mit dem "Solvent-drag" des Wasserflusses apoplastisch durch den Wurzelzellwandbereich in die Xylemgefäße transportiert werden kann. Es konnte ein Bypass-Fluss für ABA durch den gesamten Zellwandapoplasten, auch durch lipophile Barrieren wie Exo- und Endodermis nachgewiesen werden. Dies ist durch die speziellen Moleküleigenschaften von Abscisinsäure möglich: (i) der geringe Durchmesser des Moleküls (8 - 11 nm) und (ii) die hohe Lipophilie von ABA bei schwach sauren pH-Werte. Mit einer Penetration apoplastischer Barrieren ist demnach zu rechnen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Ausbildung solcher lipophilen Zellwandnetze einen signifikanten Einfluss auf den apoplastischen ABA-Transport besitzt. Die Ausbildung einer Exodermis in Mais, wie sie unter natürlichen Bedingungen zu beobachten ist, konnte den ABA-Fluss in das Xylem um die Faktoren 2 bis 4 reduzieren. Da gleichzeitig eine Verminderung der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit um denselben Betrag auftrat, blieb das Wurzel-Spross-ABA-Signal, die Phytohormonkonzentration, im Xylem gleich. Die zu den Stomata geleitete Information über den Wasserzustand der Wurzel änderte sich also nicht. Im natürlichen System ist sogar eine Verstärkung des Signals zu erwarten, da eine Exodermis nicht als Aufnahme-Barriere für gewebeproduzierte ABA wirkt. Gleichzeitig verringert sie den Verlust von apoplastischer ABA an die Rhizosphäre. Außerdem wird der Wasserverlust aus dem Gewebe durch eine Exodermis signifikant reduziert wird. Somit sind solche Wurzeln gut an die Bedingungen eines eintrocknenden Bodens angepasst. Apoplastische Barrieren sind demnach, neben membran-lokalisierten Tranportern, wichtige Parameter für die Beurteilung von Wurzeltransporteigenschaften für Wasser und darin gelöste Substanzen. Der Beitrag der apoplastischen Komponente zum Gesamt-ABA-Transport ist abhängig von der untersuchten Pflanzenart, der aktuellen Transpirations- oder Wasserflussrate und von Umwelteinflüssen wie erhöhter ABA-Konzentration im Wurzelgewebe (z.B. durch Trockenstress), pH-Wert der Rhizosphäre und den Ernährungsbedingungen der Pflanze. Erhöhter radialer Wasserfluss, erhöhte ABA-Wurzelgewebegehalte und niedriger pH-Wert der Rhizosphäre verstärken den apoplastischen Bypass-Fluss unter physiologischen Bedingungen. Geringe Wassertransportraten, niedrige ABA-Konzentrationen im Gewebe, alkalische pH-Werte der Rhizosphäre und Ammoniumernährung verstärken dagegen den symplastischen Beitrag zum ABA-Transport. In der vorliegenden Arbeit konnten die sich widersprechenden Theorien bezüglich des ABA-Effektes auf die hydraulische Leitfähigkeit von Wurzeln erklärt werden. ABA erhöht über einen Zeitraum von 2 Stunden die Zellleitfähigkeit (Lp) mit einem Maximum 1 Stunde nach ABA-Inkubation. Dies wirkt sich in einem verstärktem Lpr von intakten Wurzelsystemen aus, das einem ähnlichen Zeitmuster folgt. Pflanzen sind demnach in der Lage, mittels ABA den zellulären Wassertransportweg reversibel zu optimieren, um so unter mildem Trockenstress, wie er in einem gerade eintrocknenden Boden auftritt, die Pflanze mit ausreichend Wasser zu versorgen. Tritt ein länger andauernder Wassermangel ein, versperrt die Pflanze diesen Weg wieder. Dieser transiente Effekt erklärt auch die aus der Literatur bekannten stimulierenden und inhibierenden ABA-Wirkungen. Durch den verstärkten Wasserfluss zu Beginn der Stresssituation erzeugt ABA auf diese Weise ein sich selbst verstärkendes, wurzelbürtiges Hormonsignal in den Spross. Das Blatt erreicht in effektiver Weise eine ABA-Menge, die ausreichend ist, um die Stomata zu schließen. Es folgt eine Reduktion der Transpiration. Eine weiter andauernde Erhöhung des symplastischen Wassertransportweges wäre ohne physiologische Bedeutung. Regulierende Membranstrukturen für diesen Vorgang könnten ABA-sensitive Wasserkanäle (Aquaporine) der Plasmamembran sein. