TY  - THES
A1  - Düll, Johannes
T1  - Untersuchungen zur aktivierungsabhängigen Phosphorylierung der MAP Kinasen von T Zellen, die durch  chimärische T Zellrezeptormoleküle aktiviert werden
T1  - Activation dependent phosphorylation of MAP Kinases with chimeric antigen receptors
N2  - Durch die im Labor der AG Topp standardisierte Verfahren konnten im Rahmen dieser Arbeit stabile T Zell Linien aus primär humanen CMV spezifischen T Zellen und CMV spezifischen T Zellen mit chimärischen Rezeptoren hergestellt werden. Die Anzahl der chimärischen Rezeptoren auf den unterschiedlichen T Zellinien ist nicht signifikant unterschiedlich und beträgt ca. 17000 Rezeptoren pro Zelle. Bei der Überprüfung des Lyseverhaltens CMV spezifischer T Zellen gegenüber CMV spezifischer T Zellen transduziert mit einem chimärischen Rezeptor zeigt sich das gleiche Lyseverhalten. Um die zeitliche Dynamik dieses Verhaltens besser darzustellen, wurde ein FACS basierter Lysierungsversuch selbstständig entwickelt und etabliert. Somit konnte herausgestellt werden, dass das Lyseverhalten der T Zelllinien sowohl der CMV spezifischen T Zellen als auch das der Erst- und Zweitgeneration- T Zelllinien CAR CD19z und CAR CD19/28z vergleichbar war. Alle genannten Zelllinien lysieren ihre Targetzellen sowohl in der Quantität als auch in der zeitlichen Dynamik vergleichbar. Dies ist die einzige Gemeinsamkeit der verglichenen T Zell Aktivierungssysteme. In allen anderen funktionellen Versuchen ist die Aktivierung der T Zellen über einen chimärischen Rezeptor dem der physiologischen Aktivierung über den T Zell Rezeptor unterlegen. Der Proliferationsversuch mit CFSE zeigt eindeutig, dass nur die T Zellen, die über den TCR aktiviert werden, das Potential haben, sich zu teilen. Die T Zellen, die über den CAR sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, teilen sich nicht. Der Defekt der CAR T Zellen zeigt sich auch in der Hochregulation von CD25, einem Aktivierungsmarker für T Zellen. Die T Zellen, die durch die chimärischen Rezeptoren sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, regulieren CD25 nicht so stark nach oben wie die T Zellen, die physiologisch durch den TCR aktiviert werden. Diese Minderaktivierung spiegelt sich auch in der Zytokinproduktion wieder. Auch hier zeigt sich die unvollständige Aktivierung der CAR T Zellen. In der intrazellulären Zytokinmessung sieht man, dass bei CAR T Zellen der ersten und zweiten Generation zum einen die Einzelzellen weniger IFNy produzieren, zum anderen die Gesamtzahl der Zellen, die Zytokine produzieren, weniger ist als im Vergleich zur TCR Aktivierung. Dieses Phänomen der defizienten Aktivierung und der funktionellen Defekte von CAR T Zellen ist bekannt. Dies konnte noch einmal unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen bestätigt werden. Durch die relativ neue Methode der durchflusszytometrischen Bead Technologie konnte dies nun zum ersten Mal realisiert werden. Es zeigte sich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Aktivierungsmodi der T Zellen besteht. Eine physiologische Aktivierung von T Zellen führt zu einer höheren Maximum-Phosphorylierung als eine Aktivierung über den Erstgeneration CAR. Der signifikante Unterschied zeigt sich bei den MAP Kinasen ERK, JNK und p38. Somit ist dies ein Hinweis, dass die Signaltransduktion auf breiter Ebene aufgrund des alleinigen Vorhandenseins der Zeta Kette bei den CAR CD19z T Zellen, defizient ist und nicht ausreicht für eine volle Aktivierung, die eine volle Funktionalität der T Zelle nach sich ziehen würde. Diese unzureichende Aktivierung soll durch die kostimulatorische Komponente CD28 beim Zweitgenerationrezeptor CAR CD19/28z aufgehoben werden. In der Proliferation, Zytokineproduktion und den Aktivierungsmarkern zeigt sich keine Verbesserung im Vergleich zum Erstgenerationrezeptor bei CMV spezifischen T Zellen. Dieses Ergebnis wird bestätigt und korreliert damit, dass es keinen Unterschied in der maximalen Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 zwischen Erstgeneration CAR CD19z und Zweitgeneration CAR CD19/28z gibt. Somit ist dieses System geeignet, um aus dem Phosphorylierungsstatus von MAP Kinasen von CAR T Zellen auf die Funktionalität dieser T Zellen zu schließen.
