TY  - THES
A1  - Voß, Lena Johanna
T1  - Änderungen der Membranspannung und der Osmolarität als Auslöser für Calciumsignale in Pflanzen – Studien an Schließzellen von Nicotiana tabacum und Polypodium vulgare
T1  - Induction of Calcium Signals by Changes in Membrane Potential and Osmolarity – Studies on Guard Cells of Nicotiana tabacum and Polypodium vulgare
N2  - Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen
beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein
Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation
hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran
hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden.
Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt.
N2  - Stomata are small pores in the leaf surface that allow plants to adapt their water balance to changing environmental conditions. The turgor pressure of the guard cells determines the width of the stomatal aperture and is regulated by ion fluxes in or out of the guard cell. A network of different signal transduction pathways is necessary for the adaption of stomatal movements to ambient conditions. Many of these transduction pathways have been described in detail and many of their components have been identified. It is a well known fact that calcium acts as a second messenger in pathways regulating stomatal movements. However, the mechanisms that lead to transient elevations of the cytosolic calcium concentration are largely unknown. The molecular basis of the regulation of stomatal aperture in non-angiosperm species is also poorly understood. In order to gain new insights into these topics, mechanisms of calcium elevation and electrophysiological properties of guard cells were studied, focussing especially on the visualization of the cytosolic calcium concentration in guard cells. In the first part of this study, the application of hyperpolarizing voltage pulses by means of TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) was used to specifically trigger an increase in the cytosolic calcium concentration in individual guard cells in the angiosperm model plant Nicotiana tabacum. To visualize the dynamics of the cytosolic calcium concentration with high temporal and spatial resolution, a spinning disc system for confocal imaging was used simultaneously with the electrophysiological recordings. During the application of hyperpolarizing voltage pulses a transient increase in cytosolic volume was observed. This increase can be explained by an osmotically driven water flux caused by changes of the cytosolic ion concentration. These in turn are caused by the voltage-dependent activation
of inward rectifying potassium channels in the guard cell plasma membrane and by
the compensating current from the impaled microelectrode. Using the calcium-sensitive dye Fura-2, it could be shown that two mechanisms lead to the elevation of the cytosolic calcium concentration during the application of hyperpolarizing voltage pulses. The first mechanism is the activation of hyperpolarization-activated calcium permeable channels (HACCs) in the plasma membrane, which has already been described in 1998 by Grabov & Blatt. In addition to this mechanism of calcium release, a second previously unknown mechanism was discovered in which calcium is released into the cytosol from intracellular stores. This mechanism is related to the increase in cytosolic volume we described above and is probably caused by changes in membrane tension or osmolarity within the cell. These changes could lead to an activation of mechanosensitive calciumpermeable channels.
The second part of this thesis deals with the molecular basis of the regulation of stomata in non-angiosperms. In guard cells of Polypodium vulgare voltage-dependent currents across the plasma membrane similar to those described in angiosperm model plants could be measured using TEVC. Furthermore, the application of hyperpolarizing voltage pulses induced increases in cytosolic calcium concentration in guard cells of Polypodium and Asplenium indicating the existence of voltage-dependent calcium permeable channels in the plasma membrane. The diffusion of iontophoretically injected fluorescent dyes into the neighboring guard cells in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris and Selaginella showed that in these species a symplastic connection between neighboring guard cells exists, which could not be observed in guard cells of angiosperms. Electron microscopic images of Polypodium glycyrrhiza guard cells showed that this connection is probably formed by plasmodesmata between adjacent guard cells. Analysis of  the calcium dynamics in neighboring guard cells after hyperpolarizing voltage pulses revealed that calcium homeostasis seems to be regulated independently in both guard cells despite their symplastic connection. As part of the investigations on guard cells of ferns, a new method for the application of ABA was established, which allows the phytohormone to be charged iontophoretically into the apoplast with the aid of microelectrodes. In contrast to the guard cells of Nicotiana tabacum, which reacted with loss of turgor and subsequential stomatal closure to this method of ABA-application, no closure of the stomata could be induced in Polypodium vulgare in this way. However, since the ABA response of fern stomata is also dependent on other factors such as growth conditions (Hõrak et al., 2017), an ABA-responsiveness in this fern species can still not be completely excluded.

The release of calcium from intracellular stores, as shown in this work, could play an important role for the regulation of stomatal aperture. To clarify this question, the identification of the channels involved in osmotically/mechanically induced calcium release from internal stores would be of great interest. Further studies on fern guard cells could clarify the physiological significance of ion channels known from angiosperms for the stomatal movements in early land plants, and thus contribute significantly to the understanding of the evolution of stomatal regulation. In addition, the question arises as to what role the symplastic connection of the neighboring guard cells through plasmodesmata plays for the function of stomata.
KW  - Schließzelle
KW  - Nicotiana tabacum
KW  - Polypodium vulgare
KW  - Calcium Imaging
KW  - Elektrophysiologie
KW  - Schließzellen
KW  - Farne
KW  - Abscisinsäure
KW  - Oregon Green-BAPTA
KW  - Fura-2
KW  - Hyperpolarisierung
KW  - guard cells
KW  - ferns
KW  - abscisic acid
KW  - hyperpolarisation
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219639
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schäfer, Nadine
T1  - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen
T1  - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates
N2  - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht.
Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht.
Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat.
Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren.
Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen.
Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein.
N2  - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species.
In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera.
To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate.
Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions.
To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops.
Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms.