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor für diesen Vorgang innerhalb von corticalen Maiswurzelzellen lokalisiert und hochspezifisch für (+)-cis-trans-ABA ist. Die Signaltransduktion für diesen Kurzzeiteffekt erfolgt nicht mittels verstärkter Aquaporintranskription, könnte aber über ABA-induzierte Aktivierung (Phosphorylierung), oder Einbau von Aquaporinen in die Zellmembran ablaufen. Der Abscisinsäure-Transport ist ein komplexer Vorgang. Er wird beeinflusst durch Umwelteinflüsse, Wurzelanatomie, ist gekoppelt mit dem Wasserfluss und durch sich selbst variierbar. Herkömmliche Vorstellungen einer simplen Hormondiffusion können diesen regulierbaren Vorgang nicht mehr beschreiben. Pflanzen besitzen ein ABA-Transportsystem, das schnell, effektiv und an sich verändernde Umweltbedingungen adaptierbar ist. N2 - The experimental work of the presented study has been able to show, for the first time, that a phytohormone like ABA can be transported apoplastically into xylem vessels by solvent-drag of the water flow. For ABA, a bypass-flow throughout the whole cell wall apoplast, including lipophilic barriers like exo-and endodermis, could be demonstrated. This may be due to the particular properties of the 264 Da ABA-molecule: (i) the small diameter of the molecule (8 to 11 nm) and (ii) the high lipophily of the uncharged ABA under physiological conditions. Conclusively, a penetration of apoplastic barriers is supposed to be possible. Furthermore, this study shows the development of such lipophilic cell wall-nets should have significant influence on apoplastic ABA-transport-properties. The formation of an exodermis in maize, as it occurs under natural conditions, was able to reduce the ABA-flow into the xylem by factors of 2 up to 4. As, simultaneously, the root-hydraulic conductivity was decreased by the same rate, the root-to-shoot ABA-signal, the phytohormone concentration in the xylem, remained constant. The information about the root-water-status addressed to the guard cells has not changed, therefore. In the natural environment even an increase of this signal is to be expected, as exodermal layers are no uptake-barriers for the tissue-produced ABA. On the contrary, an exodermis will retard the leakage of ABA to the rhizosphere. At the same time, roots are more effectively adapted to drought because water loss from exodermal roots is also reduced significantly. Apoplastic barriers are, therefore, beside membrane-located transport-proteins, the important parameters for determining root-transport-properties for water and solutes. The contribution of the apoplastic component to the entire ABA-transport depends on the plant species investigated, the actual transpiration- or water-flow rate and on external conditions like high ABA-concentrations in the root tissue (e.g. after drought), pH of the rhizosphere, and the nutrient status of the plant. Increased radial water-flow, raised ABA-contents of the root tissue, and a low pH of the rhizosphere intensified the apoplastic bypass-flow under physiological conditions. Low water-transport rates, low ABA tissue-contents, alkaline pH-values in the rhizosphere and ammonium as the only N-source, on the other hand, increased the symplastic contribution to the ABA-transport. In the presented study, the controversal dispute concerning the ABA-effect on root hydraulic conductivity could be settled. ABA raises cell hydraulic conductivity (Lp) for 2 h with a maximum after 1 h of ABA-application. This results in an increased Lpr (hydraulic conductivity of intact root systems), directed by a similar time-pattern. So, by ABA plants are able to reversibly optimise the cellular transport path of water to support the plant under mild drought stress with sufficient water. However, if water deficiency continues, plants again close this additional symplastic pathway. This transient ABA-effect explains both stimulating and inhibiting ABA-actions, as known from literature. At the beginning of a stress situation ABA induces by an increased water flow a self-intensifying root-to-shoot-signal. Thus, in an effective way the leaf achieves a sufficient amount of ABA in order to close the stomata. A reduction in transpiration follows. Further continuous stimulation of the symplastic water transport path would be without any physiological meaning. Membrane structures, responsible for regulating this mechanism may be ABA-responsive water channels (aquaporins) in the plasma membrane. It has been shown that the receptor for regulating these channels is localised