N2  - Activation dependent phosphorylation of MAP kinases in t cells. These t cells were activated through a chimeric antigen recepptor system of the first and second generation. In CMV specific t cells are no differences in the strength of phosphorylation between first and second generation receptors.
KW  - T Zellen
KW  - Signaltransduktion
KW  - Chimärische Rezeptoren
KW  - Kostimulation
KW  - Adoptiver T Zell Transfer
KW  - T Zellen
KW  - Signaltransduktion
KW  - Chimärische Rezeptoren
KW  - Kostimulation
KW  - Adoptiver T Zell Transfer
KW  - T cells
KW  - signalling
KW  - chimeric antigen receptors
KW  - costimulation
KW  - adoptive t cell transfer
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85318
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bischof, Astrid
T1  - Mechanismen der TZR-abhängigen und -unabhängigen Aktivierung primärer T-Zellen der Ratte durch CD 28
T1  - Mechanisms of T cell receptor dependent and independent activation of primary rat T cells via CD28
N2  - Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abhängig über den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt über kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molekülen ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivität einiger monoklonaler Antikörper (mAb) spezifisch für CD28 der Ratte, die alle ruhenden primären Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen können, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterstützt CD28 als kostimulatorisches Molekül nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenständiges Signalmolekül, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 könnte für die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verhältnis der Stärke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt.
N2  - Resting T cells need two signals to become fully activated: one delivered via the T cell receptor (TCR) and a second one provided by costimulatory receptors. Among the known costimulatory molecules CD28 is the most potent one. In the rat system some CD28-specific monoclonal antibodies (mAb) trigger all primary rat T cells to proliferate and produce cytokines without TCR engagement. The signalling pathways elicited by one of these mitogenic CD28-specific mAb were analyzed and compared to the signals given in classical costimulation with TCR contribution. The results suggest that direct CD28 stimulation does not mimic TCR signals but elicits distinct, CD28-specific signals. Thus, CD28 as a costimulatory molecule not only supports TCR mediated signalling but functions as a generator of mitogenic signals. This could be relevant to the type of immune reaction triggered since the relative contribution of TCR and CD28 signals to T cell activation has been shown to influence the functional differentiation of T cells towards the Th1 or Th2 subset.
KW  - Antigen CD28
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Aktivierung <Physiologie>
KW  - Signaltransduktion
KW  - T-Zellaktivierung
KW  - Kostimulation
KW  - T-Zellrezeptor (TZR)
KW  - CD28
KW  - Proliferation
KW  - Kinasen
KW  - Signalkaskaden
KW  - JNK
KW  - ZAP-70
KW  - Ratte
KW  - T cell activation
KW  - costimulation
KW  - T cell receptor (TCR)
KW  - CD28
KW  - proliferation
KW  - kinases
KW  - signalling cascades
KW  - JNK
KW  - ZAP-70
KW  - rat
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-875
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Nora
T1  - Masern Virus Interferenz mit T-Zell-Aktivierung : Einfluß auf Zytoskelettdynamik, Mobilität und Interaktion mit Dendritischen Zellen
T1  - Measles Virus interference with T cell activation: effect on cytoskeleton dynamics, mobility and interaction with dendritic cell
N2  - Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Domänen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivität der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. Übereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte Fähigkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antikörpern-beschichteten Objektträgern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Veränderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin–bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse stört. Trotz der morphologischen Veränderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Moleküls gestört ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollständig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung während der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.
N2  - It was previously shown, that CD3/CD28-induced activation of PI3/Akt kinase pathway and proliferation are impaired in T cells after contact with the MV glycoprotein complex. As a result of PI3 kinase inactivation, membrane recruitment of PH domain containing proteins such as Akt kinase and the Rho GEF Vav, was abolished after CD3/CD28 coligation. The binding of MV interferes with CD3/CD28 coligation induced GTP-loading of the Rho GTPases, Cdc42 and Rac1. GTP-loading of RhoA was not impaired after MV treatment. Rather, RhoA was slightly activated by MV alone and this was enhanced upon CD3/CD28 ligation. Consisting with the failure of CD3/CD28 ligation to induce GTP-loading of Cdc42 and Rac1, polymerization of F-actin and morphological changes required for the formation of a contact plane such relaxation, flattening did not occur in MV treated T cells. MV treatment also efficiently interfered with the ability of T cells to adhere to ECM components. In contrast to mock treated, the majority of MV exposed T cells failed to aquire a polar front-rear organization. Thus, MV induced signaling efficiently impairs stimulation dependent reorganisation of the F-actin cytoskeleton and adhesion in T cells. As revealed by scanning electron microscopy, exposure of T cells to MV induced an almost complete breakdown of microvillar structures which could also not be restored upon CD3/CD28 costimulation. The almost complete collapse of membrane protrusions in MV treated cells was associated with reduced phosphorylation levels of cofilin and ERM proteins. The ability of MV exposed T cells to interact with DCs and form DC/T-cells conjugates is not affected. MV signaling to T cells interfered with clustering and recruitment of CD3 into the central supramolecular activation cluster of the IS. MV also prevents the redistribution of the MTOC in T cells towards the synapse. In summary, MV interferes with stimulated cytoskeleton remodeling, and this disturbes the ability of T cells to adhere, spread and cluster receptors essential for sustained activation. The signal given by the MV glycoprotein complex apparently prevents essential steps in APC/T cells interactions which are required for migration and successful activation.
