TY - THES A1 - Dietrich, Claudia T1 - Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle für die Virulenz von Legionella pneumophila T1 - Molecular studies of flagellar function in Legionella pneumophila virulence N2 - Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein fakultativ intrazelluläres, ubiquitär vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilität der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen können, ist bisher noch nicht geklärt. Um etwas über noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region näher charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst kürzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide“-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adhärenz, Invasion, intrazellulärer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle für das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilitätsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gewählten Versuchsbedingungen bezüglich des Adhärenzvermögens der Stämme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz für die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgeprägt. Hinsichtlich der intrazellulären Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings führte vermutlich die Reduktion der Invasivität zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream“-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp überlappend, das Gen motB an, welches für den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilität an Vorgängen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adhärenz und die intrazelluläre Vermehrung nicht beeinträchtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst kürzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream“ auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabhängig reguliert werden. N2 - Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires´ disease, lives as a facultative intracellular bacterium in the environment and has the capability to survive and replicate both in protozoa and human phagocytic and non-phagocytic cells. The role of flagella and motility in the infection of host cells still has to be determined. To better characterize the flaA-region of Legionella and to learn about the organisation of flagellar genes, two clones of a cosmid library harbouring this region from the genome of L. pneumophila Philadelphia I have been sequenced. Upstream of flaA, leading in the opposite direction, the metabolic genes accD and folC could be identified. Downstream of flaA the flagellar genes flaG, fliD, coding for the flagella-capping-protein, and fliS are located. Further downstream, two ORFs with homologies to the recently described Legionella genes enhA and milA have been identified. To investigate the influence of the flagella on the infection process, the flaA negative mutant strain KH3, where the flaA gene was inactivated by insertion of a kanamycin cassette, was complemented. This could be achieved, using the suicide vector pMSS704, by integration of the intact flaA gene back into the chromosome, leading to the complemented strain CD10. It could be shown by Western blotting that strain CD10 regained the ability to express the flagellin protein. Electronmicrographs also confirmed the presence of intact assembled flagella. Using the three strains, L. pneumophila Corby wild-type, the flaA mutant KH3, and the complemented flaA mutant CD10, the behaviour of the flagellated and non flagellated strains was investigated concerning encountering, adherence, invasion, intracellular multiplication and lysis of host cells. Both protozoa (A. castellanii) and human phagocytes (HL-60 cells and freshly isolated blood monocytes) have been utilized as potential host cells. It could be shown that flagellation enables the bacteria to reach the cells. In contrast, when the motility defect was artificially overcome by centrifugation, no difference in attachment of the three strains could be detected in our experiments. However, there was a significant reduction in the invasion efficiency for the flaA negative strain which was extremely relevant to the invasion of human phagocytes. Concerning the intracellular replication rate no difference could be observed, although most likely the defect in infectivity of the flaA mutant leads to a slower growth curve in the HL-60 model when using low MOIs. For the flaA mutant strain KH1, an unexpected decrease in cytotoxicity could also be observed. However, as