TY - THES A1 - Röschert, Isabelle T1 - Aurora-A prevents transcription-replication conflicts in MYCN-amplified neuroblastoma T1 - Aurora-A verhindert Transkriptions-Replikationskonflikte in MYCN-amplifizierten Neuroblastomen N2 - Neuroblastoma is the most abundant, solid, extracranial tumor in early childhood and the leading cause of cancer-related childhood deaths worldwide. Patients with high-risk neuroblastoma often show MYCN-amplification and elevated levels of Aurora-A. They have a low overall survival and despite multimodal therapy options a poor therapeutic prognosis. MYCN-amplified neuroblastoma cells depend on Aurora-A functionality. Aurora-A stabilizes MYCN and prevents it from proteasomal degradation by competing with the E3 ligase SCFFBXW7. Interaction between Aurora-A and MYCN can be observed only in S phase of the cell cycle and activation of Aurora-A can be induced by MYCN in vitro. These findings suggest the existence of a profound interconnection between Aurora-A and MYCN in S phase. Nevertheless, the details remain elusive and were investigated in this study. Fractionation experiments show that Aurora-A is recruited to chromatin in S phase in a MYCN-dependent manner. Albeit being unphosphorylated on the activating T288 residue, Aurora-A kinase activity was still present in S phase and several putative, novel targets were identified by phosphoproteomic analysis. Particularly, eight phosphosites dependent on MYCN-activated Aurora-A were identified. Additionally, phosphorylation of serine 10 on histone 3 was verified as a target of this complex in S phase. ChIP-sequencing experiments reveal that Aurora-A regulates transcription elongation as well as histone H3.3 variant incorporation in S phase. 4sU-sequencing as well as immunoblotting demonstrated that Aurora-A activity impacts splicing. PLA measurements between the transcription and replication machinery revealed that Aurora-A prevents the formation of transcription-replication conflicts, which activate of kinase ATR. Aurora-A inhibitors are already used to treat neuroblastoma but display dose-limiting toxicity. To further improve Aurora-A based therapies, we investigated whether low doses of Aurora-A inhibitor combined with ATR inhibitor could increase the efficacy of the treatment albeit reducing toxicity. The study shows that the combination of both drugs leads to a reduction in cell growth as well as an increase in apoptosis in MYCN-amplified neuroblastoma cells, which is not observable in MYCN non-amplified neuroblastoma cells. This new approach was also tested by a collaboration partner in vivo resulting in a decrease in tumor burden, an increase in overall survival and a cure of 25% of TH-MYCN mice. These findings indicate indeed a therapeutic window for targeting MYCN-amplified neuroblastoma. N2 - Das Neuroblastom ist der häufigste, solide, extrakranielle Tumor der frühesten Kindheit und die häufigste mit Krebs verbundene Todesursache von Kleinkindern weltweit. Patienten mit geringerer Überlebenswahrscheinlichkeit und schlechterer Therapieprognose zeigen oft eine MYCN-Amplifikation und erhöhte Mengen von Aurora-A. Aurora-A ist eine Serin/Threonin-Protein Kinase, die wichtige mitotische Prozesse reguliert. Aurora-A stabilisiert MYCN und verhindert dadurch den proteasomalen Abbau von MYCN. Die Interaktion zwischen Aurora-A und MYCN ist S Phasen-spezifisch und MYCN ist in vitro in der Lage, durch seine Bindung Aurora-A zu aktivieren. Die Funktionen und Prozesse, die von Aurora-A in der S Phase reguliert werden, sind noch nicht hinreichend untersucht und daher Gegenstand dieser Dissertation. Zell-Fraktionierungen zeigen, dass Aurora-A in der S Phase in einer MYCN-abhängigen Weise an das Chromatin gebunden ist. Phosphoproteom-Analysen mittels Massenspektrometrie identifizierten zahlreiche neue Substrate von Aurora-A, sowie acht Substrate von MYCN-aktiviertem Aurora-A. