TY - THES A1 - Englbrecht, Clemens T1 - Biochemische Rekonstitution und funktionelle Charakterisierung der Zusammenlagerungsmaschinerie spleißosomaler U snRNPs T1 - Biochemical reconstitution and functional characterization of the spliceosomal U snRNP assembly machinery N2 - Das Spleißen von prä-mRNAs stellt in der Expression eukaryontischer Gene einen essentiellen Reifungsschritt dar. Erst durch das exakte Entfernen von nicht-kodierenden Introns und Verbinden der kodierenden Exons kann die genetische Information am Ribosom in funktionelle Proteine umgesetzt werden. Spleißen wird durch das Spleißosom katalysiert, welches sich aus den small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4, U5 und U6 und einer großen Anzahl weiterer Proteinfaktoren zusammensetzt. Die snRNPs bestehen aus einer Uridin-reichen snRNA, spezifischen und generellen (Sm-)Proteinen. Die Sm-Proteine B/B`, D1, D2, D3, E, F, und G bilden einen heptameren Ring um die sog. Sm-Bindungsstelle der snRNAs. Während die Zusammenlagerung von Sm-Proteinen mit der RNA in vitro spontan ablaufen kann, wird dieser Prozess in vivo von zwei makromolekularen Proteinkomplexen assistiert, die als PRMT5- bzw. SMN-Komplex bezeichnet werden. Der PRMT5-Komplex (bestehend aus PRMT5, WD45 und pICln) agiert in der frühen Phase der Zusammenlagerung. Seine Hauptfunktion ist die symmetrische Dimethylierung der Sm-Proteine und die Stabilisierung von Sm-Proteinkomplexen durch das Chaperon pICln in zwei Intermediaten. Einhergehend mit dieser Aktivität werden auch Aggregation bzw. unspezifische Wechselwirkungen der Sm-Proteine mit RNAs verhindert. In der späten Phase der Zusammenlagerung löst der SMN-Komplex (bestehend aus SMN, Gemin2-8 und unrip) pICln-Intermediate auf, wobei dieser die Sm-Proteine en bloc übernimmt und sie auf die snRNA überträgt. Während dieser Reaktion wird pICln aus den Komplexen verdrängt. Ein Fehlen des SMN-Proteins, einer Schlüsselkomponente des SMN-Komplexes, führt zur autosomal rezessiven Erbkrankheit `Spinale Muskelatrophie` (SMA) wobei der Schweregrad der Krankheit invers mit der Menge an funktionellem SMN-Protein korreliert. Es wird vermutet, dass eine gestörte snRNP-Biogenese die Ursache der SMA ist. In der vorliegenden Arbeit sollte die U snRNP-Zusammenlagerungsmaschinerie aus rekombinanten Bausteinen rekonstituiert werden und so funktionellen und strukturellen Studien zugänglich gemacht werden. Folgende Resultate wurden in dieser Arbeit erhalten: 1) Im ersten Teil der Arbeit wurde eine experimentelle Strategie etabliert, welche die Rekonstitution des humanen SMN-Komplexes aus rekombinanten Untereinheiten erlaubte. Entscheidend hierfür war die Definition von Subkomplexen aufgrund einer Protein-Interaktionskarte. Die Subkomplexe konnten separat hergestellt und anschließend zum Gesamtkomplex vereinigt werden. 2) Die erfolgreiche Etablierung eines rekonstitutiven Systems erlaubte eine detaillierte biochemische Charakterisierung des SMN-Komplexes. Es konnte gezeigt werden, dass der rekombinante Komplex alle für die Biogenese von U snRNPs nötigen Schritte bewerkstelligen konnte. Dies schließt sowohl die Übernahme der Sm-Proteine aus den pICln-Intermediaten als auch das Verdrängen des Chaperons pICln und die Übertragung der Sm-Proteine auf die snRNAs ein. 3) Durch die Reduzierung des SMN-Gesamtkomplexes um Gemin3-5 auf einen SMN-Pentamer konnte dieser als ein funktioneller Kernbereich identifiziert werden, der die einzelnen Schritte der U snRNP-Biogenese vergleichbar mit dem gesamten Komplex bewerkstelligen konnte. Zudem agierte dieser reduzierte Komplex als notwendiger und ausreichender Spezifitätsfaktor der RNP-Zusammenlagerung. 