the flaA mutant KH3 showed wildtype behaviour in this respect, the defect is most probably independent of flagellation. The sequencing of the cosmid library clone 12/44, harbouring the genes fliA and motA, showed the clustering of further flagellar genes of Legionella. Upstream of fliA two genes could be identified, showing high similarities to the putative flagellar regulator genes motR and flhF, respectively. Downstream of motA, overlapping by 26 bp, motB is located. It also plays a major role in the function of the flagellar motor and is followed by an ORF of unknown function. Still further downstream an ORF with homologies to prfB of E. coli could be sequenced. Southern blot analysis of different Legionella-strains with a motA specific probe gave positive signals for all L. pneumophila strains, as well as for some non-pneumophila strains (e. g. L. gormanii, L. jordanis, and L. bozemanii). By insertion of a kanamycin cassette into the motA gene of L. pneumophila Corby, a motA negative mutant could also be constructed. Western blot analysis and electronmicrographs confirmed that flagellin was still expressed and assembled into flagella, while light microscopy demonstrated the inability of the mutant to swim due to the impaired flagellar motor. Experiments with A. castellanii and HL-60 cells revealed the importance of motility for the finding and the invasion of host cells as already demonstrated for the flaA mutant, while intracellular replication was not affected. Recently, a gene (flaR) has been described for L. pneumophila Corby, belonging to the LysR-familiy of transcriptional regulators. It could be shown that this regulator is able to bind both to its own promotor as well as to a lower extent to the flaA promotor. Southern hybridization of different Legionella species with a flaR specific probe revealed that FlaR must be a L. pneumophila specific factor, only being present in L. pneumophila strains, together with an upstream gene (ORF234), which is leading in the opposite direction. Fusions of the promotor regions of the two genes with the reporter gene gfp (green fluorescent protein gene) demonstrated that both promotors are actually functional in Legionella, being more active at 37°C than at 30°C. Furthermore, their activity during intracellular replication in amoebae could be demonstrated. In conclusion, the flagellum and the motility, both subject to strict regulation, are of great importance to Legionella´s ability to reach and infect potential host cells KW - Legionella pneumophila KW - Virulenz KW - Geißel KW - Molekularbiologie KW - Legionellen KW - Flagelle KW - Virulenz KW - Invasion KW - intrazelluläre Vermehrung KW - Legionella KW - flagella KW - virulence KW - invasion KW - intracellular multiplication Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1081 ER - TY - THES A1 - Fajardo-Moser, Marcela T1 - Untersuchung der Legionella-Infektion in der genetisch manipulierbaren Amöbe Dictyostelium discoideum T1 - Analysis of the Legionella infection in the modelorganism Dictyostelium discoideum. N2 - Die haploide Amöbe Dictyostelium discoideum hat sich als geeinet erwiesen für die Untersuchung der zellulären Aspekte der Legionella Infektion. Nach der Aufnahme befindet sich L. pneumophila innerhalb eines unreifen Phagosoms das weder angesäuert wird noch mit Lysosomen fusioniert. In dieser Studie wurden die Wirtzellfaktoren untersucht, die Legionella eine erfolgreiche Kolonizierung des Wirt ermöglichen. Phagozytoseversuche mit spezifischen zellulären Inhibitoren und die Analyse der Aufnahme in definierten Wirtzell-Mutanten haben gezeigt, daß das zytoplasmatische Kalziumniveau, Zytoskelettproteine und die Kalzium-bindenden Proteine des ERs, Calreticulin und Calnexin, spezifisch die Aufnahme und das intrazelluläre Wachstum von L. pneumophila beeinflussen. Mikroskopisches Untersuchungen mit GFP-markierten Calnexin und Calreticulin haben gezeigt, dass beide Proteine spezifisch in den "phagocytic cups" der L. pneumophila-infizierten Wirtszellen akkumulieren. Beide Proteine umhüllten die replikative Vakuole von L. pneumophila während der gesamten Replikation des Bakteriums. Die kumulativen Effekte intrazellulären Kalziumniveaus, die räumliche Verteilung von Calnexin und Calreticulin und die Defekte Aufnahme und intrazelluläre Vermehrung von L. pneumophila im Calnexin- und Calreticulin-minus der Zellen deuten darauf hin, daß diese Faktoren ein Teil des Regulationssystems