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Histon 3 Serin 10 von Aurora-A in Abhängigkeit von MYCN in S Phase phosphoryliert wird. ChIP-Sequenzierungen zeigen, dass Aurora-A die Elongation der Transkription und den Einbau der Histone Variante H3.3 in S Phase beeinflusst. 4sU-Sequenzierung sowie Immunoblots zeigen einen Zusammenhang zwischen der Aktivität von Aurora-A und dem Spleißosom in der S Phase. Zusätzlich konnte mittels PLA nachgewiesen werden, dass Aurora-A die Entstehung von Transkriptions-Replikationskonflikten verhindert, die andernfalls die Kinase ATR aktivieren würden. Aurora-A Inhibitoren wurden unter anderem zur Therapie von Neuroblastomen eingesetzt, allerdings ist die Dosis des Aurora-A Inhibitors durch die hohe Toxizität limitiert, was die Effizienz der Therapie stark beeinträchtigt. Daher wurde untersucht, ob die gleichzeitige Gabe von geringeren Mengen Aurora-A Inhibitor in Kombination mit einem ATR Inhibitor zur Therapie geeignet ist. In vitro konnte gezeigt werden, dass die Kombination beider Inhibitoren das Zellwachstum reduziert und das MYCN-amplifizierte Zellen im Vergleich zu MYCN nicht-amplifizierten Zellen verstärkt durch Apoptose sterben. Durch einen Kollaborationspartner konnte die Kombination der beiden Inhibitoren an Mäusen getestet werden. Die mit der Kombination behandelten Mäuse, zeigen ein deutlich reduziertes Tumorwachstum, sowie längeres Überleben. Somit stellt diese Kombination ein therapeutisches Fenster dar und könnte zur Behandlung von Neuroblastompatienten genutzt werden. KW - Neuroblastom KW - Aurora-A KW - MYCN KW - neuroblastoma Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243037 ER - TY - THES A1 - Xu, Jiajia T1 - A high-complexity lentiviral shRNA screen identifies synthetic lethal interactions with deregulated N-Myc in neuroblastoma cells T1 - Ein hoch-Komplexität Genom-weit RNAi Screen für synthetisch letale Interaktion mit dereguliertem N-Myc in Neuroblastomzellen N2 - In contrast to c-Myc, a deregulated expression of the MYCN gene is restricted to human neuroendocrine tumours. In most cases, the excessive activity of N-Myc results from a MYCN amplification. In neuroblastoma, amplification of MYCN is a predictor of poor prognosis and resistance to therapy. The inability to target the N-Myc protein directly necessitates the search for alternative targets. This project aimed at identifying genes specifically required for growth and survival of cells that express high levels of N-Myc using high-throughput shRNA screening combined with next generation sequencing. The identification and analysis of these genes will shed light on functional interaction partners of N-Myc. We screened a shRNA library containing 18,327 shRNAs and identified 148 shRNAs, which were selectively depleted in the presence of active N-Myc. In addition, shRNAs targeting genes that are involved in p53 and ARF turnover and apoptosis were depleted in the cell population during the screen. These processes are known to affect N-Myc-mediated apoptosis. Consequently, these results biologically validated the screen. The 148 shRNAs that showed a significant synthetic lethal interaction with high levels of N-Myc expression were further analysed using the bioinformatics program DAVID. We found an enrichment of shRNAs that target genes involved in specific biological processes. For example, we validated synthetic lethal interactions for genes such as, THOC1, NUP153 and LARP7, which play an important role in the process of RNA polymerase II-mediated transcription elongation. We also validated genes that are involved in the neddylation pathway. In the screen we identified Cullin 3, which is a component of the BTB-CUL3-Rbx1 ubiquitin