TY - THES A1 - Rak, Kristen Johannes T1 - Der Effekt von HDAC Inhibitoren auf neuronale und nicht-neuronale Zellen eines Mausmodells der spinalen Muskelatrophie (SMA) T1 - Effects of HDAC Inhibitors an neuronal and non-neuronal cells of a mice-modell of spinal muscular atrophy N2 - Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist mit einer Inzidenz von 1:6000 die zweithäufigste autosomal-rezessive Erbkrankheit im frühen Kindesalter. Die durch den Verlust des SMN- (survival of motoneuron) Gens reduzierte SMN Protein Expression führt zu einer Degeneration der spinalen Motoneurone mit proximal betonter Muskelschwäche. Deshalb zielen erste Therapieversuche darauf ab, diese zu erhöhen. Es war gezeigt worden, dass durch den Einsatz von Histon Deacetylase Inhibitoren (HDAC) in neuronalen Kontroll Zellen und in nicht neuronalen Zellen von SMA Patienten die SMN Protein Expression signifikant gesteigert werden konnte. In der vorgelegten Arbeit wurde untersucht, ob die HDAC Inhibitoren Valproat, SAHA und FK228 Einfluss auf die SMN Protein Expression in kortikalen neuronalen Vorläuferzellen (NSC), auf primär embryonale Fibroblasten (PMEF) und auf die morphologischen Veränderungen in primär kultivierten embryonalen Motoneuronen eines Mausmodells der SMA haben. Es konnte eine signifikante Steigerung der SMN Protein Expression durch den Einsatz von Valproat und FK228 in kortikalen neuronalen Vorläuferzellen nachgewiesen werden. Es ergab sich jedoch kein Einfluss auf die SMN Protein Expression in primär embryonalen Fibroblasten. Bei NSCs und primär kultivierten embryonalen Motoneuronen wirkten die HDAC Inhibitoren Valproat und FK228 konzentrationsabhängig toxisch auf das Überleben, die Länge der Axone und die Größe der Wachstumskegel. Es konnte kein positiver Einfluss auf die morphologischen Veränderungen des Mausmodells gesehen werden. Zusammenfassend zeigte sich in der vorgelegten Arbeit ein positiver Effekt auf die SMN Protein Expression durch den Einsatz von HDAC Inhibitoren, der jedoch mit einem toxischen Effekt auf die behandelten neuronalen Zellen einherging. N2 - Spinal muscular atrophy (SMA) has an incidence of 1:6000 and is the second most common autosomal recessive hereditary disease in early childhood. The disease is characterized by the degeneration of spinal motor neurons with weakness of the proximal limb. This is caused by the deficiency of the SMN (survival of motor neuron) protein. Therefore therapeutical strategies aim to increase the SMN protein level. It has been shown that histone deacetylase inhibitors could increase SMN protein level in neuronal control cells and non-neuronal cells of SMA patients. The aim of the presented study was to investigate whether the HDAC inhibitors valproic acid, SAHA and FK228 had an effect on the SMN protein level in cortical neural progenitor cells or primary embryonic fibroblasts of a SMA mice model. The second question was if morphological pathologies in primary cultured embryonic motor neurons of this SMA mouse model could be altered. There was a significant increase in SMN protein level by the use of valproic acid and FK228 in cortical neuronal precursor cells. However, there was no effect on the SMN protein level in primary embryonic fibroblasts. In cortical neuronal precursor cells and primary cultured embryonic motor neurons, the HDAC inhibitors valproic acid and FK228 displayed and concentration-dependent toxic effect on the survival, axonal length and the size of the growth cone. No obvious influence on the morphological changes in the mice model could be seen. In conclusion a positive effect on the SMN protein level by the use of HDAC inhibitors could be detected, but with a toxic effect on neuronal cells at the same time. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Tiermodell KW - Histon-Deacetylase KW - Valproinsäure KW - Zellkultur KW - Immunoblot KW - Spinal muscular atrophy KW - Animal modell KW - Histon-Deacetylase KW - Valproic acid KW - Cell culture KW - Immunoblot Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51516 ER - TY - THES A1 - Wenzel, Sonja T1 - Etablierung eines dynamischen Kultursystems auf Calciumphosphat-Scaffolds unter Verwendung zweier verschiedener Zelllinien T1 - Establishment of a dynamic culture system with calcium phosphate scaffolds using two different cell lines N2 - Der Ersatz von Knochengewebe durch die Methode des Tissue Engineerings stellt eine viel versprechende Alternative zu konventionellen Therapieformen dar. Jedoch müssen die bisherigen Kulturbedingungen verbessert