sind, der zu der Bildung der spezifische Vakuole von L. pneumophila führt. N2 - The haploid amoeba Dictyostelium discoideum is a versatile host system for studying cellular aspects of Legionella pathogenicity. Previous studies have shown that the internalization of L. pneumophila leads to an endoplasmic reticulum (ER)-derived organelle that supports intracellular replication of the bacteria. In this study a roadmap of host-cell factors involved in this process was developed. Phagocytosis assays with specific cellular inhibitors and the effects of well defined host-cell mutants revealed that cytoplasmic calcium levels, cytoskeleton-associated proteins and the calcium-binding proteins of the ER, calreticulin and calnexin, specifically influence the uptake and intracellular growth of L. pneumophila. Confocal microscopic time series with green fluorescent protein (GFP)-tagged calnexin and calreticulin demonstrated the accumulation of both proteins in the phagocytic cup of L. pneumophila-infected host cells. In contrast to the control experiment with Escherichia coli-containing phagosomes, both proteins decorated the replicative vacuole of L. pneumophila during the entire growth phase of the bacteria. The cumulative effects of cytosolic calcium levels, the spatial distribution of calnexin and calreticulin, and the defective invasion and replication of L. pneumophila in calnexin- and calreticulin-minus cells suggest that these factors are part of a regulatory system that leads to the specific vacuole of L. pneumophila. KW - Dictyostelium discoideum KW - Legionella pneumophila KW - Infektion KW - Molekularbiologie KW - Legionella KW - Dictyostelium KW - Phagozytose KW - ER KW - Legionella KW - Dictyostelium KW - Phagocytosis KW - ER Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21355 ER - TY - THES A1 - Hägele, Sonja T1 - Wirtsspezifität der Gattung Legionella und Etablierung von Dictyostelium discoideum als Wirtsmodell T1 - Host Specifity of the Genus Legionella and Establishment of Dictyostelium discoideum as a Host Model System N2 - Bei der Gattung Legionella handelt es sich um aquatische Stäbchenbakterien, die sich intrazellulär in verschiedenen Protozoen vermehren können. Neben der Nutzung des Protozoenwirtes können humanpathogene Legionella-Spezies in den Alveolarmakrophagen des menschlichen Respirationstraktes replizieren. Diese Besiedelung der Lunge kann zu einer atypischen Pneumonie, der Legionärskrankheit, führen. Humanpathogene Vertreter der Gattung Legionella weisen somit ein duales Wirtssystem auf. Die Wirtsspezifität phylogenetisch verschiedener Legionella Spezies wurde bislang nicht systematisch analysiert. Mit Hilfe von Infektionsversuchen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass für unterschiedlichste Legionella Spezies Acanthamoeba castellanii ein gut geeigneter Wirt darstellt. Hartmannella vermiformis und Naegleria gruberi ermöglichen dagegen nur einem eingeschränkten Legionella-Spektrum ein intrazelluläres Wachstum. Die jeweils höchsten Vermehrungsraten zeigten dabei in allen Amöben die Umweltisolate LLAP 10 und L. lytica sowie der humanpathogene Stamm L. pneumophila Corby. Außerdem scheint die Virulenz humanpathogener Legionellen-Spezies korreliert zu sein mit der Nutzung eines breiten Wirtsspektrums. Ciliaten wie Tetrahymena pyriformis sind im Gegensatz zu den Amöben als Wirte nicht so gut geeignet. Im Vergleich zu den Amöben ist sowohl die Anzahl der sich intrazellulär in T. pyriformis replizierenden Legionella-Spezies sowie deren Replikationsrate erniedrigt. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es Dictyostelium discoideum als neues Wirtsmodell zu etablieren. Bei dieser gut erforschten Bodenamöbe stehen zahlreiche molekularbiologische Methoden für das Manipulieren des Genoms zur Verfügung. Somit ist es möglich, die während einer Infektion benötigten Wirtsfaktoren von Seiten der Amöbe näher zu untersuchen. Mittels Infektionsversuchen sowie fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Methoden konnte die intrazelluläre Replikation von LLAP 10, L. lytica und L. pneumophila in D. discoideum gezeigt werden. Für L. pneumophila konnte durch FACS-Analyse festgestellt werden, dass Bakterien dieser Legionella-Spezies genauso wie in den bisher untersuchten Wirtszellesystemen zu Beginn der Infektion in einem nicht angesäuerten Kompartiment vorliegen. Für alle weiteren verwendeten Legionella Spezies sowie hitzeabgetötete L. pneumophila und die