KW  - Dattelpalme
KW  - Gerste
KW  - Elektrophysiologie
KW  - Hitzestress
KW  - Schließzelle
KW  - Anionenkanal
KW  - Zuckertransporter
KW  - SLAC1
KW  - SUT1
KW  - Signaltransduktion
KW  - ZmSUT1
KW  - Phoenix dactylifera
KW  - Hordeum vulgare
KW  - Zea mays
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491
ER  - 
TY  - THES
A1  - Maierhofer, Tobias
T1  - Funktionelle Charakterisierung von SLAC1-homologen Anionenkanälen aus Arabidopsis thaliana
T1  - Functional characterization of SLAC1-homologous anion channels from Arabidopsis thaliana
N2  - S-Typ (slow)-Anionenkanäle vermitteln in Schließzellen den Efflux von Chlorid und Nitrat, welcher letztendlich zum Schließen der Stomata, z.B. als Antwort auf Trockenstress, führt. Dabei kommt dem Phytohormon Abscisinsäure (ABA) eine zentrale Rolle zu. Es wird als Antwort auf Trockenheit synthetisiert und vermittelt über eine schnelle ABA-Signaltransduktionskette die Aktivierung von S-typ Anionenkanälen. SLAC1 war die erste Komponente eines S-Typ-Anionenkanals, die in Schließzellen identifiziert wurde. Durch die Expression in Xenopus Oozyten, konnte SLAC1 als S-Typ-Anionenkanal funktionell charakterisiert werden und seine Regulation über Kinasen (OST1, CPK21/23) und Phosphatasen (ABI1, ABI2) beschrieben werden. Mit diesen Untersuchungen gelang ein entscheidender Durchbruch bei der Entschlüsselung von Netzwerken, welche den Anionentransport in Schließzellen als Antwort auf Trockenstress regulieren. Im Laufe dieser Arbeit konnte in Schließzellen von Arabidopsis auch die Expression des SLAC1 Homolog 3 (SLAH3) nachgewiesen werden. Die Koexpression von SLAH3 mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 in Xenopus Oozyten führte zu Nitrat-induzierten Anionenströmen. Dabei wurde die Aktivität dieses S-Typ-Anionenkanals, sowohl durch Phosphorylierung, als auch durch Kalzium und Nitrat gesteuert. Ähnlich wie bei der Regulation von SLAC1 konnte die Aktivität von SLAH3 durch die Proteinphosphatase ABI1, aus der Familie der PP2Cs, blockiert werden. Diese Eigenschaft von ABI1 passt sehr gut zur bekannten Rolle dieser Phosphatase in Schließzellen: ABI1 ist ein negativer Regulator der ABA-Signalkaskade und wird durch ABA inhibiert. Unsere biophysikalischen Analysen führten schließlich zur Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges. Die Bindung von ABA an den Komplex aus ABA-Rezeptor (RCAR/PYL/PYR) und ABI1 bewirkt die Inaktivierung von ABI1 und somit die Aktivierung von CPK21. Für deren volle Aktivität ist eine ABA-abhängige Erhöhung der zytosolischen Ca2+-Konzentration notwendig. Die aktivierte Kinase CPK21 ist schließlich in der Lage, den Anionenkanal SLAH3 zu phosphorylieren und in der Anwesenheit von Nitrat zu aktivieren. Somit liefert die Identifizierung und Charakterisierung von SLAH3, als den Nitrat-, Kalzium- und ABA-sensitiven Anionenkanal in Schließzellen, Einblicke in die Beziehung zwischen der Reaktion dieses Zelltyps auf Trockenstress, der Funktion von Nitrat als Signalmolekül und dem Nitratmetabolismus. Für die meisten höheren Pflanzen stellt Nitrat die wichtigste Stickstoffquelle dar. Die Nitrataufnahme über die Wurzel repräsentiert daher den entscheidenden Schritt für den Stickstoff-Metabolismus. Ausgehend von den Zellen des Wurzelkortex muss das Nitrat für den Langstreckentransport in die oberen Pflanzenorgane, in die Xylemgefäße der Stele eingebracht werden. Die Identifikation von Proteinen und Genen, die für den Nitrattransport verantwortlich sind, ist für das Verständnis der Nitrataufnahme und -verteilung in der Pflanze eine Grundvoraussetzung. Dabei scheinen Protonen-gekoppelte Transporter der NRT1-, bzw. NRT2-Klasse, die Verschiebung von Nitrat aus dem Boden in die Wurzeln zu bewerkstelligen. Aus der Endodermis, bzw. den Xylem-Parenchymzellen muss Nitrat anschließend in das extrazelluläre Medium der Xylemgefäße freigegeben werden, um über den Transpirationssog in den Spross zu gelangen. Auch am Transport dieses Anions in das Xylem ist mit NRT1.5 ein Nitrattransporter der NRT1-Klasse beteiligt, jedoch ergaben Experimente an NRT1.5-Verlustmutanten, dass weitere Transportmechanismen für den Efflux von Nitrat in das Xylem existieren müssen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte das SLAC1-Homolog 2 (SLAH2) funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert werden. Mit Hilfe der BIFC-Methode wurde gezeigt, dass dabei die Interaktion mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 essentiell ist. Elektrophysiologische Experimente verdeutlichten, dass SLAH2 einen Nitrat-selektiven S-Typ-Anionenkanal repräsentiert, dessen Aktivität gleichzeitig durch die Anwesenheit eben dieses Anions im externen Medium reguliert wird. Durch die Promoter:GUS-Technik gelang es, die Lokalisation von SLAH2 exklusiv in den Zellen der Wurzelstele von Arabidopsis nachzuweisen. Aufgrund des stark negativen Membranpotentials pflanzlicher Zellen und der vorliegenden Anionengradienten, dürften Anionenkanäle in erster Linie den Ausstrom von Anionen vermitteln. Da in Nitrat-Aufnahme-Experimenten an SLAH2-Verlustmutanten, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, ein geringerer Nitratgehalt im Spross, dagegen eine höhere Konzentration dieses Anions in den Wurzeln zu detektieren war, scheint der S-Typ-Anionenkanal SLAH2 am Transport von Nitrat aus den Wurzeln in die Blätter beteiligt zu sein. Dabei könnte er entweder direkt an der Beladung des Xylems mit Nitrat mitwirken, oder diese durch seine potentielle Funktion als Nitratsensor regulieren.