inside the cortical cells of maize roots and highly specific for (+)-cis-trans-ABA. Signal transduction for this short-time effect is not mediated by intensified aquaporin-transcription, but there may be evidence of ABA-induced regulation by channel activation (phosphorylation) or by incorporation of aquaporins into cell membranes. The transport of abscisic acid is a complex process modified by environmental conditions, root anatomy, coupled with the water flow, and variable by itself. Customary ideas about a simple hormone diffusion are not apt to describe this complex process anymore. Plants possess an ABA-transport system, which is fast, effective, and adaptable to changing environmental conditions. KW - Sonnenblume KW - Wurzel KW - Wassertransport KW - Abscisinsäure KW - Stofftransport KW - Mais KW - Abscisinsäure KW - ABA KW - Aquaporin KW - Exodermis KW - Hydraulische Leitfähigkeit KW - Wassertransport KW - Wurzel KW - Helianthus annuus KW - Zea mays KW - Abscisic acid KW - ABA KW - aquaporin KW - exodermis KW - hydraulic conductivity KW - water transport root KW - Helianthus annuus KW - Zea mays KW - Nicotiana tabacum Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1421 ER - TY - THES A1 - Gräfe, Eva Ulrike T1 - Relative systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Quercetin und Quercetinglykosiden (Quercetin-4'-0-glucosid und Quercetin-3-0-rutinosid) im Menschen T1 - Relative bioavailability and pharmacokinetics of the flavonol quercetin and quercetin glycosides (quercetin-4'-0-glucoside and quercetin-3-0-rutinoside) in humans N2 - Aufgrund seiner potentiell gesundheitsfoerdernden Wirkung wurde das Falvonol Quercetin in den letzten Jahren intensiv untersucht. Daten zur Bioverfuegbarkeit nach oraler Applikation sind jedoch selten und widerspruechlich. Fruehere Untersuchungen deuteten darauf hin, dass die Disposition von Quercetin von der Zuckerkomponente des Glykosids oder der Pflanzenmatrix abhaengen koennte. Um den Einfluss der Zuckerkomponente oder der Matrix auf die Resorption von Quercetin festzustellen, wurden zwei isolierte Quercetinglykoside sowie zwei Pflanzenextrakte in einer vierarmigen, randomisierten cross-over Studie an 12 gesunden Probanden getestet. Jeder Proband erhielt eine Zwiebelzubereitung oder Quercetin-4'-O-glucosid, jeweils entsprechend 100 mg Quercetinaglykon, sowie Quercetin-3-O-rutinosid oder Buchweizenkrauttee entsprechend 200 mg Quercetinaglykon. Die Proben wurden mittels HPLC und Coulometrischer Arraydetektion analysiert. Im Plasma wurden ausschliesslich Quercetinglucuronide detektiert. Freies Quercetin und die Glykoside waren nicht nachweisbar. Die Bioverfuegbarkeit und Pharmakokinetik nach Applikation von Zwiebeln und Quercetin-4'-glucosid zeigte keine signifikanten Unterschiede. Maximale Plasmakonzentrationen von 2.3±1.5 µg·mL-1 and 2.1±1.6 µg·mL-1 (MW±SD) wurden nach 0.7±0.2 h und 0.7±0.3 h erreicht. Nach Einnahme von Buchweizenkraut und Rutin wurden maximale Plasmakonzentrationen (trotz der doppelten Dosis) von nur 0.6±0.7 µg·mL-1 und 0.3±0.3 µg·mL-1 nach 4.3±1.8 h bzw. 7.0±2.9 h erreicht. Die terminale Halbwertszeit lag bei ca. 11 h fuer alle vier Pruefpraeparate. Die Disposition von Quercetin ist daher primaer von der Zuckerkomponente abhaengig. Zu einem geringern Anteil beeinflusst die Pflanzenmatrix im Falle von Buchweizenkrauttee sowohl Geschwindigkeit als auch Ausmass der Resorption. Der Resorptionsort scheint fuer Quercetin-4‘-O-glucoside und Quercetin-3-O-rutinoside unterschiedlich zu sein. Die bedeutung spezifischer carrier fuer die Resorption von Quercetinglykosiden sowie von intestinalen ß-Glucosidasen muss in weiteren Untersuchungen geklaert werden. N2 - Due to its potentially beneficial impact on human health the polyphenol quercetin has come into the focus of medicinal interest. However, data on the bioavailability of quercetin after oral intake are scarce and contradictory. Previous investigations indicate that the disposition of quercetin may depend on the sugar moiety of the glycoside or the plant matrix. In order to determine the influence of the sugar moiety or matrix on the absorption of quercetin, two isolated quercetin glycosides and two plant extracts were administered