Futterbakterien Klebsiella aerogenes konnte dagegen eine Ansäuerung des Phagosoms nachgewiesen werden. Kolokalisierungsstudien des lysosomalen Markers DdLIMP mit Legionellen bestätigte außerdem eine Inhibierung der Phagolysosomfusion bei L. pneumophila, nicht jedoch bei der sich nicht replizierenden Spezies L. hackeliae. Die Untersuchung einer spezifischen Profilin-minus Dictyostelium-Mutante offenbarte eine erhöhte Phagozytoserate von Legionellen durch die Wirtszellen. Daraus resultierte auch eine leicht gesteigerte intrazelluläre Vermehrungsrate dieser Bakterien. Profilin ist ein Aktin-bindendes Protein und an der Regulation von Aufnahmeprozessen beteiligt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung Bakterien-haltiger Phagosomen aus D. discoideum etabliert. Die magnetische Reinigung von Phagosomen über paramagnetische, Bakterien-konjugierte Beads erwies sich als nicht praktikabel. Die daraufhin entwickelte Anreicherung der Phagosomen über Dichtegradienten-Zentrifugation erforderte jedoch zusätzlich die Eliminierung kontaminierender Lysosomen und Mitochondrien. Die Analyse des phagosomalen Proteoms erfolgte mittels Messung von Enzymaktivitäten und Western-Blotting-Experimenten. Dabei konnten keine quantitativen Unterschiede typischer lysosomaler Marker zwischen gereiften und ungereiften Phagosomen mit lebenden bzw. toten L. pneumophila detektiert werden. Ebenso verlief der Vergleich von ungereiften LLAP 10-haltigen Phagosomen und gereiften Klebsiella-haltigen Phagosomen. Dagegen zeigte die 2D-Gelelektrophorese des phagosomalen Proteoms vier Proteine, die in Phagosomen mit toten L. pneumophila Corby stärker exprimiert waren als in Phagosomen mit lebenden Legionellen. Weiterhin wurde ein Protein detektiert, das für Phagosomen, die lebende L. pneumophila Bakterien beinhalten, spezifisch ist. Dabei könnte es sich um einen von L. pneumophila zur Replikationsvakuole rekrutierten Wirtsfaktor handeln. N2 - Legionella pneumophila is the causative agent of Legionnaires’ disease. It is able to replicate in cells of the respiratory tract namely the alveolar macrophages. In the environment, L. pneumophila, like other Legionellae lives in fresh water habitats and replicates intracellularly in protozoa. Therefore the pathogenic species of the genus Legionella possess a dual host system. Until now, very little is known about the host specificity of phylogenetically different Legionella species. This work revealed that the amoeba Acanthamoeba castellanii can serve as a host for most of the Legionella species tested. In contrast, in Hartmannella vermiformis and Naegleria gruberi only a reduced number of different Legionella species are able to replicate intracellularly. In all three amoeba species the environmental isolates LLAP 10 and L. lytica, as well as the pathogenic L. pneumophila, showed the highest replication rate among the Legionella species tested. In the ciliate T. pyriformis, the number of replicating Legionella species and the replication rate are diminished. Therefore amoebae are more suitable than ciliates as a host for Legionella infections. A major aim of this work was to establish Dictyostelium discoideum as a new host model system. This soil amoeba is genetically well studied. Furthermore, there are several different methods for the manipulation of the genome. Therefore it is possible to examine the host-pathogen interaction from the perspective of the host. The intracellular replication of LLAP 10, L. lytica and L. pneumophila in D. discoideum has been shown by determination of CFU-values in infection assays, as well as by fluorescent and electron microscopy methods. For L. pneumophila, it could be shown with FACS-analysis that the bacteria live in a phagosome with an almost neutral pH. This corresponds to the observed results in phagosomes in human macrophages and amoebae. All other Legionella species, as well as the food bacterium Klebsiella aerogenes, and heat killed L. pneumophila, are found in an acidic vesicle. Moreover, phagolysosom fusion was inhibited by L. pneumophila as demonstrated by co-localization studies with the lysosomal marker DdLIMP. No co-localization could be shown with L. pneumophila, while non replicating Legionellae clearly indicated that DdLIMP was integrated in the phagosomal membrane. Using a specific profilin minus mutant of Dictyostelium it could be shown by FACS-analysis that the uptake of Legionellae in these mutant cells occurs with a