N2  - S-type (slow)-anion channels in guard cells mediate the efflux of chloride and nitrate which finally leads to the closing of stomata, e.g. in response to drought stress. Hereby the phytohormone abscisic acid (ABA) plays a central role. It is synthesized in response to drought and mediates the activation of S-type anion channels via a fast ABA signal transduction pathway. SLAC1 was the first component of S-type anion channels that was identified in guard cells. Following expression in Xenopus oocytes, SLAC1 could be functionally characterized as a S-type anion channel and its regulation via kinases (OST1, CPK21/23) and phosphatases (ABI1, ABI2) could be demonstrated. These studies represented a crucial breakthrough in decoding networks that regulate the anion transport in guard cells in response to drought stress. In the course of this work the expression of the SLAC1 homolog 3 (SLAH3) was detected in guard cells of Arabidopsis, too. In line with the phosphorylation-dependent activation of SLAC1, coexpression of SLAH3 with the Ca2+-dependent protein kinase CPK21 in Xenopus oocytes resulted in nitrate-induced anion currents. Thus the activity of this S-type anion channel was controlled by phosphorylation as well as via calcium and nitrate. Similar to the regulation of the activity of SLAC1, SLAH3 could be blocked by the protein phosphatase ABI1, a member of the PP2C family. This property of ABI1 is well in line with its known physiological role in guard cells: ABI1 represents a negative regulator of ABA signaling and is inhibited by ABA. Our biophysical and biochemical analyses resulted in the reconstitution of the fast ABA signal transduction pathway: Binding of ABA to the complex of the ABA receptor (RCAR/PYL/PYR) and ABI1 leads to the inactivation of ABI1 and thus to the activation of CPK21. For its full activity an ABA-dependent increase in the cytosolic Ca2+ concentration is necessary. The activated kinase CPK21 is finally able to phosphorylate and activate the anion channel SLAH3 in the presence of nitrate. Thus, the identification and characterization of SLAH3 as the nitrate, calcium and ABA sensitive anion channel in guard cells, provides insights into the relationship between the reaction of this cell type to drought stress, the function of nitrate as a signaling molecule and the nitrate metabolism. Nitrate represents the most important nitrogen source for the majority of higher plants. Nitrate uptake by roots is therefore a decisive step in the nitrogen metabolism of plants. Starting from the cells of the root cortex nitrate is loaded into the xylem vessels of the stele for long-distance transport into the aerial plant organs. The identification of proteins and genes that are responsible for the transport of nitrate is a basic requirement for the understanding of nitrate uptake and distribution in the plant. Thereby proton coupled transporters of the NRT1 and NRT2 class seem to be responsible for the translocation of nitrate from the soil to the root. From the endoderm and the xylem parenchyma cells nitrate is then released into the extracellular medium of the xylem vessels to enter the transpiration stream to the shoot. NRT1.5, a transporter of the NRT1 family, was shown to be involved in this process. However, experiments on NRT1.5-deficient mutants showed that additional transport mechanisms for the efflux of nitrate into the xylem must exist. In the course of this dissertation the SLAC1 homolog 2 (SLAH2) was functionally expressed in Xenopus oocytes. With the help of the BIFC method it could be shown that hereby the interaction with the Ca2+-dependent protein kinase CPK21 is essential. Electrophysiological experiments demonstrated that SLAH2 represents a nitrate-selective S-type anion channel whose activity is regulated by the presence of this anion in the external medium. The localization of SLAH2 exclusively in the cells of the Arabidopsis root stele was detected via the promoter:GUS technique. Due to the hyperpolarized membrane potential of plant cells and the outward-directed anion gradients, it is likely that anion channels primarily mediate the efflux of anions. Nitrate uptake experiments on SLAH2 loss of function mutants revealed a lower nitrate content in the shoot compared to wild-type plants, whereas a higher concentration of this anion was detected in the roots. This indicates that the S-type anion channel SLAH2 is involved in the transport of nitrate from the roots into the leaves. Thereby SLAH2 could either be directly responsible for the xylem loading with nitrate or it could regulate this process by its potential function as a nitrate sensor.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Anionentranslokator
KW  - Nitration
KW  - Schließzelle
KW  - Stomaschluss
KW  - SLAC1
KW  - S-Typ
KW  - stomatal closure
KW  - SLAC1
KW  - S-type
KW  - Schmalwand <Arabidopsis>
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85406
ER  - 
TY  - THES
A1  - Scherzer, Sönke
T1  - Biophysikalische Analyse und Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges aus Arabidopsis thaliana
T1  - Biophysical analysis and reconstitution of the fast ABA-signal transduction pathway in Arabidopsis thaliana
N2  - In dieser Arbeit sollte zunächst die Frage geklärt werden, ob es sich bei SLAC1 um den S-typ Anionenkanal handelt, oder ob SLAC1 nur ein essentieller Bestandteil des Anionenkanals ist. Zur funktionellen Charakterisierung des per se inaktiven SLAC1 Proteins, wurde mit der Suche nach SLAC1-aktivierenden Interaktionspartnern begonnen. Zu diesem Zweck bediente man sich der Methode der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BiFC) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Da bereits die Abhängigkeit der Anionenströme in Schließzellen von De- und Phosphorylierungsereignissen bekannt war, galt Ca2+-abhängigen Kinasen der CPK Familie, ABA-aktivierten Kinasen der SnRK Familie und Phosphatasen des PP2C Typs eine besondere Aufmerksamkeit. Mitglieder dieser Familien wurden bereits mit der Regulation des Stomaschlusses in Verbindung gebracht. Bei diesen Experimenten zeigte sich, dass SnRK2.6 (OST1) und mehrere CPKs deutlich mit SLAC1 physikalisch interagierten. Als Folge dieser Interaktion in Oozyten konnten schließlich nach Koexpression von SLAC1 zusammen mit den interagierenden Kinasen typische S-Typ Anionenströme detektiert werden, wie man sie aus Patch-Clamp Experimenten an isolierten Schließzellprotoplasten kannte. Hierbei bewirkten die Kinasen OST1 und