ligase that is involved in the turnover of Cyclin E. Depletion of cullin 3 and activation of N-Myc was found to synergistically increase Cyclin E expression to supraphysiological levels, inducing S-phase arrest and a strong DNA damage response. Together with results from a proteomics analysis of N-Myc associated proteins, our results lead us to the following hypothesis: In a neuroblastoma cell, the high levels of N-Myc result in a conflict between RNA polymerase II and the replication machinery during S-phase. The newly identified interaction partners of N- Myc are required to solve this conflict. Consequently, loss of the interaction leads to a massive DNA damage and the induction of apoptosis. In addition, inhibition or depletion of the essential components of the neddylation pathway also results in an unresolvable problem during S-phase. N2 - 6.2 Zusammenfassung Im Gegensatz zu c-Myc findet man eine Deregulation von N-Myc nur in einer begrenzten Anzahl maligner Tumore die neuroektodermalen Ursprungs sind. Die übermäßige Aktivität ist dabei fast immer durch eine genomische Amplifikation von N-Myc begründet. Im Neuroblastom korreliert eine MYCN-Amplifikation mit einer schlechten Prognose. Da es auf Grund einer fehlenden katalytischen Domäne nicht möglich ist N-Myc direkt zu inhibieren, ist die Suche nach alternativen Targets notwendig. Das Ziel dieser Arbeit war es neue Gene zu identifizieren, die notwendig für das Wachstum und Überleben von MYCN amplifizierten Zellen sind. Dies wurde durch eine Kombination von Hochdurchsatz-RNAi-Screens und Next-Generation-Sequenzierung erreicht. Durch das Screenen einer shRNA-Bibliothek, die insgesamt 18327 shRNAs beinhaltet, konnten 148 shRNAs identifiziert werden, die selektiv nachteilig für das Überleben N-Myc überexpremierender Zellen sind. Die statistische Auswertung der Ergebnisse des Screens zeigte zusätzlich eine Anreichung von shRNAs gegen Gene, die p53-und ARF-abhängig Apoptose vermitteln. Da es bekannt ist, dass diese Gene in der N-Myc-vermittelten Apoptose involviert sind, konnte dadurch der Screen validiert werden. Die weitere Auswertung mit dem bioinformatischen Programm DAVID ergab, dass unter den 148 als synthetisch letal identifizierten shRNAs solche angereichert waren, die gegen Gene spezifischer biologischer Prozesse gerichtet sind. Zum einen wurden Gene wie THOC1, NUP153 und LARP7 validiert, die eine Rolle im Prozeß der Elongation der RNA Polymerase II spielen. Zum anderen konnten Gene validiert werden die einen Beitrag bei der Neddylierung von Proteinen leisten. Durch die Depletion von Cullin 3, ein Bestandteil des BTB-CUL3-Rbx1 Ubiquitin-Ligase-Komplexes, der am Abbau von Cyclin E beteiligt ist, konnte gezeigt werden, dass zusammen mit der Aktivierung von N-Myc eine supraphysiologische Erhöhung von Cyclin E induziert wird. Dies führt zu einem S-Phase Arrest in der Zelle, der die DNA-Schadens-Signalkaskade auslöst. Zusammen mit den Ergebnissen einer Proteomanalyse, bei der neue N-Myc-assoziierte Proteine identifiziert wurden, konnte folgende Hypothese aufgestellt werden: In einer Neuroblastomzelle helfen diese neuen Interaktionspartner den durch die N-Myc Überexpression in der S-phase entstehenden Konflikt zwischen RNA-Polymerase II und Replikationsmaschinerie zu lösen. Der Verlust dieser Interaktion führt zu einer massiven Schädigung der DNA, worauf in der Zelle Apoptose ausgelöst wird. Des Weiteren führen auch die Inhibition oder Ausschaltung wesentlicher Komponenten des Neddylierungs-Signalwegs zu unlösbaren Problemen in der S-Phase des Zellzyklus. KW - Neuroblastom KW - synthetic lethality KW - apoptosis KW - cul3 ring ligase KW - replicative stress KW - N-Myc KW - Deregulierung KW - RNS-Interferenz KW - synthetische Letalität Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103157 ER -