KW  - Masernvirus
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Immunsuppression
KW  - Zellskelett
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Masern Virus
KW  - Immunsuppression
KW  - Costimulation
KW  - Zytoskelett
KW  - Dendritische Zellen
KW  - measles virus
KW  - immunosuppression
KW  - costimulation
KW  - cytoskeleton
KW  - dendritic cells
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17953
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ortler, Sonja
T1  - Die Bedeutung koinhibitorischer Signale in der ZNS Immunregulation: die Rolle des B7-Homologs B7-H1 (PD-L1)
T1  - The impact of coinhibitory signals in CNS immune regulation: the role of B7-homologue 1 (PD-L1)
N2  - Das koinhibitorische Molekül B7-H1 beeinflusst adaptive Immunantworten und ist vermutlich an den Mechanismen zur Aufrechterhaltung peripherer Toleranz und der Limitierung inflammatorischen Schadens beteiligt. Zusätzlich kommt DZ eine entscheidende Bedeutung in der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regulation ZNS-spezifischer Autoimmunität und Inflammationsprozessen zu. Um den B7-H1/PD-1-Signalweg eingehender zu untersuchen, wurden adaptive Immunantworten und die Zielorgan-spezifische Infiltration im Modell der MOG35-55-induzierten EAE analysiert, einem Tiermodell der MS, das durch neurologische Schädigungen und progressive Paralyse bedingt durch die inflammatorische Demyelinisierung im ZNS charakterisiert ist. Im Vergleich zu Wildtyptieren zeigten B7-H1-/- Mäuse einen beschleunigten Krankheitsbeginn und eine signifikante Steigerung des Schweregrads der EAE. Periphere MOG35-55-spezifische IFNg-/IL-17-Immunzellantworten traten in B7-H1-/- Mäusen verfrüht und verstärkt auf, klangen allerdings auch schneller ab. Im ZNS persistierte jedoch eine signifikant höhere Anzahl aktivierter, Neuroantigen-spezifischer T-Zellen während allen Phasen der EAE, wobei diese Zellen ebenfalls größere Mengen proinflammatorischer Zytokine sezernieren konnten. Experimente mit APZ-assoziiertem B7-H1, die einen direkten inhibitorischen Effekt auf die Aktivierung und Proliferation MOG35-55-spezifischer Effektorzellen zeigten, unterstützen die Hypothese, dass parenchymale Expression von B7-H1 ausschlaggebend für das Schicksal von T-Zellen im Zielorgan ist. B7-H1 stellt damit ein Schlüsselmolekül für die Kontrolle parenchymaler Immunreaktionen dar. Nachdem die Relevanz von B7-H1 auf APZ in vitro bewiesen werden konnte, wurde der Einfluss von B7-H1 auf systemisch oder intrazerebral injizierten DZ mit immunogenem oder tolerogenem Phänotyp untersucht. Intravenöse Applikation von tolerogenen B7-H1-/- DZ resultierte in einer besseren Protektion gegen EAE, und dieser Effekt war von einer gesteigerten Produktion Tr1-/Th2-typischer Zytokine sowie einer verstärkten Sekretion von IL-4 und IL-13 durch CD1d-restringierte T-Zellen in der Peripherie begleitet. Die Anzahl Neuroantigen-spezifischer T-Zellen, die proinflammatorische Zytokine sezernierten, war dementsprechend sowohl in der Peripherie als auch im ZNS reduziert. In diesem Zusammenhang konnte für B7-H1 eine wesentliche Beteiligung an der Inhibition der Aktivierung antigen-spezifischer, regulatorischer T-Zellen und CD1d-restringierter T-Zellen gefunden werden. Bei der Injektion intrazerebraler DZ bewirkten tolerogene DZ im Vergleich zu immunogenen DZ eine Reduktion der ZNS-Infiltration mit CD4+ T-Zellen in der frühen Phase der Erkrankung. Außerdem konnte eine Veränderung des intrazerebralen Zytokinmilieus von IFNg/IL-17 exprimierenden enzephalitogenen T-Zellen zu IL-10+ regulatorischen T-Zellen gezeigt werden. B7-H1-Defizienz auf APZ verstärkte diesen Effekt und führte dadurch in den Mäusen zur partiellen Protektion gegen klinische Symptome der EAE. Zusätzlich wurde die Beteiligung von B7-H1 an der Rekrutierung und ZNS-lokalisierten Induktion der Proliferation CD8+ regulatorischer T-Zellen durch DZ beschrieben. Unabhängig vom Phänotyp der DZ wurde eine bereits in der frühen Phase vorhandene und dauerhaft expandierende Population von CD8+ T-Zellen im ZNS DZ[B7-H1-/-]-injizierter Mäuse gefunden. Diese Zellen konnten in vitro die Proliferation MOG35-55-spezifischer CD4+ T-Zellen supprimieren und wirkten so mutmaßlich an der Abmilderung der EAE mit. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit die entscheidende Bedeutung von B7 H1 auf DZ als immuninhibitorisches Molekül, das sowohl enzephalitogene als auch regulatorische T-Zell-Antworten moduliert und damit zur Limitation von Immunantworten beiträgt.