CPK23 die größte Anionenkanalaktivierung. Dieses Ergebnis wird durch die BIFC-Experimente gestützt, da OST1 und CPK23 die stärkste Interaktion zu SLAC1 zeigten. Die elektrophysiologische Charakterisierung der SLAC1-Ströme im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten in Kombination mit in vivo Patch-Clamp Untersuchungen wies SLAC1 eindeutig als den lange gesuchten S-Typ Anionenkanal in Arabidopsis Schließzellen aus. Somit ist die direkte S-Typ Anionenkanalaktivierung durch OST1 auf dem Kalzium- unabhängigen und durch CPKs auf dem Ca2+-abhängigen ABA-Signaltransduktionsweg gelungen. Bei der Spezifizierung der einzelnen Kalzium-Abhängigkeiten dieser Kinasen in Oozyten und in in vitro Kinase Assays konnten weiterhin unterschiedliche Affinitäten der CPKs zu Kalzium festgestellt werden. So vermittelten die schwach Kalzium-abhängigen CPK6 und CPK23 bereits ohne einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentratiom über das Ruheniveau hinaus schon die Anionenkanalaktivierung. Die stark Kalzium-abhängigen CPK3 und CPK21 hingegen, werden erst aktiv wenn die ABA vermittelte Signaltransduktion zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration führt. Da somit die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 ohne dieses Kalziumsignal aktiv sind, benötigen diese einen übergeordneten Regulationsmechanismus. In den BIFC-Experimenten konnte eine deutliche Interaktion der Phosphatasen ABI1 und 2 zu den SLAC1 aktivierenden Kinasen beobachtet werden. Dass diese Interaktion zu einem Ausbleiben der Anionenkanalaktivierung führt, wurde in TEVC-Messungen gezeigt. Mit diesen Erkenntnissen um die ABA-Signaltransduktionskette in Schließzellen konnten in in vitro Kinase Experimenten ihre einzelnen Glieder zusammengesetzt und der ABA-vermittelte Stomaschluss nachvollzogen werden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass, das unter Wasserstress-Bedingungen synthetisierte Phytohormon, ABA von Rezeptoren der RCAR/PYR/PYL-Familie percepiert wird. Anschließend bindet die Phosphatase ABI1 an den ABA-RCAR1 Komplex. In ihrer freien Form inhibiert die Phosphatase ABI1 die Kinasen OST1, CPK3, 6, 21 und CPK23 durch Dephosphorylierung. Nach Bindung von ABI1 an RCAR1 sind diese Kinasen von dem inhibierenden ABI1 entlassen. Die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 stellen ihre Aktivität durch Autophosphorylierung wieder her. Die stark Ca2+-abhängigen Kinasen CPK3 und 21 benötigt hierzu noch einen ABA induzierten Ca2+-Anstieg im Zytoplasma. Diese Kinasen phosphorylieren anschließend SLAC1 am N-Terminus. Diese Phosphorylierung bewirkt die Aktivierung von SLAC1 woraufhin Anionen aus der Schließzelle entlassen werden. Das Fehlen dieser negativen Ladungen führt zur Depolarisation der Membran woraufhin der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK aktiviert und K+ aus der Schließzelle entlässt. Der Verlust an Osmolyten bewirkt einen osmotisch getriebenen Wasserausstrom und das Stoma schließt sich.
N2  - This work should clarify whether SLAC1 is the anion channel itself, or a regulatory component of S-type anion channels. To answer this question we searched for activating interaction partners of SLAC1. For this purpose the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technique was used following heterologous expression in Xenopus oocytes. Since anion currents of guard cells have been shown to be associated with phosphorylation events we focused on calcium dependent kinases (CPKs), ABA-activated SnRK kinases and PP2C phosphatases. Members of these families were already known to be involved in ABA-dependent stomatal closure. BIFC experiments revealed that SnRK2.6 (OST1) and several CPKs physically interact with SLAC1 in oocytes. Upon coexpression of SLAC1 with these interacting kinases in Xenopus oocytes, SLAC1-related anion currents appeared similar to those observed in guard cells. Strongest anion channel activation was detected by coexpression of SLAC1 and OST1 or CPK23. These findings are supported by BIFC experiments detecting OST1 and CPK23 also as strongest interaction partners of SLAC1. The electrophysiological characterization of SLAC1 currents in Xenopus oocytes, in combination with in vivo patch clamp studies demonstrated that SLAC1 is the major component of S-type anion currents in Arabidopsis guard cells. Furthermore we could show that OST1 mediates direct S-type anion channel activation in a calcium-independent manner whereas CPKs are positive regulators of SLAC1 in the calcium-dependent branch of the ABA signaling pathway. Moreover in vitro kinase assays and TEVC measurements in oocytes revealed that there are two groups of SLAC1 activating CPK kinases with distinct Ca2+ affinities: i) the weak calcium-dependent CPK6 and CPK23 mediate anion channel activation even at the low resting calcium concentrations while ii) the high affinity kinases CPK3 and CPK21 are only active in response to an increase in cytosolic calcium concentration. Since OST1, CPK6 and CPK23 are active even without a preceding calcium signal, a master regulator is necessary which keeps those kinases inactive in the absence of ABA. BIFC experiments revealed a strong interaction of phosphatases ABI1 and 2 towards the SLAC1 activating kinases. Interestingly the integration of ABI1 into the SLAC1/kinase complex prevented SLAC1 activation in oocytes. Taken together our findings allowed us to reconstitute the ABA signaling pathway from the perception of ABA to the activation of S-type anion channel SLAC1, in turn leading to stomatal closure. Under water stress conditions the phytohormone ABA is synthesized and sensed by its receptors (RCAR/PYR/PYL). This allows binding of ABI1 to the active ABA-RCAR1 complex. In its free form ABI1 by dephosphorylation inhibits the kinases OST1, CPK3, 6, 21 and CPK23. After binding of ABI1 to RCAR1, however, these kinases are released from the inhibitory effect of ABI1. The kinases OST1, CPK23 and CPK6 become active by autophosphorylation. The strong Ca2+-dependent kinases CPK3 and CPK21 in addition need an ABA-induced rise in cytosolic calcium concentration to restore their activity. These active kinases phosphorylate SLAC1 at its N-terminus leading to the activation of SLAC1. The release of anions from guard cells depolarizes the guard cell membrane potential whereupon the outward rectifying potassium channel GORK is gated open. Finally the loss of osmolytes causes an osmotic driven water loss, the guard cells shrink and thus the stoma closes.