to 12 healthy volunteers in a four-way cross-over study. Each subject received an onion supplement or quercetin-4‘-O-glucoside both equivalent to 100 mg quercetin, as well as quercetin-3-O-rutinoside and buckwheat tea both equivalent to 200 mg quercetin. Samples were analyzed by HPLC with a 12-channel coulometric array detector. In human plasma only quercetin glucuronides, but no free quercetin, could be detected. There was no significant difference in the bioavailability and pharmacokinetic parameters between the onion supplement and quercetin-4‘-O-glucoside. Peak plasma concentrations were 2.3±1.5 µg·mL-1 and 2.1±1.6 µg·mL-1 (mean±SD) and were reached after 0.7±0.2 h and 0.7±0.3 h, respectively. After administration of buckwheat tea and rutin, however, peak plasma levels were (despite the higher dose) only 0.6±0.7 µg·mL-1 and 0.3±0.3 µg·mL-1, respectively. Peak concentrations were reached 4.3±1.8 h after administration of buckwheat tea and 7.0±2.9 h after ingestion of rutin. The terminal elimination half life was about 11 h for all treatments. Thus, the disposition of quercetin in humans is primarily depending on the sugar moiety. To a minor extent, the plant matrix influences both rate and extent of absorption in the case of buckwheat tea administration compared to the isolated compound. The site of absorption seems to be different for quercetin-4‘-O-glucoside and quercetin-3-O-rutinoside. The significance of specific carriers on the absorption of quercetin glycosides as well as specific intestinal ß-glucosidases needs to be further evaluated. KW - Mensch KW - Stoffwechsel KW - Quercetin KW - Pharmakokinetik KW - Flavonoide KW - Quercetin KW - Zwiebel KW - Buchweizenkraut KW - Bioverfügbarkeit KW - Pharmakokinetik KW - Metabolismus KW - Resorption KW - flavonoids KW - quercetin KW - bioavailibility KW - pharmacokinetics KW - absorption KW - metabolism KW - onion KW - buckwheat Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1333 ER - TY - THES A1 - Fröhlich, Birgit Susanne T1 - Wachse der Honigbiene Apis mellifera carnica Pollm. T1 - Waxes of the honeybee Apis mellifera carnica Pollm. N2 - Um einen Beitrag zum besseren Verständnis der Rolle der Bienenwachse in der Kommunikation der Honigbienen leisten zu können, wurden Wabenwachse unterschiedlichen Alters und Kutikulawachse unterschiedlicher Kasten,Geschlechter und Berufsgruppen mit Hilfe von Gaschromatographie, Massenspektroskopie und FTIR-Spektroskopie untersucht. Die chemischen Analysen zeigten mittels Diskriminantenfunktionsanalysen hochsignifikante Unterschiede in den aliphatischen Kohlenwasserstoffen zwischen Wabenwachsen unterschiedlichen Alters und Kutikulawachsen unterschiedlicher Kasten und Geschlechter. Erstmals konnte für ein komplexes Substanzgemisch (Bienenwachs) eine lineare Abhängigkeit zwischen dem Schmelzverhalten und der chemischen Zusammensetzung der Wachse nachgewiesen werden.Mit Hilfe von Verhaltensversuchen wurde der Frage nachgegangen, ob die chemischen Unterschiede für die Bienen überhaupt relevant sind. Mit Hilfe der differentielle Konditionierung des Rüsselreflexes wurde getestet, inwieweit Bienen die verschiedenen Wachse unterscheiden können. Eine Diskriminierung der Wachse aufgrund der aliphatischen Kohlenwasserstoffe war den Honigbienen nicht möglich. Dies ergab einen neuen und interessanten Einblick in die Kommunikation der Honigbienen N2 - Quantitative chemical analyses of comb waxes with different age and cuticular waxes of different castes and sexes with gas chromatography, mass spectrometry and FTIR-spectrometry showed significant chemical differences in the aliphatic hydrocarbons and differences in the physical properties of the waxes. We used the proboscis extension reflex to test the ability of the bees to discriminate between these waxes. Differentially conditioned bees significantly discriminated between all waxes. They do not use the aliphatic hydrocarbons, but the esters and more polar components of the waxes. KW - Biene KW - Bienenwachs KW - Zusammensetzung KW - Honigbiene KW - Wachs KW - Gaschromatographie-Massenspektrometrie KW - FTIR-Spektroskopie KW - Rüsselreflex KW - honeybee KW - wax KW - gaschromatography-mass spectrometry KW - FTIR-spectroscopy