4) Das rekombinante System ermöglichte erstmals SMN-Komplexe mit SMA-pathogenen Mutationen herzustellen und einer eingehenden funktionellen und strukturellen Untersuchung zu unterziehen. Die detaillierte Analyse der SMA-verursachenden Punktmutation SMN(E134K) offenbarte spezifische Defekte im Zusammenlagerungsprozess und damit Einblicke in die Pathophysiologie der Krankheit. Mit der im Rahmen dieser Arbeit etablierten Rekonstitution des rekombinanten SMN-Komplexes wurde die Grundlage für die detaillierte biochemische und strukturbiologische Untersuchung der Zusammenlagerungsmaschinerie spleißosomaler U snRNPs gelegt. Dieses experimentelle System wird auch bei der Aufdeckung der biochemischen Defekte hilfreich sein, die zur neuromuskulären Krankheit SMA führen. N2 - The splicing of pre-mRNAs is an essential step in the expression of eukaryotic genes. The precise excision of non-coding introns and joining of coding exons ensures that the genetic information can be translated into functional proteins at the ribosome. The spliceosome, which catalyzes the splicing reaction, is composed of the small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) U1, U2, U4, U5 and U6 and a large number of additional proteins. These RNPs consist of a uridine-rich snRNA, individual and common (Sm) proteins. The Sm proteins, termed B/B', D1, D2, D3, E, F and G form a heptameric ring around the so-called Sm-site of snRNAs and thus form a structural framework of all snRNPs termed Sm core. Although the assembly of the Sm core occurs spontaneously in vitro, this process is assisted by two macromolecular protein complexes in vivo referred to as PRMT5 and SMN complexes. The PRMT5 complex (consisting of PRMT5, WD45 and pICln) acts in the early phase of assembly. Its main functions are the symmetric dimethylation of Sm proteins and the stabilization of Sm protein complexes within two intermediates via the chaperone pICln. Along with this activity also aggregation and non-specific interactions of Sm proteins with RNAs are prevented. In the late phase of assembly, the SMN complex (consisting of SMN, Gemins 2-8 and unrip) binds to pICln-Sm intermediates, thereby taking over the Sm proteins en bloc and transfers them onto the snRNA. During this reaction pICln is displaced from the complexes. Reduced levels of the SMN protein are associated with the autosomal recessive disease `spinal muscular atrophy` (SMA) and the severity of the disease correlates inversely with the amount of functional SMN protein. It is therefore believed that the impaired biogenesis of snRNP is directly linked to the etiology of the disease. The aim of this thesis was to reconstitute the SMN complex from recombinant sources, thereby providing the basis for mechanistic and structural studies of this unique assembly machinery. The following results were obtained in the context of this study: 1) An experimental strategy was established, which allowed the reconstitution of the human SMN complex from recombinant subunits. To accomplish this goal, defined subcomplexes were identified based on a previously published protein interaction map. Components of these subcomplexes were co-expressed, purified and could eventually be combined to the complete SMN complex. 2) The successful establishment of a reconstitution system allowed the detailed biochemical characterization of the SMN complex. It was shown that the recombinant complex executed all necessary steps in the biogenesis of U snRNPs. This included proper transfer of Sm proteins from the pICln intermediates, the displacement of the chaperone pICln and the transfer of Sm proteins onto snRNAs. 3) The reconstitution of a SMN complex lacking Gemin3-5 allowed the definition of a minimal functional core, which was sufficient to commit all individual steps of the U snRNP biogenesis in vitro. This minimal complex was also necessary and sufficient to confer specificity of the assembly reaction. 