KW  - Schließzelle
KW  - Abscisinsäure
KW  - Calcium
KW  - OST1
KW  - CPK
KW  - OST1
KW  - CPK
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76199
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krause, Diana
T1  - Transport der Hauptosmotika an der vakuolären Membran von Schließzellen
T1  - Transport of the main osmotic substances on the vacuolar membrane of guard cells
N2  - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Einblicke bezüglich des Transport-prozesses vakuolärer Protonenpumpen, Zuckertransporter und des SV-Kanals von Arabidopsis thaliana gewonnen: 1. Mittels Patch-clamp-Technik wurden ATP- und Pyrophosphat-induzierte Pump-ströme an Mesophyllvakuolen des Wildtyps gemessen. Die durch ATP hervor-gerufenen Pumpströme konnten durch den spezifischen V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A vollständig inhibiert werden. Messungen an der V-ATPase-Doppelmutante vha-a2-vha-a3 hingegen zeigten eine kaum vorhandene ATPase-Aktivität auf. Die vakuoläre Pyrophosphatase-Aktivität der vha-a2-vha-a3-Mutante war mit dem WT vergleichbar und konnte die verminderten Pumpströme der V-ATPase nicht kompensieren. Zudem wurde an A. thaliana WT-Pflanzen die Expressionsrate und Pumpstromdichte der V-ATPase von Schließzellen und Mesophyllzellen untersucht. Dabei konnte bei Schließzellen eine höhere Expressionsrate sowie Pumpleistung im Vergleich zu Mesophyllzellen detektiert werden, wodurch an der vakuolären Membran von Schließzellen eine starke protonenmotorische Kraft generiert werden kann. 2. Des Weiteren wurden die Transporteigenschaften des im Tonoplasten lokalisierten Transportproteins AtINT1 an Arabidopsis Mesophyllzellen des Wildtyps näher untersucht. Unter inversen pH-Wert-Bedingungen konnte AtINT1 als Symporter identifiziert werden, welcher myo-Inositol H+-gekoppelt aus der Vakuole in das Cytosol transportiert. 3. Überdies wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung des AtSUC4-Transporters durchgeführt. Unter einem physiologischen Protonengradienten konnte bei WT- und Atsuc4.1-Vakuolen ausschließlich ein Saccharose/H+ ge-triebener Antiportmechanismus detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten 60 % der AtSUC4-ÜE unter inversen pH-Gradienten während Saccharose-Applikation Ströme, die auf einen Saccharose/H+-Symportmechanismus hinweisen. Bei der Atsuc4.1-Verlustmutante hingegen konnten unter gleichen Lösungsbedingungen ausschließlich Ströme detektiert werden, die mit einem Saccharose/H+-gekoppelten Antiportmechanismus in Einklang zu bringen sind. Durch die Erkenntnisse der Arbeitsgruppe unter Norbert Sauer, Universität Erlangen, wird die Vermutung untermauert, dass AtSUC4 Saccharose im Symport mit H+ aus der Vakuole in das Cytosol transportiert und somit eine Rolle bei der Remobilisierung der in der Vakuole gespeicherten Saccharose übernimmt. 4. Darüber hinaus konnten Studien am nichtselektiven spannungsabhängigen „slow-vacuolar-channel“ (SV-Kanal) von Arabidopsis Mesophyllvakuolen durchgeführt werden. Dabei wurde das 14-3-3-Protein GRF6 als regulatorisches Protein identifiziert, welches die SV-Kanalaktivität stark verringert. Die gain-of-function Mutante fou2 mit der Punktmutation D454N im TPC1-Kanalprotein zeigt abweichende Kanaleigenschaften zum WT auf. Das Aktivie-rungspotential des fou2-SV-Kanals liegt bei 30 mV negativeren Membranspan-nungen, was die Offenwahrscheinlichkeit des SV-Kanals unter physiologischen Membranspannungen erhöht. Die fou2-Mutation beeinflusst außerdem die luminale Ca2+-Bindestelle des SV-Kanals, wodurch die Affinität bzgl. luminalem Ca2+ geringer ist und die fou2-SV-Kanalaktivität bei hohen luminalen Ca2+-Konzentrationen bestehen bleibt. Die absolute Offenwahrscheinlichkeit des WT-SV-Kanals nimmt mit Ansäuern des vakuolären Lumens im Gegensatz zum fou2-SV-Kanal stark ab, die Einzelkanalleitfähigkeit des WT- als auch des fou2-SV-Kanals dagegen zu. Anhand der durchgeführten Messungen konnte eine regulatorische, vakuolär gelegene Ca2+-Bindestelle des TPC1-kodierten Kanals lokalisiert und charakterisiert werden, welche sich vermutlich nahe am Spannungssensor befindet und unter physiologischen Membranspannungen einen einwärtsgerichteten Kationenstrom ermöglicht. 5. Ferner wurden SV-Kanäle von Schließzellen untersucht und deren spezifische Eigenschaften mit Mesophyll-SV-Kanälen verglichen. In Schließzellen liegt neben einer erhöhten Transkriptmenge des single-copy Gens TPC1 eine höhere Stromdichte des SV-Kanals vor. Unter einwärtsgerichtetem K+-Gradienten liegt das Aktivierungspotential von Schließzell-SV-Kanäle um 30 mV negativer als bei Mesophyllvakuolen, was unter physiologischen Membranspannungen zu einem ausgeprägtem K+-Einstrom führt. Darüber hinaus zeigte der Schließzell-SV-Kanal eine höhere Permeabilität von Na+- gegenüber K+-Ionen (1,3:1) auf. Während Schließzell- und Mesophyll-SV-Kanäle eine vergleichbare luminale Ca2+-Sensitivität aufweisen, zeigen Schließzell-SV-Kanäle eine höhere cytosoli-sche Ca2+- und vakuoläre pH-Sensitivität auf. Sequenzanalysen der TPC1-cDNA zeigten, dass die Zelltypspezifischen Unterschiede des SV-Kanals nicht durch posttranskriptionale Modifikation hervorgerufen werden.