KW - proboscis extension reflex Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1253 ER - TY - THES A1 - Foley, Paul Bernard T1 - Beans, roots and leaves T1 - Bohnen, Wurzeln und Blätter N2 - The author presents the first detailed review of the pharmacological therapy of parkinsonism from ancient times until the near present (1980). It is not clear whether parkinsonism as it is now defined – a progressive neurodegenerative disorder of the basal ganglia characterized by sharply reduced striatal dopamine levels, particularly in the striatum – has always affected a significant minority of aged persons, but suggestive evidence to this effect in the older literature is reviewed. The major discussion commences, however, with the administration of various plant alkaloids to parkinsonian patients in the second half of the 19th century. Antiparkinsonian therapy since this time may be divided into a number of phases: 1. The employment of alkaloids derived from solanaceous plants: initially hyoscyamine, then hyoscine/scopolamine and atropine. The discovery and characterization of these alkaloids, and the gradual recognition that other pharmacologically useful solanaceous alkaloids (such as duboisine) were identical with one or other of these three compounds, is discussed. 2. With the outbreak of encephalitis lethargica following the First World War, parkinsonian patient numbers increased dramatically, leading to a multiplicity of new directions, including the use of another solanaceous plant, stramonium, of extremely high atropine doses, and of harmala alkaloids. 3. The so-called “Bulgarian treatment” was popularized in western Europe in the mid-1930s. It was also a belladonna alkaloid-based therapy, but associated with greater efficacy and fewer side effects. This approach, whether as actual plant extracts or as defined combinations of belladonna alkaloids, remained internationally dominant until the end of the 1940s. 4. Synthetic antiparkinsonian agents were examined following the Second World War, with the aim of overcoming the deficiencies of belladonna alkaloid therapy. These agents fell into two major classes: synthetic anticholinergic (= antimuscarinic) agents, such as benzhexol, and antihistaminergic drugs, including diphenhydramine. These agents were regarded as more effective than plant-based remedies, but certainly not as cures for the disease. 5. A complete change in direction was heralded by the discovery in 1960 of the striatal dopamine deficit in parkinsonism. This led to the introduction of L-DOPA therapy for parkinsonism, the first approach directed against an identified physiological abnormality in the disorder. 6. Subsequent developments have thus far concentrated on refinement or supplementation of the L-DOPA effect. Recent attempts to develop neuroprotective or -restorative approaches are also briefly discussed. The thesis also discusses the mechanisms by which the various types of antiparkinsonian agent achieved their effects, and also the problems confronting workers at various periods in the design and assessment of novel agents. The impact of attitudes regarding the etiology and nature of parkinsonism, particularly with regard to symptomatology, is also considered. Finally, the history of antiparkinsonian therapy is discussed in context of the general development of both clinical neurology and fundamental anatomical, physiological and biochemical research. In particular, the deepening understanding of the neurochemical basis of central nervous system function is emphasized, for which reason the history of dopamine research is discussed in some detail. This history of antiparkinsonian therapy also illustrates the fact that the nature of experimental clinical pharmacology has markedly changed throughout this period: No longer the preserve of individual physicians, it is now based firmly on fundamental laboratory research, the clinical relevance of which is not always immediately apparent, and which is only later examined in (large scale) clinical trials. It is concluded that antiparkinsonian therapy was never irrational or without basis, but has always been necessarily rooted in current knowledge regarding neural and muscular