higher phagocytosis rate. Furthermore, the intracellular replication rate of Legionella bacteria is slightly increased. Profilin is an actin binding protein which is involved in regulation uptake processes. A method for isolating bacteria containing phagosomes from Dictyostelium was also established. Because it was not possible to isolate bacteria labeled bead phagosomes magnetically, a density gradient centrifugation was used. Contaminating lysosmes were eliminated by loading these organelles with iron particles and the use of an electromagnet. Contaminating mitochondria were eliminated by “heavy labeling” the organelles with a substrate for the succinat dehydrogenase and thereby increasing the specific density. Analysis of the phagosomal proteom occurred by measuring enzyme activities and western blotting experiments. No differences in the amount of lysosomal markers could be detected between phagosomes harboring living or dead L. pneumophila and phagosomes harboring LLAP 10 or K. aerogenes, respectively. In contrast, 2D gel electrophoresis revealed four proteins expressed in a greater amount in phagosomes containing dead L. pneumophila, and one protein specific for proteins harboring living L. pneumophila. This protein could be a host factor which is recruited to the phagosome by L. pneumophila KW - Legionella KW - Dictyostelium discoideum KW - Wirtsspezifität KW - Phagosom KW - Legionella KW - Dictyostelium KW - Wirtsspezifität KW - Phagosomen KW - Legionella KW - Dictyostelium KW - host specificity KW - phagosoms Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4256 ER - TY - THES A1 - Schwedhelm, Kai Florian T1 - Optimierte Methoden der Magnetresonanz-Spektroskopie zur molekularen Charakterisierung neuartiger Wirkstoffe gegen Infektionskrankheiten T1 - Optimized methods in nuclear magnetic resonance spectroscopy for charakterization of novell agents against infectious diseases N2 - In diesem Projekt wurde die Wechselwirkung des PPIase-Enzyms MIP mit Kollagen IV unter- sucht. MIP ist maßgeblich für die Infektiösität von Legionella pneumophila verantwortlich, einem Bakterium, welches im Menschen schwere Lungenentzündungen auslösen kann. Das Enzym zeigt eine hohe Affinität gegenüber einem kurzen Peptidsequenzabschnitt in Kolla- gen IV (genannt „P290”), welches unter anderem im Epithel der Lunge zu finden ist. Die Interaktionsoberfläche der Moleküle wurde durch den Einsatz eines paramagnetischen Spin-Labels in NMR-Experimenten charakterisiert. Mit Hilfe von Docking und Moleküldy- namiksimulationen konnte aus diesen Daten ein Modell des MIP-Kollagen-Komplexes be- rechnet werden. Es wurde gezeigt, dass MIP als Dimer in der Lage ist, nach Kollagen IV zu „greifen” und sich dann an das Molekül heranzuziehen. Wahrscheinlich dient dieser Mechanismus der Adhä- sion von L. pneumophila an die Wirtszelle. Neben der zuvor postulierten Destabilisierung von Kollagen IV durch MIP, welche hier nicht beobachtet wurde, könnte die Adhäsion ein wichtiger Faktor für die Virulenz von L. pneumophila sein. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des isolierten Peptids P290 auf die biologische PPIase-Aktivität von MIP untersucht. Durch NMR-Messungen und anschließenden Mole- küldynamiksimulationen konnte gezeigt werden, dass P290 sich stabil in die Bindungsta- sche von MIP einlagert und durch den Sequenzabschnitt -CYS130-PRO131---TRP134- das Enzym blockiert. Die übrigen Aminosäuren in P290 dienen der Stabilisierung des Kom- plexes und sorgen für die Selektivität von P290, welches, im Unterschied zu bekannten Wirkstoffen, das humane Homolog zu MIP nicht inhibiert. Die Vorhersagen der Simulatio- nen konnten durch ein Peptid Microarray und Messungen der enzymatischen Aktivität von MIP in PPIase-Assays bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden zur Optimierung von P290 eingesetzt, indem die Peptidsequenz durch den Austausch zweier Aminosäuren verändert und das Molekül zu einem Ring geschlossen wurde. Die entstandene Struktur besitzt deut- lich verbesserte Bindungseigenschaften und könnte künftig als Basis für eine neue Klasse von Wirkstoffen gegen L. pneumophila dienen. In diesem Projekt wurde eine Methode zur Aufklärung der Molekülstruktur neuartiger Wirkstoffe gegen Malaria im Komplex mit ihrem paramagnetischen Zielmolekül etabliert und weiterentwickelt. Die Vorgehensweise leitet intermolekulare Distanzinformationen aus der sog. paramagnetischen Relaxation ab, einem Effekt, der den Einsatz