N2  - As an output of this dissertation, the following new insights into vacuolar transport pro-cesses of proton pumps, sugar transporters and slow vacuolar channels (SV-channels) via the patch clamp technique were gained: 1. The vacuolar V-ATPase of A. thaliana mesophyll cells of the WT as well as of the double mutant vha-a2-vha-a3 were analyzed. The specific V-ATPase-inhibitor concanamycin A inhibits the WT V-ATPase activity completely. In vha-a2-vha-a3 mutant the V-ATPase activity was completely absent and shows no ATP induced H+ currents. However, the vacuolar vha-a2-vha-a3 pyrophosphatase current density was indistinguishable from the WT and could not compensate the missing V-ATPase pump currents. Additionally, the V-ATPase expression rate and H+ currents of A. thaliana guard cells and mesophyll cells were examined. In guard cells the expression rate as well as the pump currents were higher compared to mesophyll cells which resulted in a stronger proton motive force. 2. Furthermore, the transport mechanism of the vacuolar membrane protein AtINT1 was studied on Arabidopsis WT mesophyll cells. At high vacuolar and low cytoplasmic pH values AtINT1 could be identified as an H+/inositol symporter. These data was confirmed by further measurements of the mutant lines Atint1.1 and Atint1.2. After application of myo-inositol the currents were completely absent in Atint1.1 and strongly reduced in the Atint1.2 mutant. 3. Besides transport characteristics of the tonoplast localized AtSUC4 protein was analyzed. After application of cytosolic sucrose, WT as well as Atsuc4.1 vacuoles showed an H+/sucrose driven Antiport mechanism in presence of physiological H+-gradient. However, in the presence of an inverse pH gradient, 60 % of the AtSUC4-overexpressing mutant showed sucrose induced currents indicating an H+/sucrose Symport mechanism of the AtSUC4 transport protein. Corresponding currents could not be detected in AtSUC4 less vacuoles (Atsuc4.1). In the inverse system sucrose induced currents of the Atsuc4.1 mutant were in accordance with an H+/sucrose coupled antiport mechanism. These patch clamp measurements confirm the findings of the working group of Norbert Sauer, University of Erlangen. AtSUC4 acts as a symporter by transporting sucrose coupled with H+ out of the vacuole into the cytosol and therefore plays a role in the remobilization of stored vacuolar sucrose. 4. Additionally the non-selective voltage dependent slow vacuolar channel (SV channel) of Arabidopsis mesophyll vacuoles was electrophysiologically characterized. Thereby the 14-3-3 protein GRF6 could be identified as a regulatory protein of the SV channel, which down-regulates the SV channel activity. The gain-of-function mutant fou2 containing the point mutation D454N on the vacuolar lumen side of the SV channel protein, shows different channel proper-ties compared to WT. The fou2 channel activation was shifted to 30 mV more negative membrane potentials which resulted in higher open probability than WT SV channels. The fou2 mutation also affected the luminal Ca2+ binding site of the SV channel and lowered the affinity to vacuolar Ca2+. fou2 channel activity remained high even at inhibitory vacuolar Ca2+ concentrations. The WT SV channel open probability decreased strongly with luminal acidification in contrast to fou2. However, the single channel conductance of WT and fou2 SV channels increased. The regulatory vacuolar Ca2+ binding site of the TPC1 channel seems to be located nearby the voltage sensor and enables a pronounced fou2 inward current under physiological membrane voltages. 5. The A. thaliana guard cell SV channel features were compared with mesophyll cells. In guard cells the transcript number of the single copy gene TPC1 was elevated which resulted in a higher SV current density than in mesophyll cells. When the K+ gradient was directed out of the vacuolar lumen the guard cell SV channel activated at about 30 mV less negative voltages compared to mesophyll cells and mediated distinct inward currents. The guard cell SV channel showed permeability for Na+ over K+ (1,3:1). SV channels from guard cells and mesophyll cells exhibited comparable luminal Ca2+ sensitivities. However, the guard cell SV channel is more sensitive to cytosolic Ca2+ and vacuolar pH. Sequence analyses of the TPC1 cDNA showed that the varying features of the guard cell and mesophyll cell SV channels are not related to posttranscriptional modifications.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Schließzelle
KW  - Vakuole
KW  - Saccharose
KW  - Inosite
KW  - Spannungskontrollierter Ionenkanal
KW  - Protonenpumpe
KW  - AtTPC1
KW  - AtSUC4
KW  - Protonenpumpe
KW  - Vakuole
KW  - Schließzelle
KW  - AtTPC1
KW  - AtSUC4
KW  - proton pump
KW  - vacuole
KW  - guard cell
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75043
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mumm, Patrick
T1  - Elektrophysiologische Untersuchungen der Ionenflüsse und ihrer Regulation in Stomakomplex-bildenden Zellen von Zea mays und Schließzellen von Arabidopsis thaliana
T1  - Electrophysiological  analysis of ion fluxes and their regulation in stomatal cell of Zea mays and guard cells of Arabidopsis thaliana
N2  - 1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-ähnliche Anionenkanäle identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkanäle der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Darüber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenläufige Polarisation des Membranpotentials während der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais ähnliches Verhalten während der Stomabewegung zeigte und gegenläu-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein ähnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung während der Licht-induzierten Stomaöffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zurückkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverhältnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei geöffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schlüssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen während der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten näher untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenströme bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universität Würzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert für einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-ähnliche Anionenströme generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten Lösungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg für die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkanäle in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal ähnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬hängigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabhängigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, während unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach für den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein.