werden, um das Differenzierungsverhalten von Zellen optimal steuern zu können. Dabei spielt nicht nur die Wahl eines geeigneten Scaffolds und der zu verwendenden Zellen, sondern auch die des Kultursystems eine entscheidende Rolle. In einem dynamischen Kultursystem zirkuliert Medium und bietet gegenüber einem statischen Kultursystem veränderte Bedingungen bezüglich Nährstoffversorgung und Stimulation durch Flüssigkeitsscherstress. Um die Einflüsse der veränderten Bedingungen zu analysieren, wird in dieser Arbeit ein dynamisches Kultursystem etabliert. Dazu werden Calciumphosphat(CaP)-Scaffolds mit dem 3D Powder Printing System gedruckt und mit Zellen der Osteosarkomzelllinie MG63 oder der Fibroblastenzelllinie L-929 besiedelt. In 17 Versuchsreihen werden die zellbesiedelten Scaffolds bei unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten und über unterschiedliche Kultivierungszeiträume kontinuierlich perfundiert. Anhand der Wachstumsparameter Zellzahl und Zellviabiltät, sowie der Morphologie und räumlichen Verteilung der Zellen werden die Qualitäten der Kultursysteme untersucht und mit statischen Kultursystemen verglichen. Die mit dem 3D Powder Printing System gedruckten Scaffolds erweisen sich als geeignet: Nach 6-tägiger Kultur können unter dem Rasterelektronenmikroskop auf den CaP-Scaffolds eine reichliche Zellbesiedelung mit morphologisch gesunden Zellen, die in das Porensystem hineinwachsen, beobachtet werden. Bei beiden Zelllinien nehmen in beiden Kultursystemen die Wachstumsparameter über einen 6-tägigen Kultivierungszeitraum stetig zu und eine Langzeitkultur über 30 Tage kann in beiden Kultursystemen am Leben erhalten werden. Die kontinuierliche Perfusion in einem dynamischen Kultursystem wirkt sich auf das Zellwachstum günstig aus. Im Vergleich von dynamischen zu statischem Kultursystem über einen 6-tägigen Kultivierungszeitraum wachsen beide Zelllinien im dynamischen Kultursystem besser. Dabei spielt die Fließgeschwindigkeit im dynamischen Kultursystem auf die verbesserte Nährstoffversorgung und Stimulation durch Flüssigkeitsscherstress eine Rolle. Außerdem ist zu beachten, dass der Einfluss der Fließgeschwindigkeit des Mediums auf die einzelnen Scaffolds innerhalb des Kulturcontainers unterschiedlich ist. Dies hängt vom Strömungsprofil im Container ab und macht sich durch eine erhöhte Standardabweichung der Messwerte gegenüber der statischen Kultur bemerkbar. N2 - The replacement of bone tissue by the method of tissue engineering represents a promising alternative to conventional forms of therapy. However, current culture conditions have to be optimized in order to control the differentiation behavior of cells. In this context, the choice of the appropriate scaffolds and cells as well as of a suitable culture system play a crucial role. In contrast to static culture systems, medium circulates in a dynamic culture system which offers changed conditions regarding nutrition and stimulation by fluid induced shear stress. To analyze the effects of changed conditions, a dynamic culture system is established in this work. For this purpose, calcium phosphate (CaP) scaffolds printed by the 3D Powder Printing System were populated with cells of the MG63 osteosarcoma cell line or of the fibroblast cell line L-929. In 17 experiments, the cultured scaffolds were perfused continuously at different flow rates and for different cultivation periods. Based on the growth parameters cell number and cell viability, as well as on the morphology and the spatial distribution of the cells, the qualities of the dynamic culture systems were compared to static culture systems. The scaffolds printed by the 3D Powder Printing System proved to be suitable: After a 6-day culture period, the CaP scaffolds showed an abundant cell colonization with morphologically healthy cells growing into the pore system which was observed under a scanning electron microscope. Using both cell lines in both culture systems, the growth parameters increased continuosly during a 6-day cultivation period and it was possible to keep a long-term culture over 30 days in both culture systems alive. The continuous perfusion in a dynamic culture system has a favorable effect on cell growth. In comparison of dynamic to static culture systems over a 6-day culture period, both cell lines grew better in the dynamic culture system. Here the flow rate in the dynamic culture system plays a major role controlling the improved nutrition and stimulation by fluid induced shear stress. Furthermore, the influence of the