klassischer Me- thoden zur Molekülstrukturaufklärung mittels NMR verhindert. Es werden drei Parameter durch NMR-Spektroskopie bestimmt: 1. die longitudinale Relaxationszeit der Wasserstoff- atome in Wirkstoffmolekül, 2. die effektive Korrelationszeit des Komplexes und 3. der Spin- Zustand des Eisenions im Zielmolekül. Mit Hilfe dieser Messmethode konnte die Komplexstruktur mehrerer bekannter Medika- mente gegen Malaria aufgeklärt werden. Weiterhin wurden zwei neue Klassen von Wirkstof- fen untersucht, die C,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide und die N,C-gekoppelte Naphthylisoquinolin-Alkaloide. In Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen aus der Literatur lagern sich die Wirkstoffe stets um einen Winkel geneigt und in Richtung des Randes des Zielmoleküls verschoben an. Diese Konfiguration maximiert die attraktiven π- π-Wechselwirkungen zwischen den Molekülen. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse aus NMR, UV-Spektroskopie und Massenspektrome- trie konnte die Existenz eines bisher nicht bekannten Tetramer-Komplexes nachgewiesen werden, welcher eine wichtige Zwischenstufe in der Biokristallisation von Hämozoin durch die Malariaparasiten darstellen könnte, und Ansatzpunkte für den weiterhin nicht vollstän- dig bekannten Wirkmechanismus der meisten Antimalaria-Wirkstoffe liefert. Für die Naphthylisoquinolin-Alkaloide zeigte sich weiterhin, dass Wasser eine essenzielle Rolle in der Komplexbildung spielt. In Moleküldynamiksimulationen der N,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide konnte die Entstehung einer Wasserstoffbrücke zwischen Wirkstoff und Zielmolekül gezeigt werden, welche einen zusätzlichen Weg der Komplex- stabilisierung neben den bereits bekannten π-π-Wechselwirkungen aufzeigt. Die N,C-NIQs konnten erstmals auch bei einem pH-Wert von 5,6 beobachtet werden, einer chemischen Umgebung wie sie auch in-vivo in der Verdauungsvakuole des Malariaparasiten herrscht. N2 - Summary Even in the 21st century, infectious diseases remain the predominant cause of death world- wide. According to reports of the World Health Organisation, 2 million people die of Malaria every year, most of which are children under the age of five years. Respiratory infections claim an additional 3.9 million lives. Other infections are held responsible for a total of more than 10 million deaths. Global climate change leads to the occurrence of tropical in- fections well beyond their former endemic regions. Additional challenges arise due to the growing number of resistant organisms, rendering most known treatments ineffective. To achieve sustained success in the fight against infectious diseases, a detailed understan- ding on the mode of action of newly developed substances on a molecular level is essential. In this thesis, magnetic resonance spectroscopy is used as a tool for molecular structure determination. My results may offer incentives for the development of new agents against infectious diseases and their continuous optimization. 4.1 The MIP-collagen IV complex The scope of this project was to investigate the interaction between the PPIase enzyme MIP and the NC1 (non-collagenous 1) domain of collagen IV. The MIP (macrophage infectivity potentiator) protein is the major virulence factor of Legionella pneumophila, a bacterium causing severe lung infections in humans. MIP exhibits high affinity towards a short peptide sequence in collagen IV (“P290”). Amongst others, this type of collagen is found in the epithelial cells of the lung. In this work, the interface of interaction between P290 and MIP was mapped using a pa- ramagnetic spin label in combination with nuclear magnetic resonance spectroscopy expe- riments. Labeled P290 strongly enhances the relaxation rates of individual amino acids in MIP, which are in the immediate vicinity (within 1 nm) of the spin label. The enhancedrelaxation rates were detected through T2-sensitive HSQC experiments. Subsequently, re- sults were incorporated in docking and molecular dynamic (MD) simulations to compute a model of the MIP-collagen IV complex. Results show the MIP dimer “grabbing” collagen IV with both enzymatic domains and pul- ling the molecules closer together. We suggest that this molecular adhesion mechanism may play a key role in the invasion of host tissue by L. pneumophila. A possible destabilization of collagen IV through the enzymatic activity of MIP, as suggested previously by other