N2  - 1. Within this dissertation the following new insights into the coordinated ion transport between guard and subsidiary cells of Zea mays were gained: a. Using the patch clamp technique on subsidiary and guard cell protoplasts, S-type-like anion channels were identified in both cell types. In subsidiary cells they were inhibited by elevated cytosolic calcium con-centrations and stimulated by ABA and cytosolic alkalinization. In con-trast, the S-type-like guard cell anion channels were hardly influenced by alkalinization and stimulated upon a rise in the cytosolic free calcium level. b. Impaling of subsidiary cells in intact Zea mays plants with microeletrodes revealed a reversed membrane polarization during light-/darkness-induced stomatal movement. Since the membrane potential of Hordeum vulgare subsidiary cells showed a similar behavior that was, however, reversed in the surrounding guard cells during stomatal movement, a similar change in the membrane potential of Zea mays guard cells is most likely. c. Furthermore an alkalinization in Zea mays subsidiary cell could be moni-tored during light-induced stomatal opening, which returned to original values after stomatal closure. d. Based on reconstructed 3D-models of intact maize stomatal complexes, a volume ratio between guard cells and subsidiary cells of 1:6 and 1:4 of open and closed stomata, respectively, were estimated. The obtained results could be conclusively embedded in a model that decribes the shuttle transport of ions between guard and subsidiary cells during light-induced stomatal movement. 2. Patch clamp studies on guard cells of A. thaliana CPK23- and OST1-loss-of-function mutants showed strongly reduced S-type anion currents after stimula-tion through Ca2+ or ABA compared to wild type. These in vivo data support the results of the working group of Prof. R. Hedrich (University Würzburg), that OST1 and CPK23 are directly interacting with the S-type anion channel in A. thaliana. The SLAC1-homologue gene SLAH3 is encoding for a nitrate perme-able S-type anion channel in guard cells. Since SLAC1-loss-of-funtion mutants generate S type anion currents when nitrate is the dominating anion or nitrate is present in chloride-based solutions, SLAH3 seems to represent an alternative pathway for anion efflux in guard cells. 3. The R-type anion channels from Arabidopsis thaliana guard cells were electro-physiologically characterized and revealed similar electrical characteristics as those known from Vicia faba guard cells: strong voltage dependence, fast activa-tion- and deactivation kinetics. In contrast to Vicia faba, however, the voltage dependence was not modulated by external malate. But in the presence of exter-nal malate the current response in ALMT12-loss-of-function mutants was strongly reduced, while similar anion currents were monitored in wild type and almt12 mutant plants in the absence of external malate. These results indicate that ALMT12 is likely responsible for the malate-activating component of the R-type anion channel.
KW  - Schließzelle
KW  - Spaltöffnung
KW  - Anionentranslokator
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Mais
KW  - Schließzellen
KW  - Stomata
KW  - Anionenkanäle
KW  - Arabidopsis
KW  - anion channel
KW  - guard cell
KW  - maize
KW  - arabidopsis
KW  - stomata
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49267
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stange, Annette
T1  - Beziehung zwischen Ca2+-Homöostase und Aktivität der S-Typ Anionenkanäle in Schließzellen
T1  - Relation of Ca2+-homeostasis and activity of S-type anion channels in guard cells
N2  - Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosphäre, indem sie die Öffnungsweite von Poren in der Epidermis von Blättern, sog. Stomata, verändern. Bei Wassermangel werden die stomatären Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgelöst, welches eine Aktivierung von Anionenkanälen in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkanäle ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkanäle führt, nur lückenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkanäle untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration für eine Aktivierung der Anionenkanäle ausreicht. Für diese Studien wurde hauptsächlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die Möglichkeit Anionenkanäle durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgelöst wurden und gleichzeitig die Ströme, die über die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei führte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erhöhung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration während des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zunächst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration auslöste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden Fällen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kanäle beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgelöst wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivität der Schließzellen während einer langen Depolarisation findet möglicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kanäle und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkanälen. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkanäle durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorgänge über die Plasmamembran wurde auch in Drüsenzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale nötig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszulösen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Drüsen nicht direkt mit Ca2+-Flüssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abhängigen Aktivierung scheinen Anionenkanäle in Drüsen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabhängigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabhängige Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abhängigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivität zeigten. Die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkanäle vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden könnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenströme waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivität gegenüber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollständige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatidsäure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollständigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatidsäure im ABA-Signalweg hinweisen könnte.
N2  - Plants regulate gas exchange with the atmosphere by changing the aperture of pores in the epidermis of leaves, which are called stomata. Upon water deficiency, stomatal pores close to minimize water loss. This process is initiated by the phytohormone ABA, which induces activation of anion channels in the plasma membrane of guard cells. Even though activation of anion channels is a central element in the response to ABA, the signalling pathway, leading to the activation of anion channels, is still not understood. This work focuses on the role of signalling intermediates like protein kinases, protein phosphatases, lipid-based messengers and Ca2+ in the activation of anion channels. With regard to Ca2+, the generation of Ca2+-signals and the extent to which a rise in the cytosolic free Ca2+-concentration is sufficient for the activation of anion channels was studied. For this purpose, especially the double electrode voltage clamp (DEVC) technique was used in combination with FURA-2 based Ca2+-imaging. The ability of Ca2+ to activate anion channels was tested by evoking Ca2+-signals in guard cells of intact Nicotiana tabacum plants by either clamping the plasma membrane to hyperpolarized or depolarized voltages and simultaneously measuring plasma membrane currents. Thereby a transient elevation of the cytosolic free Ca2+-concentration directly followed the hyperpolarization, whereas depolarization initially induced lowering of the cytosolic free Ca2+-concentration, followed by a transient Ca2+-increase after returning to the holding potential. This suggests that hyperpolarization-activated Ca2+-channels are involved in both Ca2+-responses and that the threshold potential of the guard cell at which a Ca2+-signal is generated shifts to more positive values after a prolonged depolarization. Modulation of the voltage sensitivity of the guard cell during a prolonged depolarization might be due to activation of Ca2+-channels and/or inhibition of Ca2+-transport proteins by a low cytosolic free Ca2+-concentration. The transient elevation of the cytosolic free Ca2+-concentration, induced by hyperpolarization or prolonged depolarization, correlated with a transient activation of S-type anion channels. Analysis of the Ca2+-concentration and time dependence showed that S-type anion channels are activated by Ca2+ in a fast signalling pathway with a half maximal cytosolic free Ca2+-concentration of 515 nM (SE=235, n=33). The mean saturated S-type anion current was -349 pA (SE=107, n=33) at -100 mV. The effect of Ca2+ on plasma membrane transport processes was also studied in gland cells of Dionaea muscipula. In this cell type, a mechanical stimulation of trigger hairs induced a Ca2+-signal, whereby more than two action potentials were needed for a transient increase in the cytosolic free Ca2+-concentration. This data indicates that that the depolarization-phase of the action potential is not directly coupled to Ca2+-fluxes. Instead of a Ca2+-dependent activation, anion channels in glands of Dionaea muscipula thus seem to be activated by a Ca2+-independent signalling pathway. This type of activation mechanism can also be found in ABA-signalling in guard cells. There, a Ca2+-independent activation of S-type anion channels involves protein kinases like OST1 and CPK23, a process that is negatively regulated by the protein phosphatase ABI1. In this work, the redundancy between OST1 and CPK23 as well as components of the Ca2+-dependent signalling pathway could be shown in DEVC experiments with ost1-2 and cpk23-mutants of Arabidopsis thaliana, which still showed S-type anion channel activity. Furthermore, the activity of S-type anion channels in Arabidopsis thaliana mutants lacking the S-type anion channel SLAC1 indicates that redundant S-type anion channels exist, which might be activated by other protein kinases as well. ABA-induced S-type anion currents could also be measured in abi1-transformed Nicotiana tabacum plants, although these plants showed a reduced sensitivity to ABA compared to wildtype plants, suggesting an incomplete inhibition of the ABA-signalling pathway. The redundancy of intermediates in the ABA-signalling pathway could also be seen in studies with the lipid-based messenger phosphatidic acid, which only induced a slow and incomplete stomatal closure. However, this could point at a minor role for phosphatidic acid in the ABA-signalling pathway, as well.
