TY - THES A1 - Xian, Yibo T1 - Identification of essential genes and novel virulence factors of Neisseria gonorrhoeae by transposon mutagenesis T1 - Identifizierung von essentiellen Genen und neuen Virulenzfaktoren von Neisseria gonorrhoeae durch Transposonmutagenese N2 - Neisseria gonorrhoeae is a human-specific pathogen that causes gonorrhea. It is defined as a super bacterium by the WHO due to the emergence of gonococci that are resistant to a variety of antibiotics and a rapidly increasing infection incidence. Genome-wide investigation of neisserial gene essentiality and novel virulence factors is urgently required in order to identify new targets for anti-neisserial therapeutics. To identify essential genes and new virulence factors, a high-density mutant library in N. gonorrhoeae MS11 was generated by in vitro transposon mutagenesis. The transposon library harbors more than 100,000 individual mutants, a density that is unprecedented in gonococcal research. Essential genes in N. gonorrhoeae were determined by enumerating frequencies of transposon insertion sites (TIS) with Illumina deep sequencing (Tn-seq). Tn-seq indicated an average distance between adjacent TIS of 25 bp. Statistical analysis unequivocally demonstrated 781 genes that were significantly depleted in TIS and thus are essential for Neisseria survival. A subset of the genes was experimentally verified to comprise essential genes and thus support the outcome of the study. The hereby identified candidate essential genes thus may constitute excellent targets for the development of new antibiotics or vaccines. In a second study, the transposon mutant library was applied in a genome-scale “negative-selection strategy” to identify genes that are involved in low phosphate-dependent invasion (LPDI). LPDI is dependent on the Neisseria porin subtype PorBIA which acts as an epithelial cell invasin in absence of phosphate and is associated with severe pathogenicity in disseminated gonococcal infections (DGI). Tn-seq demonstrated 98 genes, which were involved in adherence to host cells and 43 genes involved in host cell invasion. E.g. the hypothetical protein NGFG_00506, an ABC transporter ATP-binding protein NGFG_01643, as well as NGFG_04218 encoding a homolog of mafI in N. gonorrhoeae FA1090 were experimentally verified as new invasive factors in LPDI. NGFG_01605, a predicted protease, was identified to be a common factor involved in PorBIA, Opa50 and Opa57-mediated neisserial engulfment by the epithelial cells. Thus, this first systematic Tn-seq application in N. gonorrhoeae identified a set of previously unknown N. gonorrhoeae invasive factors which demonstrate molecular mechanisms of DGI. N2 - Neisseria gonorrhoeae ist ein human-spezifisches Pathogen, das die Krankheit Gonorrhoe verursacht. Aufgrund der steigenden Anzahl antibiotikaresistenter Gonokokken und der damit verbundenen, rapide zunehmenden Anzahl von Infektionen erklärte die WHO Gonokokken 2012 zum Superbakterium. Daher ist eine genomweite Untersuchung der neisseriellen Genessentiatialität und neuer Virulenzfaktoren dringend erforderlich, um neue Ziele für die antineisserielle Therapie zu identifizieren. Hierzu wurde eine high-density Mutantenbibliothek in N. gonorrhoeae MS11 durch in vitro Transposonmutagenese generiert. Die Transposonbibliothek enthält mehr als 100.000 individuelle Mutanten - eine Dichte, die in der Gonokokken-Forschung beispiellos ist. Essentielle Gene von N. gonorrhoeae wurden durch die Ermittlung der Häufigkeit von Transposon insertion sites (TIS) mit Hilfe von Illumina deep sequencing (Tn-seq) bestimmt. Tn-seq ergab eine durchschnittliche Distanz von 25 Basenpaaren zwischen benachbarten TIS. Die statistische Analyse zeigte eindeutig 781 Gene, die signifikant weniger TIS aufwiesen und deshalb als essentiell für das Überleben der Neisserien verstanden werden können. Für ausgewählte Gene wurde experimentell bestätigt, dass sie essentielle Gene beinhalten, wodurch das Ergebnis der Tn-seq unterstützt wird. Die hierbei identifizierten essentiellen Gene könnten exzellente Targets für die Entwicklung neuer Antibiotika oder Impfstoffe darstellen. In einer zweiten Studie wurde die Transposon Mutanten Bibliothek