groups, was not observed. Additionally, our co-operation partners were able to demonstrate that P290, as an indi- vidual peptide, inhibits the biological PPIase activity of MIP, while leaving human homo- logue enzymes untouched. My findings from NMR measurements and subsequent MD si- mulations showed that P290 occupies the MIP binding pocket via the amino acid sequence -CYS130-PRO131---TRP134-. This sequence element is stabilized via the attachment of the terminal residues of P290 to the surface of MIP, thereby enabling P290 to distinguish between MIP and human enzymes. Based on these results, we constructed optimized versions of P290 by ring closure and repla- cement of two amino acids. Our co-operation partners showed that the resulting structures exhibit improved binding properties on a peptide microarray and may provide the basis for a new class of inhibitors targeting Legionella pneumophila. 4.2 Structure elucidation of paramagnetic complexes for- med by novel antimalarial agents We used paramagnetic NMR spectroscopy to characterize the formation of complexes of several antimalarial compounds with their presumed target “heme”. A paramagnetic Fe(III) ion is located at the center of heme, which influences the longitudinal relaxation rates of nearby proton spins. This effect interferes with common strategies for NMR structure elucidation, but in this study was taken advantage of in a newly developed method to map intermolecular distances with high precision using NMR inversion recovery experiments at 9.4 T, 14.1 T, 17.6 T, and 18.8 T. This method was utilized to solve the molecular structure of known drugs against Mala- ria as well as two new classes of antimalarial agents (the C,C-coupled naphthylisoquinoline alkaloids and the N,C-coupled naphthylisoquinoline alkaloids) in complex with their target molecule: heme. In accordance with theoretical predictions from the literature, we sho- wed that the drug molecules align in a configuration maximizing attractive π-π stacking interactions between the molecules. In combination with findings from NMR, UV spectroscopy and mass spectrometry, we de- monstrated the formation of a previously unknown tetrameric complex. This complex may represent an important step in the mode of action of antimalarial drugs. Additionally, results from NMR measurements and molecular dynamics simulations provided insight into the important role of H2O for complex stabilization. We were able to demonstrate the formation of a so far undescribed hydrogen bond between drug and target. Furthermore, it was possible to investigate the N,C-coupled naphthylisoquinoline alkaloids at pH 5.6, which exactly matches the chemical environment in the food vacuole of the ma- larial parasite in-vivo. All these findings may contribute to a deeper understanding of the mode of action of new antimalarial agents. KW - NMR-Spektroskopie KW - Legionella pneumophila KW - Legionellen KW - Legionärskrankheit KW - Würzburg / Sonderforschungsbereich Erkennung KW - NMR KW - Malaria KW - Legionella KW - paramagnetic resonance KW - spin label Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38535 ER - TY - THES A1 - Weinmann, Erik T1 - Ein neues Konjugationsssystem in Legionella pneumophila Corby T1 - A new System for Conjugation in Legionella pneumophila Corby N2 - In dieser Arbeit wurde in Legionella pneumophila Corby ein bislang nicht in L. pneumophila beschriebener Bereich im Genom kloniert und sequenziert, der für ein putatives Konjugations- Typ IV Sekretionssystem kodiert. Alle für ein Typ IV Sekretionssystem notwendigen Gene sind vorhanden. Zum einen kodieren diese ein „mating pair formation“ System, also Proteine für die Pilusgenese und energieabhängigen Transport von Substraten aus der Bakterienzelle. Konjugationsexperimente zeigen, dass es sich bei den „DNA transfer and replication“ Genen trb/tra System um einen funktionierenden Mechanismus zur Mobilisierung von DNA handelt. N2 - This study explains a System for gene transfer in Legionella pneumophila, which is abscent in the recently published Legionella pneumophila genomes. All genes needed for energy dependent transfer of genetic material are included in this gene cluster. Mating experiments show that those genes are able to mobilize DNA in E.coli strains. KW - Legionella KW - Bakterielle Konjugation KW - Gentransfer KW - Legionella KW - Legionella pneumophila KW - Conjugation Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29485 ER -