KW  - Schließzelle
KW  - Plasmamembran
KW  - Schmalwand <Arabidopsis>
KW  - Abscisinsäure
KW  - Venusfliegenfalle
KW  - Aktionspotenzial
KW  - S-Typ Anionenkanal
KW  - Ca2+-Signal
KW  - FURA
KW  - Tabak
KW  - S-typ anionchannel
KW  - Ca2+-signal
KW  - FURA
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52131
ER  - 
TY  - THES
A1  - Konrad, Kai Robert
T1  - Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba
T1  - Investigation of the early ABA-induced electric responses of Vicia faba guard cells
N2  - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren.
N2  - Within the framework of this dissertation the perception and early signal transduction chain of the phytohormon ABA was investigated with the Patch-Clamp-technique in Vicia faba guard cell protoplasts. It was discovered that the ABA-signalling chain to activate plasma-membrane anion channels likely implied a protein kinase and was triggered through a cytosolic ABA-perception. The ABA-induced anion channel activation leads to plasma membrane depolarization. Based on the ABA-evoked depolarization response a method was developed to monitor and quantify membrane potential changes in populations of Vicia faba guard cell protoplasts with the voltage-sensitive dye DiBAC4(3).
KW  - Schließzelle
KW  - Membranpotenzial
KW  - Anionentranslokator
KW  - Ackerbohne
KW  - Abscisinsäure
KW  - DiBAC4(3)
KW  - guard cell
KW  - anion channel
KW  - membrane potential
KW  - abscisic acid
KW  - DiBAC4(3)
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27216
ER  - 
TY  - THES
A1  - Steinmeyer, Ralf
T1  - Untersuchungen und Simulationen zur Koordination der Ionenflüsse bei der Schließzellbewegung in Vicia faba und Arabidopsis thaliana
T1  - Studies and Simulations about the Coordination of Ion Fluxes during the Guard Cell Movement in Vicia faba and Arabidopsis thaliana
N2  - Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte.
N2  - While the function of stomata as well as of the different proteins involved in ion fluxes across the plasma membrane are well understood, a guard cell specific model for the concerted function and coordination is still missing. Results - KAT1, the inward rectifying potassium channel from Arabidopsis thaliana is well characterized in terms of structure and electrophysiological function. A knock-out mutant of this channel should be restrained in stomatal opening. Nevertheless under different conditions, with light or fusicoccin as opening stimulus, no difference could be found between wild type and KAT1::En-1 mutant plants. - Glucose is found to accumulate in guard cells during the day when stomata are opened and it is thus suggested to contribute to the osmotical pressure for opening. The uptake of a fluorescent glucose derivative was found to be light dependent and impaired by addition of CCCP which eliminates the proton gradient across the plasma membrane. - A knock-out mutant of the proton/sugar cotransporter protein AtSTP1 showed a significant reduction of cells showing 2-NBDG fluorescence as compared to the wild type. This shows a prominent contribution of this transporter to the uptake of glucose. - Changes of the free running membrane potential upon light/dark transitions were measured in guard cells of intact Vicia faba plants. A majority of these cells showed repeatable hyperpolarizations in light and depolarizations in darkness. These changes in potential were mainly driven by the (in-)activation of an instantaneous positive current of about 35 mA, most probably the H+-ATPase. - In a biophysical simulation, the dependence of anion channel, inward as well as outward rectifying potassium channels and proton pump on cytosolic and apoplastic ion concentrations, pH and membrane potential were included to build a model of ion fluxes for stomatal movements. Also included were literature values for channel conductance and the kinetics of concentrations during stomatal movements. - From this model, two main predictions were made for the cooperation of transport proteins in stomatal movements: 1. At the end of the opening phase of stomata, the H+-ATPase must be deactivated, since otherwise the cytosolic potassium concentration would rise and the membrane potential would decrease both to values that were never reproduced in measurements. A desensitization of the H+-ATPase was already found after pulses of blue light, but never upon permanent white light. 2. The proton/chloride cotransporter not only needs to be active during stomal opening for chloride uptake, but also during closure. Since in guard cells of open stomata, the concentration of potassium is higher than that of chloride, a 1:1 efflux of both ions would soon end the depolarization needed for further potassium efflux. To overcome this, a chloride cycle is suggested, where the cotransporter is active and keeps the net efflux of chloride small. - Different loading techniques were tested for fluorescent calcium indicator dyes. Incubation at low pH, for the free acid form as well as low temperature for the acetoxymethyl-ester forms of the dyes were shown to be impossible in Vicia faba guard cells. During the work on this thesis, one example for a detergent-aided loading of free acid dyes was published. - For parallel recording of electrophyiological parameters and cytosolic ion concentrations, an injection technique was tested that operates by regulated air pressure on one barrel of a double-barreled pipette. The other barrel was used for measurements of the membrane potential. Experiments with a discontinuous voltage clamp amplifier failed, since the target voltage was not reached probably due to non-compensable, variable pipette capacities.
KW  - Ackerbohne
KW  - Schließzelle
KW  - Ionenkanal
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Schließzelle
KW  - Ionenkanal
KW  - Apoplast
KW  - Membranpotential
KW  - guard cell
KW  - ion channel
KW  - apoplast
KW  - membrane potential
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17098
ER  -