function. The achievements of L-DOPA therapy, the first successful pharmacological treatment for a neurodegenerative disorder, derived from the fruitful union of the skills and contributions of different types by laboratory scientists, pharmacologists and clinicians. N2 - Der Autor stellt die erste detaillierte Zusammenfassung der Entwicklung der pharmakologischen Therapie des Parkinsonismus vom Altertum bis in die jüngere Vergangenheit (1980) dar. Es ist nicht klar, ob der Parkinsonismus, wie er jetzt definiert wird – eine progressive neurodegenerative Störung der Basalganglien, die durch die zum scharf verringerten Dopamininhalt des Corpus striatum führende Degeneration der nigrostriatalen Bahn gekennzeichnet wird – zu allen Zeiten eine bedeutende Minderheit älterer Personen heimgesucht hat, verlockende Hinweise darauf findet man aber in der älteren Literatur. Die Hauptdiskussion beginnt jedoch mit der Anwendung verschiedener Pflanzenalkaloide bei Parkinson-Patienten in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts. Die Geschichte der Parkinson-Therapie seit dieser Zeit läßt sich in eine Serie von Phasen gliedern: 1. Die Anwendung von aus den Solanazeen isolierten Alkaloiden: zuerst Hyoscyamin, später Hyoscin/Skopolamin und Atropin. Die Entdeckung und die Charakterisierung dieser Alkaloide und die allmähliche Feststellung, daß andere pharmakologisch nützliche Solanazeen-Alkaloide (z.B. Duboisin) mit einem oder anderem dieser schon bekannten Mittel identisch waren, werden diskutiert. 2. Mit dem Ausbruch der Encephalitis lethargica nach dem Ersten Weltkrieg stieg die Anzahl von Parkinson-Patienten dramatisch an, was zu einer Vielfältigkeit neuer therapeutischer Richtungen führte: Der Einsatz des auch zu den Solanazeen gehörenden Stramonium, die Verabreichung von extrem hohen Atropindosen, und die Benutzung von Harmala-Alkaloiden waren insbesondere hochgeschätzt. 3. Die sogenannte “Bulgarische Kur” verbreitete sich schnell in Westeuropa in der Mitte der dreißiger Jahre. Es handelte sich dabei ebenfalls um eine auf Tollkirsche-Alkaloiden basierte Therapie, der jedoch höhere Wirksamkeit und wenige Nebenwirkungen zugemutet wurde. Diese Methode, vermittels der Verabreichung tatsächlicher Tollkirschenextrakte bzw. definierter Kombinationen von Belladonna-Alkaloiden, beherrschte die Parkinson-Therapie bis zum Ende der vierziger Jahre. 4. Nach dem Zweiten Weltkrieg wurden synthetische Parkinson-Mittel überprüft, in der Hoffnung, die Mängel der bisherigen anticholinergen Therapien überwinden zu können. Diese Mittel teilten sich in zwei Hauptkategorien ein: synthetische anticholinerge (= antimuskarine; z.B. Benzhexol) und antihistaminerge Mittel (z.B., Diphenhydramin). Diese Arzneimittel wurden als wirkungsvoller als pflanzliche Therapien angesehen, jedoch sicherlich nicht als Heilmittel für die Krankheit. 4. Eine gründliche Richtungsänderung der Parkinson-Therapie kündigte sich mit der Entdeckung (1960) des striatalen Dopamindefizits im Parkinsonismus an. Diese führte zur Einführung der L-DOPA-Therapie, der ersten Parkinson-Therapie, die gegen eine genau definierte physiologische Abnormität gerichtet war. 5. Die darauf folgenden Entwicklungen haben sich bis heute auf Verfeinerung bzw. Ergänzung des L-DOPA-Effektes konzentriert. Neuere Ansätze, neuroprotektive bzw. -restorative Therapien zu entwickeln, werden kurz behandelt. Die Arbeit diskutiert auch die Mechanismen, die der Wirksamkeit der verschiedenen Parkinson-Mittelarten zugrunde liegen, und auch die Probleme, die Forscher bei der Entwicklung und Bewertung neuartiger Mittel konfrontiert haben. Diese Diskussion zieht auch in Betracht die Auswirkung der Haltung des jeweiligen Forschers betreffend der Ätiologie und Natur des Parkinsonismus auf die Beurteilung neuer therapeutischer Möglichkeiten. Schließlich wird die Geschichte der Parkinson-Therapie im Kontext der allgemeinen Entwicklung der klinischen Neurologie als auch der grundlegenden anatomischen, physiologischen und biochemischen Forschung während dieser Periode behandelt. Insbesondere wird das wachsende Verständnis der neurochemischen Grundlagen der Funktion des Zentralnervensystems hervorgehoben, indem die Geschichte der Dopaminforschung