flow rate of the medium on the individual scaffolds within the culture container varies for the different scaffold positions. This depends on the flow profile of the container and is indicated by an increased standard deviation of the measured values when compared to the static culture. KW - Zellkultur KW - Tissue Engineering KW - Cell culture KW - tissue engineering Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48766 ER - TY - THES A1 - Ströhle, Serge - Peer T1 - Kultivierung von humanem Speicheldrüsengewebe in einer dreidimensionalen Polyurethanmatrix T1 - Cultivation of human salivary gland tissue in a three-dimensional Polyurethane Matrix N2 - Bei Tumoren von Kopf und Hals kann primär oder adjuvant durch Bestrahlung therapiert werden. Die Folgen dieser Behandlung können Xerostomie, Karies, Infektionen, Dysphagie oder Mundgeruch sein. Diese Nebenwirkungen vermindern die Lebensqualität des Patienten. Unterschiedliche Behandlungsansätze haben aufgrund von therapiebedingten Einschränkungen nicht den Weg in den klinischen Alltag gefunden. Eine Alternative zu den vorhandenen Behandlungsansätzen kann das Tissue Engineering sein. Das Ziel einer Normalisierung der Speichelproduktion nach Behandlung soll durch eine implantierbare, künstliche Speicheldrüse erreicht werden. Kann humanes natives Speicheldrüsengewebe der Parotis auf gradientenfreiem dreidimensional aufgebauten Polyurethan wachsen und seine Funktionalität beibehalten? Humane Parotiszellen wurden von 20 Patienten im Alter von 42 - 90 Jahren durch Operation entnommenen und in Polystyrol-Zellkulturflaschen mit dem Nährmedium BEGM herangezüchtet. Es erfolgte eine 2D-Zellverteilung der reinen Parotiskultur. Zur Kontrolle der Vitalität zwischen den Passagen wurde eine Trypan-Blau Färbung verwendet. Als Trägermaterial der Zellen wurde eine biokompatible, abbaubare Matrix aus ε-Polycaprolacton verarbeitet. Die Übertragung der humanen Parotiszellen wurde mit einer Kleberproteinlösung, bestehend aus den Hauptbestandteilen Aprotinin, Fibrinogen und der Thrombinlösung durchgeführt. 7,14 und 21 Tage nach Aufbringung wurde der Überstand der zeitgleich entnommenen Konstrukte zur Überprüfung des α-Amylase konserviert. Zusätzlich wurden an den 3 Untersuchungstagen Konstrukte für die Anfertigung von histologischen Schnitten, quantitativer PCR, indirekter Immunfluoreszenz und zur Elektronenmikroskopie entnommen. Zur Überprüfung der Funktionalität der angezüchteten Speicheldrüsenzellen wurde das Enzym α-Amylase und das Wasserkanalprotein Aquaporin 5 herangezogen. Bei der Kultivierung der humanen Speicheldrüsenzellen konnte durch den Vitalitätstest Trypan-Blau Färbung in Kombination mit einer Neubauerzählkammer eine konstant hohe Anzahl an vitalen Zellen bis zur 4. Passage nachgewiesen werden. Durch die Lebend/Tot Färbung auf FDA/EB Basis der Konstrukte über die Untersuchungszeit von 14 Tagen konnte keine Vermehrung von avitalen Zellen mikroskopisch festgestellt werden. Die statistische Auswertung mittels Boxplots des ELISA berechnete für den ersten Untersuchungstag einen Median auf niedrigem Niveau von 4,4 U/l und sank im weiteren Zeitverlauf am Untersuchungstag 21 auf die niedrigsten Median von 2,2 U/l ab. α-Amylase konnte an allen 3 Tagen mittels quantitativer PCR und indirekter Immunfluoreszenz belegt werden. Aquaporin 5 als Funktionsnachweis war in der vorliegenden Studie nicht signifikant durch quantitative PCR beweisbar. Die Rasterelektronenmikroskopie bildete adhärente Zellen in kugeliger Form aus den besiedelten Matrices nach 7 Tagen Kultivierung ab. Durch die Transmissionselektronenmikroskopie konnten Zellen, die Zellfortsätze ausgebildet hatten nach 14 Tagen beobachtet werden. Der Versuch, histologische Schnitte auf Grundlage der Paraffineinbettung oder Kryo-Konservierung zu erzeugen, musste frustran abgeschlossen werden. Eine Kultivierung von Speicheldrüsenzellen auf einer Matrix aus ε-Polycaprolacton ohne Gradienten ist eingeschränkt umsetzbar. Die Studie konnte zeigen, dass das Wachstum der Zellen auf konstant niedrigem Niveau über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen lag. Der Funktionsnachweis von α-Amylase auf absinkendem niedrigem Niveau sowie fehlender Bestätigung von Aquaporin 5 kann als stationäre Phase des Wachstums interpretiert werden. Zur Verbesserung der Zellentwicklung sollte die besiedelte Matrix zu einem 3D-Zellwachstum anregen. Bei sequenziell entstehender Polarität der Zellen käme es zu einer Verbesserung der Vitalität sowie der vermehrten Ausbildung von α-Amylase und Aquaporin 