für eine genomweite „negative Selektionsstrategie“ bereitgestellt. Es sollten Gene identifiziert werden, die an der phosphatfreien Invasion (low phosphate-dependent invasion = LPDI) beteiligt sind. Die LPDI ist vom neisseriellen Porin Subtyp PorBIA abhängig, welches bei Epithelzellen in Abwesenheit von Phosphat als Invasin fungiert und mit einer schweren Pathogenität in disseminierenden Gonokokkeninfektionen (DGI) assoziiert ist. Tn-seq ergab 98 Gene, die an der Adhärenz an die Wirtszelle, und 43 Gene, die an der Wirtszellinvasion beteiligt waren. Zum Beispiel wurden das hypothetische Protein NGFG_00506, ein ABC Transporter, das ATP-bindende Protein NGFG_01643, wie auch NGFG_04218, das für ein Homolog von mafI in N. gonorrhoeae FA1090 kodiert, experimentell als neue Invasionsfaktoren in der LPDI verifiziert. NGFG_01605, bei dem angenommen wird, dass es sich um eine Protease handelt, wurde als ein allgemeiner Faktor identifiziert, der an der PorBIA-, Opa50- and Opa57-vermittelten Einstülpung der Membran von Epithelzellen beteiligt ist. Die erste systematische Anwendung von Tn-seq in N. gonorrhoeae identifizierte eine Reihe bisher unbekannter Invasionsfaktoren von N. gonorrhoeae, die molekulare Mechanismen der DGI zeigen. KW - Neisseria gonorrhoeae KW - transposon mutagenesis KW - essential genes KW - virulence factors KW - Virulenzfaktor KW - Transposon KW - Mutagenese Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102659 ER - TY - THES A1 - Spohn, Gunther T1 - The transcriptional control of virulence gene expression in Helicobacter pylori T1 - Die transkriptionelle Kontrolle der Virulenzgenexpression in Helicobacter pylori N2 - The Gram-negative, spiral-shaped, microaerophilic bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of various disorders of the upper gastrointestinal tract, such as chronic superficial gastritis, chronic active gastritis, peptic ulceration and adenocarcinoma. Although many of the bacterial factors associated with disease development have been analysed in some detail in the recent years, very few studies have focused so far on the mechanisms that regulate expression of these factors at the molecular level. In an attempt to obtain an overview of the basic mechanisms of virulence gene expression in H. pylori, three important virulence factors of this pathogen, representative of different pathogenic mechanisms and different phases of the infectious process, are investigated in detail in the present thesis regarding their transcriptional regulation. As an essential factor for the early phase of infection, including the colonisation of the gastric mucosa, the flagella are analysed; the chaperones including the putative adhesion factors GroEL and DnaK are investigated as representatives of the phase of adherence to the gastric epithelium and persistence in the mucus layer; and finally the cytotoxin associated antigen CagA is analysed as representative of the cag pathogenicity island, which is supposed to account for the phenomena of chronic inflammation and tissue damage observed in the later phases of infection. RNA analyses and in vitro transcription demonstrate that a single promoter regulates expression of cagA, while two promoters are responsible for expression of the upstream divergently transcribed cagB gene. All three promoters are shown to be recognised by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Promoter deletion analyses establish that full activation of the cagA promoter requires sequences up to -70 and binding of the C-terminal portion of the alpha subunit of RNA polymerase to an UP-like element located between -40 and -60, while full activation of the major cagB promoter requires sequences upstream of -96 which overlap with the cagA promoter. These data suggest that the promoters of the pathogenicity island represent a class of minimum promoters, that ensure a basic level of transcription, while full activation requires regulatory elements or structural DNA binding proteins that provide a suitable DNA context. Regarding flagellar biosynthesis, a master transcriptional factor is identified that regulates expression of a series of flagellar basal body and hook genes in concert with the alternative