ausführlich behandelt wird. Die Geschichte der Parkinson-Therapie weist auch darauf hin, daß sich die Natur der experimentellen Pharmakologie während dieser Periode grundsätzlich geändert hat. Sie liegt nämlich nicht mehr im Zuständigkeitsbereich des einzelnen Arztes, sondern wird im Gegenteil auf grundlegender Laborforschung aufgebaut, deren klinische Bedeutung nicht immer sofort deutlich ist. Erst später werden die Ergebnisse dieser Grundlagenforschung in großangelegten klinischen Versuchen bei Patienten überprüft. Es wird gefolgert, daß die Parkinson-Therapie zu keiner Zeit als ohne vernünftige Grundlage bzw. irrational betrachtet werden darf. Sie ist jedoch immer dem aktuellen Wissensstand betreffend neuraler und muskulöser Funktion entsprechend geregelt worden. Der Erfolg der L-DOPA-Therapie, der ersten langfristig wirksamen pharmakologischen Behandlung einer neurodegenerativen Krankheit, ist das Ergebnis der ertragreichen Vereinigung der Fähigkeiten und verschiedenartigen Beiträge von Grundlagenforschern, Pharmakologen und Klinikern. KW - Parkinson-Krankheit KW - Pharmakotherapie KW - Geschichte KW - Medizingeschichte KW - Neurologie KW - Parkinsonismus KW - Solanazeen KW - Pharmazie KW - Neurochemie KW - History of medicine KW - neurology KW - parkinsonism KW - pharmacy KW - neurochemistry Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181975 ER - TY - THES A1 - Eckert, Martin T1 - Zur Regulation und Expression von Aquaporinen unter Berücksichtigung des pflanzlichen Wasserhaushaltes T1 - On the regulation and expression of aquaporins with regard to plant water relation N2 - Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet. N2 - Gas exchange measurement of plants was optimized for the model organism Arabidopsis thaliana. Consequently, studies on the participation of aquaporin PIP1b in water transport processes became possible. The transpiration rates obtained for PIP1b anti-sense plants revealed no differences in the time course of stomatal opening. Thus, water permeabilities of guard cell plasma membranes seem not to be influenced by the extend of PIP1b expression. - Gas exchange measurement of the Nicotiana tabacum NtAQP1 anti-sense plants showed a reduced transpiration in response to light and a reduced basal transpiration in the dark. This indicates the participation of NtAQP1 in water movement. - Selected Arabidopsis thaliana mutants were analyzed with regard to their stomatal response to red, red/blue light irradiation. For that, a dual beam protocol was developed. A comparison of the mutant lines to the wild-type revealed significant differences for the phytochrome A (phyA-103), the abscisic acid (aba3-2) and the auxin resistent (axr1-3) mutants. Furthermore, the mutant line npq1-2 did not show the abnormal stomatal response to blue light reported previously. - The expression patterns of a PIP1b-GFP-reporter gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants were analyzed. High promotor activities were obtained in areas of meristematic tissue in roots and shoot, in vascular elements, in young cotyledons and in stamina. A close correlation between PIP1b-promoter activity and cell elongation was obvious. - Sequence analysis of the NtAQP1 promoter discovered DNA-motifs that correspond to specific binding sites of MYB-related transcriptional activators. By using promotor-reporter constructs, the involvement of one of this motifs in a GA- and ABA-induced increase of NtAQP1-promoter activity could be shown. In order to elucidate the effects of phytohormones on deleted promoter elements a dual vector system has been created, which was employed in the transient transfection of BY2-protoplasts. - The expression of a GFP::NtAQP1 translational fusion in BY2-cells revealed a subcellular location in the cytoplasmic membrane. Furthermore, the protein-fusion was recorded in small vesicle-like structures. KW - Pflanzen KW - Wasserhaushalt KW - Aquaporine KW - Genexpression KW - Genregulation KW - aquaporin KW - wasserhaushalt KW - stomata KW - GFP KW - protoplasten KW - transformation KW - aquaporins KW - water relation KW - stomata KW - GFP KW - protoplast transformation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1114 ER -