4) The recombinant system established in this thesis further opened the possibility to analyze mutant SMN proteins implicated in SMA. The investigation of the SMA-causing missense mutation SMN(E134K) revealed specific defects in the assembly process, shedding light on the etiology of the disease. The reconsitutive system established in this thesis provides the basis for a detailed biochemical and structural investigation of the assembly machinery. It will also help to uncover biochemical defects directly linked to the neuromuscular disorder SMA. KW - Small nuclear RNP KW - Spleißosom KW - SMN-Komplex KW - pICln KW - SMN complex KW - pICln Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98168 ER - TY - THES A1 - Pelz, Jann-Patrick T1 - Strukturbiologische Untersuchungen zur Chaperone-vermittelten Zusammenlagerung spleißosomaler U-snRNPs T1 - Structural studies on the chaperone-assisted assembly of spliceosomal U snRNPs N2 - Durch die Spleißreaktion werden nicht-kodierende Sequenzelemente (Introns) aus eukaryotischen Vorläufer-mRNAs entfernt und die kodierenden Sequenzelemente (Exons) miteinander zu einem offenen Leserahmen verbunden. Dieser zentrale Prozessierungsschritt während der eukaryotischen Genexpression wird durch das Spleißosom katalysiert, das aus den vier kleinen nukleären Ribonucleoproteinpartikeln (snRNPs) U1, U2, U4/U6 und U5, sowie einer Vielzahl weiterer Proteinfaktoren gebildet wird. Alle snRNPs besitzen eine gemeinsame ringförmige Kernstruktur, die aus sieben gemeinsamen Sm-Proteinen (SmB/B‘-D1-D2-D3-E-F-G) besteht, die ein einzelsträngiges Sequenzmotiv auf der snRNAs binden. Während sich diese, als Sm-Core-Domäne bezeichnete Struktur in vitro spontan ausbilden kann, erfolgt die Zusammenlagerung in vivo in einem assistierten und hochregulierten Prozess. Dieser ist abhängig von insgesamt mindestens 12 trans-agierenden Faktoren, die in den PRMT5- und SMN-Komplexen organisiert sind. Der PRMT5-Komplex agiert in der frühen Phase der Zusammenlagerung, indem er die Sm-Proteine durch die Untereinheit pICln rekrutiert und die symmetrische Methylierung von Argininresten in den C terminalen Schwänzen von SmB/B‘, SmD1 und SmD3 katalysiert. Als Resultat dieser frühen Phase befinden sich die Sm-Proteine SmD1-D2-E-F-G und SmB/B‘-D3 in zwei getrennten und durch pICln organisierten Komplexen. Während SmB/B‘-D3-pICln am PRMT5-Komplex gebunden bleibt, existiert der zweite Komplex als freies Intermediat mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S. Diese Intermediate können nicht mit RNA assoziieren, sodass für die Fortsetzung des Zusammenlagerungsprozesses die Interaktion der Sm-Proteine mit pICln aufgelöst werden muss. Dies geschieht in der späten Phase der Sm-Core-Zusammenlagerung, in der die Sm-Proteine vom SMN-Komplex (bestehend aus SMN, Gemin2-8 und unrip) übernommen werden und pICln dissoziiert wird. Dadurch werden die Sm-Proteine für ihre Interaktion mit der snRNA aktiviert und können auf die Sm-Bindestelle transferiert werden, wodurch die Formierung des Sm-Core abgeschlossen wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe einer Kombination röntgenkristallographischer und elektronenmikroskopischer Methoden zwei wichtige Intermediate dieses Zusammenlagerungs-prozesses strukturbiologisch charakterisiert werden. Bei diesen Intermediaten handelt es sich um den 6S-Komplex, sowie um ein Sm-Protein-Transferintermediat mit einem Sedimentations-koeffizienten von 8S. In diesem ist der 6S-Komplex an zwei zentrale Untereinheiten des SMN-Komplexes (SMN und Gemin2) gebunden, während pICln den Komplex noch nicht verlassen hat. Der 8S-Komplex stellt daher ein „gefangenes“ Intermediat zwischen der frühen und späten Phase der Zusammenlagerung dar. Zunächst gelang es eine erste Kristallform des rekombinant hergestellten 8S-Komplexes zu erhalten, die jedoch keine Strukturlösung erlaubte. Durch eine kombinierte Optimierung der Kristallisationsbedingung und der verwendeten Proteine wurde eine weitere ähnliche Kristallform erhalten, mit der die Kristallstruktur des 8S-Komplexes gelöst werden konnte. Die Kristallisation des 6S-Komplexes gelang im Anschluss auf Basis der Hypothese, dass Kristalle beider Komplexe aufgrund der kompositionellen Verwandtschaft zwischen 6S und 8S auch Ähnlichkeiten in der Architektur ihrer Kristallgitter aufweisen könnten. Daher wurden innerhalb von pICln gezielt Aminosäuren substituiert, die sich innerhalb von Kristallkontakten der 8S-Kristalle befanden und konformationell eingeschränkt waren. Mit entsprechend rekonstituierten 6S-Präparationen konnten dann zwei Kristallformen erzeugt werden, die eine Strukturlösung des 