5. Dies könnte in einer Kombination der Zellkultur aus Parotiszellen mit Kokulturen aus humanen Myoepithelzellen und Parenchymzellen erreicht werden. Sehr gute Ergebnisse des Zellwachstums und der Zellfunktion konnten aktuell in anderen Studien auf der Trägersubstanz Matrigel oder durch Rebesiedelung von dezellularisierten Organen beobachtet werden. N2 - In the case of tumours of the head and neck, the tumour can be treated primarily or adjuvantly by radiation. The consequences of this treatment can be xerostomia, caries, infections, dysphagia or bad breath. These side effects reduce the patient's quality of life. Different treatment approaches have not found their way into the clinical routine due to therapy related limitations. Tissue engineering can be an alternative to the existing treatment approaches. The goal of normalising saliva production after treatment is to be achieved by means of an implantable, artificial salivary gland. Can human native salivary gland tissue of the parotid gland grow on gradient-free three-dimensional polyurethane and retain its functionality? Human parotid gland cells were taken from 20 patients aged 42 - 90 years by surgery and cultivated in polystyrene cell culture bottles with the culture medium BEGM. A 2D cell distribution of the pure parotid culture was performed. A trypan-blue staining was used to control the vitality between the passages. A biocompatible, degradable matrix of ε-polycaprolactone was used as carrier material for the cells. The transfer of human parotid cells was performed with a glue protein solution consisting of the main components aprotinin, fibrinogen and the thrombin solution. 7, 14 and 21 days after application, the supernatant of the constructs taken at the same time was preserved for the examination of α amylase. In addition, constructs for the preparation of histological sections, quantitative PCR, indirect immunofluorescence and electron microscopy were taken during the 3 days of examination. The enzyme α-amylase and the water channel protein aquaporin 5 were added to test the functionality of the cultivated salivary gland cells. During the cultivation of human salivary gland cells, the vitality test Trypan blue staining in combination with a Neubauer counting chamber showed a constantly high number of vital cells up to the 4th passage. The live/dead staining on FDA/EB basis of the constructs over the examination period of 14 days did not show any proliferation of avital cells. The statistical evaluation by means of ELISA box plots calculated a median at a low level of 4.4 U/l for the first day of the examination and dropped to the lowest median of 2.2 U/l on examination day 21. α-amylase was detected on all 3 days by quantitative PCR and indirect immunofluorescence. Aquaporin 5 as a functional test was not significantly detectable by quantitative PCR in this study. The scanning electron microscopy imaged adherent cells in spherical form from the colonised matrices after 7 days of cultivation. Using transmission electron microscopy, cells that had formed cell extensions could be observed after 14 days. The attempt to produce histological sections based on paraffin embedding or cryopreservation had to be frustrated. Cultivation of salivary gland cells on a matrix of ε-polycaprolactone without gradients is of limited use. The study was able to show that the growth of the cells was at a constantly low level over the 21-day period of the study. The proof of function of α-amylase at a decreasing low level and the lack of confirmation of aquaporin 5 can be interpreted as a stationary phase of growth. To improve cell development, the colonised matrix should stimulate 3D cell growth. If the cells were to develop a sequential polarity, there would be an improvement in vitality as well as increased formation of α-amylase and aquaporin 5. This could be achieved by a combination of cell culture from parotid cells with cocultures of human myoepithelial cells and parenchymal cells. Very good results of cell growth and cell function could be observed in other studies on the carrier substance Matrigel or by re-colonisation of decellularised organs. KW - Ohrspeicheldrüse KW - Tissue Engineering KW - Polyurethane KW - Trägersubstanz KW - Zellkultur KW - Ohrspeicheldrüse KW - Elektronenmikroskopie KW - Biomarker KW - Real time quantitative PCR KW - Electron microscopy KW - Cell culture KW - Parotid glands KW - Biochemical markers KW - Quantitative Real-Time PCR Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216887 ER -