N2  - The coinhibitory B7-H1 molecule influences adaptive immune responses and has been proposed to contribute to the mechanisms maintaining peripheral tolerance and limiting inflammatory damage in parenchymal organs. Additionally, DC emerge as crucial immune cell population during development, maintenance and regulation of CNS-specific autoimmunity and inflammation. To further explore the B7-H1/PD1 pathway in CNS autoimmune inflammation, adaptive immune responses and target organ infiltration were analysed in MOG35-55-induced EAE, an animal model of MS characterized by neurological impairment and progressive paralysis resulting from inflammatory demyelination in the CNS. In comparison to wildtype mice B7 H1-/- mice exhibited an accelerated disease onset and significantly exacerbated EAE severity. Peripheral MOG35-55-specific IFNg/IL-17 T cell responses occurred earlier and enhanced in B7-H1-/- mice, but ceased more rapidly. In the CNS, however, significantly higher numbers of activated neuroantigen-specific T cells persisted during all stages of EAE and were able to secrete higher amounts of proinflammatory cytokines. Experiments showing a direct inhibitory role of APC-derived B7-H1 on the activation and proliferation of MOG35-55-specific effector cells support the assumption that parenchymal B7 H1 is pivotal for delineating T cell fate in the target organ. Therefore, B7-H1 represents a key molecule in the control of parenchymal immune reactions. Having shown the critical relevance of B7-H1 on APC in vitro, the influence of B7-H1 expression on systemically or intracerebrally injected DC displaying an immunogenic or tolerogenic phenotype was investigated. Intravenous application of tolerogenic B7-H1-/- DC resulted in a more efficient protection from EAE, accompanied by an increased peripheral production of Tr1/Th2 cytokines and a pronounced secretion of IL-4 and IL-13 by CD1d-restricted T cells. In accordance, numbers of neuroantigen-specific T cells secreting proinflammatory cytokines were reduced both in the periphery and in the CNS. Here, a substantial contribution of B7-H1 to inhibition of activation of antigen-specific, regulatory T cells and CD1d-restricted T cells could be found. Using intracerebral DC injections, a reduction of early CNS CD4+ T cell infiltration was shown for tolerogenic DC compared to immunogenic DC. Furthermore, alteration of the intracerebral cytokine milieu containing IFNg+/IL-17+ encephalitogenic T cells to IL 10+ regulatory T cells was demonstrated. B7-H1 deficiency on DC enhanced this effect, thereby mediating partial protection of mice from clinical signs of EAE. Additionally, involvement of B7-H1 expression on the ability of DC to recruit and induce proliferation of CD8 regulatory T cells locally in the CNS was described. Regardless of DC phenotype, an early and consistently expanding population of CD8+ T cells was observed in the CNS of DC[B7-H1-/-]-injected mice, which was able to suppress proliferation of MOG35-55-specific CD4+ T cells in vitro and thus probably contributes to EAE amelioration in vivo. Taken together, the findings of this study demonstrate the critical importance of DC-derived B7-H1 as an immune-inhibitory molecule capable of modulating both encephalitogenic and regulatory T cell responses thus contributing to the confinement of immune responses.
KW  - Multiple Sklerose
KW  - Kostimulation
KW  - EAE
KW  - dendritische Zellen
KW  - ZNS
KW  - B7-H1
KW  - multiple sclerosis
KW  - costimulation
KW  - EAE
KW  - dendritic cells
KW  - CNS
KW  - B7-H1
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34784
ER  -