6S-Komplexes ermöglichten. Durch die Kristallstruktur des 6S-Komplexes konnte für pICln eine strukturelle Mimikry der Sm-Proteine identifiziert werden. Diese ermöglicht eine Bindung der Sm-Proteine und eine frühzeitige topologische Organisation des Sm-Pentamers D1-D2-F-E-G in einer geschlossenen hexameren Ringstruktur. Die Kristallstruktur des 8S-Komplexes zeigt, wie der SMN-Komplex über Gemin2 an das Sm-Pentamer bindet. In Kombination mit einer EM-Struktur des 8S-Komplexes gelang es weiterhin, einen plausiblen Mechanismus für die Elimination von pICln und die Aktivierung der Sm-Proteine für die snRNA-Bindung zu formulieren. Somit konnten diese Arbeiten zu einem besseren Verständnis der Funktionen von trans-agierenden Faktoren bei Zusammenlagerung von RNA-Protein-Komplexen in vivo beitragen. N2 - Splicing is the process in which non-coding sequence elements (introns) are removed from eukaryotic pre-mRNAs and coding sequence elements (exons) are linked to an open reading frame. This central step in eukaryotic gene expression is catalyzed by the spliceosome, which is composed of the four small nuclear Ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4/U6, U5 and a large number of additional protein factors. The snRNPs possess a common ring-shaped core structure that is formed by the seven Sm proteins (SmB/B’-D1-D2-D3-E-F-G) around a single-stranded sequence (Sm site) of the snRNAs. While this so-called Sm core domain forms spontaneously in vitro, its assembly is a highly regulated and assisted process in vivo. It is dependent on the action of at least 12 trans-acting factors which are organized in the PRMT5 and SMN complexes. The PRMT5 is active in the early phase of assembly and recruits the Sm proteins via its pICln subunit and catalyzes the symmetrical di methylation of arginine residues in the C-terminal tails of SmB/B’, SmD1 and SmD3. As a result of the early phase the Sm proteins SmD1-D2-E-F-G and SmB/B’-D3 are organized by pICln in two distinct complexes. While SmB/B’-D3 remains bound to the PRMT5 complex, the second complex exists as a free intermediate with a sedimentation coefficient of 6S. These intermediates cannot associate with RNA and the interaction of the Sm proteins with pICln has to be resolved for the assembly process to be continued. This happens in the late phase of Sm core assembly in which the Sm proteins are taken over by the SMN complex and pICln is dissociated. Afterwards the Sm proteins can be transferred onto the Sm site of the snRNA and the Sm core is formed. As part of this thesis two key intermediates of this assembly process could structurally be characterized by a combination of crystallographic and electron microscopic methods. These intermediates comprise the 6S complex and an Sm protein transfer-intermediate with a sedimentation coefficient of 8S. In this 8S complex the 6S complex is bound to two central subunits of the SMN complex (SMN and Gemin2) while pICln is still associated with the Sm proteins. Hence, this complex represents a trapped intermediate between the early and late phase of assembly. In the beginning a first crystal form of a recombinantly prepared 8S complex was obtained that did not allow the solution of the structure. By a combined optimization of the crystallization condition and the proteins a further similar crystal form was obtained that allowed for the solution of the 8S crystal structure. The crystallization of the 6S complex could successfully be accomplished based on the hypothesis that the lattices of crystals of both complexes might show an architectural similarity because of the similar composition of the complexes. Hence, amino acids of pICln that were conformationally restricted within crystal contacts of the 8S crystals were targeted for substitution to alanine. 