sigma factor sigma 54. Evidence is provided that this regulator, designated FlgR (for flagellar regulatory protein), is necessary for motility and transcription of five promoters for seven basal body and hook genes. In addition, FlgR is shown to act as a repressor of transcription of the sigma 28-regulated promoter of the flaA gene, while changes in DNA topology are shown to affect transcription of the sigma 54-regulated flaB promoter. These data indicate that the regulatory network that governs flagellar gene expression in H. pylori shows similarities to the systems of both Salmonella spp. and Caulobacter crescentus. In contrast to the flagellar genes which are regulated by three different sigma factors, the three operons encoding the major chaperones of H. pylori are shown to be transcribed by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Expression of these operons is shown to be regulated negatively by the transcriptional repressor HspR, a homologue of a repressor protein of Streptomyces spp., known to be involved in negative regulation of heat shock genes. In vitro studies with purified recombinant HspR establish that the protein represses transcription by binding to large DNA regions centered around the transcription initiation site in the case of one promoter, and around -85 and -120 in the case of the the other two promoters. In contrast to the situation in Streptomyces, where transcription of HspR-regulated genes is induced in response to heat shock, transcription of the HspR-dependent genes in H. pylori is not inducible with thermal stimuli. Transcription of two of the three chaperone encoding operons is induced by osmotic shock, while transcription of the third operon, although HspR-dependent, is not affected by salt treatment. Taken together, the analyses carried out indicate that H. pylori has reduced its repertoire of specific regulatory proteins to a basic level that may ensure coordinate regulation of those factors that are necessary during the initial phase of infection including the passage through the gastric lumen and the colonisation of the gastric mucosa. The importance of DNA topology and/or context for transcription of many virulence gene promoters may on the other hand indicate, that a sophisticated global regulatory network is present in H. pylori, which influences transcription of specific subsets of virulence genes in response to changes in the microenvironment. N2 - Das Gram-negative, spiralförmige Bakterium Helicobacter pylori verursacht verschiedene Krankheiten des oberen Verauungstraktes, wie z.B. chronische superfizielle Gastritis, chronische aktive Gastritis, Ulzera und Magenkarzinom. Obwohl viele der bakteriellen Faktoren, die zur Entwicklung dieser Krankheitsformen beitragen, in den letzten Jahren untersucht wurden, sind die molekularen Mechanismen, die die Expression dieser Faktoren regulieren, noch weitgehend unbekannt. Als Ansatz zur Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der Virulenzgenexpression in H. pylori wurden in der vorliegenden Arbeit drei wichtige Virulenzfaktoren repräsentativ für die verschiedenen Phasen des Infektionsprozesses ausgewählt und in Bezug auf ihre transkriptionelle Regulation analysiert. Als essentielle Faktoren für die frühe Phase der Infektion, gekennzeichnet durch die Erstbesiedelung der Schleimschicht des Magens durch die Bakterien, wurden die Flagellen untersucht. Die Chaperone-Proteine mit den mutmaßlichen Adhärenzfaktoren GroEL und DnaK wurden stellvertretend für die Phase der Adhäsion an die Magenepithelzellen und die anschließende persistente Besiedelung der Magenschleimhaut analysiert. Als Verteter der cag Pathogenitätsinsel, die mit großer Wahrscheinlichkeit für die chronische Entzündung und Schädigung des Magengewebes in den späteren Phasen der Infektion verantwortlich ist, wurde schließlich das sogenannte Cytotoxin-assoziierte Antigen CagA untersucht. RNA-Analysen und in vitro-Transkriptionsstudien konnten zeigen, daß die Transkription des cagA-Gens von einem einzigen Promotor aus gesteuert wird, während die Expression des stromaufwärts gelegenen divergenten cagB-Gens von zwei Promotoren reguliert wird. Alle drei Promotoren werden von der vegetativen, sigma 80-enthaltenden RNA-Polymerase erkannt. Durch die Einführung spezifischer Deletionen zwischen cagA und cagB konnte weiterhin gezeigt werden, daß zur vollständigen Aktivierung des cagA-Promoters Sequenzen bis -70 sowie die Bindung der alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase an ein UP-ähnliches Element zwischen -40 und -60 erforderlich sind, während die vollständige Aktivierung des wichtigsten cagB-Promotors Sequenzen oberhalb von -96 erfordert, die mit denjenigen des cagA Promoters überlappen. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die Promotoren der Pathogenitätsinsel eine Klasse von Minimalpromotoren darstellen, die ein geringes Niveau an Transkription garantieren, für ihre volle Aktivierung aber regulatorische Elemente oder strukturelle DNA-bindende Proteine benötigen, die ein spezielles topologisches Umfeld produzieren. Bezüglich der Flagellen konnte ein zentraler Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der in Kooperation mit dem alternativen Sigma-Faktor sigma 54 die Expression einer Serie von Genen kontrolliert, die für strukturelle Komponenten des Flagellenkörpers kodieren. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Faktor (genannt FlgR für Flagellen-Regulator) für die Motilität der Bakterien notwendig ist und die Transkription von fünf Operonen reguliert, die für sieben strukturelle Gene des Flagellen-Basalkörpers und -Hakens kodieren. Darüberhinaus reprimiert FlgR die Transkription des sigma 28-regulierten flaA-Gens, während Änderungen der DNA-Topologie die Transkription des sigma 54-regulierten flaB-Promotors beeinflussen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das regulatorische Netzwerk, welches die Expression der strukturellen Komponenten der Flagellen in H. pylori kontrolliert, Ähnlichkeiten zu den in Caulobacter crescentus und Salmonella spp. beschriebenen Systemen aufweist. Im Gegensatz zu den Flagellengenen, die von drei verschiedenen Sigma-Faktoren reguliert werden, konnte im Fall der drei Operone, die für die Haupt-Chaperone von H. pylori kodieren, eine sigma 80-abhängige Transkription nachgewiesen werden. Die Expression dieser Operone wird darüberhinaus negativ reguliert durch den transkriptionellen Repressor HspR, ein Homolog des gleichnamigen Hitzeschockrepressors von Streptomyces spp. In vitro-Experimente mit gereinigtem rekombinantem HspR konnten zeigen, daß das Protein die Transkription durch die Bindung an große DNA Regionen reprimiert, die in einem Fall mit dem Transkriptionsstart überlappen, und in den anderen beiden Fällen um -85 bzw. -120 lokalisiert sind. Im Gegensatz zur Situation in Streptomyces, wo die Transkription HspR-abhängiger Gene durch Hitzeschock induziert werden kann, ist die Transkription der HspR-regulierten Gene in H. pylori nicht mit Temperaturerhöhungen induzierbar. Die Expression zweier der drei Chaperone-kodierenden Operone kann dagegen durch osmotischen Schock induziert werden, während die Transkription des dritten Operons, trotz seiner HspR-Abhängigkeit, nicht durch osmotische Reize beeinflußbar ist. In ihrer Gesamtheit lassen die transkriptionellen Analysen der verschiedenen Virulenzfaktoren darauf schließen, daß H. pylori sein Repertoire an spezifischen regulatorischen Genen auf ein minimales Niveau reduziert hat, das die koordinierte Regulation derjenigen Faktoren sicherstellt, die für die Anfangsphase der Infektion, namentlich die Durchquerung des Magenlumens und die Erstbesiedelung des Magenepithels, notwendig sind. Die Bedeutung von DNA-Topologie und -Kontext für die Transkription vieler Virulenzgene könnte andererseits auf die Anwesenheit eines hochentwickelten globalen regulatorischen Netzwerkes hinweisen, welches die Transkription spezifischer Untergruppen von Virulenzgenen in Reaktion auf bestimmte Umweltfaktoren beeinflußt. KW - Helicobacter-pylori-Infektion KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Helicobacter pylori KW - Transkription KW - Virulenzfaktoren KW - Flagellen KW - Pathogenitätsinsel KW - Chaperone KW - Helicobacter pylori KW - transcription KW - virulence factors KW - flagella KW - pathogenicity island KW - chaperones Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2334 ER -