6S preparations reconstituted with these proteins yielded two new crystal forms that allowed for the structure solution of the 6S complex. Based on the crystal structure of the 6S complex a structural mimicry of Sm proteins by pICln was revealed. This enables binding of the Sm proteins by pICln which is the basis for an early topological organisation of the Sm Pentamer D1-D2-F-E-G within a closed hexameric ring structure. The crystal structure of the 8S complex revealed how the SMN complex binds to the Sm Pentamer via its Gemin2 subunit. In combination with an EM structure of the 8S complex both structures revealed a plausible mechanism for the elimination of pICln and the activation of the Sm proteins for snRNA binding. The solution of both structures helps to better understand the function of trans-acting factors during the in vivo assembly of RNA-protein complexes. KW - Spleißosom KW - SMN KW - Molecular Chaperone KW - Macromolecular Assembly KW - Macromolecular Crystallography KW - Small nuclear RNP KW - Assembly KW - Polypeptidketten bindende Proteine Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116973 ER - TY - THES A1 - Linder, Bastian T1 - Systemischer Spleißfaktormangel im Zebrafisch Danio rerio – Etablierung und Charakterisierung eines Tiermodells für Retinitis pigmentosa T1 - Systemic splicing factor deficiency causes tissue-specific defects: a zebrafish model for retinitis pigmentosa N2 - Retinitis pigmentosa (RP) ist eine vererbte Form der Erblindung, die durch eine progressive Degeneration von Photorezeptorzellen in der Retina verursacht wird. Neben „klassischen“ RP-Krankheitsgenen, die direkt oder indirekt mit dem Sehprozess und der Aufrechterhaltung der Photorezeptoren in Verbindung stehen, können auch Mutationen in Genen für konstitutive Spleißfaktoren zur Photorezeptordegeneration führen. RP kann daher als Paradebeispiel einer Erkrankung mit paradoxer Gewebespezifität angesehen werden: Defekte in essentiellen und ubiquitär exprimierten Genen führen zu einem Phänotyp, der nur wenige Zelltypen betrifft. Um Einblicke in diesen außergewöhnlichen Pathomechanismus zu erhalten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Tiermodell für Spleißfaktor-vermittelte RP im Zebrafisch Danio rerio etabliert. Zunächst wurde gezeigt, dass eine RP verursachende Punktmutation des Spleißfaktors Prpf31 auch in dessen Zebrafisch-Homolog zu einem Verlust der physiologischen Aktivität führt. Als Modell für die Prpf31-Mangelsituation diente dann die durch ein Antisense-Morpholino induzierte partielle Reduktion der Prpf31-Expression in Zebrafischlarven. Konsistent mit einem RP-Phänotyp zeigte sich in diesen Larven eine starke Beeinträchtigung des Sehvermögens. Sie wurde – ebenfalls analog zu RP – durch defekte Photorezeptoren verursacht, die bei ansonsten normal entwickelter Retina eine deutlich veränderte Morphologie aufwiesen. Daraufhin konnten in einer genomweiten Transkriptomanalyse der Augen von Prpf31-defizienten Larven erstmals in vivo photorezeptorspezifische Gene identifiziert werden, deren Expression durch den Mangel an Prpf31 beeinträchtigt war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob es neben den bereits bekannten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren gibt, deren Defekt die Degeneration von Photorezeptoren auslösen kann. Dazu wurde in Zebrafischlarven ein Mangel an Prpf4 erzeugt, einem Spleißfaktor, der bislang nicht mit RP in Verbindung gebracht worden war. Der Phänotyp dieser Fische war nicht von dem des Prpf31 RP-Modells zu unterscheiden. Dies lieferte einen Hinweis darauf, dass auch Defekte in Prpf4 in der Lage sein könnten, RP auszulösen. Tatsächlich konnte durch genetisches Screening ein RP-Patient mit einer Punktmutation in Prpf4 identifiziert werden (Kollaboration mit Hanno Bolz, Universität Köln). Die biochemische Analyse dieser Mutation zeigte, dass sie zu einem Defekt der Integration von Prpf4 in spleißosomale Untereinheiten und zu dessen Funktionsverlust in vivo führt. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Tiermodell konnte zum ersten Mal in vivo ein von Spleißfaktor-Mutationen verursachter Pathomechanismus von Retinitis pigmentosa nachvollzogen werden. Die vom Prpf31-Mangel betroffenen Photorezeptortranskripte stellen vielversprechende Kandidaten für die Vermittlung der Gewebespezifität dar und unterstützen die Hypothese, dass ihre ineffiziente Prozessierung den RP-Phänotyp auslöst. Die Entdeckung eines weiteren Spleißfaktors, dessen Defizienz ebenfalls zu defekten Photorezeptoren führt, zeigt, dass offenbar der Funktionsverlust des Spleißosoms generell in der Lage ist, die Degeneration dieser Zellen zu verursachen. Dies ist nicht zuletzt auch von klinischer Relevanz, da vermutet werden kann, dass sich unter den vielen bisher nicht identifizierten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren befinden. N2 - Retinitis pigmentosa (RP) is a hereditary eye disease marked by the progressive degeneration of photoreceptor cells in the retina. Typical RP disease gene products are involved in visual function or photoreceptor maintenance. However, also mutations in constitutive splicing factors have been shown to cause this type of photoreceptor degeneration. In humans, almost all transcripts need to be processed by the spliceosome and hence its constitutive components are considered to be essential in all cells of the body. RP therefore serves as a paradigm for diseases with a tissue specificity paradox: Defects in essential and ubiquitously expressed genes lead to a phenotype that affects only a small subset of cells or tissues. To gain insight into this unusual etiology, an animal model for splicing factor-linked RP was established in the zebrafish Danio rerio. First, it was shown that an RP-causing missense mutation in the splicing factor Prpf31 leads to a loss of its physiological activity not only in humans, but likewise in zebrafish. The resulting splicing factor deficiency was then modeled in zebrafish embryos by the injection of an antisense morpholino that blocked Prpf31 translation. Consistent with an RP-like phenotype, partial silencing of Prpf31 led to a marked reduction in visual function. This was – again similar to what is observed in RP – caused by severe photoreceptor defects, as these cells presented a highly aberrant morphology in an otherwise normal retina. Consequently, a genome-wide transcriptome analysis of these animals for the first time resulted in the identification of photoreceptor-specific transcripts which show altered expression in vivo due to Prpf31 deficiency. The second part of this work followed the hypothesis that mutations in other splicing factors may likewise elicit photoreceptor degeneration. Therefore, the splicing factor Prpf4, which was not linked to RP prior to this work, was silenced in zebrafish embryos by the injection of an antisense morpholino. The phenotype of these fish was indistinguishable from the Prpf31 RP-model. Defects in Prpf4 might hence be able to cause the degeneration of photoreceptors. Consistent with this, an RP patient with a missense mutation of Prpf4 was identified (in collaboration with Hanno Bolz, University of Cologne). The biochemical analysis of this mutation revealed that it leads to a defect in the integration of Prpf4 into spliceosomal subunits and to its loss of function in vivo. The animal model established in this work for the first time allowed studying the etiology of splicing factor-linked RP in photoreceptors in vivo. The photoreceptor transcripts affected by Prpf31 deficiency are promising candidates for mediating the tissue-specificity of the disease and support the hypothesis that their inefficient processing triggers the RP-phenotype. The identification of another splicing factor, whose deficiency leads to defective photoreceptors, shows that a loss of spliceosomal function in general is able to cause the degeneration of these cells. This is also of clinical relevance, as it shows that the large list of unknown RP disease genes might include even more splicing factors. KW - RNS-Spleißen KW - Spleißen KW - Spleißosom KW - Retinopathia pigmentosa KW - Tiermodell KW - Zebrabärbling KW - RNA Spleißen KW - Zebrafisch KW - Tiermodell KW - Retinitis pigmentosa KW - Biochemie KW - pre-mRNA splicing KW - zebrafish KW - animal model KW - Retinitis pigmentosa KW - biochemistry Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69965 ER -